CN104232604B - 一种多聚半乳糖醛酸酶PG7fn及其基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种多聚半乳糖醛酸酶PG7fn及其基因和应用。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。多聚半乳糖醛酸酶PG7fn最适pH值为5.0，最适温度为60℃；在pH 3.0‑8.0下37℃处理1h还保持90％的酶活力，在50℃下处理1h之后还保持85％的酶活力，这说明此酶具有很好的pH稳定性和热稳定性。利用毕赤酵母表达后，比活高达27,561U/mg。

Description

一种多聚半乳糖醛酸酶PG7fn及其基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种多聚半乳糖醛酸酶PG7fn及其基因和应用。
背景技术
果胶是一类带负电的高分子杂多糖，是果蔬植物细胞中胶层的主要成分，广泛存在于各类高等植物尤其是水果和蔬菜的组织中(Stevenson et al.,1988)。果胶质含有由不同酯化度的D-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键连接而成的多糖链,侧链常带有阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、半乳糖等成分，是非淀粉多糖(NSP)的成分之一。果胶质填充在植物的细胞壁之间，具有使细胞粘合在一起的作用。果胶类物质可分为4类：原果胶(protopectin)、果胶(pectin)、果胶酸(pectic acid,pectate)和果胶酯酸(pectinic acid,pectinate)。果胶作为细胞初生壁中间层结构的主要成分，它与纤维素、半纤维素一起构成一个植物细胞阻挡外界的坚韧屏障(O'Neill et al.,2004)，所以在很多工业生产中果胶是一种不利因素需要去除，而果胶酶则能有效降解果胶。
在众多的果胶酶系中，多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase)是降解果胶骨架结构的主要酶种之一，同时也是果蔬汁加工中应用最为广泛的酶。根据消去半乳糖醛酸的方式不同，多聚半乳糖醛酸酶分为内切PG酶(EC3.2.1.15)和外切PG酶(EC3.2.1.67)两种。内切PG酶能随机地从多聚半乳糖醛酸链内部打开α-1,4糖苷键，产生聚合度为10—14的寡聚半乳糖醛酸。内切PG酶的水解作用可使果汁溶液的澄清度提升，粘度显著下降，产生强烈的解聚降粘作用，是目前商品化复合果胶酶系中的主要组成酶种。
发明内容
本发明的目的是提供一种能高效应用的多聚半乳糖醛酸酶。
本发明的再一目的是提供编码上述多聚半乳糖醛酸酶的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供一种制备上述多聚半乳糖醛酸酶的基因工程方法。
本发明从Thielavia arenaria XZ7中分离得到一种多聚半乳糖醛酸酶PG7fn，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
MILSTLVLSLGALAAANPVPANSNLSKRASCTFTDATSAISGKKSCSTITLKDITVPAGTTLDLTKLNDGTKVIFSGTTTFGYKEWEGPLISVSGNNILVEGATGHVIDGNGAKWWDGKGSNGGKTKPKFFYAHSMKNSNIKGLHVKNTPVQAFSINGATNLGVYDVSLDNSAGDSAGGHNTDAFDVGSSNGVYISGAVVKNQDDCLAINSGTNITFTGGKCSGGHGLSIGSVGGRSDNTVKTVRILNSSISNSQNGVRIKTVYGATGSVSDVKYEGITLSGITKYGVVIEQDYENGSPTGTPTAGVPITDLTLNGVTGSVSSGATEVYILCAKGACKNWTWNKVSVTGGKKSAKCENVPSPASC
该酶包括365个氨基酸，N端16个氨基酸为信号肽序列。
因此，成熟的多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
NPVPANSNLSKRASCTFTDATSAISGKKSCSTITLKDITVPAGTTLDLTKLNDGTKVIFSGTTTFGYKEWEGPLISVSGNNILVEGATGHVIDGNGAKWWDGKGSNGGKTKPKFFYAHSMKNSNIKGLHVKNTPVQAFSINGATNLGVYDVSLDNSAGDSAGGHNTDAFDVGSSNGVYISGAVVKNQDDCLAINSGTNITFTGGKCSGGHGLSIGSVGGRSDNTVKTVRILNSSISNSQNGVRIKTVYGATGSVSDVKYEGITLSGITKYGVVIEQDYENGSPTGTPTAGVPITDLTLNGVTGSVSSGATEVYILCAKGACKNWTWNKVSVTGGKKSAKCENVPSPASC
信号肽序列为MILSTLVLSLGALAAA(SEQ ID NO.3).
