KR101546810B1 - 구제역 ｏ 혈청형-동남아 지역형의 방어 항원이 발현되는 재조합 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 바이러스 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 O 혈청형-SEA(South East Asia, 동남아) 지역형에 대한 방어 항원이 발현되는 재조합 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 바이러스 백신에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 ME-SA(Middle-East South America, 중동-남미) 지역형의 O1 마니사(manisa) 백신 바이러스에서 구조 단백질 P1의 코딩 유전자를 O 혈청형 SEA 지역형 바이러스의 것으로 교체하여 외피 항원을 뒤바꿈으로써 O 혈청형 SEA 지역형에 대한 방어 항원을 발현할 수 있는 재조합 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 바이러스 백신에 관한 것이다.

Description

구제역 Ｏ 혈청형-동남아 지역형의 방어 항원이 발현되는 재조합 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 바이러스 백신{Foot-and-mouth disease recombinant virus expressing P1-protective antigen of O serotype-SEA topotype, and the viral vaccine comprising the same}

본 발명은 O 혈청형-SEA(South East Asia, 동남아) 지역형에 대한 방어 항원이 발현되는 재조합 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 바이러스 백신에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 ME-SA(Middle-East South America, 중동-남미) 지역형의 O1 마니사(manisa) 백신 바이러스에서 구조 단백질 P1의 코딩 유전자를 O 혈청형 SEA 지역형 바이러스의 것으로 교체하여 외피 항원을 뒤바꿈으로써 O 혈청형 SEA 지역형에 대한 방어 항원을 발현할 수 있는 재조합 바이러스 및 이를 포함하는 구제역 바이러스 백신에 관한 것이다.

구제역(Foot-and-mouth disease; FMD)은 발굽이 둘로 갈라진 동물에 감염되는 바이러스성 수포형성을 유도하는 질병으로 빠른 복제와 빠른 전파력이 특징이다. 이 전염병은 그 경제적 중요성으로 인하여 세계동물보건기구(OIE)에 의하여 중요한 동물질병으로 분류되어 있으며, 발생시 국가간 교역이 불가능하여 축산물의 교역에 있어 가장 중요한 요소로 작용하고 있다. 이 병원체는 단일 가닥의 양극성 RNA 바이러스로 피코나비리데(Piconaviridae)과, 아프소바이러스(Aphthovirus)속에 속하며 7개의 다른 혈청형(A, O, C, Asia1, SAT1, SAT2, SAT3)으로 분류되고 있다.

구제역 바이러스(Foot-and-mouth disease virus)의 O형 중에도 약 8가지 이상의 여러 지역형이 있다. 엄격하게 개발한다면, 이러한 지역형에 대한 백신을 모두 개발하여 백신으로 사용하여야 하지만, 모든 백신주 개발을 위해서는 야외주가 지속적으로 세포에서 배양될 수 있어야 하며, 또한 적절한 증식력을 지녀야 한다는 문제가 있다.

그러나, 한 종류의 구제역 백신을 고전적으로 세포에 배양하여 개발하는 일은 수년간의 연구를 집약해야 이뤄질 수 있다. 이를 이용한 백신이 개발된다 하더라도 이 바이러스의 특성은 개발할 때마다 명확히 분석되어져야 한다. 이러한 절차 등은 구제역과 같은 전파능력이 탁월한 전염병을 방역하기에는 시간이 너무 소요되어 동물의 방어를 위해 제시간에 구제역 백신을 개발, 생산을 어렵게 하고 있으며 필요한 시점에 동물에 적용하는 것이 지난하다.

따라서, 기존의 백신 바이러스를 이용하여 필요로 하는 백신주를 신속하게 개발함으로써, 필요로 하는 백신주를 적절한 시기에 제작 가능한 형태로 만들 필요가 있다.

본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하기 위하여, 이미 구제역 백신주로 알려져 있는 동물에 병원성이 약화된 바이러스를 기초로 바이러스 유전자로 구성된 기본 벡터를 이용하여 O 혈청형 중 SEA 지역형에 대한 백신을 생산할 수 있는 재조합 바이러스를 제작하게 되었다.

