FI96121B - DNA-rakenne ja menetelmä heterologisen proteiinin tuottamiseksi - Google Patents

DNA-rakenne ja menetelmä heterologisen proteiinin tuottamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI96121B
FI96121B FI884550A FI884550A FI96121B FI 96121 B FI96121 B FI 96121B FI 884550 A FI884550 A FI 884550A FI 884550 A FI884550 A FI 884550A FI 96121 B FI96121 B FI 96121B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
fragment
plasmid
bar1
sequence
dna
Prior art date
Application number
FI884550A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI96121C (fi
FI884550A (fi
FI884550A0 (fi
Inventor
Susan K Welch
Vivian L Mackay
Original Assignee
Zymogenetics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zymogenetics Inc filed Critical Zymogenetics Inc
Publication of FI884550A0 publication Critical patent/FI884550A0/fi
Publication of FI884550A publication Critical patent/FI884550A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI96121B publication Critical patent/FI96121B/fi
Publication of FI96121C publication Critical patent/FI96121C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/49—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C12N9/60—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

- 96121 DNA-rakenne ja menetelmä heterologisen proteiinin tuottamiseksi
Esillä oleva keksintö kohdistuu yleisesti proteiinien ilmentä-5 miseen ja erityisemmin spesifisten erityssignaalien käyttöön ilmennettäessä proteiineja hiiva- ja nisäkässoluissa.
Viime vuosina geenitekniikan edistysaskeleet ovat osoittaneet, että DNA-sekvenssejä, jotka on johdettu korkeampien organismien 10 geeneistä ja jotka koodittavat spesifisiä proteiineja, voidaan ilmentää hiivasoluissa. Yhdistelmä-DNA-tekniikka on myös johtanut erityssignaalien löytämiseen ja käyttöön, jotka signaalit mahdollistavat spesifisten proteiinien erittämisen soluseinän kautta väliaineeseen.
15
Eukaryoottisten (esim. nisäkäs-) geenituotteiden valmistamisella hiivassa on etuja verrattuna valmistamiseen käyttämällä nisäkäs- tai bakteerisoluviljelmiä. Yksi suurimmista haitoista käytettäessä bakteereita isäntänä heterologisten proteiinien 20 valmistamisessa on endotoksiini en tuotanto, jotka endotoksiinit täytyy poistaa täydellisesti ennen kuin tuotetta voidaan käyttää farmaseuttisena aineena. Bakteereissa tuotetuilla heterolo-gisilla proteiineilla on osoittautunut olevan heikko liukoisuus, joka ongelma, jollei sitä ratkaista, rajoittaa rajusti 25 niiden käyttöä farmaseuttisina aineina. Lisäksi nisäkässolujen käyttö proteiinituotteen ilmentämiseksi kaupallisilla tasoilla on paljon kalliimpaa.
Sitä vastoin on hiivan kaupallisessa laajuudessa fermentoiminen 30 hyvin vakiintunutta ja mahdollistaa heterologisten proteiinituotteiden suurien määrien tuottamisen. Hiiva on eukaryootti-nen organismi, jolla on enemmän samankaltaisuutta nisäkässolujen kanssa kuin bakteereilla. Solut voivat erittää hiivassa tuotettuja proteiineja väliaineeseen, jolloin kontaminoivan 35 proteiinin vähentynyt määrä helpottaa tuotteen puhdistamista. Eritys voi myös mahdollistaa glykosylaation ja disulfidisi-doksen muodostuksen, mikä voi olla edellytyksenä tiettyjen proteiinien sopivalle keräämiselle ja/tai biologiselle 96121 2 toiminnalle. Hiiva- ja nisäkässolujen eritysjärjestelmät ovat samankaltaisia. Kummallakin solutyypillä on eritysorganelleja, kuten endoplasmakalvosto, Golgin laite ja rakkulasiirtojärjes-telmä solunpinnalle. Lisäksi syntyvistä proteiineista löydetyt 5 erityssignaalipeptidit ovat aivan samanlaisia näissä kahdessa solutyypissä (Watson, Nuc. Acids Res. 1_2:5145, 1984) avain-piirteen ollessa hydrofobisten aminohappojen ydin. Nämä sig-naalipeptidit tunnistetaan proteiinisarjasta, joka välittää äskettäin syntetoituja eritysproteiineja endoplasmakalvostoon 10 ja liittää ne niiden soluonteloon. Signaaliproteaasit poistavat oleellisesti signaalipeptidit eritysproteiineista sekä hiiva- että nisäkässoluissa. Katsauksena eukaryottisiin eri-tysreitteihin, katso Kelly (Science, 230:25, 1985).