本发明提供了编码上述多聚半乳糖醛酸酶基因PG7fn，具体地，该基因的基因组序列(含有两个内含子)如SEQ ID NO.4所示。
ATGATCTTGTCCACCCTCGTTCTTTCTCTCGGCGCCCTTGCGGCAGCCAATCCGGTCCCTGCCAACTCCAACTTGTCCAAGAGAGCTAGCTGCACCTTTACTGACGCCACATCGGCCATCAGCGGCAAGAAGAGCTGCAGCACCATCACCCTGAAGGATATTACGGTCCCGGCTGGAACCACCTTGGACCTGACCAAGCTGAACGACGGCACAAAGGTCATCTTCTCTGGGACCACCACGTTCGGCTACAAGGAGTGGGAGGGTCCCCTGATTTCTGTTTCTGGAAACAACATCCTTGTGGAGGGCGCCACAGGTCATGTCATTGACGGCAACGGAGCCAAGTGGTGGGATGGCAAGGGCAGCAACGGTGGCAAGACGAAGCCTAAGTAGGGGTGTCCAGTCTTTGTTCAGATCAAAATCGCAACTAATCATCTCCCAGATTCTTCTACGCCCATAGCATGAAGAACTCCAACATCAAAGGCCTCCATGTTAAGAACACGCCCGTTCAGGCCTTCAGCATCAACGGTGCCACAAACCTCGGGGTGTAAGTTACAGCCCAAGTGTGATATATAGCACCCCGCAGGGTCTCCAGTTGGGACTAACATGAAGAAACAGCTACGACGTCAGTCTTGACAACTCGGCCGGCGACAGTGCCGGTGGCCACAACACGGACGCATTCGACGTCGGATCCTCCAACGGTGTCTACATCTCTGGCGCCGTGGTGAAGAACCAGGACGACTGCCTGGCCATCAACTCAGGCACCAACATCACCGTATGTTTTCTTTTACCCCTCAAACTTGACAACCCCCTTACCCAGCTCCTAACCCCAACATCTGGCAGTTTACCGGCGGCAAATGCAGCGGCGGCCACGGCCTCTCGATCGGCTCCGTCGGGGGCCGATCCGACAACACGGTCAAAACAGTACGCATCCTCAACTCGTCCATCAGCAACTCGCAGAACGGTGTGCGCATCAAGACGGTGTATGGCGCGACGGGGTCTGTCTCGGACGTGAAGTACGAGGGTATCACGCTGTCCGGCATTACCAAGTACGGTGTGGTTATCGAGCAGGACTATGAGAATGGCTCCCCCACGGGCACACCCACTGCGGGCGTTCCGATTACGGATCTGACGCTGAATGGCGTTACGGGGAGTGTGAGTTCCGGTGCGACAGAGGTGTATATCCTCTGTGCTAAGGGGGCTTGCAAGAATTGGACTTGGAATAAGGTCAGTGTTACGGGCGGGAAGAAGTCGGCTAAGTGTGAGAATGTGCCTAGTCCGGCATCTTGCTAG
该基因的cDNA序列如SEQ ID NO.5所示。
ATGATCTTGTCCACCCTCGTTCTTTCTCTCGGCGCCCTTGCGGCAGCCAATCCGGTCCCTGCCAACTCCAACTTGTCCAAGAGAGCTAGCTGCACCTTTACTGACGCCACATCGGCCATCAGCGGCAAGAAGAGCTGCAGCACCATCACCCTGAAGGATATTACGGTCCCGGCTGGAACCACCTTGGACCTGACCAAGCTGAACGACGGCACAAAGGTCATCTTCTCTGGGACCACCACGTTCGGCTACAAGGAGTGGGAGGGTCCCCTGATTTCTGTTTCTGGAAACAACATCCTTGTGGAGGGCGCCACAGGTCATGTCATTGACGGCAACGGAGCCAAGTGGTGGGATGGCAAGGGCAGCAACGGTGGCAAGACGAAGCCTAAATTCTTCTACGCCCATAGCATGAAGAACTCCAACATCAAAGGCCTCCATGTTAAGAACACGCCCGTTCAGGCCTTCAGCATCAACGGTGCCACAAACCTCGGGGTCTACGACGTCAGTCTTGACAACTCGGCCGGCGACAGTGCCGGTGGCCACAACACGGACGCATTCGACGTCGGATCCTCCAACGGTGTCTACATCTCTGGCGCCGTGGTGAAGAACCAGGACGACTGCCTGGCCATCAACTCAGGCACCAACATCACCTTTACCGGCGGCAAATGCAGCGGCGGCCACGGCCTCTCGATCGGCTCCGTCGGGGGCCGATCCGACAACACGGTCAAAACAGTACGCATCCTCAACTCGTCCATCAGCAACTCGCAGAACGGTGTGCGCATCAAGACGGTGTATGGCGCGACGGGGTCTGTCTCGGACGTGAAGTACGAGGGTATCACGCTGTCCGGCATTACCAAGTACGGTGTGGTTATCGAGCAGGACTATGAGAATGGCTCCCCCACGGGCACACCCACTGCGGGCGTTCCGATTACGGATCTGACGCTGAATGGCGTTACGGGGAGTGTGAGTTCCGGTGCGACAGAGGTGTATATCCTCTGTGCTAAGGGGGCTTGCAAGAATTGGACTTGGAATAAGGTCAGTGTTACGGGCGGGAAGAAGTCGGCTAAGTGTGAGAATGTGCCTAGTCCGGCATCTTGCTAG