따라서, 본 발명은 구제역 O 혈청형-SEA 지역형에 대한 백신을 효율적으로 생산할 수 있는 재조합 바이러스를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 구제역 O 혈청형-동남아(SEA) 지역형의 재조합 바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 구제역 O 혈청형-동남아(SEA) 지역형의 재조합 바이러스를 포함하는 구제역 예방용 백신을 제공한다.

본 발명에 따른 재조합 바이러스는 동물에서 병원성이 거의 보이지 않을 정도로 감소시킬 수 있고, 야외 바이러스와 감별이 가능하며, 한국 주변에 발생되는 중국 또는 대만 등에서 발생하는 바이러스 지역형을 효과적으로 방어할 수 있도록 구제역 백신의 제작에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 구제역 O 혈청형-SEA 지역형 바이러스에 대한 방어 단백질 유전자가 삽입된 플라스미드의 모식도이다.
도 2는 구제역 O형 마니사 바이러스에 대한 재조합 바이러스를 이용하여 SEA 지역형 바이러스에 대한 방어 단백질 유전자가 삽입시킨 게놈의 모식도이다.
도 3은 제작된 플라스미드로부터 회복된 구제역 바이러스가 세포에서 바이러스 군락(플라크)을 이루는 것을 나타내는 사진이다. A는 01 마니사 바이러스의 군락, B는 O-SEA-Andong P1 바이러스의 군락을 나타낸다.
도 4는 제작된 바이러스에서 발현된 단백질에 대하여 간이 항원 키트로 구제역 항원 양성반응을 확인한 것을 나타내는 사진이다.
도 5는 본 발명에 따른 재조합 바이러스로 제작된 백신을 돼지에 접종한 후 중화 항체 형성을 나타내는 그래프이다.

본 발명은 구제역 O 혈청형-동남아(SEA) 지역형의 재조합 바이러스에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 실험실 내에서 구제역 바이러스 유전자를 클로닝하고, 유전자 조작 후 재조합 구제역 바이러스를 인위적으로 회복시켜 백신 생산을 위한 종독 바이러스에 관한 것이며, 이러한 바이러스를 이용하여 O 혈청형-SEA 지역형(중국, 동남아, 대만 등지에서 발생되는 구제역 지역형)에 대해 방어할 수 있는 구제역 백신을 제작할 수 있다.

본 발명은 O형 캐세이 지역형에 대하여 어느 정도 안전성이 확보된 구제역 백신을 제작하기 위하여, 돼지에서 병원성이 낮은 바이러스를 기초로 SEA-P1 부위를 발현하도록 바이러스를 제작하였다.

한편, 구제역 바이러스 O형 마니사(Manisa) 주는 O형 백신에서 가장 널리 쓰이는 백신 바이러스로 알려져 있으며, ME-SA(중동-남미지역형, PanAsia 계열을 포함함)의 바이러스에 대한 방어가 가능하다. 그러나 또 다른 O 혈청형인 SEA형은 최근 동남아시아를 비롯한 한국에서 대규모 발생을 일으킨 구제역으로, 이 지역형에 효율적으로 방어될 수 있는 적합한 백신의 개발이 필요한 실정이다.

따라서 본 발명에서는 O형 마니사주를 백신 종독주로 이용하여 SEA형을 방어하는 재조합 바이러스를 제작한다. 상세하게는, 구제역 바이러스에 대한 O형 백신주로서 널리 사용되고 있는 O1 마니사 백신 바이러스(특허출원 10-2012-0152084호, 2012.12.24. 출원)를 기초로 하여, O1 마니사 바이러스에서 구조 단백질인 방어 항원(P1)의 전체 유전자를, 동남아시아(South East Asia, SEA) 지역형의 방어 항원 유전자(P1 부위인 VP1, VP2, VP3, VP4 유전자), 특히 한국에서 2010년 11월 발생하여 대규모의 발생을 일으켰던 바이러스 SEA 지역형의 방어 항원 유전자(P1 부위)로 교체하여 외피 항원을 바꿈으로써, SEA 지역형에 방어할 수 있는 바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 구제역 O 혈청형-동남아(SEA) 지역형의 재조합 바이러스를 포함하는 구제역 예방용 백신에 관한 것이다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.

