DD274053A5 - Verfahren zur Produktion eines menschlichen, einkettigen Plasminogenaktivators - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Methode zur Produktion eines menschlichen, einkettigen Plasminogenaktivators des Urokinasetyps oder dessen Mutanten. Neuartige Humanplasminogenaktivatoren des Urokinasetyps werden durch Hefezellen produziert, die mit einem Hybridvektor transformiert wurden, der aus einer DNA-Folgekodierung fuer den genannten Humanplaminogenaktivator besteht. Beschrieben werden auch neuartige Hybridvektoren, mit diesen Hybridvektoren transformierte Hefewirte und Verfahren fuer deren Herstellung.

Description

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Berlin, den 2. 8. 1988 703 11/11

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung wird auf dem Gebiet der Biochemie angewandt. Sie betrifft ein neuartiges Verfahren für die Herstellung von Proteinen·

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Urokinase oder ein Plasmogenaktivator des Urokinasetyps (nachstehend als "u-PA" bezeichnet) ist eine Serinprotease, welche Plasmogen durch proteolytische Spaltung in Plasmin aktiviiert. Plasmin ist eine starke Protease, die in der Lage ist, das Fibrinnetz von Blutgerinnseln abzubauen, um lösliche Abbauprodukte zu bilden.

u-PA wurde zuerst aus menschlichem Urin isoliert, und es ist bekannt, daß dieser durch gezüchtete Nierenzellen und einige Tumurzellstämme sekretiert wird. Er wird anfangs als ein einkettji'es Molekül (nachstehend als "scu-PA" bezeichnet) produziert und kann durch die Wirkung von Plasmin proteolytisch in eine Zweikettenform (nachstehend als "tcu-PA" bezeichnet) umgewandelt werden, in welcher die beiden Ketten durch eine Disulfid· brücke aneinander gebunden bleiben. u-PA hat eine einzigartige Glykosylationastelle bei Asn302.

Da scu-PA nur eine geringe amidolytische Aktivität gegenüber synthetischen Substraten mit niedrigem Molekulargewicht hat, wurde er bis vor kurzem als ein echter, proteolytisch

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inaktiver Vorläufer des aktiven Enzyms tcu-PA betrachtet. Ergebnisse aus jüngerer Zeit aber beweisen, daß scu-PA wirksam Plasminogen zu Plasmin aktiviert und eine erheblich höhere Selektivität für Fibrin als tcu-PA hat (siehe Lijnen, H. R., u. a., J. Biol. Ghem. 26i_, 1253 (1986)). Die Mechanismen der überraschenden fibrinolytischen Aktivität und der Thrombusspezifizität von scu-PA wurden untersucht (Li,jnen u. a., ebenda; Collen, D., u. a., J. Biol. Chem. 261, 1259 (1986)). Es wurde nachgewiesen, daß scu-PA kein ine.ktives Zymogen ist, sondern Plasminogen aktiviert, ohne vorher in tcu-PA umgewandelt zu sein. Im Gegensatz zu tcu-PA wird scu-PA durch eine noch unbekannte Plasmakomponente konkurrierend gehemmt, wobei diese Hemmung oder Inhibition durch Fibrin oder Fibrinfragmente, d. h., am Thrombus, umgekehrt wird. Zirkuliert dieser scu-PA unter in vivo-Bedingungen im Blut, aktiviert er also das Plasminogen nicht. Seine fibrinolytische Aktivität bleibt auf sein eigentliches Ziel beschränkt. Dagegen ist tcu-PA in der Lage, Plasminogen an jedem Punkt innerhalb des Kreislaufsystems zu aktivieren, was zu unerwünschten Nebenwirkungen wie Blutungen führt. Diese Eigenschaften machen scu-PA zum bevorzugten Plasminogenaktivator des Urokinasetyps.

Mit der Entwicklung der Rekombinant-DNA-Technologie ist es nun möglich geworden, Proteine wie scu-PA im industriellen Maßstab zu produzieren. Ausgehend von der bekannten Struktur der genomischen u-PA-DNA (Riccio, A. u. a., Nucleic Acids Research Q₁ 2759 (1985)) und der u-PA-cDNA (Holmes, W. E. u. a., Biotechnology J3> 923 (1985)), wurden Verfahren für die Produktion von scu-PA in der Fachliteratur be-

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schrieben, welche die Rekombinant-DNA-Technologie nutzen. So wurde die Expiession in E. coli erreicht von Holmes, W. E. u. a. (ebenda), Jacobs, P. u. a. (DNA 4, 139 (1985)), Winkler, M. E. u. a. (Biochemistry 2£, 404I (1986)), Nagai, M. u. a. (Gene JMS, 183 (1985)) 5 siehe auoh belgische PS 900 826, japanische PS 61 181 377 und europäische Patentanmeldung 92 182. Die Expression von scu-PA in tierischen Zellen wird in de.i europäischen Patentanmeldungen 92 182 und 154 272 offengeigt. Alle diese bekannten Verfahren weisen jedoch schwerwiegende Nachteile auf: es hat sich als schwierig erwiesen, tierische Zellen im großen. Maßstab zu züchten, was eine Voraussetzung für die billige und gewinnbringende Herstellung von Proteinen, die durch diese Zellen produziert werden, ist. Die Generationszeit der tierischen Zellen legt wesentlich über der für Mikroorganismen, so daß eine längere Fermentierungsperiode notwendig ist, um eine ausreichend hohe Zelldichte zu erreichen. Die Zelldichte wiederum, die bei der Züchtugn von -cierischen Zellen erreichbar ist, ist wesentlich niedriger als die Zelldichte, die im allgemeinen bei der Züchtung von Mikroorganismen im großen Maßstab erreicht wirft. Außerdem ist es im Vergleich zu Mikroorganismen schwierig, Stammverbesserungen zu erreichen. Andererseits werden in den Proteinpräparationen aus E. coli oft komtaminierende Endotoxine gefuiden. Sie müssen durch kostspielige und zeitraubende Reinigungsschritte entfernt werden. Proteine, die durch E.coli produziert werden, sind notwendigerweise unglykosyliert, da den E. coli das enaymatische System fehlt, das für die Bindung der Kohlehydratketten an die entsprechenden Stellen im Proteinmolekül verantwortlich ist. Der Rekombinant-scu-PA ist daher im Gegensatz zum natürlichen scu-PA unglykolysiert, wenn er durch

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E. coli produziert wird. Es wurde berichtet, daß durch Ej_ coli produzierte acu-PA auf Grund der unvollständigen Ausrichtung der Disulfidbrücken und einer inkorrekten Faltung des Proteins als ein amorphe3, unlösliches Polymer existieren. Polglich ist wenigstens ein zusätzlicher Faltungsschritt unter Einbeziehung großer Mengen an Lösungsmittel notwendig, um ein biologisch aktives Protein zu erhalten (Winkler, M. E., u. a., siehe oben).

Ziel der Erfindung

Betrachtet man die Nachteile der bekannten Verfahren, besteht noch immer die Notwendigkeit verbesserter Methoden, welche iie Produktion von biologisch aktiven uid scu-PA im großen Maßstab möglich machen» Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, solche Methoden zu schaffen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neuartiges Verfahren zur Herstellung der genannten Proteine bereitzustellen.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung von Proteinen, insbesondere Serinproteasen des Urokinasetypn. Dieses Verfahren schließt den Einsatz von gentechnisch behandelten Hefe stammen ein. Die Erfindung betrifft außerdem neuartige Proteine des Urokinasetyps, DNAs zur Kodierung solcher Proteine,j Hybridvektoren, welche diese DNAs enthalten, ebenso wie gentechnisch behandelte Hefestamme und Verfahren für die Herstellung der genannten DNAs, Hybridvektoren und Hefestämme«

Ea wurde überraschenderweise festgestellt, daß Hefezellen, die mit einem Hybridvektor transformiert wurden, welcher die Human-u-PA-Kodierungsfolge, gebunden an die Signalfolge eines Hefegens, trägt, scu-PA produzieren, die eine biologische Aktivität haben, welche der von natürlichen scu-PA gleichwertig ist und hefespezifiach glykolysiert ist. Es muß erwähnt werden, daß Hefe-acu-PA vollständig aktiv ist, ohne das in vitro-Faltungaverfahren notwendig wären.

Dementsprechend betrifft die Erfindung eine Methode für die Herstellung eines menschlichen Plaaminogenaktivators des Urokinasetypa und der einkettigen Form oder dessen Mutanten, die darin besteht, unter entsprechenden Nahrungsbedingungen einen Hefestamm zu züchten, der mit einem Hybridvektor transformiert wurde, der aus einer Hefeexpressionskontrollfolge, einem DNA-Segment, das gebildet wird aus einer ersten DNA-

Folge, die ein Signalpeptid oberhalb eines und im einem Leserahmen mit einer zweiten DNA-Folge kodiert, welche den reifen Plasminogenaktivator des Urokinasetyps oder dessen Mutanten kodiert, wobei dieses DNA-Segment unter der Transkriptionskontrolle der genannten Expressionskontrollfolge steht, und einer DNA-Folge besteht, die aus den Transkriptionsterminationssignalen eines Hefegens gebildet wird, und den genannten Plasminogenaktivator des Urokinasetyps oder dessen Mutanten zu isolieren.

Der Begriff "DNA-Folgekodierung für den reifen Plasminogenaktivator des Urokinasetyps" soll alle allelischen Formen von u-PA einschließen, deren Existenz bekannt ist oder die aus dem Humangenom isoliert werden könnnen. Diesen DNA-Folgen fehlen alle Vor- und/oder Nachfolgen.

Mutanten von scu-PA sind vor allem die Mutanten, welche die Proteinprotease resistent machen. Diese scu-PA sind an Stellen von Proteolyse durch im Blut vorkommende Proteasen, wie Thrombin oder Plasmin, zweiwertig modifiziert, so daß sie an diesen Stellen nicht mehr anfällig gegenüber Proteasehydrolyse sind. Zu den Target- oder Zielstellen gehören Lys135 bis Lys136 (Spaltung an dieser Stelle erzeugt die sogenannte niedrigmolekulargewichtige Form von scu-PA oder LUK; siehe Abb. 2 der beigefügten Zeichnungen), Arg156 bis Phel157 (anfällig gegenüber Thrombinangriff) und Lys158 bis Ile159 (Spaltung an dieser Stelle durch Plasmin erzeugt tcu-PA). Geeignete scu-PA-Mutanten haben stellenspezifische Substitutionen, Einfügungen oder Streichungen von Aminosäureresten an einer oder mehreren dieser Targetstellen. Besonders bevorzugt sind die Mutanten, bei denen ein

Aminosäurerest oder beide Aminosäursreste, welche die Targetstellen bilden, gelöscht werden, oder bei denen wenigstens einer dieser Aminosäurereste durch einen anderen Aminosäurer est ersetzt wird, so daß die resultierenden Mutanten gegenüber dem proteolytischen Angriff reaistent sind.

Bei weiteren Mutanten dieser scu-PA wird die einzigartige N-Glykolysationsstelle, die bei Asn³⁰² (Asn^3O2-Ser-Thr) auftritt, so modifiziert, daß an dieser Stelle keine GIykolysation erfolgen kann. Es ist allgemein bekannt, daß eine Voraussetzung für die N-vernetzte Glykolisation in Säugetiei'zellen das Auftreten der Tripeptidfolge -Asn-L-Thr (oder Ser)- ist, worin Asn ein Akzeptor ist und L jede von 20 genetisch verschlüsselten Aminosäuren mit Ausnahme von Prolin- oder Asparaginsäure sein kann, welche die Glykolysation unterbinden,

Wird vorstehend oder nachstehend der Begriff "scu-PA-Proteine" gebraucht, dann soll er scu-PA sowie dessen Mutanten einschließen.

Die Erfindung betrifft insbesondere eine Methode für die Herstellung von scu-PA-Proteinen mit der Formel I

Ser Asn GIu Leu His Gin VaI

Pro Ser Asn Cys Asp Cys Leu Asn GIy GIy Thr Gys VaI Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn lie His Trp Cys Asn Cys Pro Lys Lys Phe GIy GIy Gin His Cys GIu lie Asp Lys Ser Lys Thr Cys Tyr GIu GIy Asn GIy His Phe Tyr Arg GIy Lys AIa Ser Thr Asp Thr Met GIy Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser Ala Thr VaI Leu Gin GIn Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu Gin Leu GIy Leu GIy

Lys His Asn Tyr Cys Arg Aan Pro Asp Asn Arg Arg Arg Pro Trp Cys Tyr VaI Gin VaI GIy Leu Lys Pro Leu VaI Gin GIu Cys Met VaI His Asp Cys Ala Asp GIy X₁ X₂ Pro Ser Ser Pro Pro GIu GIu Leu Lya Phe GIn Cya GIy GIn Lys Thr Leu Arg Pro Y₁ Y₂ Yo lie He GIy GIy GIu Phe Thr Thr He GIu Asn GIn Pro Trp Pho Ala Ala He Tyr Arg Arg His Arg GIy GIy Ser VaI Thr Thr VaI Cys GIy GIy Ser Leu He Ser Pro Cys Trp VaI He Ser AIa Thr His Cys Phe He Asp Tyr Pro Lys Lys GIu Asp Tyr He VaI Tyr Leu GIy Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gin GIy GIu Met Lys Phr GIu VaI GIu Asn Leu He Leu His Ly.3 Asp Tyr Ser AIa Asp Thr Leu Ala His His Asn Asp He Ala Leu Leu Lys He Arg Ser Lys GIu QIy Arg Cys Ala GIn Pro Ser Arg Thr He GIn Thr He Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro Ö2n Phe GIy Thr Ser Cys GIu He Thr GIy Phe GIy Lys GIu Z₁ Ser Z₂ Asp Tyr Leu Tyr Pro GIu GIn Leu Lys Met Thr VaI VaI Lys Leu He Ser His Arg GIu Cys Gin GIn Pro His Tyr Tyr GIy Ser GIu VqI Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro GIn Trp Lys Thr Asp Ser Cys Gin GIy Asp Ser GIy GIy Pro Leu VaI Cys Ser Leu Gin GIy Arg Met Thr Leu Thr GIy He VaI Ser Trp GIy Arg GIy Cys AIa Leu Lys Asp Lys Pro GIy VaI Tyr Thr Arg VaI Ser His Phe Leu Pro Trp He Arg Ser His Thr Lys GIu GIu Asn GIy Leu AIa Leu

worin X₁ und X₂ unabhängig voneinander Lys, einen Aminosäurerest, der kein basw Aminosäurerest ist, oder eine chemische Bindung darstellen, Y₁ gleich Arg, einem Aminosäurerest, der kein basi. Aminosäruerest ist, oder eine chemische Bindung ist, Y₂ gleich Phe, einem sauren Aminosäurerest oder einer chemischen Bindung ist, Y^ gleich Lys, einem Aminosäurerest, der kein basischer Aminostäurerest ist, oder einer chemischen Bindung irt, Z₁ gleich Asn ist, das hefespezifisch glykolysiert ist, oder ein anderer Aminosäu-

rerest ist und Z₂ gleich Thr cder einotn anderen, vorn Ser verschiedenen Aminosäurerest ist.

Der Begriff "Aminosäurerest" soll die Reste alle genetisch kodierten Aminosäuren Ginschließen, wie aaidische Aminosäurereste, beispielsweise die Reste von Glutaminsäure und Asparaginsäure, basische Aminosäurereste, beispielsweise die Reste von Arginin-, Lysin- und Histidinsäure, und neutrale Aminosäurereste, beispieleweise die Reste von Asparagin, Glutamin, Glyzin, Alanin, Leuzin, Isoleuzin, Serin, Threonin, Tyrosin oder Prolin.

Um die Glykolysation an der N-Glykolysationsstelle zu verhindern, muß die als Signal für die N-Glykolysation erkannte Tripeptidfolge geändert werden. Der Ersatz der Asn-(Z₁-) und/oder Thr- (Zg-) Reste in den oben stehenden Tripeptidfolge durch eine andere Aminosäure wurde die Bildung von Glykosidbindungen an dieser StäLle beseitigen. Der Einfachheit halber wjrd die Modifikation der N-Glykolysationsstelle nicht auf Proteinpegel vorgenommen. Es ist vielmehr vorteilhaft, das den scu-PA kodierende Gen so zu modifizieren, daß nach Expression des genannten modifizierten Gens durch einen V/irt ein Mutant-scu-PA produziert wird, bei dem die N-Glykolysationsstelle so geändert ist, daß an dieser Stelle eine Glykolysation nicht möglich ist. Speziell wird Asparagin durch Valin, Leuzin, Isoleuzin, Alanin oder besonders Glutamin substituiert, und Threonin wird durch Valin, Methionin oder besonders Alanin ersetzt.

Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von Verbindungen mit der Formel I, bei denen X-j gleich Lys, GIy oder Ser ist, Xp IjVs dar stallt, Y^ gleich Arg ist, Yp Phe,

A.sp oder GIu ist, Yo gleich Lys ist, Z^ gleich Asn oder GIn ist und Z₂ für Thr steht.

Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von scu-PA, [Gly135.|-scu-PA, [se.v135]-scu-PA, i'Aspi 57*1-scu-PA, |Seri35, Asp157'| -scu-PA und IGIyI 35,

Ί TO?

Asp157|-scu-PA, worin Asn^ hefespezifisch glykiysiert ist, und außerdem jGln302(-scu-PA, (Gly135, Acp157, Gln302iscu-PA und [ser135, Asp157, Gln3O2,]-scu-PA.

Die transformierten Hefestämme nach der Erfindung werden in einem flüssigem Medium gezüchtet, das assimilierbare Queller für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze ! enthält.

Verwendbar sind verschiedene Kohlenstoffquellen. Beispiele für bevorzugte Kohlenstoffquellen sind assimilierbare Kohlehydrate, wie Glukose, Maltose, Mannitol oder Laktose, oder ein Azetat wie Natriumazetat, das entweder allein oder in geeigneten Geraischen eingesetzt werden kann. Zu den geeigneten Stickstoffquellen gehören beispielsweise Aminosäuren, wie Kasaminosäure, Peptide und Proteine und deren Abbauprodukte, wie Trypton, Pepton oder Fleischextrakte, außerdem Hefeextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser sowie Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, -sulfat oder -nitrat, die entweder allein oder in geeigneten Mischungen eingesetzt werden könnnen. Zu den anorganischen Salzen, die eingesetzt werfen können, gehören beispielsweise Sulfate, Chloride, Phosphate und Karbonate von Natrium, Kalium, Magnesium und Kalzium. Zusätzlich kann das Nährmedium auch wachstumsfördernde Substanzen enthalten. Zu den Substanzen, die das V/aohstum fördern, gehören beispielsweise Spurenele-

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mente, wie Eisen, Zink, Mangan und ähnliche, oder einzelne Aminosäuren.

Hefezellen, die Hybridplasmide mit einem konstitutiven Promoter enthalten (z. B. ADHI, GAPDH) bringen das an das genannte Promoter gebundene u-PA-Gen ohne Induktion zur Expression. Wenn das u-PA-Gen aber unter der Kontrolle eines regulierten Promoters (z. B, PGK oder PHP5) ist, muß die Zusammensetzung des Wachstumsmediums abgestimmt werden, um maximale Pegel der mRNA-Transkripte zu erhalten, d. h., wenn mit dem PHOjj-Promoter gearbeitet wird, muß das Wachstumgsmedium eine geringe Konzentration an anorganischem Phosphat für die Depression dieses Promoters enthalten.

Die Kultur erfolgt unter Anwendung herkömmlicher Methoden. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert von Medium und Fermentierungszeit, werden so ausgewählt, daß maximale Werte von scu-PA-Proteinen produziert werden. Ein ausgewählter Hefestamm wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen in Tt.tohkultur unter Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von etwa 25° bis 35° C, vorzugsweise bei etwa 28° C, bei einem pH-Wert von 4 bis 7, beispielsweise etwa bei einem pH-Wert von 5, und für die Dauer von etwa 20 bis 50 Stunden, vorzugsweise bis zum Erreichen der Maximalerträge an scu-PA-Proteinen, gezogen.