去除信号肽序列后核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
AATCCGGTCCCTGCCAACTCCAACTTGTCCAAGAGAGCTAGCTGCACCTTTACTGACGCCACATCGGCCATCAGCGGCAAGAAGAGCTGCAGCACCATCACCCTGAAGGATATTACGGTCCCGGCTGGAACCACCTTGGACCTGACCAAGCTGAACGACGGCACAAAGGTCATCTTCTCTGGGACCACCACGTTCGGCTACAAGGAGTGGGAGGGTCCCCTGATTTCTGTTTCTGGAAACAACATCCTTGTGGAGGGCGCCACAGGTCATGTCATTGACGGCAACGGAGCCAAGTGGTGGGATGGCAAGGGCAGCAACGGTGGCAAGACGAAGCCTAAATTCTTCTACGCCCATAGCATGAAGAACTCCAACATCAAAGGCCTCCATGTTAAGAACACGCCCGTTCAGGCCTTCAGCATCAACGGTGCCACAAACCTCGGGGTCTACGACGTCAGTCTTGACAACTCGGCCGGCGACAGTGCCGGTGGCCACAACACGGACGCATTCGACGTCGGATCCTCCAACGGTGTCTACATCTCTGGCGCCGTGGTGAAGAACCAGGACGACTGCCTGGCCATCAACTCAGGCACCAACATCACCTTTACCGGCGGCAAATGCAGCGGCGGCCACGGCCTCTCGATCGGCTCCGTCGGGGGCCGATCCGACAACACGGTCAAAACAGTACGCATCCTCAACTCGTCCATCAGCAACTCGCAGAACGGTGTGCGCATCAAGACGGTGTATGGCGCGACGGGGTCTGTCTCGGACGTGAAGTACGAGGGTATCACGCTGTCCGGCATTACCAAGTACGGTGTGGTTATCGAGCAGGACTATGAGAATGGCTCCCCCACGGGCACACCCACTGCGGGCGTTCCGATTACGGATCTGACGCTGAATGGCGTTACGGGGAGTGTGAGTTCCGGTGCGACAGAGGTGTATATCCTCTGTGCTAAGGGGGCTTGCAAGAATTGGACTTGGAATAAGGTCAGTGTTACGGGCGGGAAGAAGTCGGCTAAGTGTGAGAATGTGCCTAGTCCGGCATCTTGCTAG
其中，信号肽的基因序列如SEQ ID NO.7所示。
ATGATCTTGTCCACCCTCGTTCTTTCTCTCGGCGCCCTTGCGGCAGCC
本发明还提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的重组载体，优选为pPIC9r-PG7fn。
本发明还提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。
本发明还提供了一种制备高比活多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的方法，包括以下步骤：
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组多聚半乳糖醛酸酶表达；
3)回收并纯化所表达的多聚半乳糖醛酸酶PG7fn。
此低温多聚半乳糖醛酸酶的理论分子量为37.4kDa。该多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的最适pH为5.0,在pH4.0～5.5的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的70％以上。多聚半乳糖醛酸酶PG7fn在pH 3.0-8.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性近90％，这说明此酶具有较好的pH稳定性；最适温度60℃，在40℃-65℃范围内，酶活性均维持在最大酶活性的60％以上。多聚半乳糖醛酸酶PG7fn在50℃下处理60min后剩余酶活性在85％以上，这说明此酶具有很好的热稳定性。利用毕赤酵母表达后，比活高达27,561U/mg。
本发明还提供了编码上述多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的基因PG7fn。