[실시예 1] 구제역 바이러스의 분리

구제역 바이러스는 한국에서 2010년 11월 구제역에 감염된 돼지의 수포액으로부터 분리(SEA 지역형)를 하였으며, 하기 실험에서는 이와 같이 분리된 바이러스를 O/Andong/SKR/2010로 명명하고 이 바이러스의 방어 유전자인 P1 부위를 사용하였다.

[실시예 2] 재조합 바이러스의 제작

구제역 바이러스 유전자가 클로닝되어 있는 플라스미드(pOmanisa)를 기초로 SEA 지역형 바이러스의 방어 유전자 부위(P1)를 삽입 대체하여 플라스미드(pOm-SEA-Andong P1)를 제작하였다. 구제역바이러스 O-SEA 방어 단백질 유전자가 삽입된 플라스미드의 모식도는 도 1에 제시되어 있으며, 구제역 O형 마니사 바이러스에 대한 재조합 바이러스의 게놈 모식도는 도 2에 제시되어 있다.

구체적인 제작 방법은, Toyobo 돌연변이유발 키트(KOD-Plus-Mutagenesis Kit; TOYOBO, Osaka, Japan)를 이용하여 SEA 지역형 바이러스의 방어 유전자 부위(P1)를 증폭하였다. 프라이머(Andong_P1F, 5‘-GGAGCCGGACAATCCAGTCCGGCTAC-3’(서열번호 2); 및 Andong_P1R, 5‘-CTGCTTTACAGGTGCCACTATTTTCTG-3’(서열번호 3))를 이용한 PCR은 5X 버퍼(FINNZYMES, 10μl), 10mM dNTPs(1μl), Phusion 효소(2U/μl, 0.5μl), 멸균증류수(35.5μl)의 용량으로 98℃에서 30초 후, 98℃에서 10초, 65℃에서 30초, 72℃에서 2분 30초간 25사이클, 그리고 최종 72℃에서 10분의 조건 하에서 반응을 실시하였다.

또한, Omanisa 유전자에서 P1 유전자가 제거된 벡터를 PCR에 의하여 증폭하였다. 프라이머(O1m_2AF, 5‘-CTTCTAAATTTTGACCTGCTCAAATTGGCG-3’(서열번호 4); 및 O1m_LbR 5‘-CTTGAGCCTTTTCTGGACCTTTGTTTTCCA-3’(서열번호 5))를 이용한 PCR 조건은 5X 버퍼(FINNZYMES, 10μl), 10mM dNTPs(1μl), Phusion 효소(2U/μl, 0.5μl), 멸균증류수(35.5μl)의 용량으로 98℃에서 30초 후, 98℃에서 10초, 65℃에서 30초, 72℃에서 2분 30초간 25사이클, 그리고 최종 72℃에서 10분의 조건 하에서 반응을 실시하였다.

그 후 증폭된 P1 유전자와의 결찰반응(TAKARA Long Ligation kit)을 수행하였으며, 최종적으로 전체 염기서열 분석을 통하여 적절히 클로닝(pOmanisa-SEA P1)된 것을 확인하였다.

또한 제한효소 NdeI를 이용하여 유전자를 선형으로 절단한 다음, 그 유전자를 BHK-T7-9세포(T7 폴리머라제가 발현되는 세포)에 리포펙타민(lipofectamin, GibcoBRL) 형질도입 킷트를 이용하여 킷트가 제시하는 방법으로 유전자를 도입 후 배지를 첨가하고 37℃에서 2일간 배양 후 ZZ-R(염소 태아혀세포) 세포에서 37℃에서 2일간 배양하는 것을 3회 이상 반복한 다음 세포변성 효과를 관찰한 후, 최종적으로 생산된 바이러스를 채독하였다.

[시험예 1] 바이러스 증식 확인

상기 실시예 1에서 제작된 플라스미드로부터 구제역 바이러스가 회복되어 세포에서 바이러스가 성공적으로 증식하는지 여부를 확인하였다.