Das produzierte scu-PA-Protein kann sich innerhalb der Hefezellen akkumuliiren, oder es kann in den periplasmischen Raum sekretiert werden. PUr f,en Pail, daß sich das scu-PA-Protein innerhalb der Zellen akkumuliert hat, besteht der erste Schritt bei der Gewinnung des scu-PA-Proteins darin, das Protein aus dem Zellinneren frei', usetzen. Bei den mei-

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sten Verfahren wird zuerst die Zellwand durch enzymatische Digestion mit Glukoaidasen (siehe unten) entfernt. Anschließend werden die resultierenden Sphäroplaste mit Reinigungsmitteln, beispielsweise Triton® X-100,behandelt. Als Alternative dazu können mechanische Kräfte, wie Scherkräfte (beispielsweise X-Presse, französische Presse), oder das Schütteln mit Glasperlen angewendet werden, um die Zellen aufzubrechen. Das resultierende Gemisch wird mit herkömmlichen Mitteln nach scu-PA-Protein angereichert, beispielsweise durch die Entfernung des größten Teils des nichtproteinhaltigen Materials durch Behandlung mit Polyethylenimin, Ausfällung der Proteine unter Verwendung von Ammoniumsulfat, Gelelektrophorese, Dialyse, Chromatografie, beispielsweise Ionenaustauschchromatografie, Größenausschlußchromatografie, HPLG oder Umkehrphasen-HPLC, Molekularsieben auf einer geeigneten Sophadex®-Kolonne oder ähnliche. Die abschließende Reinigung des vorgereinigten Produkts wird beispielsweise durch Affinitätschromatografie, so z. B, die Antikörperaffjnitätschromatografie, insbesondere die mono- klonale Antikörperaffinitätschroraatografie unter Verwendung von monoklonalen Anti-u-PA-Antikörpern, die an eine nichtlösliche Matrix fixiert sind, nach in Fachkreisen bekannten und ähnlichen Methoden durchgeführt. Vorteilhaft ist es, allen Pufferlösungen, die in den Reinigungsschr.itten eingesetzt werden, ein Reinigungsmittel, insbesondere oin nichtionisches Reinigungsmittel, wie Triton X-IOO^ oder Tween 80^, zuzusetzen, um die Adsorption deo scu-PA-Proteins an den Lehälterflachen zu verhindern und die Stabilität zu verbessern. Das Reinigungsmittel kann bis zu einer Endkonzentration von 0,01 - 1 % zugesetzt werden.

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In den Fällen, in denen das scu-PA-Protein von der Hefezelle in den periplaamischen Raum sekretiert wird, kann mit einem vereinfachten Protokoll gearbeitet werden: Das Protein wird ohne Zellysis durch enzymatische Entfernung der Zellwand oder durch Behandlung mit chemischen Reagentien, z. B. Thiolreagentien oder EDTA, gewonnen, was zu Zellwandbeschädigungen führt, welche die Freisetzung des produzierten scu-PA-Proteins gestatten. Wenn das scu-PA-Protein in die Kulturbrühe sekretiert wird, kann es direkt aus dieser gewonnen werden.

In /· ^hc.ugigkoit vom verwendeten Wirtetaram und den angewendeten Reinigungsmethoden, können die scu-PA-Proteine nach der vorliegenden Erfindung durch geringe Mengen der entsprechenden zweikettigen Formen kontaminiert sein, was durch die proteolytische Aktivität verursacht wird, die durch die Wirtszellen freigesetzt wird. Die Trennung der zweikettigen Form von der gewünschten einkettigen Form (scu-PA) erfolgt durch in Fachkreisen bekannte Methoden, beispielsweise durch Ohromatografie auf Benzamidin-Sepharose^R (siel (1986)).

se^R (siehe Winkler, M. E. u. a., Biochemistra, 25>, 4041

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß sich die scu-PA-Proteine nach der vorliegenden Erfindung von den von E)_5- coli gewonnenen scu-PA dahingehend unterscheiden, daß sie die biologische Aktivität des natürlichen Human-scu-PA aufweisen, ohne daß ein Refaltungsvorgang notwendig wäre, und daß sie "bei Asn30k hefespezifisch glykolysiert sind. Auf Grund der hefespezifischen Glykolysation sind die scu-PA-Proteine nach der Erfindung auch dadurch von scu-PA verschieden, die von tierischen Zellen gezüchtet oder trans-

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formiert wurden, und sind damit neuartig.

Demzufolge betrifft die Erfindung auch scu-PA und deren Mutanten, die eine hefeapezifische Glykolysation haben, insbesondere eine Glykolysation, die spezifisch für Saccharomyces cerevisiae ist.

Mutanten von scu-PA, bei denen die G-lykolysationsstelle so modifiziert ist, daß die Glykolysation an dieser Stelle nicht stattfinden kann, sind ebenso neuartig und ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung.

Demzufolge betrifft die Erfindung auch Verbindungen mit der Formel I, in denen Z^ der Rest einer anderen genetisch kodierten Aminosäure als Agn ist, Zp gleich Thr ist und X.,, X₂, Y.), Yp und Yo die unter Formel I gegebene Bedeutung haben, und Verbindungen mit der Formel I, in denen Z₁ gleich Asn ist, Zp der Rest einer anderen genetisch kodierten Aminosäure als Thr oder 3er ist und Xh, Xp, Y-, Yp und Y^ die unter Formel I gegebene Bedeutung haben.

Insbesondere betrifft die Erfindung Verbindungen mit der Formel I, bei denen X-j gleich Lye, GIy oder Ser ist, Xp gleich Lys ist, Y^ gleich Arg ist, Yp gleich Phe, Asp oder GIu ist, Υ., gleich Lys ist, Z^ gleich GIn ist und Z„ gleich Thr ist.

Die am meisten bevorzugten Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind scu-PA, | GIy 135JvSCU-PA, (Ser i35|-acu-PA,

iAsp157J -scu-PA, (Ser135, Asp157J -scu-PA und f.GIyI35, Asp157l

302 scu-PA, worin Asn hefespezifisch glykolysiert ist, und außerdem \Gln3O2j-scu-PA, ['Gly135, Asp157» Gln302j-scu-PA

und [Ser135, Aap157, G 1^02]-scu-PA.

Die transformierten Hefeatämrae nach der Erfindung können nach Rekombinant-DNA-Methoden hergestellt werden, die aus folgenden Schritten bestehen:

- Erarbeitung einer strukturellen Genkodierung für scu-PA oder dessen Mutanten,

- Sinbeziehung des genonnenen strukturellen Gens in einen geeigneten Vektor,

- Transformation eines geeigneten Wirtsorgarilsmus mit dem produzierten Hybridvektor und

- Auswahl der transformierten Wirte uua den untransformiorten Wirten.

Die Nukleotidfolgen der u-PA-cDNA und der genomischen u-PA-DNA sind bekannt (Holmes, W, E. u. a., Biotechnology, J3, 923 (1985); Riccio A. u. a., Nucleic Acids Research V3, 2759 (1985)). Wenn die cDNA- und die genomische DNA-Polgen von u-PA bekannt sind, kann die strukturelle Genkodierung für u-PA oder dessen Mutanten nach in Fachkreisen bekannten Methoden ermittelt werden. Zu den Methoden zur Erarbeitung dieser DNA gehören die Isolierung der mRNA aus menschlichen Zellen, welche scu-PA produzieren, beispielsweise menschlichen Karzinomzellen oder Nierenzellen von menschlichen Embryos, Auswahl der gewünschten mRNA, z. B. duroh Hybridisierung mit einer geeigneten DNA-Sonde, Herstellung einsträngiger DNA, die zu dieser mRNA komplementär ist, daraus dann der doppelsträngigen, komplementären DNA (ds cDNA) oder Isolierung der genomischen DNA aus menschlichen Zellen und Auswahl der gewünschten DNA unter Verwendung einer geeigneten DNA-Sonde und, soweit erforderlich, Mutation der gewon-

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nenen cDNA oder genomischen DNA oder Herstellung des strukturellen Gens durch chemische Synthese. Vorzugsweise werden die strukturellen Gene nach der Erfindung Über die mRNA-Route und, wenn Mutanten gewünscht werden, durch die Mutagenese der primär gewonnenen u-PA-cDNA hergestellt» Demzufolge kann die strukturelle Genkodierung für einen Mutanten von u-PA durch Herausschneiden eines Abschnitts der DNA erfolgen, der aus dem (den) Kodon(en) für den (die) unerwünschten Aminosäurerest(e) besteht, aus dem reifen u-PA-Stammgen und dessen Ersatz durch ein DNA-Segment, in welchem der (die) genanntein) Kodon(e) durch Kodon(e) substituiert wurde(n), der (die) für die gewünschten Aminosäurerest(e) kodiert, oder durch Ausführung einer Deoxyribonukleotiäsubatitution vermittels der stellengerichteten Mutagenese (siehe Zoller, M. J. u. a., Methods Enzymol. 200, 468 (1983)» Botstein, D. u. a., Science 22^, 1193 (1985)).

Die Hybridvektoren nach der vorliegenden Erfindung bestehen aus einer Hefeexpressionskontrollfolge, einem DNA-Segment, das gebildet wird aus einer ersten DNA-Folge, die ein Signa \n: Id oberhalb eines und im Leserahmen mit einer zweit ^ί , Folgekodierung für den reifen Plasminogenaktivator deü ^T okinasetyps oder dessen Mutanten kodiert, wobei dieses DNA-Segment unter der Transkriptionskontrolle der genannten Expressionskontrollfolge steht, und einer DNA-Folge, welche die Transkriptionsterminationssignale eines Hefegens aufweist.

Hefeexpressionskontrollfolgen werden von der genomischen DNA von Hefe abgeleitet, insbesondere von Saccharomyces cerevisiae. Vorzugsweise wird die Expressionskontrollfolge eines stark expressierten Hefegens für die Expression von

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scu-PA verwendet. So kann der Promoter von Gen TRP1, das Gen ADHI oder ADHII, das Säurephosphatase-Gen (PHO5), ein Promoter des Enolase-, Glyzeraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-(GAPDH-), 3-Phosphoglyzeratkinase- (PGK-), Hexokinase-, Pyruvatdekarboxylase-, Phcdphofruktokinase-, Glukose-6-phosphatisomerase-, 3-Phosphoglyzeratmutase-, Pyruvatkinpse-, Triosephosphatisomerase- und Hhosphoglukoseisomerase«· und Glukokinasegens oder ein Promoter der hefegepaarten Pheromongene, die für den a, oder den ^Faktor kodieren, eingesetzt werden. Möglich ist es auch, Hybridpromoter zu verwenden, die aus den oberen Aktivierungsfolgen (UAS) eines Hefegens und unteren Promoterelementen, einschließlich einer funktioneilen TATA-Box, eines anderen Hefegens bestehen, beispielsweise einem Hybridpromoter, einschließlich der UAS(n) des Hefe-PHO5-Gens, und der unteren Promoter elemente, einschließlich einer funktionellen TATA-Box des Hef e-GAPDH-Gens. Bevorzugte Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten Promoter mit Transkriptionskontrolle. Promoter dieses Typs, z. B. der Promoter des Oens PHP5 oder die PH05-GAPDH-Hybridpromoter, können durch Veränderung der Y/achstumsbedingungen ein- oder ausgeschaltet werden. Beispielsweise kann der PHOJj-Pr ο mot er bewußt unterdrückt werden, wozu nur die Konzentration des anorganischen Phosphats im Medium erhöht zu werden braucht. Ein weiterer bevorzugter Promoter nach der Erfindung ist der Promoter des Gens GAPDH, insbesondere dessen Punktionsfragmente, beginnend bei den Nukleotiden zwischen -550 und -180, insbesondere am Nukleotid -540, -263 oder -198, und endend am Nukleotid -5 des GAPDH-Gens.

Die DNA-Folge, die ein Signalpeptid kodiert ("Signalfolge¹¹) wird vorzugsweise von eukaryotischen Genen, beispielsweise

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menschlichen oder Hefegenen, abgeleitet, welche eine Kodierung für Polypeptide ausweisen, die normalerweise sekretiert,werden. Geeignete Signalfolgen sind beispielsweise die u-PA-Signalfolge, die aus genomischer Human-DNA gewonnen werden kann, Hefesignalfolgen, wie die Signal- und Präprofolgen der Hefeinvdrtase, ^-Faktor, Pheromonpeptidase-(KEX1), "Killer-Toxin"- und repressierbare Säurephosphatase-(PH05) Gene und die GlukoamylaseaignaIfolge von Aspergillua awamori« Als Alternative dazu können verschmolzene Signalfolgen konstruiert werden durch Verbinden eines Teils der Signalfolge (soweit vorhanden) des natürlcih mit dem verwendeten Promoter verbundenen Gens mit einem Teil der u-PA-Signalfolge. Bevorzugt werden die Kombinationen, welche eine genaue Spaltung zwischen der Signalfolge und der reifen scu-PA-Aminosäurefolge gestatten. Zusätzliche Folgen, wie Pro- oder Abstandsfolgen, welche spezielle Verarbeitungssignale tragen können aber nicht müssen, können ebenfalls in die Konstruktionen einbezogen werden, um die genaue Verarbeitung der Vorläufermoleküle zu erleichtern. Als Alternative dazu können verschmolzene Proteine erzeugt werden, die interne Verarbeitungssignale enthalten, welche die richtige Reifung in vivo oder in vitro ermöglichen. Beispielsweise enthalten die Verarbeitungssignale einen Lys-Arg-Rest, der durch eine Hefeendopeptidase erkannt wird, die in den Golgi-Membranen loziert ist. Die bevorzugten Signalfolgenden nach der Erfindung sind die des Hefe-PH05-Gens mit einer Kodierung für ein Signalpeptid mit der Formel

Met Phe Lys Ser VaI VaI Tyr Ser He Leu Ala AIa Ser Leu AIa Asn AIa,

des Hefeinvertasegens mit einer Kodierung für ein Signal-

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peptid mit der Formel

Met Leu Leu Gin AIa Phe Leu Phe Leu Leu Ala GIy Phe AIa Ala Lys lie Ser AIa,

und des Human-u-PA-Gens mit der Kodierung für ein Signal» peptid mit der Formel

Met Arg AIa Leu Leu AIa Arg Leu Leu Leu Cys VaI Leu VaI VaI Ser Asp Ser Lys GIy.

Eine DNA-Folge, welche Hef etranskripiionsterminationssigna-Ia aufweist, ist vorzugsweise die 3'-Flankierung3folge eines Hefegens, welches geeignete Signale für die Transkriptionsbeendigung und die Polyadenylation enthält. Geeignete 3'-Flankierungsfolgen sind beispielsweise die des Hefegens, die natürlich mit der verwendeten Expressionskoni;rollfolge verbunden sind. Die bevorzugten Flankierungsfolgen sind die von Hefe-PHO5-Gen.

Die Hybridplasmide nach der Erfindung enhalten neben dem Promoter, der Signalfolge, der DNA-Folgekodierung für u-PA oder dessen Mutanten und den 3'-Flankierungsfolgen zusätzliche DNA-Folge(n), die wichtige Funktionen erfüllen, beispielsweise bei der Vermehrung der mit den genannten Hybridplasmiden transformierten Zellen. Die zusätzliche(n) DNA-Folge(n) können von prokaryotischen und/oder eukaryotischen Zellen abgeleitet werden und können chromosomale und/oder extrachromosomale DNA-Folgen einschließen. Beispielsweise können die zusätzlichen DNA-Folgen von Plasmid-DNA stammen (oder daraus bestehen), beispielsweise bakterieller oder eukaryotischer Plasmid-DNA, viraler DNA und/oder chromosomaler DNA,

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beispielsweise bakterieller, Hefe- oder höher eukaryotiacher chromosomaler DNA. Bevorzugte Hybridpiaamide enthalten zusätzliche DNA-Folgen, die von bakteriellen Plasmiden, insbesondere Esoheriohia _coli-Plasmid pBR322 oder pUC19-verwandte Plaamide, Bakteriophag A , Heie-2^-Plasmid, und/ oder Hefe-Chromosomal-DNA abgeleitet wurden.

Bei den bevorzugten Hybridplaemiden nach der Erfindung haben die zusätzlichen DNA-Folgen einen Hefereplikationsursprung und einen selektiven genetischen Marker für Hefe. Hybridplasmide_} die einen Hefereplikationaursprung enthalten, δ, B. ein autonom replizierendes Segment(are) werden nach der Transformation extrachromosomell innerhalb der Hefezelle gehalten und werden nach Mitosis autonom repliziert. Ebenso können Hybridplasmide verwendet werden, die Folgen enthalten, welche homolog zur Hef e-2/i-Plasmid-DNA oind. Diese Hybridplastnide rekombinieren sich mit den bereits in der Zelle vorhandenen Hefe-2u-Plasmiden oder replizieren sich selbst autonom, wenn der Replikationsursprung vorhanden ist. 3u-Folgen sind besonders geeignet für Hochfrequenztransformationspia amide und erbringen hohe Kopiezahlen.

Für das selektive Gen-Marker für Hefe kann jedes Markergen verwendet werden, welches die Auswahl der Transformanten auf Gruna der phönotpyischen Expression des Markers erleichtert. Geeignete dominante Marker für Hefe sind besonders die, welche antibiotische Resistenz zum Ausdruck bangen, oder, bei auxotrophen Heferautanten, Gene, welche die Wirtslä^ionen komplementieren. Entsprechende Gene übertragen beispielsweise Resistenz auf das Antibiotikum G418 oder Hygromyzin oder gewährleisten die Prototrophie in einem auxotrophen Hefemutanten, beispielsweie die Gene URA3, LEU2

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HIS3 oder TRP1.

Vorteilhaft ist es, wenn die zusätzlichen DNA-Folgen, die in den Hybridplasmiden nach der Erfindung vorhanden sind, auch einen Replikationsursprung und einen selektiven genetischen Marker für einen bakteriellen Wirt, insbesondere Escheriohia οοIi einschließen. Mit dem Vorhandensein eines E_2- c^oli-Replikationsursprungs und eines B^ coli-Marker im Hybridplasmid der Hefe sind nützliche Merkmale verbunden. Erstens können durch Wachstum und Vergrößerung in B₂, coli große Mengen ar. Hybridpiasmid-DNA gewonnen werden, und zweitens erfolgt die Konstruktion der Hybridplasmide günstig in JSj. coli, wobei das gesamte Repertoire der Klonungstechnologie auf der Grundlage von JZ^ coli genutzt werden kann. IS_2- ooli-Plastnide, wie pBR322 und ähnliche, enthalten sowohl den E^ ooli-Replikationsursprung als auch genetische JLl coli-Marker, die Resistenz auf Antibiotika übertragen, beispielsweise Tetrazylin und Ampizillin, und werden vorteilhaft als Teil der Hefehybridvektoren eingesetzt.

Die zusätzlichen DNA-Folge^, die beispielsweise Replikationsursprung und genetische Marker für Hefe und einen bakteriellen Wirt enthalten (siehe oben), werden nachstehend als "Vektor-DNA" bezeichnet, die zusammen mit dem Hefepromoter und dem seu-PA-Kodierungsbereich ein Hybridplasmid nach der Erfindung bilden.

Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel betrifft die vorliegende Erfindung Hybridplasmida, die zur autonomen Replikation in einem Hefewirtsstamm in der Lage sind und selektierbare Marker haben, die aus einer Hefeexpressionskontrollfolge, einem DNA-Segment, das von einer ersten DNA-Folge

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gebildet wird, welche ein Signalpeptid oberhalb eines und in einem Leserahmen mit einer zweiten DNA-Folge kodiert, die für den reifen Plasminogenaktivator des Urokinasetyps oder dessen Mutanten kodiert, und einer DNA-Folge, welche Transkriptionsterminationsignale eines Hefegens enthält, wobei das genannte DNA-Segment zusammen mit den Transkriptionsstart- und -terminationssignalen sowie kodierten Translationsstart- und -stoppsignalen in dem genannten Hybridvektor unter der Kontrolle der genannten Expressionskontrollfolge angeordnet ist, so daß sie in einem transformierten Hefestamm expressiert wird, um den genannten Plasminogenaktivator oder dessen Mutanten zu produzieren, besteht«

Die Hybridvektoren der vorliegendan Erfindung werden nach Methoden hergestellt, die in Fachkreisen bekannt sind, beispielsweise durch Verbinden einer Hefeexpressionskontrollfolge, eines DNA-Segmentes, das aus der Signalpeptidkodierungsregion und einer DNA-Folgekodierung für u-PA oder dessen Mutanten besteht, der 3'-Flankierungsfolge eines Hefegens und der Vektor-DNA.