本发明通过PCR的方法分离克隆了这一多聚半乳糖醛酸酶基因PG7fn，DNA全序列分析结果表明，多聚半乳糖醛酸酶PG7fn结构基因PG7fn全长1098bp,编码365aa和一个终止密码子，N端16个氨基酸预测为信号肽序列。蛋白理论分子量为37.4kDa，等电点为8.78，有一个第二十八家族的催化结构域。在GenBank中的比对结果表明PG7fn是一个新的内切多聚半乳糖醛酸酶。
本发明还提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶基因的重组载体，优选为pPIC9r-PG7fn。将本发明的多聚半乳糖醛酸酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将多聚半乳糖醛酸酶基因插入到质粒pPIC9r上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pPIC9r-PG7fn。
本发明还提供了包含上述多聚半乳糖醛酸酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/PG7fn。
本发明还提供了一种制备多聚半乳糖醛酸酶的方法，包括以下步骤：
1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组多聚半乳糖醛酸酶的表达；
3)回收并纯化所表达的多聚半乳糖醛酸酶。
其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞GS115，得到重组菌株GS115/PG7fn。
附图说明
图1：在毕赤酵母中表达的重组多聚半乳糖醛酸酶的SDS-PAGE分析，其中，M:低分子量蛋白质Marker；1:去糖基化处理的酶液；2:纯化的酶液。
图2：重组多聚半乳糖醛酸酶的最适pH。
图3：重组多聚半乳糖醛酸酶的pH稳定性。
图4：重组多聚半乳糖醛酸酶的最适温度。
图5：重组多聚半乳糖醛酸酶的热稳定性。
图6：用HPAEC对重组多聚半乳糖醛酸酶以PGA为底物时的产物分析。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：表达宿主Pichia pastoris GS115，表达质粒载体pPIC9r为本实验室保存。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司，多聚半乳糖醛酸购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
(1)LB培养基(g/l)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0,pH7.0。
(2)平板筛选培养基(g/l)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0,琼脂15.0，pH7.0。
实施例1沙栖梭孢壳XZ7来源的多聚半乳糖醛酸酶编码基因PG8fn的克隆
提取基因组DNA及RNA。根据第二十八家族内切多聚半乳糖醛酸酶真菌基因的保守[NQDDCL(V)A和NGVRI(V)KT]序列设计合成了简并引物G28n-F和G28n-R：
G28n-F：5'-GAACCARGAYGAYTGYSTIGC-3'；
G28n-R：5'-GGTCTTNAYNCKNACICCRTT-3'
以上述的沙栖梭孢壳XZ7基因组DNA为模板进行PCR扩增。降落PCR反应参数为：94℃变性5min；94℃变性30sec，51-46℃退火30sec，72℃延伸1min，10个循环(每个循环降落0.5℃)，然后94℃变性30sec，46℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，72℃保温10min。得到一约180bp片段，将该片段回收后与连接pEASY-T3载体送三博生物技术有限公司测序。
根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般20～30nt，退火温度在61℃。并将它们分别命名为7fn-uSP1,7fn-uSP2,7fn-uSP3(上游特异性引物)；
7fn-dSP1,7fn-dSP2,7fn-dSP3(下游特异性引物)见表1。按照改进的TAIL-PCR中的程
序对两端侧翼序列进行扩增。
表1.多聚半乳糖醛酸酶PG8fn TAIL-PCR特异性引物
通过改进的TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。通过序列拼接获得该片段的上下游侧翼序列，全序列共长约1.3kb。再以cDNA为模板，8fn-m-F/R引物进行PCR扩增，将得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。多聚半乳糖醛酸酶基因PG7fn完整的开放阅读框(ORF)由1098个碱基组成，编码365个氨基酸和一个终止密码子，在GenBank中的比对结果表明为新基因。PG8fn编码蛋白预计分子量为37.4kDa，等电点为8.78PG8fn前16个氨基酸为信号肽序列。
实施例2多聚半乳糖醛酸酶的制备。