구체적으로, LFBK(소 신장세포)를 이용하여 채독된 바이러스를 1시간 접종 후 세척하고 군락의 확인을 위해 Seaplague 아가를 배양배지와 혼합하고 도포하여 1일간 배양한 후 바이러스의 플락을 확인하였으며, 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3을 보면, 상기 실시예 1에서 재조합하여 얻은 O-SEA-Andong P1(도 3의 B)의 경우가 원래의 O1 마니사 바이러스(도 3의 A)보다 바이러스 군락이 더 큰 표현형으로 나타남을 확인할 수 있다.

[시험예 2] 항원성 평가

상기 실시예 2에서 제작한 재조합 바이러스에서 발현된 단백질에 배양 상층액 25μl를 넣어 항원 간이진단키트(BioSign FMDV Ag, PBM 사, 미국)로 항원성을 평가하였다. 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 제작한 바이러스에서 발현된 단백질은 항원 양성 반응을 나타내었다.

[시험예 3] 바이러스 역가 측정 및 공격 접종 후 백신의 효과

상기 실시예 2에서 제작한 재조합 바이러스로 제작된 백신, 즉 10⁷ 이상의 TCID50 역가를 갖고 이중 오일(double oil emulsion)인 ISA206(Seppic, 프랑스)을 혼합한 오일 백신을 제작하고, 이 백신 2ml를 돼지 3마리의 목 근육에 접종하였다. 세계동물보건기구(OIE)에서 제시된 실험 메뉴얼(www.oie.int)에 따라 접종 이후 1주일 간격으로 혈청을 채취하여 O/Andong/SKR/2010 바이러스에 대한 2회 반복조건으로 혈청의 2배 계단희석으로 세포변성효과를 관찰함으로써 중화항체 수준을 측정하였으며, 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5를 보면, 백신 접종 후 3~4주만에 일반적 방어 항체 수준으로 알려진 32~45배 이상의 항체 형성을 나타냄을 확인할 수 있다.

또한, 백신 접종 후 구제역 바이러스(O/Andong/SKR/2010 바이러스)로 돼지 1마리의 발굽에 0.1ml를 접종하여 증상이 심하게 나오면 2일 후 백신 접종군과 18시간을 접촉 감염시켰다. 공격 접종하여 백신의 효과를 임상증상, 바이러스 배출 및 혈액내 검출 실험을 실시하여 확인 및 관찰하였다. 관찰 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

그룹	돼지 번호	공격 접종 후 임상증상 및 바이러스 검출 (임상증상/바이러스검출-비강액/바이러스검출-혈청 /바이러스분리-혈청)
		공격 후 1일	공격 후 2일	공격 후 3일	공격 후 4일
백신 접종군	No.135	-/-/+/-	-/-/+/-	-/-/+/-	-/-/-/-
	No.136	-/-/-/-	-/-/-/-	-/-/-/-	-/-/-/-
	No.137	-/-/+/-	-/+/-/-	-/-/-/-	-/-/-/-
음성대조	No.138	-/-/+/-	+/+/+/+	+/+/+/+	+/+/+/-

상기 표 1을 보면, 음성 대조군에서는 임상 증상이 보였으나, 백신 접종군에서는 임상 증상이 없었으며, 바이러스 배출도 현저히 줄거나 보이지 않았음을 확인할 수 있다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(Management : Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Foot-and-mouth disease recombinant virus expressing P1-protective antigen of O serotype-SEA topotype, and the viral vaccine comprising the same <130> YPD201302-0067 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 11097 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pOm-SEA-Andong P1 <400> 1 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 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<220> <223> Primer(O1m_LbR) <400> 5 cttgagcctt ttctggacct ttgttttcca 30

Claims (2)

1. 서열번호 1의 염기서열을 갖는 구제역 O 혈청형-동남아(SEA) 지역형의 재조합 바이러스.
2. 제1항의 구제역 O 혈청형-동남아(SEA) 지역형의 재조합 바이러스를 포함하는 구제역 예방용 백신.

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