Zur Erarbeitung von Hybridplasmiden können entsprechend dargestellte kreisförmige Vektor-DNA, beispielsweise bakterielle Plasmid-DNA (siehe oben) mit wenigstens einer Reetriktionsstelle oder ähnliche, vorzugsweise mit zwei oder mehr Replikationssteilen, eingesetzt werden, Vorteilhaft ist es, wenn die Vektor-DNA bereits Replikaticnsursprünge und Gen~Marker für die Hefe und/oder einen bakteriellen Wirt enthält. Die Vektor-DNA wird unter Anwendung einer entsprechenden Restriktionendonuklease gespalten. Die restriktierte DNA wird an das (die) DNA-Fragment(e) gebunden,

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das (die) die Hefeexpreasionskontrollfolge, das genannte DNA-Segment und die genannte DNA-Folge mit den Transkriptionsterminationssignele enthält (enthalten). Vor oder nach dem Verbinden der genannten DNA-Fragmente (oder ebenso gleichzeitig damit) können auch Replikationsurspriinge und/ oder Marker für die Hefe oder einen bakteriellen Wirt eingeführt werden. Bei allen Vorgängen werden die Restriktionsund Ligationsbedingungen so gewählt, daß keine Interferenz mit den wesentlichen Funktionen der Vektor-DNA und der Expressionskontrollfolge auftritt. Der Hybridvektor kann sequential oder durch Ligation von zwei DNA-Segmenten, welche alle interessierenden Folgen enthalten, aufgebaut werden.

Es können verschiedene Methoden angewendet werden, um DNA-Segmente in vitro zu verbinden« Stumpe Enden (vollständig basispaarige DNA-Duplexe), die durch bestimmte Restriktionsendonukleasen produziert werden, können direkt mit T4-DNA-Ligase verbunden werden. Gebräuchlicher ist es, daß DNA-Segmente durch ihre einsträngigen kohäsiven Enden verbunden und durch DNA-Ligase, z. B. T4-DNA-Ligase, zweiwertig geschlossen werden. Solche einsträngigen "kohäsiven Enden" können durch Spaltung von DNA mit einer anderen Klasse von Endonukelasen gebildet werden, welche gestaffelte Enden erzeugen (die beiden Stränge des DNA-Duplexes werden an unterschiedlichen Punkt in einem Abstand von einigen Nukleotiden gespalten). Einzelstränge können auch durch Anfügen von Nucleotiden an stumpfe Enden oder gestaffelte Enden unter Anwendung von Terminals ansf era se ("homopolymer es Tailing") oder einfach durch Rückkauen eines Strangs eines stumpfendenden DNA-Segmentes mit einer geeigneten Exonuklease, beispielsweise λ-Exonuklease, hergestellt werden. Ein weiteres

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Verfahren für die Herstellung von gestaffelten Enden besteht in der Bindung einer chemisch synthetisierten Linker-DNA, welche eine Erkennungsstelle für eine ein gestaffeltes Ende bildende Endonuklease enthält mit einem stumpfendenden DNA-Segment und dem Digerieren der resultierenden DNA mit der entsprechenden Endonuklease»

Die Komponenten des Hybridvektors nach der Erfindung, wie Hefepromoter, strukturelles Gen für u-PA oder dessen Mutanten, einschließlich Signalfolge, Transkriptionste minator, Replikationssystem usw«, werden in einer festgelegten Reihenfolge aneinander gebunden, um eine angemessene Punktion zu gewährleisten. Die Komponenten werden durch gemeinsame Restriktionsstellen ader durch synthetische Linker-Moleküle gebunden, um die richtige Ausrichtung und Reihenfolge der Komponenten zu gewährleisten.

Die transformierten Hefeatämme nach der Erfindung werden auf die bekannte Y/eise hergestellt, d. h., durch '.Transformation eines Hefestammes mit einem Hybridvektor, bestehend aus einer Hefeexpressionskontrollfolge, einem DNA-Segment aus einer ersten DNA-Folge zur Kodierung eines Signalpeptids ob'rihalb eines und in einem Leserahmen mit einer zweiten DNA-Folgekodierung für den reifen Plaaninogenaktivator des Urokinasetyps oder dessen Mutanten, wobei das DNA-Segment unter der Transkriptionskontrolle der genannten Expressionskontrollfolge steht, und einer DNA-Folge, welche die Transkriptionsterminationssignale eines Hefegens enthält»

Zu den geeigneten Hefewirtsorganisraen gehören die Spezies der Gattungen Kluyveromyces, Candida, Piohla, Saccharomyoes, Yarrowia, Torulopsis und verwandte Gattungen (siehe Lodder,

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J., The Yeasts (Die Hefen), Amsterdam 1971), insbesondere Stämme von Sacoharomyoes cerevisiae.

Die Transformation der Hefewirtszellen wird durch in Fachkreisen bekannte Methoden ausgeführt. Beispielsweise kann die Transformation nach der Methode ausgeführt werden, die von Hinnen, u. a. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA JJj, 1929 (1978)) beschrieben wurde. Diese Methode kann in drei Schritte unterteilt werden:

(1) Entfernung der Hefeze?.lwand oder von Teilen davon.

(2) Behandlung der "nadctea" Hefezellen (Sphäroplaste) mit

der transformierenden DNA bei Vorhandensein von PEG-

2+ (Polyethylenglykol-) und Ca -Ionen.

(3) Regeneration der Zellwand und Auswahl der transformierten Zellen in einer festen Agar-Schicht.

Bevorzugte Methoden:

zu (1): Die Hefezellwand wird enzymatisch entfernt, dazu werden verschiedene Präparate von Glukosida sen verwendet, beispielsweise Schneckendarmsäfte (z. B. Glusulase^'oder Helicase^, oder Enzymgemische, die von Mikroorganismen (z. B. Zymolyase™) gewonnen wurden, in osmotisch stabilisierten Lösungen (z. B. 1 M Sorbitol).

zu (2): Die Hefesphäroplaste ballen sich bei Vorhandensein von PEG zusammen, und es werden lokale Fusionen von zytoplasmischen Membranen induziert. Die Erzeugung von "fusionsartigen" Bedingungen ist entscheidend, und viele transformierte Hefezellen werden während des Transformationsprozesses diploid oder sogar triploid. Ea können Verfahren angewendet werden, um die Selektion der geschmolzenen Sphäro-

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plaste zur Anreicherung der Transformanten zu nutzen, d. h., transformierte Zellen können leicht aus vorselektierten Fusionsprodukten ausgesichtet werden.

zu (3): Da sich Hefezellen ohne Zellwand nicht teilen, muß die Zellwand regeneriert werden. Diese Regeneration erfolgt vorteilhaft durch Einbettung von Sphäroplasten in Agar. Beispielsweise wird geschmolzenes Agar (etwa 50° 0) mit Sphäroplasten gemischt. Nach dem Abkühlen auf Hefewachstumstemperaturen (etwa 30° 0), erhält man eine feste Schicht. Diese Agarschicht soll die rasche Diffusion und den Verlust wesentlicher Makromoleküle aus den Sphäroplasten verhindern und erleichtert damit die Regeneration der Zellwand. Die Regenerierung der Zellwand kann jedoch auch (wenn auch mit geringerer Effektivität) durch Plattieren der Sphäroplaste auf die Oberfläche von vorgeformten Agarschichten erreicht werden.

Vorzugsweise wird das Regenerations-Agar so hergestellt, daß die Regeneration und die Selektion der transformierten Zellen gleichzeitig möglich sind. Das Hefegene, welche die Enzyme vor. Aminosäuren kodieren, als selektive Marker (siehe oben) auf biosynthetischen Bahnen genutzt werden, erfolgt die Regenerierung vorzugsweise in einem Hefe-Minimalmedium-Agar. Wenn eine sehr hohe Regenerationseffektivität erforderlich ist, ist das folgende zweistufige Verfahren vorteilhaft: (1) Regenerierung der Zellwand in einem reichen Komplexmedium und (2) Selektion der transformierten Zellen durch Replika-Plattierung der Zellschicht auf selektive Agar-Platten.

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Wenn der Hybridvekbor keinerlei Marker-Gen enthalt, können die transformierten Zellen auch durch Alternativmethoden identifiziert werden. Zu diesen Methoden gehören beispielsweise die in situ-Hybridisatlon mit einem markierten DNA-Fragment, das homolog zu den Folgen des Hybridvektors ist (z. B. nach Hinnen u. a., siehe oben), in situ-Immunoanalysen, vorausgesetzt, daß der Antikörper für das Produkt des eingeführten Gens verfügbar ist, oder andere Sichtungsmethoden, welche Genprodukte messen, die durch transformierende(s) Plasmid(e) kodiert wurden.

Als Alternative dazu kann die Hefe mit einem Hybridvektor nach der Erfindung und einem zweiten Vektor, der einen genetischen Marker für die Hefe enthält, kotransformiert werden. Wenn die beiden verschiedenen Vektoren gemeinsame DNA-Folgen haben (es kann sich dabei um bakterielle Folgen hann dein), erfolgt die Rekombination, was zu einem verschmolzenen, selektierbaren Hybridmolekül führt.

Die transformierten Hefestämme, welche die Hyhridplasmide nach der Erfindung enthalten, können in der Produktion von scu-PA oder dessen Mutanten durch Mutation und Selektion unter Anwendung von in Fachkreisen bekannten Methoden verbessert werden. Die Mutation kann beispielsweise durch UV-Bestrahlung oder geeignete chemische Reagentien bewirkt werden. Besonders bevorzugt wird die Produktion von Mutanten, denen es an Protease fehlt, insbesondere Hefemutanten, um so den proteolytischen Abbau des produzierten scu-PA oder dessen Mutanten innerhalb der Zelle zu vermeiden. Geeignete Mutanten können mit herkömmlichen Mitteln ausgewählt und isoliert werden.

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Die scu-PA-Proteine, die nach der vorliegenden Erfindung gewonnen werden können, insbesondere die neuartigen scu-ΡΛ-Proteine, weisen wertvolle pharmakologische Eigenschaften auf. Sie können analog zu den bekannten Plasminogenaktivatoren beim Menschen zur Verhinderung oder bei der Behandlung von Thrombose oder anderen Zuständen eingesetzt werden, in denen die Auslösung einer lokalen fibrinolytischen oder proteolytischen Aktivität erwünscht ist, über den Mechanismus der Plasrainogenaktivierung, beispielsweise bei Arterioä&erose, Myokard- und Zerebralinfarkt, Venenthrombose, Thromboembolismus, postoperative Thrombose, Thrombophlebitix und diabetische Vaskulpathies.

Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Menge des aktiven Bestandteils (scu-PA oder dessen Mutant) ξ neamin en mit organischen oder anorganischen _t festen oder flüssigen, pharmazeutisch akzeptablen Trägermitteln enthalten, die für die parent erale, wie intravenöse Verabreichung geeignet sind und die keine schädliche Wechselwirkung mit den aktiven Bestandteilen eingehen. < ·

Geeignet sind insbesondere Infusionslösungen, vorzugsweise wässrige Lösungen oder Suspensionen, die vor der Anwendung hergestellt werden können, beispielsweise aus lyophilierten Präparaten, die den aktiven Bestandteil allein oder zusammen mit einem Trägermittel, wie Mannitol, Laktose, Glukose, Albumin und ähnlichen, enthalten. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können sterilisiert und, wenn das gewünscht wird, mit Adjuntiven, beispielsweise Präservativen, Stabilisatoren, Emulgatoren, Solubilisatoren, Puffern und/oder Salzen, wie Natriumchlorid, gemischt sein, um den

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osmotischen Druck zu regulieren. Die Sterilisation kann durch steriles Filtern durch Filter mit geringer Porengröße (0,45 ^m Durchmesser oder kleiner) erfolgen, worauf das Präparat, wenn das gewünacht wird,lyophiliert werden kann. Es können auch Antibiotika zugesetzt werden, um die Erhaltung der Sterilität zu unterstützen. Beispielsweise wird das scu-PA-Protein nach der Erfindung in eine sterilisierte, wässrige Lösung eingebracht, die 5 % Glukose und wahlweise Stabilisatoren und Salze enthälc.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung werden in Dosierungseinheitsformen abgegeben, beispielsweise Ampullen, die 1 bis 2000 mg eines pharmazeutisch akzeptablen Trägermittels je Dosierungseinheit und etwa 1 bis 20 mg, vorzugsweise etwa 3 bis 15 mg, des aktiven Bestandteils (scu-PA oder dessen Mutant) je Dosierungseinheit enthalten.

In Abhängigkeit vom Typ der Erkrankung und dem Alter und Zustand des Patienten, liegt die tägliche Dosis, die einem Patienten mit. einem Gewicht von etwa 70 taj zur Behandlung zu verabreichen ist, im Bereich von 20 bis 150 mg, vorzugsweise von 45 bis 100 mg, je 24 Stunden.

Die Erfindung betrifft auch eine Methode zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß ein biologisch aktivea Protein nach der vorliegenden Erfindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägermittel gemischt wird.

Der Einsatz der neuen Proteine für die prophylaktische und therapeutische Behandlung des Menschen ist auch ein Ziel der Erfindung«

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Die Erfindung betrifft auch die neuartigen Hybridplasmide und die mit den genannten Hybridplasmiden transformierten Hefestämme und die Verfahren für deren Produktion«

Die Erfindung betrifft insbesondere scu-PA-Proteine, Hybridvektoren, transformierte Hefewirte und die Verfahren zu ihrer Produktion, wie sie in den Beispielen beschrieben werden«

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Im folgenden experimentellen Teil werden verschiedene Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, in denen ί

Abb. 1 eine Restriktionsendonukleasedarstellung der menschlischen u-PA-cDNA ist,

Abb. 2 die Nukleotidfolge und die abgeleitete Aminosäurefolge der raenaohlichen u-PA-cDNA darstellt. Die erste Aminosäure des reifen Proteins ist unterstrichen,

Abb. 3 schematisch den Aufbau von Plasmid pCS16 darstellt,

Abb. 4 schematisch den Aufbau von Plasmie pCS'16/üPA., das die u-PA-cDNA aufweist, darstellt,

Abb. 5 ein schematisches Diagramm ist, welches des Aufbau von Plasmid pJDB2O7/PHO5?-I-UPA zeigt (verwendete Abkürzungen: SS «- Signalfolge, t - Transkriptionsterrainator, ρ Promoter, L - Linker);

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Abb. 6 die DNA-Folge des Promoterbereichs von GAPDH ist,

Abb. 7 schematisch den Aufbau von Plasmid p31GAPDL-IT darstellt,

Abb. 8 die Promoterelemente des GAPDH-Gens darstellt, das in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird,

Abb. 9 schematisch den Aufbau von Plasmid pJDB2O7/GAPDL-I-UPA zeigt,

Abb. 10 ein acb.ematiscb.es Diagramm ist, das den Aufbau von Plasmid pJDB2O7/GAPDL-UPA zeigt,

Abbildungen 11 und 12 schematisch den Aufbau von Plasraid pDP38 über Plasmid pDP33 zeigen,

Abb. 13 die DNA-Folgen der mutierten u-PA=Gene und die entsprechenden Aminosäurefolgen der Mutanten-scu-PA-Proteine nach der vorliegenden Erfindung darstellt.

Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung, sind jedoch nicht als deren Einschränkung zu betrachten.

Ausführungsbe i spiele Experimenteller Teil

Beispiel 1

Konstruktion von Plasmid püSib/üPA, das den u-PA-Kodiorungsbereich aufweist

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Ein 1,5 kb-Pstl-BamHI-Fragment von Plasmid pUN121 (Nilsson, B. u. a., Nucl. Acids Res. 1_χ, 8019 - 8030 (1983)), niches das el-Gen von Phag Lambda und einen Teil des Tetrazyklinresistenz-Gens aufweist, wird in pU018 (Ilorrander, J. u. a«, Gene 26, 101 - 106 (1983)) geklont, mit PstT und BamHI geschnitten. Das resümierende Klon wird mit Pstl digeriert. Die überhängenden 3'-Enden werden in Reaktion mit T,-DNA-Polymerase (Maniatis, T. u. a«, Molecular Cloning (Molekularklonung) (1982), S. 395) entfernt, und mit den stumpfen Enden werden Xhol-Linker (5'-CCTGGAGG-O', Biolabs) ligiert. Wach dem Digerieren mit Xhol wird das Molekül durch Ligation rezirkularisiert. Ein Aliquot des Ligationsgemischs wird dazu genutzt, Ca⁺ -behandelte JS_2- ooli-HB101-Zellen zu transformieren. Die DNA von individuellen ampizillinresistenten, transformierten Kolonien wird analysiert, Eines von mehreren korrekter. Klonen wird ausgewählt und als pCS16 bezeichnet.

B) Konstruktior. von Plasmid P.C316/UPA £ siehe Abb. 4.1

****** ^^- ^** *** SS 12 SS ^S IS *"* ^pS SS SS SS ^S η. yr S* ^S «S« S« SS ^S S* SS SS SS ^T «ZS SS SS SS SS SS SS Sä. «m SS SS S3 SS SS ^S Sr« SS SS SS SS

Urokinase-cDNA wird aus tnRNA präpariert, die von menschlichen Hep3-Zellen gewonnen wurde (siehe Maniatis, T. u. a., ebenda, S. 188 - 246). Ein 1,3 kb-Smal-BamHI-Fragment und ein 1 kb-BamHI-EcoRI-Pragment der u-PA-cDNA werden in die Smal-, EcoRI-Stellen von pUl1121 (NiDsDon, B. u. a., Nuol. Acids Res. Jh, 8019 - 8030 (1983)) geklont und ergeben Plasmid pcUK176. Die Restriktionsendonukleasedarstellung der Einfügung von menschlicher u-PA-cDNA wird in der Abb. 1 gezeigt· Die Wukleotidfolge und die deduzierte Aminosäurefο1-e;e der u-PA-Einfügung werden in Abb. 2 gegeben. Die uPA-cDNA-Einfügung wird in Plasmis pCS16 subgeklont. Die subgeklonte cDKA erstreckt sich von der Smal-Stelle in den 5'-

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nichttranslaterierten Bereich (Abb. 1) bis zur PvuII-Stel-Ie in den Nukleotidpositionen 1439 - 1444 (Abb. 2) im V-nichttranolaterierten Bereich«

15 Mg von Plaamid poUK176 werden mit PvuII digeriert. Das 379 bp-PvuII-Fragment wird von anderen Fragmenten auf einem 1,5 %igen Agarosegel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3* getrennt. Die DKA wird elektroeluiert, durch DE52-Ionenaustausohchromatografie (Whatman) gereinigt und durch Ethanol ausgefällt. 1,2 ug von einsträngigen Xhol-Linkern (5'-CCTCGAGG^¹) werden an ihren 5'-Enden phsophoryliert, 10 min bei 75° C erhitzt, während des Abklihlens auf Zimmer" temperatur selbstausgeheilt und bei -20° C gelagert. 0,9 ^g der kinasierten, doppelsträngigen Xhol-Linker werden bei einem 80fachen Molüberschuß mit den stumpfen Enden des 379 bp-PvuII-Fragmentes von pcUK176 (siehe oben) in 20 μΐ von 60 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM DDT, 3,5 mM ATP und 400 Einheiten von T,-DNA-Ligase (Biolabs) bei 15° C für die Dauer von 16 Stunden ligiert. Das Gemisch wird 10 min bei 85° C erhitzt. Überschüssige Linker-Moleküle werden durch Ausfällung mit 0,54 Volumen Isopropanol bei Vorhaddensein von 10 mM EDTA und 300 mM Natriumazetat, pH-Wert 6,0, für 30 min bei Zimmertemperatur entfernt. Die DNA wird mit Shol und BamHI digeriert. Ein 121 bp-BamHX-XhoI-Fragment wird auf 1,5 %igem Agarosegel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, isoliert. 6 pg von Plasmid pcUK176 werden mit Smal und BamHI digeriert. Es wird ein 1,3 kb-Smal-BamHI-Fragment, das den größten Teil der u-PA 'Kodierungsfolge aufweist, isoliert. 6 jig von Plasmid pCS16 werden mit Smal und Xhol digeriert. Das 2,7 kb-Vektorfragment wird isoliert. Die DNA-Fragmente werden aus dem Gel elektro-

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eluiert und mit Ethanol ausgefällt. 0,2 pMol des 1,3 kb-Smal-BamHI-Fragmentes, 0,2 pMol des 121 bp-BamHI-XhoI-Frag-mentes (beide Fragmente bilden zusammen die volle u-PA-Kodierungsfolge) und 0,1 pMol des 2,7 kb-Vektorfragmentes werden in 10 μΐ von 60 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP und 400 Einheiten von T₄-DNA-Ligase bei 15° C ligiert. Aliquote des Ligationsgemischs von 1 und 3 ul werden zu 100 ,ul von Ga⁺⁺-behandelten Ε± ooli-HB101-Zellen gegeben. Die Transformation wird in der beschriebenen Weise ausgeführt (Hinnen, A. u. a., Proc. Natl. Acad. Sei USA £5, 1929 (1978)). In LB-Medium, das 100 rog/1 Ampizillin enthält, werden 12 ampizillinresistente Kolonien gezogen. Die DNA wird nach Hdmes u. a. (Anal. Biochenu VU^₁ 193 (1981)) isoliert und durch EcoRI-, PvuII- und Xhol-Restriktionsdigestionen analysiert. Die Basmid-DNA eines einzigen Klons mit den erwarteten Restriktionsfragmenten wird als pGS16/UPA bezeichnet.