将表达载体pPIC9r进行双酶切(EcoR I+Not I)，同时将编码多聚半乳糖醛酸酶的基因PG7fn双酶切(EcoR I+Not I)，切好的编码成熟多聚半乳糖醛酸酶的基因片段(去除信号肽片段)与表达载体pPIC9r连接，获得含有多聚半乳糖醛酸酶基因PG7fn的重组质粒pPIC9r-PG7fn并转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株GS115/PG7fn。
取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mL BMGY培养基的1L三角瓶中，置于30℃，220rpm摇床培养48h；后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用100mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5mL甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，同时取上清用于酶活性检测。
重组多聚半乳糖醛酸酶的表达量为10,947.3U/mL，比活高达27,561U/mg。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组多聚半乳糖醛酸酶在毕赤酵母中得到了表达。所表达的多聚半乳糖醛酸酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的95％以上。
将含有信号肽的基因以同样方法进行表达，也检测到多聚半乳糖醛酸酶的酶活。
实施例3重组多聚半乳糖醛酸酶的活性分析
一、DNS法：具体方法如下：在给定的pH、温度条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下，每分钟分解多聚半乳糖醛酸生成1μmolD-(+)-半乳糖醛酸所需的酶量。
二、重组多聚半乳糖醛酸酶的性质测定
1、重组多聚半乳糖醛酸酶的最适pH和pH稳定性的测定方法如下:
将实施例3纯化的重组多聚半乳糖醛酸酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物多聚半乳糖醛酸用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中45℃下进行多聚半乳糖醛酸酶活力测定。结果(图2)表明，PG7fn的最适pH为5.0,在pH4.0-5.5的范围内，酶活性均维持在最大酶活性的70％以上。多聚半乳糖醛酸酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min,再在pH5.0缓冲液体系中最适温度下测定剩余酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图3)表明，在pH 3.0-8.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性近90％，这说明此酶具有较好的pH稳定性。
2、多聚半乳糖醛酸酶的最适温度及热稳定性测定方法如下:
多聚半乳糖醛酸酶的最适温度的测定为在0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为多聚半乳糖醛酸酶在不同温度下处理不同时间，再在最适条件下进行剩余酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图4)表明,其最适温度为60℃。酶的热稳定性试验表明(图5)，重组酶在50℃时稳定性非常好，处理60min后，剩余酶活性为85％。
3、多聚半乳糖醛酸酶的Km值测定方法如下:
参照本实验室李宁的方法(李宁,2009)，测定反应的一级反应时间。确定测定Km及Vmax的反应时间为5min。用不同浓度的多聚半乳糖醛酸(12.5，10，8，6，4，2，1.5，1，0.5，0.1mg/ml)为底物，在最适条件下测定酶活性，计算出相应的反应速度，利用GraphPadPrism 5软件计算Km值及Vmax。
PG7fn以多聚半乳糖醛酸为底物时，在最适条件下的Km值、Vmax值分别是1.5mg/mL和50,000μmol/min/mg。
4、不同金属离子化学试剂对PG7fn酶活的影响测定如下:
在酶促反应体系中加入1mM的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在60℃、pH5.0条件下测定酶活性。结果(表3)表明，除了Ag+对酶活有强烈的抑制作用外，其它离子对该酶的作用不明显，表明PG7fn有着良好的金属离子和化学试剂抗性。
表2.各种金属离子和化学试剂对PG7fn活力的影响
5、重组多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的底物特异性。
纯化后重组酶底物特异性的测定是通过纯酶液与各种甲酯化的果胶(P9311，DM:34％；P9436，DM:70％；P9561,DM:85％)在最适反应条件下测定相对酶活力来完成的。以多聚半乳糖醛酸作为底物所测得的相对活性定义为100％。