Auf analoge V/eise wird die Urokinase-cDNA von der Smal-Stelle (Nukleotidpositionen 1-6, Abb. 2) bis zur Pstl-Steile an den Nukleotidpositionen 1637 - I642 (siehe Abbildung 2) in Plasmid pGS16 subgeklont. Plasmid pcUK176 wird mit Pstl digeriert, die kritischen Enden werden in Reaktion mit T4-DNA-Polymerase in stumpfe Enden umgewandelt, wie das von Maniatis u. a. (siehe oben, S. 395) be-.schrieben wurde. Das 1,2 kb-DNA-Fragmen⁺ wird isoliert. Wie oben beschrieben, werden Xhol-Linlr.er zugegeben. Die DNA wird mit BamHI und Xhol digeriert, und es wird ein bp-BamHI-XhoI-Fragment isoliert. 0,2 pMol dieses Fragments werden, mit dem 1,3 kb-Smal-BamHI-Fragment und dem 2,7 kb-Vektorfragment ligiert (siehe oben). Das Ligationsgemisch

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wird zur Transformation von E. coli-HBIOI-Ca -Zellen verwendet. Die Plasmid-DNA eines einzelnen Klons mit den erwarteten Restriktionsfragmenten wird als pG'S16/UPA-13 bezeichnet. Dieses Plasmid enthält die u-PA-cDNA-Einfügung von der Smal-Stelle im 5^f-nichttranalaterierten Bereich (Abb. 1) bis zur Pstl-Stelle an der Nukleotidposition 1641 (Abb. 2) im 3'-nichttranslaterierten Bereich. Der einzige Unterschied zu Plaumid pCS16/UPA ist der erweiterte 3'-nichttranslaterierte Bereich.

Beispiel 2

Konstruktion von Plasmid p3iRIT-12, das den PH05-Proraoter

und die Invertasesiflnalfolge enthält

A) Synthese von Oligodeoxyribonukleotiden für die Invertaseaignalfolge

Vier Oligodeoxyribonukleotide 1-1, 1-2, 1-3 und 1-4 werden durch DNA-Synthetiaatoren (Modell 38OB Applied Biosystems) synthetisiert. Nach dem Deblockieren werden die synthetischen Fragmente auf einem 12 %igen Polyakrylamidgel, das 8 M Harnstoff enthält, gereinigt. Salzfreie, reine Oligodeoxyribonukleotide werden unter Verwendung von Sep Pak (Waters Associates) gewonnen. Diese Fragmente stellen einen Duplex dar, welcher die Invertasesignalfolge mit den häufig verwendeten Hefekodonen kodiert.

Hindlll

EcoRI MetLeuLeuGlnAlaPheLeuPheLeuLeu 1-1 5'AATTCATGXTTTT^XMGXTTTXXTTTTXXTTTT 3' 1-2 3'GTACGAAAACGTTCGAAAGGAAAAGGAAAACCGAC 5'

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AlaGlyPheA.laAlaLysIleSerAla

1-3 5'GGCTGGTTTTGCAGCCMAATATCTGCATCTTAGCGTc V 1-4 3'CAAAACGTCGGTTTTATAGACGTAGAATCGCAGAGCT 5'

Hgal

Xhol

B) Subklonen der Invertasesignalfolge in Plasmid p31

a) Präparation dea Vektors:

1>5 Mg von p3iR/SS-TRA^2 (europäische Patentanmeldung 143 081) werden mit 10 Einheiten EcoRI (Boehringer) in 50 ul von 10 mM Tris.HCl, pH-Y/ert 7,5, 6 mM MgCl₂, 100 mM KaCl, 6 mM Merkaptoethanol eine Stunde lang bei 37° C digeriert. Nach dem Zusatz von 1 /Ul von 2,5 M NaCl wurden 10 Einheiten Xhol (Boehringer) zugesetzt und bei 37° C eine Stunde lang inkubiert. Der 4,2 kb-Vektor wird auf einem 0_y8 %igen päparativen Agarosegel isoliert. Die GeI-soheibe wird auf ein Micro Collidor-Rohr (Satorius GmbH) gebracht, mit 200 jtil TE bedeckt und elektroeluiert (50 Minuten lang bei 90 mA elektrophoretisiert). Die TE-Lösung wurde aufgefangen und in 2..5 Volumen absoluten Ethanols nach dem Zusatz von 0,1 Volumen 10 χ TNE ausgefällt. Das DNA-Pellet wird mit kaltem, 80 %igen Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die DNA wird in 6 ^m TE (40 pMol/μΙ) wieder zur Suspension gebracht.

b) Ausheilung der Oligodeoxyribonukleotide (1-1, 1-2, 1-3

1-4)« Kination und Ligation mit dem Vektor

Eine Lösung, die 10 pMol jedes der vier Deoxyribonukleotide in 10 μΐ von 0,5 M Tris.HCl, pH-Wert 8, enthält, wird bei 95° C 5 min auf einem Wasserbad inkubiert. Das Wasserbad wird langsam auf 30° C über eine Zeitspanne von 5 Stun-

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den abgekühlt. Diesem ausgeheilten Gemisch werden 2 μΐ von jeweils 0,1 M MgCl₂, 0,1 M NaCl, 30 mM DTT, 4 mM ΑΊΤ und 8 Einheiten (1 ul) Polynukleotidkinase (Boehringer) zugesetzt. Die Kination erfolgt bei 37° C für die Dauer von einer Stunde. Die ausgeheilten, kinasierten Oligodeoxyribonukleotide und 60 pMol von p3iR/SS-TPA_2-EcoRI-XhoI-geschnittenem Vektor (1,5 /Ul) werden mit 400 Einheiten (1 μΐ) von T4-DNA-Ligase (Biolabs) bei 14° C 17 Stunden lang Iigiert. Die Reaktion wird durch Inkubation bei 65° C für die Dauer von 10 min gestoppt. 10 μΐ dieses Ligationsgemischs werden für die Transformation von E._coli-HBi01-Ca⁺⁺-Zellen verwendet (Dagert, M. und Ehrlich, S. D., Gene 56, 23 - 28 (1979))· Herausgenommen werden 20 amp -Kolonien. DNA wird durch Schnellisolationsverfahren hergestellt (Holmes, D. S. und Quigley, M., Anal. Biochem. V\£, 193 - 197 (1981)J_. Die DNA wird mit EcoRI und Xhol digeriert, am EcoRI-Ende radiomarkiert und auf einem 6 %igen Poylakrylamidgel, das 8 M Harnstoff enthält, unter Verwendung der radiomarkierten, pBR322-HaeIII-geschnittenen DNA als Marker analysiert. Für die DNA, die von allen 20 Klonen gewonnen wurden, werden korrekte Grb'ßenbänder beobachtet.. Ein Klon wird in 100 ml LB-Medium, das 100 Mg/ml Ampizillin enthält, gezogen. Die Plasraid-DNA wird isoliert und als p3iRIT-12 bezeichnet.

Beispiel 3

Konstruktion von Plasmis pJDB2O7/PHO5-I-UPA (Abb. 5)

PJDB207/PH05-I-UPA enthält den PHP5-Promoter, die'lnvertasesignalfolge, die Kodierungsfolge der reifen Urokinase und den PH05-Transkriptionsterminator in einer Tandem-Anordnung, die in den ρJDB207-Hefeexpressionsvektor geklont ist.

20 μβ von Plasmid pCSi6/UPA werden bis zur Vollendung mit 40 Einheiten von EcoRI digeriert. Nach der Phenolextraktion und der Ethanolausfällung wird die EcoRI-digerierte DNA bei 65° C weiter durch Taql geschnitten. Die resultierenden Fragmente werden auf einem präparativen, 1,2 %igen Agarosegel getrennt. Das 462 bp-Taql-ScoRI-Fragment wird durch Elektroeluierung aus dem Gel und Ethanolausfällung isoliert.

Ein Oligodeoxyribonukleotid-Linker mit der Formel

(I) 5'-OTGCAAGCAATGAACTTCATCAAGTTCCAt-O'

(II) 3¹- TCGTTACTTGAAGTAGTTCAAGGTAGC-^'

wird mit der Taql-Stelle des DNA-Fragments ligiert. Der Linker stellt den 5'-Terminus der Kodierungsfolge des reifen u-PA (Nukleotide 130 - 154, Aüb. 2) wieder her und bewirkt die Inrahmenfusion auf die Invertasesignalfolge. Die 5'-CTGOA-Folge des Linkers füllt das entsprechende ausgesparte 3'-Ende der Invertasesignalfolge, die durch Hgal-Spaltung entstanden ist.

300 pMol jedes der 01igcdf_:soxynukleotide I und II werden ßhosphoryliert und ausgeheilt. 5*25 >ig (600 pMol) der phosphorylierten, doppelsträngigen Linker-DNA werden mit 1,7 μβ (5,6 pMol) des 462 bp'Taql-EcoRI-Fragmentes (siehe oben) in 175 ul von 60 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM ATP, 5,mM DTT und 800 Einheiten von T4-DNA-Ligase bei 15° C über die Daue.v von 16 Stunden ligiert. Die T4-DNA-Ligase wird 10 u.in lang bei 85° C inaktiviert. Der Überschuß an Linkern wird durch Ausfällung bei Vorhandensein von 10 mM EDTA, 300 mM Natriumazetat, pH-Wert 6,0, und 0,54 Volumen I sopropanol entfernt. Die DNA wird mit Pstl digeriert.

- 39 -

Es wird ein einzigartiges 312 bp-Fragment isoliert, das den Linker enthält, der an die DNA-Folgen mit der Kodierung für u-ΡΛ bis zum Nukleotid 436 gebunden ist (Pstl-Stelle, siehe Abb. 2). Das DNA-Fragment wird durch Elektroeluierung und Ausfällung mit Ethanol gereinigt»

Plasmid pCS16/UPA wird mit Xhol und Ps+^T digeriert. Es wird ein 1007pb-PstI-XhoI-Fragment isoliert uud gereinigt. Dieses Fragment enthält den größten Teil der Kodierungsfolge für Urokinase.

Plasmid p3iRIT-12 (siehe Beispiel 2) wird mit SaH und Xhol digeriert. Aus dem Gel wird durch Elektroeluierung und Ethanolausfüllung ein 882 bp-Sall-XhoI-Fragment isoliert. Das Fragment wird mit BamHI und Hgal weiter digeriert. Es wird ein 591 bp-BamHI-Hgal-Fragment isoliert, das den PHOj?-Promoterbereich und die Invertasesignalfolge enthält.

Plasmid pJDB2O7/PHO5-TPA 18 (siehe europäische Patentanmeldung 143 081) wird mit BamHI und Xhol digeriert. Auf einem präparativen, 0,6 %igen Agarosegel in Tris-Azetat-Puffer, pH-Wert 8,2, wird das 6,8 kb-Vektrofragment isoliert. Die DNA wird elektroeluiert und mit Ethanol ausgefällt.

Alle DNA-Fragmente werden in einer Konzertration von 0,1 p-Μοί/μΐ in HgO wieder zur Suspension gebiacht, 0,2 pMol des 591· bp-I'jmHI-Hgal-Fragmentes, 0,2 pMol des 312 bp-Hgal-Pstl-Fraynentes, o,2 pMol des 1007 bp-Pstl-XhoI-Fragmentes und 0,1 pMol des 6,8 kb-BamHI-KhoI-Vektorfragmentes werden 15 Stunden lang bei 15° G in 10 μΐ von 50 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 1 mM ATP und 400 Einheiten von Τ--DNA-Ligase ligiert. Es wird ein μΐ des Ligationsgemischs

27*0

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zur Transformation von E« coli-HB101-Ca -Zellen verwendet. Es werden 12 amp -Kolonien herausgegriffen und in LB-Medium gezogen, das 100 mg/1 Ampizillin enthält. DNA wird durch das Schnellisolationsverfahren hergestellt (Holmes, D. S. u. a,, Anal. Biochem. V\£> 193 (1981)). Bei Restriktionsdigerierungen der Plasinid-DNA mit Hindlll und EcoRI werden die erwarteten Restriktionsfragtnente beobachtet. Die Plasmid-ÜM eines einzelnen Klons wird ausgewählt und als pJDB2O7/PHO5-I-UPA bezeichnet.

Beispiel 4 Konstruktion von Plasmid pJDB2O7/PHO5-UPA

Die&e Konstruktion umfaßt den PHOJj-Promoter, die PHOJj-Signalfolge, die im Rahmen mit der Kodierungsfolge der reifen Urokinase gebunden wird, und d*"n PHO^-Tr anslcript ions terminator, der in den ρJDB2O7-Hefevektor geklont wird.

Ein Oligodesoxyribonukleotidlir-.ker mit der Formel (I) 5'-CCAATGCAAGCAATGAACTTCATCAAGTTCCAT-3·

(II) 3'-ggttacgttcgttacttgaagtagttcaaggtagc-s·

bringt 8 Hukleotide (5'-CCAATGCA) der PHOJj-Signalfolge (von einer internen Ball-Stelle bis zur Verarbeitungsstelle) und bewirkt die Inrahmenfusion an die Kodierungsfolge de3 reifen u-PA (Hukleotirtpositionen 130 - 154, Abb. 2). Der Linker wird an die TaqT.-Stelle des 462 bp-Taql-EcoRI-Fragmentea von pCSi6/UPA (siehe Beispiel 3) ligiert. Phosphorylierung, Aush )ilung und Ligation erfolgen wie im Beispiel 3. Die DNA wird mit Ball und Pstl digeriert, ß3 wird ein 315 bp-Fragment isoliert. Das DNA-Fragment enthält die DNA-FoI-

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ge des u-PA-Gend bis zur Pstl-Stelle in der Position (Abb. 2).

Plasrnid p31 (siehe europäische Patentanmeldung 100 561) wird mit Ball und BamHI digeriert* Es wird ein 584 bp-BamHI-Ball-Fragment isoliert, das den PH05-Promoter und den größten Teil der PKOJ>=Signa !folge enthält, Die DNA-Fragmente werden durch Elektroeluierung und DE52-Chromatografie gereinigt, mit Ethanol ausgefällt und in H-O mit einer Konzentration von Ο,',¹ pMol/^μΙ wieder zur Suspension gebracht.

Es werden 0,2 pMol des 584 bp-BamHI-Ball-Fraginents, 0,2 pMol des 315 bp-F-all-Pstl-FriSgments, 0,2 pN'ol des 1007 bp-Pstl-Xhol-Fragments (siehe Beispiel 3) und 0,1 pMol des 6,8 kb BamKI-XhoI-Vektrfragmonts (siehe Beispiel 3) Iigiert und zur Transformation von E. coIi ΗΒ10Ί verwendet.

Sechs amp Kolonien werden herausgenommen und in LB-Medlum gezogen, das 100 mg/1 Ampicillin enthält. Plaamid-DNA wird durch das DNA-Schnellverfahren hergestellt uncl durch BamHI/-Pstl-Doppeldigestion analysiert. Ss wird ein einzelnes Klon mit den erwarteten Restriktionfragmenten ausgewählt, und das Plasmid wird als ρ J DB 2 07/PHOJ)-UPA bezeichnet,

Beispiel 5

Konstruktion von Plasmid pJDB2O7/PHO5-SSUPA

Dieses Piasmid enthält das Urokinase-Gen mit der eigenen Signalfolge unter der Kontrolle des PH05-Promoters im Hefeexpressionsvektor pJDB2O7·

Zwanzig Mikrogramm von Plasmid pCS16/U?A-13 (siehe Beispiel

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1) werden bis zur Vollendung mit 100 Einheiten von BgII (Nukleotidpoaitionen 76 - 86, Abb. 2) digeriert. Die resultierenden 3 Fragmente werden auf einem prüparativen, 1 %igen Agarosegel in Tris-Borat-EDTA-Puffer, pH-Wert 8,3, getrennt. Das 1,7 kb-Bgll-Fragment wird elektrceluiert und mit Ethanol ausgefällt.

Ein Oligodesoayribonukleotid-Linker mit der Formel

(I) 5'-AATTCGATTAGGAATGAGAGCGGTGG-3^f

(II) 3¹- GCTAATGGTTACTCTCGGG -5'

hat eine EcoRI-Stelle, die an die 8 Nukleotide des PHP5-5^f-nichtkodi9?enden Bereichs vor der ATG und den Nukleotiden 70 - 82 (Abb. 2) der Kodierungsfolge von u-PA, einschließlich ATG, gebunden iat. Der Linker wird an die BgII-kritischen Enden der DNA ligiert, wie das im Beispiel 3 beschrieben wurde. Die DNA wird mit EcoRI und Pstl digeriert.

Es wird ein 380 bp-Fragment isoliert, das aus der u-PA-Signalfolge und einem Teil der Kodierungsfolge für den reifen u-PA bis zum Nukleotid 436 (Pstl-Stelle, Abb. 2) besteht.

Plasmid p31R (siehe europäische Patentanmeldung 100 561) wird mit BamHI und EcoRI digeriert, und das 534 bp-BamHI-EcoRI-Fragment wird isoliert und weist das PH05-Promoter auf. Aus dem Agaros^gel werden DNA-Fragmente elektroeluiert, durch DE52-Ghromatografie gereinigt, mit Ethanol ausgefällt und in H₂O mit einer Konzentration von 0,1 pMol/jul wieder zur Suspension gebracht.

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Es werden 0,2 pMol des 534 bp-BamHI-EcoRI-Fragments, 0,2 pMol des 380 bp-EcoRI-Pstl-Fragments, 0,2 pMol des 1007 bp-Pstl-Xhol-Fragments (siehe Beispiel 3) und 0,1 pMol des 6,8 kb-BamHI-XhoI-Vektorfragments (siehe Beispiel 3) ligiert und zur Transformation von E. ooli-HB101-Ca⁺ -Zellen verwendet. In LB-Medium, das 100 mg/1 Ampizillin enthält, werden 12

amp Kolonien gesondert gezogen» DNA wird durch das Schnell-DNA-Verfahren hergestellt und durch BamHI und EcoRI analysiert. Plasmid-DNA von einem einzelnen Klon wird auogewählt und als pJDB2O7/PHO5-SSUPA bezeichnet.

Beispiel 6

Konstruktion von Plasmid pJDB2O7R/PHO5-UPA

Die Kodierungsfolge von reifer Urokinase wird an den PHOj?- Promoter gebunden. In diese Konstruktion, die zu Vergleichszwecken ausgeführt wurde, ist keine Signalfolge einbezogen.

Ein Oligodesoxyribonukleotid-Linker mit der Formel

(I) 5^-AATTCATGAGCAATGAACOTCATCAAGTTCCAt -V

(II) V- GTACTCGTTACTTGAAGTAGTTCAAGGTAGC-5'

enthält ein ATG und Nukleotide 130 - 154 von u-PA (siehe Abb. 1), welche die Aminosäuren Ser1 bis Ser9 der reifen Urokinase kodieren. Die Oligonukleotide werden phosphoryliert, ausgeheilt und an das 462 bp-Taql-EcoRI-Fragment von pCS16/UPA (siehe Beispiel 3) ligiert. Die DNA wird mit EcoRI und Pstl digeriert. Ss wird ein 315 bp-EcoRI-Pstl-Fragment isoliert, welches ATG und die Kodierungsfolge für den reifen u-PS bis zur Pstl-Stelle in Position 436 (Abb. 2) enthält.

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Plasmii p31R (siehe europäische Patentanmeldung 100 561) wird mit BamHI und EcoRI digeriert, und daa 534 bp-BamHI-EcoRI-Fragment wird auf einem präparativen, 1,5 %igen Agarose-Gel isoliert. Dieses Fragment enthält den PH05-Promoter.

Alle DNA-Fragmente werden elektroeLuiert, durch DE52-Chromatografie gereinigt, mit Ethanol ausgefällt und in HgO mit einer Konzentration von 0,1 pMol//ul wieder zur Suspension gebracht. Es werden jeweils 0,2 pMol des 534 bp-BamHI-EcoRI-Fragmentes, des 315 bp-ECoRI-Pstl-Fragmentes und des 1007 bp-Pstl-XhoI-Fragmentes (siehe Beispiel 3) und 0,1 pMol des 6,8 kb-BamHI-XhoI-Vektorfragments (siehe Beispiel 3) ligiert'und wie üblich in E. coli~HP101-Ca⁺⁺ transformiert. Es werden 8 amp Kolonien herauager ^en und in LB-Medium gezüchtet, das 100 mg/1 Aupizillir jnthält. Es wird Plasmid-DNA hergestellt und durch BamtP und EcoRI-Restriktionsdigestionen analysiert. Die Plasiaid-DNA eines einzelnen Klons mit dem erwarteten Restriktionsschema wird als PJDB2O7R/PHO5-UPA bezeichnet.

Beispiel 7

Klonung des Hefe~GAPDH-Gens mit deseen konstitutivem Promo-

ter _m

s) 4^i^b§u_eines_Hefegenarchivs

Dreißig Mikrogramm der gesamten hochmolekulargewichtigen Hefe-DNA (Olsen, M, V. u. a., J. Mol. Biol. 1^2, 387 (1979)) des Sacoharomyces cerevisiae-V/ildtypstammens S288G werden 30 Minuten lang bei. 37° C mit 2 Einheiten EcoRI-Methylase (New England Biolabs) in 250 ^μΐ EcoPLl-Methylierungspuffer, wie das vom Hersteller empfohlen wird, inkubiert. Die DNA

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wird durch Ethanol ausgefällt, in 500 ul von 25 mM Tris. HCl, pH-Wert 8.5, 2 mM MgCl₂ (EcoRI^Ä-Puffer) (Meyer, H., PEBS Lett. ^, 341 (1979)) wieder zur Zuspension gebracht und mit EcoRI (Boehringer) digeriert, bis die Größenverteilung der DNA-Fragmente im 30 bis 50 kb-Bereich ein Maximum hat (eine Xhol-Digestion von XDNA ergibt entsprechende 33 kb- und 17 kb-Marker). Die unter EcoRI^K-Bedingungen digerierte Hefe-DNA wird 6 Stunden lang bei 38 000 U/min in einem Rotor SW 40 auf einem Sukrosegradienten (5 - 20 % Sukrose in 10 mM Tris.HCl, pH-Wert 7,5, 1 mM EDTA) fraktioniert, nach der Größe. Dreißig Fraktionen zu jeweils 0,4 ml werden oben vom Gradienten abgenommen. Fraktior. 16 enthält DNA-Fragmente mit 30 bis 40 Lb in der Größe. Die DNA dieser Fraktion (3 Mg) wird mit Ethanol ausgefällt und 16 Stunden lang bei 15° C in einem Gesamtvolumen -_K von15 μΙ bis 1 /ig des Kosmidvektors pYcl (Hohn, B. u. a. in "Genetic Engineering" (Gentechnik), Bd. 2, S, 169, New York 1980), linearisiert durch BcoRI, ligiert. Die Ligation erfolgt mit 300 Einheiten T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) unter Verwendung des Puffers./stems, das vom Lief er er beschrieben wird. Die DNA wird in vitro in das Bakteriophag λ gepackt (Hohn, B. in "Methods in Enzymology" (Methoden in der Enzymologie), Bd. 68, S. 299, New York, 1979)) und die montierten Phage werden dazu genutzt, den E. coli-Stamm HB101 umzuwandeln, (r^, mf, leiP, pro®, recA). Die Effektivität der Umwandlung beträgt etwa 5000 ampizillinreststente Kolonien je Mikrogramm des pYcl-Vektors. Es werden 3000 amp Kolonien herausgenommen und einzeln in Mikrotiter-Schalen in LB-Medium (10 g Bacto-Tryptone (Difco), 5 g Bacto Hefeextrakt (DiBo), 10 y NaCl), das 100 ug/ml Ampizlllin enthält, gezogen.

274 O

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b) l3olation_des_Hefe₌GAPpH₌aens

Das oben beschriebene Genarchiv wird mit einem synthetischen Oligonukleotid (hergestellt unter Anwendung der Phosphotriestertnethode: Itakura, K« u. a., J. Am. Chem. Soc. SI» 7^-27 (1975); de Rooij, J. F. M. u. a., Reel, Trav. Chim. Pays-Bas %8, 537 (1979)) folgender Struktur gesichtet: 5'-GCTCCATCTTOCACCGOGCC-3'. Es werden 10 μg des Oligonukleotids unter Verwendung von 10 μΐ von f-³²P-ATP (3000 Gi/mMol, 10 μθ±/μ1 Amersham) mit T4-Polynukleotidkinase (Boehringer) kinasiert, wozu ein Gesamtvolumen von 50 ^aI verwendet wird, wie das von Maniatis u. a. ("Molecular Cloning" (Molekularklonung", Cold Spring Harbor Lab., 1982, S. 125) beschrieben wurde. Die Koloniehybridisierung wird so durchgeführt, wie das von denselben Autoren (s. 312) beschrieben wurde. Positive Klone werden durch Autoradiografie unter Anwendung von Kodak-Röntgenfilm X-5 festgestellt. Die Isolierung der Plasmid-DNA (siehe euorpäische Patentanmeldung 100 561) ergibt ein Hybrid-Klon, der ein 2100 bp-Hindlll-Fragment mit der Kodierung für BAPDH enthält (Holland, J. P. u. ac, J, Biol. Chem. ,25J-, 9839 (1979)). Der abschließende Beweis für die Authentizität der geklonten DNA kommt aus einem DNA-Folgebildungsexperiment unter Verwendung des oben genannten Oligonukleotids in Kombination mit dem Dideoxy-Folgebildungsprotokoll, wie das von Hong, G. F. (Bioscience Report3 _1_» 243 (1981) für doppelsträngige DNA beschrieben wurde. Das geklonte GAPDH-Gen hat dieselbe Folge wie pgap49i das von Holland u. a. (J. Biol. Chem. 2jj5_, 2596 (1980)) veröffentlicht wurde.

c) Herstellung_des_GAPDH-Promoterg

Das 649 bp-Taql-Fragment, das Position -27 bis -675 des ATG

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des GAPDH-Gens (siehe Abb. 6) einschließt, wird durch Digerieren des oben genannten Hybridplasmids mit Taql (New England Binlabs), Trennen der DNA-Pr a gtn en te auf einem 1,2 %±- gen, weichen Agarose-Gel und Extrahieren der DNA durch heißes Phenol isoliert· Die Klonung des Taql-Fragments erfolgt in die CIaI-Steile von pBR322: 1 ug von pBR322 werden mit drei Einheiten CIaI (New England JBiolabs) gespalten, wie daa vorn Lieferer beschrieben wird. Es werden 300 ng des phenolisierten und geschnittenen Vektors mit etwa 300 ng der Sinfühungs-DNA (649 bp-Taq-Fragment) unter Verwendung von 200 U von T4-DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen von 20 μΐ Iigiert. Die Transformation erfolgt zur Ampizillinresistenz in E. coli HB101« es wird Plasmid-DNA hergestellt und durch Restriktionsaralyse (Taql, Dral) analysiert. Die Orientierung des Taql-Pragments wird unter Verwendung der Restriktionsendonuklease Dral in Kombination mit der BamHI-Stelle der Plasmide ermittelt, und es wird ein Plasmid ausgewählt, bei dem die Taql-Stelle der Position -675 dicht bei der Hindlll-Stelle von pBR322 liegt. Dieses als pßR322/GAPDH bezeichnete Plasmid wird unter Anwendung von BamHI (New England Biolabs) lineariaiert. Die DNA wird in 10 mM Tris, pH-Wert 8,0, bei einer Konzentration von 0,5 JAg/ml wieder zur Suspension gebracht. Es werden 16 ug der Sall-gespaltenen DNA mit 2 Einheiten von Exonuklease Bal31 (BRl) in 100 ul von 20 mM Tris, pH-Wert 8,0, 199 mM NaCl, 12 mM MgCl₃ 12 mM CaCIp und 1 mM EDTA digeriert. Aliquote von jeweils 2 ug DNA werden nach 1, 2, 3, 4, 5 und 6 Minuten d.-τ Inkubation bei 30° C entnommen und sofort mit 50 μΐ Phenol und 60 μΐ TNE gemischt. Nach der Extraktion mit Phenol/Chloroform und der Ethanolausfällung wird die DNA in 10 mM Tris,

- 48 ~

pH-Wert 8,0, bei einer Konzentration von 100 Mg/ml wieder zur Suspension gebracht. Um das Ausmaß der exonukleolytischen Spaltung durch Bal3i zu analysieren, werden 0,5/ig der DNA von jedem Entnahmezeitpunkt mit Endonuklease BamHI digeriert und auf einem 1,5 %igen Agaross-Gel in Tris-Borat-Puffer, pH-Wert 8,3 (90 mM Tris.HCl, pH-Wert 8,3, 90 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA), analysiert. Im Durchschnitt werden von jedem Ende des Fragments je Minite der· Bal31-Digestion 100 bp entfernt.

Bglll-Linker ^'-GGAGATCTCC^') werden phosphoryliert, ausgehielt und an Ba131-behandelte DNA-Pragmente ligiert. Überschüssige Linker werden durch Ausfällung mit Isopropanol entfernt. Die DNA wird mit BgIII digeriert und bei einer Konzentration von 5 ,ug/ml in einem Gesamtvolumen von 20 μΐ direkt zirkulärisiert. Die Größe des Ba131-gekürzten Taq1-Fragments wird durch Restriktionsanalyse (unter Verwendung von BgIII und Hindlll) bestimmt. Es werden drei Klone ausgewählt. Diese enthalten DNA-Pragmente, die sich etwa über 200 bp, 265 t>p und 540 bp von ATG oberhalb in den GAPDH-Promoter erstrecken. Alle drei Fragmente enthalten die präsumptive TATA-Box bei etwa -140 bp. Diese Klone enthalten noch den Ursprung der Replikation im pBR322-abgeleiteten Teil der DNA und werden als pGAPDH-F, pGAPDH-E bzw. pGAPDH-D bezeichnet.

Um die GAPDH-Promot er element e von der Taql-Stelle an der Position -27 bis zu einer Position unmittelbar neben ATG des GAPDG-Gens zu erweitern, werden aei synthetische komplementäre Oligonukleotide mit der folgenden Struktur synthetisiert:

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5' GGAATAAACACACATAAATAAAG 3' V TTATTTGTGTGTATTTATTTCTTAA 5'

Diese Oligonukleotide versehen die reine GAPDHrPromoterfolge von der Position -26 bis zur Position -5 mit der Erzeugung einer terminalen EcoRI-Stelle. Zwei Mikrogramm der Plasmide pGAPDH-F, pGAPDH-E und pGAPDH-D werden jeweils mit 6 Einheiten von Taql in 50^1 digeriert, und das resultierende Gemisch wird phenolysiert, mit Ethanol ausgefällt und in 10 ^l Wasser wieder zur Suspension gebracht. Die synthetischen Oligonukleotide werden durch Mischen von 2 μ\ einzelnen Strangs in 10O₇Ul einer Lösung, die 10 mW! Tris.HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl₂ und 50 mM NaCl enthält, dreiminütiges Erhitzen auf 90° C und langsames Abkühlen der Lösung auf Zimmertemperatur (innerhalb von etwa 3 Stunden) geheilt. Ein Mikrogramm des Taql-cLigerierten Plasmids wird mit etwa einem zwanzigfachen Molüberschuß der ausgeheilten Oligonukleotide in einem Volumen von 20 μΐ gemischt und für etwa 18 Stunden unter Verwendung von 800 Einheiten der T4-DNA-Ligase ligiert. Nach dem Inaktivieren der Ligase wird das gesamte Gemisch mit 3 Einheiten von BgIII (New England Biolabs) digeriert. Die BgIII-EcoRI-Fragmente von etwa 200 bp, 265 bp bzw. 540 bp werden auf einem weichen, 1,5 %igen Agarose-Gel getrennt, aus dem Gel extrahiert und mit Ethanol ausgefällt.

Plasmid p31RIT-12 (siehe Beispiel 2) wird mit BamHI und EcoRI digeriert. Das 3,6 kb-Vektorfragment wird isoliert. Dieses Fragment wird dazu genutzt, die 200 bp-, 265 bp- und 540 bp-BGlII-EcoRI-GAPDH-Promoterfragmente zu klonen. Ligation, Transformation und Plasmidieolation werden unter den gleichen Bedingungen wie oben ausgeführt. Plasmide mit

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den korrekten Einfügungen werden als p3iGAPPL-IT, p31GAPEL-IT bzw. p31GAPDL-IT bezeichnet (Abb. 7).

Die DNA-Polgen der BgIII-EcoRI-Pragmente der Plasmide p31GAPPL-IT, P31GAPEL-IT und p31GAPDL-IT werden in der Abb. 8 gezeigt. Die exakte Größe dieser Fragmente beträgt 202 bp, 267 bp bzw. 544 bp.

Beispiel 8 Konstruktion von Plasmid pJDB2O7/GAPDL-I-UPA (Abb. 9)

Dieses Plasmid enthält den BAPDH-D-Promoter, die Invertasesignalfolge, die Kodierungsfolge der reifen Urokinase und den PH05-Transkriptionsterminator in einer Tandemanordnung im Shuttle-Vektor pJDB2O7.

Plasmid-DNA von p31GAPDL-IT wird mit Sail und Hindill digeriert. Ein 0,8 kb-Sall-Hindlll-Pragment wird auf einem präparativen, 1,0 %igen Agarose-Gel abgetrennt. Dieses Fragment enthält den GAPDH-D-Promoter und einen Teil der Invertasesignalfolge.

Plasmid pJDB2O7/PHO5-I-UPA wird mit Hindill und BamHI digerieret. Das 1239 bp-Hindlll-BamHI-Fragment weist den restlichen Teil der Invertasesignalfolge und den größten Teil der u-PA-Kodierungsfolge auf. Außerdem wird pJDB2O7/PHO5-I-UPA mit Sail und BamHI digeriert. Das große, 6,6 kb umfassende Vektor:"ragment wird auf einem präparativen, 0,6 %igen Agarose-Gel in Tris-Azetatpuffer, pH-Wert 8,2, isoliert.

Die DNA-Pragmente werden durch Elektroeluierung aus dem Gel isoliert, durch DE52-Chromatografie gereinigt und mit Etha-

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nol ausgefällt. Da3 0,8 kb-Sall-Hindlll-Fragment, das 1239 bp-Hindlll-BamHI-Fragment und das 6,6 kb-Sall-BamHI-Vektorfragment werden ligiert und zur Transformation von E. coli-HB1O1-Ca⁺⁺-Zellen verwendet. Plasmid-DNA von 6 amp^R Transformanten wird durch Hindlll- und Sall-Reatriktionsdigestionen analysiert. Plasmid-DNA von einem einzelnen Klon mit den erwarteter. Reatriktionsfragmenten wird als pJDB2O7/ GAPDL-I-IPA bezeichnet.

In einer analogen Konstruktion wird ein 493 bp-Sall-Hindlll-Fragment des Plasmiden p3iGAPPL-IT (siehe Beispiel 7) isoliert und zur Ligation verwendet. Die resultierende Plasmid-DNA wird als ρJDB2O7/GAPPL-I-UPA bezeichnet.

Auf analoge Weise wird pJDB2O7/GAPEL-I-UPA konstruiert.

Beispiel 9 Konstruktion von Plasmid ρJDB2O7/GAPDL-UPA (Abb. 10)

Eine Tandemanordnung, welche den GAPDH-D-Promoter, die PH05-Signalfolge, die Urokinasekodierungsfolge und den PHP 5-Trnaskriptionsterminator aufweist, wird in den Hefe-Shuttle-Vektor PJDB2O'" geklont.

Es werden 20 ,ug von Plasmid ρJDB207/PHOJj-UPA mit BgIII und Sail digeriert. Die beiden resultierenden Fragmente werden auf einen präparativen, 0,8 %igen Agarose-Gel in Tris-Azetatpuffer, pH-Wert 8,2, getrennt. Die 7,6 kb- und 1,1 kb~ Bgill-Sall-Pragmurice werden isoliert. Das 1,1 kb-Fragment wird mit Dral .vuiter digeriert. Nach der Phenol/Chloroformextraktion und ier Ausfällung mit Ethanol werden 3,5 pMol der DNA mit einem lOOfachen Überschuß eines kinasierten und

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ausgeheilten Oligodesoxyribonukleotid-Linkejs mit der Formel

5·-AATTCGATTACCAATGTTT-3^f 3·- GCTAATGGTTACAAA_5'

mit einer EcoRI-Stelle und 8 Nukleotiden des PHOJ3-5^f-nichtkodierenden Bereichs vor ATG und einem Teil der Dral-Erkennungöfolge ligiert.

Nach der Ligation über 16 Stunden bei 15° C wird die Ligase inaktiviert, überschüssige Linker werden durch Isopropanol-Ausfällung (0,54 Volumen) bei Vorhandensein von 300 mM Natriumazecat, pH-Wert 6,0, und 10 mM EDTA entfernt. Die DNA wird mit BgIII und ECoRi digeriert. Es wird ein 326 bp-EcoRI-Bglll-Fragment isoliert*

Plasmid p31GAPDL-IT wird mit Sail und EcoRI digeriert, ein 0,75 kb-Sall-ScoRI-Fragment wird isoliert.

Die DNA-Fragmente werden durch Elektroeluierung aus Agarose-GeI isoliert, durch DE52-Chromatografie gereienigt und mit Ethanol ausgefällt. Es werden 0,2 pMol des 0,75 kb-Sall-EcoRI-Fragments, 0,4 pMol des 326 bp-Ecolll-Bglll-Fragments und 0,1 pMol des 7,6 kb-Sall-Bglll-Vektorfragments für die Dauer von 5,5 Stunden bei 15° C ligiert. Es werden 1 ul des Ligationageuiiöchs für die Urnwandlung von E. coli~HB101-Ca^T1~- Zellen verwendet.

•n

Es werden 10 amp Transformanten gezogen und die Plasmid-DNA gewonnen. Die Plasmid-DNA >d durch EcoRI-Restrikti^nsdigestionen analysiert. Plasmid-DNA von einem einzelnen Klon mit dem erwarteten Restriktionsschema wird als pJDB2O7/GAPDL-UPA bezeichnet.