以多聚半乳糖醛酸的相对酶活为100％，同等条件下，PG I对各种甲酯化的果胶(P9311，DM:34％；P9436，DM:70％；P9561,DM:85％)的酶活分别为61.81％,30.77％和6.99％。这说明甲酯化程度越高，酶对底物的降解变弱。
6、多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的产物分析如下：
在多聚半乳糖醛酸底物中加入适量重组酶，在最适pH下37℃保温12h。用3kDa超滤管超滤去除酶和未降解的底物。将超滤液进行高效离子交换色谱层析(HPAEC)产物分析。
产物分析发现，PG7fn在较长反应时间下，可以将底物完全降解成半乳糖醛酸、二聚半乳糖醛酸和三聚半乳糖醛酸(图6)，通过序列比对和结构分析，以及参照其酶活力的大小，将其归类为内切型多聚半乳糖醛酸酶。

Claims (10)

1.一种多聚半乳糖醛酸酶PG7fn，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。
2.一种多聚半乳糖醛酸酶基因PG7fn，其特征在于，其编码权利要求1所述的多聚半乳糖醛酸酶PG7fn。
3.一种多聚半乳糖醛酸酶基因PG7fn，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
4.包含权利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶基因PG7fn的重组载体。
5.包含权利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶基因PG7fn的重组载体pPIC9r-PG7fn，其特征在于，通过将权利要求2所述的多聚半乳糖醛酸酶基因PG7fn插入到质粒pPIC9r上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，得到重组载体pPIC9r-PG7fn。
6.包含权利要求2所述多聚半乳糖醛酸酶基因PG7fn的重组菌株。
7.如权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，其所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。
8.根据权利要求7所述的重组菌株，所述重组菌株为重组毕赤酵母菌株GS115/PG7fn。
9.权利要求1所述多聚半乳糖醛酸酶PG7fn用于降解果胶的应用。
10.一种制备权利要求1所述多聚半乳糖醛酸酶PG7fn的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)用权利要求4所述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组多聚半乳糖醛酸酶表达；
3)回收并纯化所表达的多聚半乳糖醛酸酶PG7fn。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN108239649A (zh) * 2018-01-18 2018-07-03 广东利世康低碳科技有限公司 一种重组内切聚半乳糖醛酸酶及其基因pgaA与应用
CN109694859B (zh) * 2019-01-10 2020-11-06 齐鲁工业大学 一种嗜热果胶酶及其表达基因与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1212012A (zh) * 1996-03-01 1999-03-24 诺沃挪第克公司 具有半乳聚糖酶活性的酶
CN1240478A (zh) * 1996-12-20 2000-01-05 诺沃挪第克公司 一种新的内切葡聚糖酶

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1212012A (zh) * 1996-03-01 1999-03-24 诺沃挪第克公司 具有半乳聚糖酶活性的酶
CN1240478A (zh) * 1996-12-20 2000-01-05 诺沃挪第克公司 一种新的内切葡聚糖酶

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AIZ95162.1;Tu,T.,et al;《Genbank》;20150330;全文 *
Molecular Characterization of a Thermophilic Endopolygalacturonase from Thielavia arenaria XZ7 with High Catalytic Efficiency and Application Potential in the Food and Feed Industries;Tao Tu,et al;《J. Agric. Food Chem》;20141210;第62卷;12686−12694 *

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