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Auf analoge Weise werden die Plasmide ρJDB207/GAPPL-UPA und PJDB2O7/GAPEL-UPA hergestellt.

Beispiel IO

Konstruktion von Plasmid -pDP3fl (Abbildungen 11 und 12)

Aus dem Saooharomyces cerevjgiae-Stamm S288C werden durch Digestion der Zellwand mit 5 >ig/ml Zymolase, 100 000 Einheit en/>ig, bei 37° C für die Dauer von 20 min und anschließendes Auflösen der Zellen mit 2 % SDS 2 Mikron kovalent geschlossene Kreis-DNA isoliert. Es wild EDTA bis zu 25 mM zugesetzt, Cäaiumchlorid bis zu einer Enddichte von 1,55 g je Milliliter, Ethidiumbromid bis zu 1 mg/ml, und das Ganze wird in ein Rohr einer Zltrazentrifuge übertragen. Plasmid-DNA wird aus der Ohromosomal-DNA durch Ultrazentrifugieren für die Dauer von 42 Stunden bei 42 000 U/min und 15° C abgetrennt. Die 2 Mikro Plasmid-DNA werden aus dem Gradienten mit einer Spritze geschnitten. Das Ethidiumbromid wird mit NaCl-gesättigtera Isopropanol entfernt, und die Plasmid-DNA wird abschließend mit Ethanol ausgefällt. Dann wird die gereinigte Plasmid-DNA mit Pstl lineariaiert und in die Pstl-Stelle von pUCi9 geklont (Norrander, J. u. a., Gene J^, 101 (1983)), um Plaomid pDP3i zu ergeben. Plasmid P0DB2O7 wird mit den Enzymen Kpnl und Hpal digeriert. Das resultierende 0,55 kb-Pragment wird gereinigt und in das 4,24 kb-Kpnl-Hpal-Pragment von Plasmid pUC7/LEU2 (ein Plasmid, das das 2,2 kb-Xhol-SalI-LEU2-genomische Hefegen enthält (Andreadis A. u. a., Cell 21» 319 (1982), geklont in die Sall-Stelle von Plasmid pUG7 (Vieira J. u. a., Gene Jj) 259 (1982))) geklont. Das ergibt Plasmid pDP30, in welchem die ursprünglich 2 Mikron/LEU2-Pusion wie im Plasmid pJDB2O7 vor dem LEU2-Gen and dessen kompletten Terminator angeordnet

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wird. pDP3O wird mit Hpal und Sail digeriert, und das 1,85 kb-Pragment, welches das komplette JjEU2-Gen enthält, wird gereinigt und in das 8,7 kb-Hpal-Sall-Fragment von Plasmid PdP3i geklont. Dan resultierende Plasmid, pDP33, wird mit Hindill bei Vorhandensein von 50 Mg/ml Ethidiumbromid linearisiert (Oesterlund, M. u. a., Gene 20, 121 (1982)) und mit dem 1,17 kb-Hindlll-Fragment ligiert, welches das URA3-Gen enthält (Rose, M. u. a., Gene 2__, 113 (1984)). Die positive Einfügung des URA3-Gena wird vorbereitet durch Auswahl durch Transformation in den B. coli-Stamm pyrf (Rose, M. u. a., ebenda). Das ergibt Plasmid pDP34. pDP34 wird mit Enzym SphX digeriert. Das resultierende 8,4 kb-Fvagment wird gereinigt und selbstligiert, um Plasmid pDP38 zu ergeben.

Beispiel 11

Konstruktion der Plasmide pDP38/GiIPDL-I-UPA und pDP38/GAPDL-

UIA

Vektor pDP38 (aiehe Beispiel 10) enthält die Gene LEU2 und URA3, die pBR322~Folgen und einen Teil der Hefe-2-Mikron-DNA. Plasmid pE?38 wird mit BamHI linearisiert. Die resultierenden kritischen Enden werden in einer Reaction mit KIenow-DNA-Polymerase gefüllt (Maniatis u. a., S. 113, siehe oben). Die DNA wird weiter bis zur Vollendung mit Sail ungeriert und das große 8,4 kb-Fragment wird isoliert.

Mind Hindill (1 Einheit/ug DNA) werden bei Vorhandensein von 10 μg/ml Ethidiumbromid bei 37° C für die Dauer von 28 min 10 Mg des Plasmids pJDB207/GAPDI-I-UPA teilweise digeriert. Die Reaktion wird durch den Zusatz von EDTA bis zu einer Endkonzentraion von 10 mM gestoppt. Die kritischen Enden werden in Reaktion mit Klanow-DNA-Polymerase gefüllt. Die DKA wird weiter mit Sail digeriert. Es wird ein 2,2 kb-Sall·¹·

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\.HindIIl] /stumpf endigea Fragment isoliert.

Die gereinigten ΙΛίΑ-Pragmente werden ligiert und in E. ooli HB1O1~Ca⁺⁺-Zellen transformiert. Es werden 24 amp Kolonien gezogen. Es wird Plasmid-DKA hergestellt und durch EcoRI- und Sall/Hindlll-Restriktionsdigestionen analysiert. Die Plasmid-DNA eines einzelnen Klons mit den erwarteten Restriktion3fragraenten wird al3 pDP38/GAPDL~I-UPA bezeichnete

In einer analogen Konstruktion wird ein 2,2 kb stumpfendiges Fragment aus ρJDB2O7/GAPDL-UPA nach der kompletten Hindlll-Digestion, Klenow-DwA-rclymerasereaktion und Sall-Digestion isoliert. Dieses Fragment wird wie oben beschrieben in pDO38 ligiert. Ein einzelnes Klon wird als PDP38/GAPDL-UPA bezeichnet.

Auf analoge Weise werden die 2,2 kb-SalI-[HindIIlj/stumpfend igen Fragmente von ρJDB2O7/GAPEL-I-UPl, ρJDB2O7/GAPFL-I-UPA, pJDB2O7/GAPEL-UPA und pJDB2O7/GAPFL-UPA isoliert. Die gereinigten Fragmente werden in pDP38 ligiert. Das Ligationsgemisch wird zur Transformation von E. uoli HbIOI verwendet.

Die Plasrnid eines einzelnen Klons wird dann eis pDP38/GAPEL-I-UPA, PDP38/GAPFL-I-UPA, pDP38/GAFEL-UPA bzw, pDP38/GAPFL-UPA bezeichnet.

Beispiel 12

Transformation der Stämme S. cerevisiae HT246 und GRF''8

Der Saccharotr.yces cerevisiae-Stamm HT246 (a, his3-11, hia3-i5»

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leu2-3» i§Ü^2>-112_f Prb) wird mit den Plasmiden

ρJDB2O7/PHO^-

ρJDB2O7/PHO^-I-UPA

PJÜB2O7/PHO5-SSUPA

PJDB2G7R/PHO5-UPA

pJDB2O7/GArDL-UPA

pJDB2O7/GAPPL-UPA

pJDB207/GAPDL-I-UPA

unter Anwendung des von Hinnen u» a. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 25» 1929 (1978)) beschriebenen Transformationeprotokolls trailaformiert. Transformierte Hefeziellen werden auf Hefemini.malmedienplatten, denen es an Leuzin fehlt, ausgewählt. Bs werden einzelne transformierte Hefezellen ausgewählt un bezeichnet ala

oaccharomyoes oerevisiae HT246/pJDB2O7/PHOg-UPA eaocharomyces cerevisiae HT246/pJDB2O7/PHO5-I-UPA SaccharoniNcea cerevisiae HT246/pJDB2O7/PHO^-SSUPA SaQcharomyces cerevisiae HT246/pJDB2O7R/PHO5-UPA Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB2O7/GAPDL-UPA Saccharom?:aes cerevisiae HT246/pJDB207/GAPPL-UPA Sacoharomyces cerevisiae HT246/PJDB2O7/GAPDL-I-UPA

Auf analoge Weise wird der Saccharomyces cerevisiae-Stamm GRPI8 (D3M 366^?) mit den oben genannten Plasmiden transformiert. Die resultierenden transformierten Hefestämme werden bezeichnet als

Saccharomyces cerevisiae GRP18/pJDB2O7/PHO5-UPA Saouharomyces cerevisiae GRP18/pJDB2O7/PHO5-I-UPA Saocharomyces cereviaiae GRPI8/pJDB2O7/PHO^-SSUPA

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Saooharotnyces oerevisiae GRF18/pJDB207R/PH0£-UPA Saccharomyoea oerevisiae GRFi8/pJDB207/GAPDL-UPA Saocharomycea cerevisiae GRP18/pJDB2O7/GAPPL-UPA Saocharomycea oerevisiae GRF18/pJDB207/GAPDL-I-UPA

Beispiel 13

Transformation des Stammes Saccharomyces cerevisiae HT35O

S, cerevisiae-Stamm HT35O wird gewonnen durch Kreuzen von S. cerevisiae-Stamm HT246 mit einem ura-»3-defizienten Stamm wie S, cerevisiae HT285 (<#, his3-11, his3-15, ieu2-3, Ieu2-112, ura3, p_ep_4-3), was für Stamm HT35O zu folgendem Genotyp führt («X, his3-11, his3-15, leu.2-3, Ieu2-112, ura3, prb, p_e£4-3). Stamm HT35O wird mit den Plaamiden pDP38/GAPDL-I-UPA, pDP38/GAPPL-I-UPA, pDP38/GAPEL-I-UPA, pDP38/GAPDL-UPA, pDB38/GAPFL-UPA bzw. pDP38/GAPEL-UPA unter Anwendung des Tranaformationsprotokolls von Hinnen u. a. (ebenda) transformiert. Die transformierten Hefezellen werden auf Hdfe-Minimalmedienplatten, denen es an Urazil fehlt, ausgewählt und mit Leuzin supplementiert. Einzelne transformierte Hefekolonien werden isoliert und bezeichnet als

Saccharomyces cereviaiae HT35O/pDP38/GAPDL-I-UPA Saocharomyces ce.revisiae HT35O/pDP38/GAPFL-I-UPA Saccharomycea cerevisigre HT35O/pDP38/DA?EL-I-UPA Saocharomyces cereviaiae HT35O/pDP38/GAPDL-UPA Saccharomyces cereviaiae HT35O/pDP38/GAPFL-UPA Saccharomyces cerevisias HT35O/pDP38/GAPEL-UPA

Beispiel 14 Fermentierung von transformierten Hefestämmen

Saccharomyces oeregLsiae HT246/pJDB2O7/PHO5-UPA.

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Saccharemyoes cerevisiae HT246/pJDB2O7/PHO5-I-UPA und Saccharomycea oerevisiaB HT246/pJDB2O7R/PHO5-I-UPA

enthalten Plaamide mit der vollen Länge des PH05-Promoters und brauchen eine DerepresSion des Promoters für die Expression des scu-PA. Zellen der S. cerevisiae-HT246-Transformanten werden jeweils in 10 ml Hefe-Minimalmediam (Difco-Hefe-Stickstofibase, ohne Aminosäuren, der 2 % Glukose und 20 mg je Liter L-Histidin zugesetzt werden) in einem 50 ml-Erlenrneyerkolben unter Schütteln bei 30° C für die Dauer von 24 Stunden gezogen, bis eine Dichte von 5 bis 7 χ 10 Zellen je Milliliter erreicht ist. Die Zellen der Vorkultur werden dann in 0,9 %igem NaGl gewaschen, und 20 % der Vorkulturzellen werden zur Impfung von 50 ml eines Minimalmediums mit niedrigem P^ verwendet, welches nach der Rezeptur des Difco Yeast Nitrogen Base-Mediums (ohne Aminosäuren) hergestellt wurde, aber 0,03 g/l KH₂PO₄, 10 g/l L-Asparagin anstelle von (NH₄^SO₄, 20 g/l Glukose und 1 g/l L-Histidin enthält. Die Kulturen werden bei 30° C bis zu 48 Stunden mit 180 U/min gerührt. Es werden Enddichten von 1 χ 10⁸ Zellen je Milliliter (^ OD₆₀₀ =4-5) erreicht.

Hefetransformanten, die Plasmide mit dem GAPDH-Promoter von unterschiedlicher Länge aufweisen, expressieren den scu-PA konstitutiv.

Entsprechende Transformanten, die pJDB2O7-abgeleitete Plasmide enthalten, werden in der Hefe-Minimalmediutn-Vorkultur (siehe oben) gezogen. 20 % der gewaschenen Vorkultur werden in 50 ml des komplexen Hauptkulturmediums geimpft, das aus Pepton 5, Hefeextrakt 10, Glukose 20, Sukrose 40, (NHJ₂SO₄ 3, KH₂P0₄2, MgSO₄ 0,5, NaCl 0,1, GaOl₂ 0,1 und Biotin 10 jug/l

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besteht. Nach 48 Stunden Inkubation bei 30° C und 200 U/min erhält man etwa 1 χ 10 Zellen/ml (^O

Entsprechende Transformanten, die pDP38-abgeleitete Plasmide aufweisen, werden unter Urazit-Selektion kultiviert. Die Zellen werden 24 Stunden bei 30° G und 180 U/min in einem Vorkulturmedium gezogen, das besteht aus (g/l) Kasaminosäuren 4_?5, Hefeextrakt 6,5, Sukrose 20, Glukose 20, (NH₄) gSO, 3,6, IUi₂PO₄ 1, MgSO₄ 0,2, GaCl₂ 0,013, Spurenelementen·

Es werden 10 % der gewaschenen Vorkulturzellen verwendet, um 50 ml selektives Hauptkulturmedium zu impfen, das besteht aus (g/l) Yeasx Nitrogen Base (Difco, ohne Aminosäuren) 5, ΙΑ spar gin 7.5, Kasaminosäuren 8,5, Methylethylsulfonat 10, Adenin 0,05, L-Histidin 0,04, L-Leuzin 0,1, L-Tryptophan 1, Oa-Pantothenat 0,03, Glukose 30. Nach 48 Stunden Inkubation bei 30° G und 200 U/min erhält man etwa 8 χ 10⁸ Zellen/ml (= OD₆₀₀ Ca. 35).

Zellen von 2 ml werden nach 24 Stunden bzw* 48 Stunden durch Zentrifugieren bei 3OOO U/rr.ir für die Dauer von 10 Minuten in Falcon 2070-Röhren aufgenommen. Die Zellen werden einmal mit 0,9 %igem NaGl gewaschen und zentrifugiert. Das Zellpellet wird in Lysis-Puffer (66 mM Kaliumphosphat, pH-Wert 7,4, 4 mM Zwittergent (Galbiochem)) zur Suspension gebracht. Der Zellsuspension werden 8 g Glasperlen (Durchmesser 0,5 bis 0,75 mm) zugesetzt, und die Suspension wird auf einem Vortex Mixer (Scientific Instruments Inc. USA) bei voller Drehzahl für 4 bis 5x2 min geschüttelt. Durch dieses Verfahren werden mehr als 90 % der Zellen aufgebrochen. Zelltrümmer und Glasperlen werden durch Zentrifugie-

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ren bei 4 C mit 3000 U/min für die Dauer von 5 min sedimentiert. Unmittelbar vor Prüfung des biologischen Aktivität werden die obenaufschwimmenden Schichten bis zum 500fachen in 0,1 M Tris-HCi, pH-Wert 7,4, 0,05 % Tween 80, 0,1 % Rinder serumalbumin verdünnt *

Beispiel 15 Bestimmung der biologischen Aktivität

Die amidolytische Aktivität von scu-PA kann direkt gemessen werden, wozu man das synthetische Tripeptidchromogensubstrat Kabi S-2444 (KabiVitrum, Stockholm, Schweden) (pyro-Glu-Gly-Arg-pNA) anwendet. Zur Bestimmung des Gehalts an tcu-PA, der bei Lys158 und/oder Lys136 gespalten ist, wird die Untersuchung nach den Empfehlungen des Herstellers (ohne Plasmin-Aktivierung) ausgeführt. Scu-PA verlangt Plasmin-Aktivierung vor der Bestimmung der amidolytischen Aktivität, was zu folgender Modifikation der Direktuntersuchung führt: 100 ^uI scu-PA-enthaltende Proben (siehe Beispiel 14) werden mit 0,01 Einheiten Humanplasmin (Boehringer, Mannheim, Deutschland) 60 min lang bei 37° G vorinkubiert. Es werden 5 I.U· Aprotinin (Boehringer, Mannheim, Deutschland) zugesetzt, und das Gemisch wird weitere 10 min bei 100° C Temperatur inkubi< (siehe oben) zugesetzt wird.

bei 100° C Temperatur inkubiert, bevor das Substrat S-2444

Die quantitative Erfassung der Aktivität erfolgt durch Vergleich mit dem V/HO-Urokinase-Standard (Posten 66/46) und wird in internationalen Einheiten (I.U.) ausgedrückt. Nach der kommerziellen Präparation Ukidan™ (Serono, Freiburg, Deutschland) wird hoch reine Urokinase, die aus menschlischem Urin isoliert wurde, eine spezifische Aktivität von

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70 000 bis 100 000 I.U./mg Protein aufweisen.

Der scu-PA-Gehalt kann auch über aie Plasminogenaktivierung unter Verwendung des synthetischen Tripeptidsubstrats S-2251 (KabiVitrum, Stocicholrn, Schweden) gemessen werden. Die Untersuchung erfolgt nach den Empfehlungen des Herstellers (KabiVitrum, siehe oben) mit acu-PA-haltigen Proben als Plasminogenaktivator anstelle von Streptokinase.

Die Menge der in den Hefefermentierungsbrühen vorhandenen Antigens wird unter Anwendung des Dot-Blotting-Verfahrens (Bio-Rad, Richmond, USA - Punkt-Klecks-Verfahren) bestimmt. Pur die Peststellung wird ein polyklonaler Ratten-Antihumanurinurokinaseantikörper benutzt·

Proben werden nach 24 Stunden Fermentierung entnommen und werden wie im Beispiel 14 vorbehandelt. Eine Zusammenfassung der plasminogenaktivierenden Aktivitäten (S-2251 als Substrat) bei unterschiedlichen Plasmiden in 2 verschiedenen Stämmen \.ird in der Tabelle 1 gegeben.

Tabelle 1

Plasmid Wirt Selektion S-2251-Aktivität

I.U./2 χ 10⁷ Zellen

PJDB2O7R/PHO5-UPA HT246 PJDB2O7/PHO5-SSUPA HT246 PJDB2O7/PHO5-I-UPA HT246 PJDB2O7/HIO5-UPA HT246 ρJDB207/GAPDL-UPA HT246

leu	0
leu	2,2
leu	10
leu	1,4
leu	9

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Fortsetzung Tabelle 1

Plasmid Wirt Selektion S-2251-Aktivität

I.U./2 χ 1O⁷ Zellen

pDP38/GAPDL-I-UPA	HT35O	leu	3	,7
pDP38/GAPDL-I-UPA	HT35O	ura	5	,4
pDP38/GAPPL-l-UPA	HT35O	leu	O	,4
PDP38/GAPPL-I-UPA	HT35O	ura	3

Ein Vergleich der in den 3 durchgeführten Untersuchungen bestimmten Aktivitäten wird in der Tabelle 2 gegeben.

Angegeben wird das volumetrische Gesatnttiter (je ml Kulturbrühe), das nach 48 Stunden Permentierung des Stammes HT246 unter Anwendung von Plasmid ρJDB2O7/GAPDL-I-UPA ermittelt wurde.

Tabelle 2

I.U./ml Kulturbrühe

Aktivität auf Aktivität auf Dot-Blotting

S-2444 S-2444 S-2251 (Bestimmung) ohne Plasmin mit Plasmin

25,8 215 1670 ca. 1000

Aus den Ergebnissen geht hervor, daß man die beste scu-PA-Produktion in Hefe erreicht, wenn die DNA-Konstruktion eine Hefesignalfolge wie PH05 oder dia Invertasesignalfolge einschließt. Die Ergebnisse zeigen außerdem,daß der scu-PA in unterschiedlichen Hefe-Wirts-Hintergründen experssiert

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wird, wodurch eins Fermentierung unter selektiven Bedingungen (entweder minimales Medium mit niedrigem Pi oder Urazil-Selektion) zu einer vergleichweise höheren spezifischen Produktivität je OD führt.

Etwa 90 % des Expressionsproduktes sind scu-PA, was aus den Aktivitätsraessungen auf S-2444 mit oder ohne Plasminaktivierung hervorgeht. Das Dot-Blotting zeigt, daß die Menge des vorhandenen Antigens das Ausmaß der gemessenen "biologischen Aktivität nicht wesentlich überschreitet. Folglich wird der Heferekombinant-scu-PA wie bei echter scu-IA korrekt gefaltet.

Beispiel 16 Gewinnung des acu-PA aus Hefezellen (30 1-Kulturbrühe)

Stamm S. cereviaiae HT246/pJDB2O7/GAPDL-I-UPA wird wie Stamm S. oereviaies GRF18/pJDB2O7/GAPFL-HIR bei der Produktion von Hirudin gezogen (siehe europäische Patentanmeldung 225 633). Der Gehalt an scu-PA innerhalb der Zellen (nach der Desintegration, siehe Beispiel H) wird durch indirekte amidolytische Untersuchung unter Verwendung von Substrat S-2251 (siehe Beispiel 15) bestimmt. Weh 43 Stunden Inkubation werden die Zellen durch Zentrifugieren in einer Sharples-Zentrifuge (Appareils Centiftgas, Rueil, Frankreich) geerntet und in einem gleichen Volumen an Lysis-Puffer (200 tnM K₂HPO., 0,2 % Tween 80) zur Suspension gebracht. Die Zellen werden dann in einer Glasperlenmühle gebrochen (Dyno-Mill, KDL, Badtofen AG, Basel; 4500 U/min, 18 l/h). Die Suspension wird auf das Fünffache mit I50 mM NaGl, 0,05 % Tween 80, verdünnt und die Zelltrümmer bei Vorhandensein von 0,6 °/oo Polyethylenimin bei 4° C durch Zen-

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trifugieren in einem Westfalia-Separator SB7-47 sedimentiert. Die leicht trübe obenaufschwimmende Schicht wird durch eine Zetapor-Patrone (0,22 /im Porenbreite) gefiltert und auf einen pH-Wert von 6,05 unter Verwendung von 1 II HCl abgestimmt. Hs wird ein Liter dec Kationenaustauscher-Schnellflußmittels S-Sepharose (Pharmacia) je Kilogramm abgesetzter Hefezellen zugesetzt, und die Suspension wird bei 4° C eine Stunde lang gerührt. Dann werden die Perlen in eine Kolonne mit einem Durchmesser von 9 cm gebracht und mit 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,0, 150 mM NaCl, 0,05 % Synperonic gewaschen. Bei einer Durchflußrate von 30 ml/min wird scu-PA mit demselben Puffer eluiert, der 250 mM NaCl enthält. Den Fraktionen, die scu-PA enthalten (gemessen durch direkte amiddytische Untersuchungen; siehe Beispiel 15) wird Konkanavalin A Sepharose (Pharmacia) zugesetzt (1 ml Gel je 0,2 mg scu-PA), und die Suspension wird bei 4° C 45 min lang gerührt. Nach dem Wasehen mit 1 M NaCl, 10 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,0, 0,05 % Synperonic, werden die Kugeln in eine Kolonna mit einem Durchmesser von 4»4 cm gebracht und der scu-PA wird mit 0,8 M Methyl-<X~D-mannopyranosid, 150 mM NaOl, 20 mM Natriumazetat, pH-Wert 4,0, 0,05 % Synperonic bei einer Durchflußrate von 1 l/h eluiert. Den 3cu-PA-enthaltenden Fraktionen wird Antiurokinase IgG-Sepharose zugesetzt (gereinigter Kaninchenantikörper (IgG-Fraktion), anhand von Urokinase aus dem Menschenurin gezogen), und die Suspension wird bei 4 C für die Dauer von 45 min gerührt. Dann werden die Perlen in eine Kolonne mit einem Durchmesse.? von 2,2 cm gebracht und mit 1 M NaCl, 10 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,0, 0,05 % Synperonic gewaschen. Der scu-PA wird mit 0,1 M Glyzin-HCl, pH-Wert 2,4, 0,05 % Synperonic bei einer Durch-

flußrate von 1 ml/min eluiert. Die seu-PA-enthaltenden Fraktionen v/erden mit 1N NaOH auf einen pH-Wert von 6 abgestimmt.

In dieser Phase besteht die Gesamtaktivität etwa zu 25 bis 30 % aus tcu-PA, was durch direkte amidolytische Untersuchunge ermittelt wird (siehe Beispiel 15).

Der Ausfluß aus der Antikörperkolonne wird ei'ie Mono-S-Kolonne (Bettvolumen 1 ml, Pharmacia) zugeführt, die mit 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 6,0, 0,05 % Synperonic äquilibriert wurde. Nach dem Waschen mit dem Äquilibrationspuffer wird der scu-PA mit einem stufenartigen Gradienten des Äquilibrationspuffers und eines Puffers B eluiert, der aus 500 mM NaCl, 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,0, 0,05 % Synperonic besteht, bei einer Durchflußrate von 1 ml/min. Bei dieser Eluierung werden zwei Aktivitätsspitzen beobachtet, eine Spitze wird beim ersten Schritt bei 30 % von Puffer B eluiert, und die andere tritt beim zweiten Schritt bei 55 % von Puffer B auf. Die direkte amidolytische Untersuchung zeigte, daß die bei 30 % B eluierte Fraktion noch eine große Menge an tcu-PA enthält, während die bei 55 % B eluierte Stufe nur 1 - 3 % tcu-PA enthält.

Hefe-scu-PA, der auf diese Weise produziert wurde, wandert als einzelnes Band von etwa 51 KD-Molekulargewicht bei der SDS-Polyakrylamid-Gel-Elektrophorese unter nichtreduzierenden Bedingungen. Der gewonnene scu-PA hat eine Reinheit von etwa 95 % oder darüber, was durch direkte amidolytische Untersuchung ermittelt wird (siehe Beispiel 15) wie auch durch SDS-Polyakrylamid-Gel-Elektrophorese unter nichtreduzierenden Bedingungen.

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Beispiel 17 Glykosylationszustand von Hefe-sou-PA

Die Glykosylation wird mit einer ''i-Konkana valin A-Überlagerungaanalyse nach Gelelektrophorese bestimtrt. Konkanavalin A ist ein Pflanzenlektin, das speziell Mannosereste erkennt. Gereinigte scu-PA von Hefe sowie u-PA-Standard~ Ukidan^ (SerOno, Freiburg, Deutschland) werden der Gelelektrophorese auf 10 %igen Gels unterzogen. Dann werden die Proteine in einer 7 %igen Essigsäure für die Dauer von 30 Minuten an das Gel fixiert. Das Gel wird in Lektinpuffer mit folgender Zusammensetzung gewaschen:

0,15 M NaCl

50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4

0,5 mM CaCl₂

0,5 mM MnCl₂

Es wird so lange gewaschen, bis der pH-Wert 7$3 erreicht. Dann wird das Gel sorgfältig mit 2 ml Lektinpuffer überlagert, der 3 mg Hämoglobin, 100 μg Konkanavalin A und 2 μθ±

I-Konkanavalin A enthält.

Ein anderes, ansonsten identisches Gel wird mit der oben genannten Mischung überlagert, ergänzt durch 0,2 M Oi-Methylmannosid. Nach 3 Stunden Inkubation in einer angefeuchteten Kammer werden die Gele gründlich in Lektinpuffer gewasshen, getrocknet und durch Röntgenfilme exponiert. Ohne

& -Methylmannosid werden sowohl Ukidan^als auch Hefe-scu-

12^ς PA mit ^I-Konkanavalin gefärbt. Ihre Molekulargewichte sind im wesentlichen identisch. Bei Vorhandensein vonc</-Methylmannosid, einem konkurrierenden Inhibitor der Lektinbindung, verschv/indet die menschliche Urinurokinase, wäh-

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rend die Hefe-scu-PA noch sichtbar bleiben. Das weist daraufhin, daß Hefe-scu-PA glykosjliert wird und das diese Glykosylation einem anderen Typ als die der menschlichen Urinurokinase entspricht.

Beispiel 18 Weitere Reinigung des scu-PA

Eine Lösung von scu-ΡΛ (siehe Beispiel 16), die anhand von 0,05 M Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 0,05 % Tween 80 und 0,05 M NaGl dialysiert wurde, wird bis zu 3 ml einer Benzamidin-Sepharose-Kolonne (Pharmacia, Uppsala, Schweden) zugeführt und mit Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 8,0, gewaschen, der 1 M NaCl enthält. Scu-PA wird im Durchfluß und in der Waschlö-3ung vollständig zurückgewonnen, während das Nebenprodukt tcu-PA aus der Kolonne mit 0,05 M Tris-HGl-Puffer, pH-Wert 8,0, der 1 M L-Arginin enthält, eluiert werden kann. Der gewonnene scu-PA hat eine Reinheit von etwa 98 % oder mehr»

Beispiel 19

Mutation der Glykosylationsstelle bei [ Asn302J der Urokinase-B-Kette

Das Plaamid pJDB2O7/PHO5-I-UPA (siehe Beispiel 3) enthält den kompletten Kodierungsbereich der Urokinase. Die DNA wird mit Pstl und BamHI geschnitten. Das 886 bp-Pstl-BamHI-Fragment vom Uro.kinasegen enthält die Glykosylationsatelle (Asn3O2) in den Nukleotidpositionen 1033 - 104-1. Ein anderes Fragment von ähnlicher Größe wird v:eiter durch BstET.I geschnitten. Das 886 bp-Pstl-BamHI-Fragnent wird auf einem präparativen 0,3 %igen Agarose-Gel isoliert.

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M13mpl8-RF-DNA wird mit Patl und BamHI geschnitten. Das 7,3 kb-Fragment wird auf einem präparativen 0,8 %igen Agarose-Gel isoliert. Die DNA-Fragmente werden aus dem Agarose-Gel elektroeluiert und durch DE52-Chromaoografie und Ethanolausfällung gereinigt.

Es werden 0,1 pMol des 73 kb-Pstl-BamHI-geschnittenen Vektors und 0,2 pMol de3 886 bp-Pstl-BamHI-u-PA-Fragments Iigiert. Pur die Transformation von E. ooli-JM109~Ca -Zellen nach dem Handbuch "IvI13 cloning and sequencing handbook" (Handbuch zum M13-Klonen und zi\x- Folgebildung), das von Amersham veröffentlicht wurde, werdeni μΐ und 3 μΐ des Ligationsgemischs verwendet. Zwölf farblose Flecken werden herausgegriffen, und ea wird einsträngige DNA hergestellt (Messing, J., Method» in Enzymology ipj_, 21 - 78 (1983)). Die einsträngige DWA. wird dazu verwendet, durch Ausheilen und Erwei.cern des universellen M13-Primers mit Klenow-polymerase teilweise doppelsträngige DNA herzustellen« Das Reektionsprodukt wird mit Phenol/Chloroform extrahiert und die DNA wird mit Ethanol ausgefällt, Die DNA wird mit Pstl und BamHI geschnitten. Ein 886 bp-F.ragment zeigt an, daß das u-PA-Fragment in den Mi3mp18-Vektor geklont wurde_t ^in Klon wird weiter analysiert, und dia korrekte Einfügung wird durch Folgebildung bestätigt. Der Klon wird als Mi3mp18/UPA bezeichnet.

b) Mutation_ä§i_Gly,kosylationsatelle_bei_Asn_i2Q2

302

|Asnj £er Thr

M13mp18-Ein.fügung: 3'.... AAA GCT TTT CTC TTA AGA TGC CTG (Gegensinn-Strang) ATA*..5'

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mutagenes

Primer W: 5'-GGA AAA GAG GAA TCT AGC GAC-3¹

mutierter

Stramg im Sinn: 5'....TTT GGA AAA GAG CAA TCT ACC GAC TAT...V

1024 GJLn 1044 Polgebildungs-

primer: OTGCCCTCGATGTATAACG 967 985

Die mutagenpii und Folgebildungsyrimere v/erden unter Anwendung der Phosphoramiditmethode (Caruthers, M. H. in "Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments" (Chemische und enzymatische Synthese von Genfragmenten) (Hsg. Gassen, H. G. und Lang, A.) Verlag Chemie, Bundesrepublik Deutschland)) auf einem Synthetisator der Applied Biosystem, Modell 380B, synthetisiert.

Die in vitro-E.iutagenese auf einsträngiger Schablonen-DNA wird so ausgeführt, wie da3 von T. A. Kunkel (Proc. Watl. Acad. Sei. USA 82, 438 - 492 (1985)) beschrieben wurde. Urazilhaltige, einsträngige Schablonen-DNA wird durch einen Wachstumszyklus auf dem E. coli-aa am RZ1O32 (dut~, ung") produziert.

Es werden 100 pMol des mutagenen Oligonukleotidprimers-W in 20 μΐ von 50 mM Tria-HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0,5 nut AT? und 20 Einheiten von T4-Polynukleotidkinase (Boehringer) phosphoryliert. Nach 30 min bei 37 G wird die Reaktion durch Erhitzen auf 70° C für die Dauer von 10 min gestoppt.

Ss werden 0,3 pMol der urazilhaltigen M^mpie/UPA-Schablo-

- 70 -

nen-DNA mit 10 pMol phosphoryliertem, mutagenen Oligodesoxyribonukleotidprimers W und 10 pMol des Mi3-Universalfolgebildungsprimers in 30 ,ul von 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, und 10 mM MgCl₂ inkubiert. Die Probe wird auf 80° C erhitzt und in einem kleinen Wasserbad auf Zimmertemperatur abkühlen gelassen.

c) Erweiterungs-Ligatigns-Reaktion

Zur oben genannten ausgeheilten Probe werden 10 ^l eines Enzym-dNTP-Gemischs gegeben, das 1 mM dNTP, 10 mM TrIs-HCl, pH-Wert 8,0, 10 mM MgCl , 20 mM DTT, 1 mM ATP, 400 Einheiten von T4-DNA-Ligase (Biolabs, 400 Einheiten/μΐ) und 6 Einheiten von Klenow-DNA-Polymerase (Boehringer, 6 Einheiten/nl) enthält. Die Inkubation erfolgt über Nacht bei 15° C.

d) Transformation von E. coli-BMH7i-Zellen

Das Ligationsgemisch wird mit TE auf 200 μΐ verdünnt. Kornpetenten E. ooli-BMH71-Ca -Zellen (Kunkel, siehe oben) werden 0,1 ;ul, 1 ^μΐ und 10 /Ul des Erweiterungs-Ligations-

gemischs zugesetzt. Nach 30 min auf Eis werden die Zellen 3 min lang einer V/ärmeschockbehandlung bei 42° C unterzogen und dann auf Eis gehalten. Die Zellen werden mit Topp-Agar E. coli-JM101-Indikatorzellen plattiert.

Es werden sechs Flecken herausgenommen und zur Infektion von E. coli-JM1Q9 verwendet. Aus der obenaufschwimmenden Schicht werden Phase durch PEG-Ausfällung isoliert. Einsträngige DM wird durch Extraktion mit Phenol und Ausfällung mit Ethanol hergestellt. Schablonen-DNA werden in TE wieder zur Suspension gebracht.

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Die Mutation des AAT-Kodons (ASn3O2) auf den CAA-Kodon (Gln3O2) wird durch DNA-PoIgebeStimmung für einen Klon mit dem oben genannten Folgebildungsprimer unter Anwendung der Kettenterminationsmethode (Sanger, F. u. a., Proc. Nat* Acad. Sei. USA "JA, 5463-67 (1977)) bestätigt. Die Mutation führt zu einer Asn—* Gln-Anderung in der Aminosäureposition 302 von u-PA, wodurch die einzelne Glykosylationsstelle in der Urokinase ausgeschaltet wird. W bezeichnet dia Mutation der Glykosylationsstelle in der u-PA-B-Kette (Asn302—> Gln3O2). Andere Mutationen werden in der u-PA-Kodierungsfolge nicht gefunden. Der positive Klon wird als M13mp18/UPA-W bezeichnet.

Beispiel 20 Mutation von

Die proteolytische Spaltung von scu-PA an der Lys135-Lysi36-Bindung führt zur Bildung einer Urokinase mit niedrigem Molekulargewicht. Die dibasische Spaltungsstelle wird durch die in vitro-Mutation von [Lys135J an Glyzin ausgeschaltet.

135 136 (Lyal Lys

M13mp18-Ein- 3'....AGG GGT GTA CGT TTT TTd₁GGG^GGJAGA .....5' fügung (Gegensinnstrang)

mutagenes Primer LG 5'-GCA GAT GGA GGT AAGbCCJTCC -3' mutierter

Sinnstrang 5'....TGG GGA GAT GGA GGT AAG'CCC TOC TCT...3'

523 PS 543

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Das Verfahren für die in vitro-Muiagenese wiret im Beispiel 19 beschrieben. Es wird ein mutierter, einsträngiger Im-Sinn-Strang präpariert. Die Mutation des AAA-Kodons (Lys 135) auf den GGT-Kodon (GIy) wird durch DNA-Folgebildung unter Anwendung des M13-Universalprimers (Biolabs) bestätigt.

Die Mutation [Lys135| > GIy führt zur Ausschaltung der

proteolytischen Spaltungsstelle bei Aminosäure 135 in der Α-Kette der Urokinase. Ein Klon mit der mutierten DNA wird als M13mp18/UPA~LG bezeichnet.

Beispiel 21

Mutation von [,Lys135 _{l t}l —> Ser

Aminosäure \Lys135l wird auf analoge Weise zum Beispiel auf Serin mutiert.

135 136 Ey3 Lys M13mp18-ßin- V AGG CGT CTA CCT TTT TTC GGG AGG AGA 5'

fügunß (Strang im .e, sinn)

_mil+„ _lOa 5'- GCA GAT GGA AGT MG CCC TCC -3'

Primer LS

mutierter 5' TGC GCA GAT GGA AGT AAG CCC TCC TCT...3'

Strang im 523 [Seij 543

Die Mutation des AAA-Kodons (Lys135) auf den AGT-Kodon (Ser) wird durch Polgebildung der einsträngigen Schablonen-DNA unter Verwendung des I/113-Universalprimers bestätigt. Ein Klon mit der korrekten Mutation wird ala M13mp18/UPA-LS bezeichnet.

- 73 -

Beispiel 22 Mutation von Ü?he157l —» Asp

Einkettiger u-PA wird in zweikettigen u-PA durch proteolytische Spaltung durch Plasmin der Lys158-Ile159-Bindung umgewandelt. Thrombin spsltet die Arg156-Phe157-Bindung. Um die protedytische Spaltung des scu-PA durch Plasmin und Thrombin au verhindern, wird [Phe157| zu Asp mutiert.

156 157 158 158

Arg tPhej Lys He

Mi3mp18- 3'...GA GAC TGC GGG QCG AAA TTC TAA TAA CCC CC...5' Einfügung (Gegensinnstrang)

mutagenes 5'- G AGG CCC CGC GAC AAG ATT ATT G -3' Primer P

mutier- 5'...CT CTG AGG CCC CGC GAC AAG ATT ATT GGG GG...3' ter Im- 588 JAsJj 610 Sinn-Strang

Die Mutation des TTT-Kodons (Phe157) auf den GAC-Kodon (Asp157) wird durch DNA-Folgebildung unter Anwendung des M13-Universalprimers (Biolabs) bestätigt. Die Mutation [Phe157j —V Asp führt zur Ausschaltung der proteolyti-3chen Spaltung steilen für Thrombin an der Aminosäureposition 156 und für Plasmin an der Aminosäurepositijn in der einkettigen Uorkinase. Ein Klon mit der mutierten DNA wird als M13mp18/UPA-P bezeichnet.

Beispiel 23

übertragung der Mutation Gln3O2 vom M13-Klon auf die Hefeexpressionskassette

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Mi3/mp18/UPA-W enthält eine mutierte DNA-Einfügung mit °iner Kodierung für eine Aminosäure bei einer einzigen Änderung (Gln3O2), welche die Glykosylationsstelle in der B-Kette der Urokinase ausschaltet. Das DNA-Fragment mit der Mutation wird aui das Hefeexpreasionaplasmid pJDB2O7/ PHO5-I-UPA übertragen.

Plasmid ρJDB2O7/PHO5-I-UPA wird mit Sail und BamHI geschnitten. Das 6,6 kb-Vektorfragment wird isoliert. Es enthält den 3'-Teil des u-PA-Gens von der BamHI-Stelle an der Nukleotidposition 1323 (Abb. 1) bis zur Position 1441 (PvuII-Stelle mit angefügten XhoI-Linkern) und die PHO5-Transkriptionsterminationssignale.

ρ JDB2O7/PHOj)-I-UPA wird mit Sail und Pstl digeriert. Das 1,2 kb-Sall-Pstl-Fragment wird isoliert und aus dem Gel elektroeluiert. Das DNA-FKgment enthält die Sall-BamHI-Folge von pBR322, den PHO^-Promoter, die Invertasesignalfolge und die u-PA-Kodierungsfolge bis zur Pstl-Stelle.

RF-DNA wird für M13mp18/UPA-W (siehe Beispiel 19) durch das DNA-Schnellisolationsverfahren (Holmes, D. S. u. a., Analyt. Biochem. M4 (1981), 193 - 197) hergestellt. Es werden 5 Mg der DNA mit BamHI und Patl digeriert. Nach dem Zusatz von 2 μg RNuse (Serva) und der Inkubation für die Dauer von 5 Minuten bei 37° C wird das 886 bp-Pstl-BaniHI-Fragment auf einem präparativen 0,8 ftigen Agarose-GeI isoliert. Das DNA-Fragment wird elektroeluiert und in Ethanol ausgefällt. Das Fragment enthält die Mutation AAA —* CAA an den Nukleotidpositionen 1033 - 1035 (Asn3O2 —> GLn) in der B-Kette der Urokinase. Jeweils 0,2 pMol

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des 1,2 kb-Sall-Pstl-Fragmentes und des 886 bp-Pstl-BamHI-Fragmentea und 0,1 pMol des 6,6 kb-Sall-BamHI-Vektorfrag-

Oj.

mentes werden ligiert. Kompetente E. coli-HB101-Ca -Zellen werden transformiert.

Es werden 12 ampizillinresistente Transformanten gezogen. Die Plaemid-DNA wird isoliert und durch EcoRI- und Hindlll-Restriktionsschnitte analyisert. Die Mutation (W) an der Glykosylationsstelle zerstört die EcoRI-Stelle an den Nukleotidpositionen 1032 - 1047· Das Vorhandensein der Mutation wird durca DNA-Folgebildung bestätigt*. Eine Plasmid-DNA mit der Mutttion wird als ρJDB207/PHQJi-I-UPA-W bezeichnet.

Auf analoge Weise werden die Pstl-BamHI-Fragmente von M13mp18/UPA-P, M13mpi8/UPA-LG und M13mp18/UPA-LS für die Konstruktion von pJDB2O7/PHO5_>-^-UPA-P, pJDB2O7/PHO£-I-UPA~LG bzw. pJDB2O7/PHO5-I-UPA-LS verwendet.

Beispiel 24

Konstruktion von Plasmid pJDB2O7/PHO5-I-UPA-LPG

Um die proteolytische Spaltung von scu-PA zu verhindern, werden die Mutationen der Aminosäurefolge an der Position 135 (Lys -* GIy) und an der Position 157 (Phe --^ Asp) kombiniert und in Plasmid pJDB2O7/PHO5-I-UPA-LPG kodiert.

Plasmin pJDB2O7/PHO5-I-UPA-LG (siehe Beispiel 23) wird mit Sail und Ball geschnitten. Das 1,3 kb-Sall-Ball-Fragment enthält die Sall-BamHI-Folge von pBR322, den PH05-Promoter, die Invertasesignalfolge und die u-PA-Kodierungsfolge bis zur Ball-Stelle mit der Gly135~Mutation.

-. 76 -

Plasmid ρ JDB2O7/PJICJi-I-UPA-P (siehe Beispiel 23) wird mit Ball und BamHI digeriert. Das 0,7 kb-Ball-BamHI-Fragment ist ein inneres Fragment der u-PA-Kodierungsfolge mit der Asp157-Mutation.

D<as 1,3 kb-Sall-Ball-Fragment, das 0,7 kb-Ball-BamHI-Fragment und das 6,6 kb-Sall-BamHI-Vektorfragment (Beispiel 23) werden liegiert. Kompetente Zellen von E. C0II-HBIOI werden transformiert. Plasmid-DNA der Transformanten wird isoliert und durch Restriktionsdigestionen und DNA-Folgebildung analysiert. Ein einziger Klon mit der erwarteten Nukleotidfol-.y;ekodierang für die Mutationen Glyi35 und Asp157 wird ausgewählt und als ρJDB2O7/PHO^-I-UPA-LGP bezeichnet.

Auf analoge Weise wird pJDB2O7/PHO5-I-UPA-LSP unter Verwendung des Sall-Ball-Fragmentes von pJDB2O7/PHO5-I-UPA-LS konstruiert.

Beispiel 2t?

Konstruktion der Plasmid-pJDB207/PH05-I_UPA-LGPW-Kodierung für |.Gly135,Asp157,Gln3O2]-u-PA

Die Kombination der drei Mutationen in der u-PA*Aminosäurefolge in den Positionen 135, 157 und 302 führt zu [Gly135, Asp157, Gln3O2j-u-PA. Dieses neue Urokinasemolekül hat die proteolatischen Spaltungsstellen in der Position 135 (Lys —* GIy) und 157 (Phe -^ Asp) sowie die GIykosylationsstelle an der Postion 302 (Asn —*· GIn) durch die Mutation ausgeschlossen.

Plasmid ρJDB207/PHOJj-I-UPA-LGPW kodiert für den Urokinasemutanten und wird auf folgende Weise konstruiert:

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Piaamid ρJDB2O7/PHOJj-I-UPA-LG? wird mit Sail und Xhol digeriert. Das 2,2 kb-Sall-XhoI-Fragment wird isoliert_f aus dem Agarose-Gel elektroeluiert, durch DE52-Ghromatografie gereinigt und in Ethanol ausgefällt. Dieses DNA-Fragment enthält drei MstT-Stellen im PHOJj-Promoter und die u-PA-Folge. Drei Mikrogramm des 2,2 kb-Sall-XhoI-Fragmentes werden mit 3 Einheiten von Mstl eine Stunde lang bei 37° C teilweise digeriert. Die Reaktionsprodukte werden auf einem präparativen 0,8 %igen Agarose-Gel getrennt und das 1,7 kb-Sall-Mstl-Fragment isoliert und als dem Agarose-Gel elektroeluiert. Das DNA-Fragment enthält die Sall-BamHI-Folge von pBR322, den PHOJj-Pr ο mot er, die Invertasesignalf olge und die u-PA-Kodierungsfolge bis zu der Mstl-Stelle in der Nukleotidposition 935.

Fünf Mikrogramm der RF-DNA von M13mp18/UPA-W (siehe Beispiel 19) werden mit BamHI und Mstl digeriert. Nach dem Zusatz von 2 ug RNase (Serva) und der Inkubation für die Dauer von 5 min bei 37° C wird das 387 bp-Mstl-BamHI-Fragment auf einem präparativen 0,8 %igen Agarosegel isoliert. Das DNA-Fragment wird elektroeluiert und in Ethanol ausgefällt. Das Fragment enthält die Mutation AAT —^ CAA in den Nukleo_ tidpositionen 1033 - 1035 (Asn302 —* GIn) in der B-Kette der Urokinase.

Das 1,7 kb-Sall-Mstl-Fragment, das 387 bp-Mstl-BamHI-Fragment und das 6,6 kb-Sall-BamHI-Vektorfragment (Beispiel 23) werden ligiert. Kompetente Zellen von E. coli HB101 werden mit einem Aliquot des Ligationsgemischs transformiert. PlaS-mid-DNA von amp Transformanten wird isoliert und durch Hindlll- und EcoRI-Restriktiondigestionen und durch DNA-Folgebildung analysiert. Ein einzelner Klon mit der erwar-

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teten Nukleotidfolge der u-PA-Einfügung mit der Kodierung fUr die Mutationen Gly135, Λ3ρ157 und Gln3O2 wird ausgewählt und als pJDB2O7/PHO5-I-UPA-LGP\y bezeichnet.

Auf analoge Weise wird pJDB2O7/PHO5-l-UPA-LSPW unter Verwendung des Sall-Mstl-Fragmentes von ρJDB2O7/PHO^-I-UPA-LSP konstruiert,

Beispiel 26

Transformation von S. cerevisiae-Stammen HT24o und GRP18 und Kultivierung der transformierten Stämme

Die Saccharomyoes cerevisiae-Stämme HT246 und GRF18 werden transformiert mit den Plasmiden

ρJDB2O7/PHO^-I-UPA-W ρ JDB2O7 /PHOJj-I-UPA-LG PJDB2O7/PHO5-I-UPA-LS PJDB2O7/PHO5-I-UPA-LGP ρJDB2O7/PHO^-I-UPA-LSP ρJDB2O7/PHO5-I-UPA-LGPW PJDB2O7/PHO5-I-UPA-LSPW

unter Anwendung des Transformationsprotokolls, das von Hinnen u. a. (Proc. Natl, Sei. USA JJ?, 1929 (1978)) besclir-ieben wurde. Transformierte Hefezellen werden auf Hefemiaimalmediumplatten, denen es au Leuzin fehlt, ausgewählt. Einzelne transformierte Hefekolonien werden isoliert und bezeichnet als

Saccharomyces cerevisiae HT246/pJDB207/PHOJj-I-UPA-W

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Saccharomyces cereviaiae HT24O/pJDB2O7/PHO^-I-UPA-P Saccharomycea cerevisiae HT246/pJDB2O7/PHO5-I-UPA-LG Saccharomycea cereviaiae HT246/pJDB2O7/PHO5-I-UPA-LS Saccharomycea cereviaiae IIT246/pJDB2O7/PHO5-I-UPA-LGP Saccharomycea cereviaiae HT246/pJDB2O7/PHO^-I-UPA-LSP Saccharomycea cereviaiae HT246/pJDB207/PH0J5-I-UPA-LGPW SaocharomyfOB cereviaiae HT246/pJDB2O7/PHO5-I-UPA-LSPW Snccharotnyces cereviaiae GRFi8/pJDB207/PH05-I-UPA-W Saccharomyoea cereviaiae GRFi8/pJDB207/PHCj-I-UPA-P Saccharomycea cereviaiae GRF18/pJDB2O7/PHO5-I-UPA-LG Saccivaromycea cereviaiae GRF18/pJDB2O7/PHO5-I-UPA-LS Saccharomycea cereciaiae GRF18/pJDB2O7/PHO5-I-UPA-LGP Sacoharomycea cerevisiae GRF18/pJDB2Q7/PHO5-I-UPA-LSP Saccharomycea cereviaiae GRF18/pJDB2O7/PHO^-I-UPA-LGPW Saccharomycea cereviaiae GRFi8/pJDB207/PH05-I-UPA-l-,SPW

Die Stämme werden auf analoge Weise wie im Beispiel 14 kultiviert. Die scu-PA-Mutantproteine werden auf analoge Weise wie in den Beispielen 16 oder 18 isoliert.

Beispiel 27

Erate pharmazeutische Zusammensetzung für parenterale Verabreichung^

Eine Lösung zur parenteralen Verabreichung wird hergestellt durch Auflösen von 3 mg gereinigtem acu-PA, 25 mg Mannitol und 45 mg Natriumchlorid in 5 ml sterilisiertem V/asser und Mischen der resultierenden Lösung mit einem geeigneten Volumen einer 5 %igen Glukoselösung» Die Löaung wird durch Filtern durch einen 0,22 /im-Membranfilter sterilisiert.

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Eeispiel 28

Zv/eite pharmazeutische Zusammensetzung zur parenteralen Verabreichung (Dispersion zur Injektion)

Es werden 169,3 mg Sojabchnenlezithin (Sojabohnenphosphatid NC 95, Hersteller Nattermann, Köln, Deutschland; Reinheit 90 - 96 %\ Zusammensetzung der Fettsäuren: Linolsäure 61 bis 71 %, Linolensäure 4 - 7 %, Oleinsäure 6 - 13 %_t Palmitinsäure 10 - 15 %, Stearinsäure 1,5 - 3,5 %) und 92,7 mg reines Natriumglykocholat in 752,5 ml sterilisiertem Wasser aufgelöst. Die Lösung wird mit 1 N NaOH auf einen pH-Wert von 7,4 abgestimmt. Es werden 10 mg des lyophilierten scu-ΡΛ zugesetzt. Das Gemisch wird gerührt, bis man eine klare Lösung erhält. Die Lösung wird durch Filtern durch einen 0,22 μηι-Membranfilter sterilisiert und in Ampullen gefüllt·

Pharmazeutische Zusammensetzungen, die scu-PA-Mutanten als aktiven Bestandteil enthalten, werden auf analoge Weise wie in den Beispielen 27 und 28 hergestellt.

Deponierung der Mikroorganismen

Die folgenden Stämme von Mikroorganismen werden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Grisebachstraße 8_V< D-34OO Göttingen,* Mascheroder Weg 1b, D-33OO Braunschweig** deponiert (gegeben werden Deponierungsdatum und Zugriffnummer):

-Saccharomyces cereylsiaeHT246; 15. April 1987; DSM 4O84 **Escherichia coli HB101/pCS16: 23. Oktober 1987; DSM4294 ^XH Essherichia coli HB1O1/p3iR/SS-TPA£2: 23. Oktober 1987;

DSM4295

- 81 -

sail hbioi/pou_K1t6: 23

sail »1«»/Pl»38. 19.

Claims (8)

1. - 82 -

   Patentanspruch

   Methode zur Produktion eines menschlichen, einkettigen Plasminogenaktivators des Urokinasetyps oder dessen Mutanten, gekennzeichnet durch die Züchtung eines Hefestammes, der mit einem Hybridvektor transformiert ist, welcher eine Hefeexpressionskontrollfolge, ein DNA-Segment, das aus einer ersten DNA-Polge mit der Kodierung für ein Signalpeptid oberhalb eines und in einem Leserahmen mit einer zweiten DNA.-Folgekodierung für den reifen Plaaninogenaktivator des Urokinasetyps cder dessen Mutanten besteht, wobei das DNA-Segtr.ent unter der Transkriptionskontrolle der Expressionskon'srollfolge steht, und eine DNA-Folge aufweist, welche die Transkriptionsterminationssignale eines Hefe-Gens enthält, unter geeigneten Nährstoffbedingungen und die Isolierung des Plasminogenaktivators des Urokinasetyps oder dessen Mutanten.
2. 2. Methode nach Anspruch 1 für die Produktion eines proteaseresistenten Mutanten des menschlichen, einkettigen Pias· minogenaktivators des Urokinasetyps.
3. 3. Methode nach Anspruch 1 für die Produktion eines Mutanten des menschlichen, einkettigen Plasminogenaktivators des Urokinasetyps, worin die Glykosylationsstelle so modifiziert ist, daß an dieser Stelle keine Glykosylation erfolgen kann.
4. 4. Methode nach Anspruch 1 für die Produktion eines Proteins mit der Formel I

   - 83 -

   Ser Asn GIu Leu His Gin VaI

   Pro Ser Asn Cys Asp Cys Leu Asn GIy GIy Thr Cys VaI Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn lie His Trp Cys Asn Cys Pro Lys Lys Phe GIy GIy Gin His Cys GIu lie Asp Lys Ser Lys Thr Cys Tyr GIu GIy Ann GIy His Phe Tyr Arg GIy Lys Ala Ser Thr Asp Thr Met GIy Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser AIa Thr VaI Leu Gin GIn Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu Gin Leu GIy Leu GIy Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg Arg Arg Pro Trp Cys Tyr VaI Gin VaI GIy Leu Lys Pro Leu VaI Gin GIu Cys Met VaI His Asp Cys Ala Asp GIy X₁ X₂ Pro Ser Ser Pro Pro GIu GIu Leu Lya Phe GIn Cys GIy GIn Lys Thr Leu Arg Pro Y₁ Y₂ Y. lie He GIy GIy GIu Phe Thr Thr He GIu Asn GIn Pro Trp Phe Ala Ala He Tyr Arg Arg His Arg GIy GIy Ser VaI Thr Tyr VaI Cys GIy ¹GIy Ser Leu He Ser Pro Cys Trp VaI He 3er AIa Thr His Cys Phe He Asp Tyr Pro Lys Lys GIu Asp Tyr He VaI Tyr Leu GIy Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gin GIy GIu Met Lys Phe GIu VaI GIu Asn Leu He Leu His Lys Aap Tyr Ser AIa Asp Thr Leu Ala His His Asn Asp He Ala Leu Leu Lys He Arg Ser Lys GIu GIy Arg Cas Ala GIn Pro Ser Arg Thr He GIn Thr He Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro GIn Phe GIy Thr Ser Cys GIu He Thr GIy Phe GIy Lys GIu Z₁ Ser Z₂ Asp Tyr Leu Tyr Pro GIu GIn Leu Lys Met Thr VaI VaI Lys Leu He Ser His Arg GIu Cys Gin GIn Pro His Tyr Tyr GIy Ser GIu VaI Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro GIn Trp Lys Thr Asp Ser Cys Gin GIy Asp Ser GIy GIy Pro Leu VaI Cys Ser Leu Gin GIy Arg Met Thr Leu Thr GIy He VaI Ser Trp GIy Arg GIy Cys AIa Leu Lys Asp Lys Pro GIy VaI Tyr Thr Arg VaI Ser His Phe Leu Pro Trp He Arg Ser His Thr Lys GIu GIu Asn GIy Leu AIa Leu

   wobei X₁ und X₂ unabhängig voneinander Lys, einen Aminosäurerest, außer einem basischen Aminosäurerest, oder eine ehe-

   - 84 -

   mische Bindung darstellen, Y^ gleich Arg, einem anderen als einem basischen Aminosäurerest oder einer chemischen Bindung ist, Y₂ gleich Phe, einem sauren Aminosäurerest oder einer chemischen Bindung ist, Y^ gleich Lys, einem anderen al ζ einem basischen Aminosäurerest oder einer chemischen Bindung ist, Z^ gleich Asn_v das hefespezifisch glykosyliert ist, oder einem anderen Aminosäurerest ist und Zp gleich Thr oder einem anderen Aminosäurerest, der verschieden von Ser ist, ist.
5. 5. Methode für die Produktion eines Proteins mit der Formel I nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß X-j gleich Lys, GIy oder Ser ist, X₂ Lys darstellt, Y-j gleich Arg ist, Y₂ gleich Phe, Asp oder GIu ist, Y-, gleich Lys ist, Z- gleich Asn, das hefespezifisch glykosyliert ist, oder GIn ist und Z₂ gleich Thr ist.
6. 6. Methode für die Produktion eines Plasminogenaktivators nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er die Aminosäurefolge des natürlichen, menschlichen, einkettigen Plasminogenaktivators des Urokinasetyps hat, bei dem Asn3O2 heiespezifisch glykosyliert ist.
7. 7. Methode nach Anspruch 1 für die Produktion eines Plasminogenaktivators, ausgewählt aus der Gruppe, welche besteht aus scu-PA, [Gly135,]-scu-PA, |Ser135 ]-scu-PA, |Asp157J-scu-PA, J3eri35,Asp157j-scu-PA und [Gly135, Asp157J -scu-PA, worin Asn hefespezifisch glykosyliert ist, [Gln3O2j-scu-PA, JGly135,Asp157,Gln3O2J-scu-PA und [Ser135,Asp157,Gln3O2]-scu-PA. .
8. 8. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Hefestamm ein Stamm von Saccharomyces cerevisiae ist.