Heterologisten proteiinien eritys hiivasta on saavutettu käyt-15 tämällä luonnollisia hiivaerityspeptideitä. Polypeptidit, joiden tiedetään erittyvän hiivasta, sisältävät hydrofobisen ami-noterminaalisen osan, joka mahdollistaa peptidin saapumisen eritysreitille. Tämä hydrofobinen alue tunnetaan "signaalipep-tidinä". Yleensä signaalipeptidi toimii yhdessä muiden sek-20 venssien kanssa ohjaten kypsän polypeptidin tai proteiinin eritystä. Nämä sekvenssit pilkkoutuvat tavallisesti kypsästä polypeptidistä erityksen aikana ja muodostavat kollektiivisesti erityspeptidin. Useat tutkijat ovat käyttäneet a-faktori-erity speptidiä (pre-pro-sekvenssi) (Kurjan and Herskowitz, 25 Cell 30: 933-943, 1982) heterologisten proteiinien erittämi-·* seen hiivasta (EP 116 201, EP 123 294, EP 123 544, ja EP 171 000). EP 166 201:ssä käytetään MFa1-promoottoria ja erityspeptidiä ihmisen epidermaalin kasvutekijän erittämiseen. EP 1 23 294:ssä käytetään MFa1-promoottoria ja erityspeptidiä 30 ihmisen [ Leu5 ]-β-endorf iinin erittämiseen. EP 123 544:ssä kloonataan kaksi geeniä, MFa1 ja MFa2, joiden tuotteet ovat *· kykeneviä indusoimaan G1 -pidätystä MATa-soluissa.
EP 123 544:ssä kloonatun MFa1-geenin on osoitettu vastaavan Kurjanin ja Herskowitzin (ibid.) kuvaamaa MFa1-geeniä. MFo2-35 geenin on osoitettu olevan organisationaalisesti samanlainen, muttei identtinen, MF<*1-geenin kanssa. EP 123 544:ssä käytetään MFa1-promoottoria ja erityspeptidiä erilaisten heterolo-
II
- 96121 3 gisten proteiinien erittämiseen. Ne käsittävät proteiinit, joita erittyi merkittävinä määrinä, kuten ihmisen interferoni D, ihmisen seerumialbumiini, naudan interferoni o1 , naudan interferoni o2, kudosplasminogeeniaktivaattori (t-PA) ja ih-5 misen insuliinin kaltainen kasvutekijä; ja proteiinit, joita erittyi vähäisinä määrinä, kuten renniini ja ihmisen interferoni γ. EP 171 000:ssa selostetaan MFa1-promoottorin ja eri-tyspeptidin käyttöä o -neoendorfiinin ja interleukiini 2:n erittämiseen. Siinä esitetään MFa1:n käyttöä muiden proteii-10 nien tai peptidien erityksessä, jotka proteiinit käsittävät insuliinin, somatostatiinin, kasvuhormonin, kasvuhormonia stimuloivan tekijän, diureettisen hormonin, interferoni γ :n, kas-vainnekroositekijän ja lymfotoksiinin.
Wo 86/00638:ssa on käytetty PH05-erityspeptidiä heterologis-15 ten proteiinien erittämiseen hiivasta. EP 123 289:ssä on selostettu a-faktorierityspeptidin käyttöä heterologisten proteiinien erittämiseen.
S. cerevisiae BAR1 -geeni koodittaa "Barrierina" tunnettua proteiinia, jota erittyy yhdistyväntyyppisistä a-soluista. 20 Barrier-proteiini sallii solujen voittaa a-faktorin kasvuin-hibointivaikutukset. BAR1-eritysreitti voi olla erilainen reitti kuin a-tekijäeritysreitti.
US-patentissa 4 61 3 572 selostetaan, että BAR1-geeniä voidaan käyttää vieraiden proteiinien erittämiseen, mutta se ei iden-25 tifioi spesifisiä alueita, jotka voivat olla käyttökelpoisia tässä suhteessa.
WO 87/02670;ssä selostetaan BAR1-signaalipeptidiä koodaavan alueen käyttöä vieraiden geeni tuotte iden pienten määrien erit-*· tämisen ohjaamiseksi transformoiduista hiivasoluista.
30 WO 87/02670 :ssä kuvatun BAR1 -eritysjärjestelmän havaittiin saavan aikaan vähemmän tehokkaan ohjaussignaalin kuin mitä alfa-tekijäerityspeptidi saa aikaan.
Tutkimukset kudosplasminogeeniaktivaattorierityksestä hiivasta - 96121 4 osoittavat, että α-faktorierityspeptidi ei siirrä tehokkaasti t-PA:ta tai urokinaasia väliaineeseen. Tämä näyttää olevan totta myös muiden heterologisten proteiinien suhteen.
5 Sen tähden alalla tarvitaan muiden erityspeptidien identifikaatiota, jotka peptidit mahdollistavat vieraiden proteiinien erit-tämisen hiivasta tehokkaammalla tavalla. Esillä oleva keksintö täyttää tämän tarpeen ja saa aikaan lisäksi muita niihin kohdistuvia etuja.
10
Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .
Lyhyesti sanottuna esillä oleva keksintö selostaa DNA-rakennet-15 ta, joka käsittää transkriptionaalisen promoottorin, joka on toimivasti kytketty DNA-sekvenssiin, joka koodittaa signaalipep-tidiä ja jota seuraa lukemis järjestyksessä toinen DNA-sekvenssi, joka koodittaa BARl-geenituotteen osaa vähintään C-terminaalisen domeenin osa ja heterologinen proteiini tai polypeptidi mukaan 20 lukien. Edullinen signaalipeptidi on sulkusignaalipeptidi. Eräässä suoritusmuodossa voi toinen DNA-sekvenssi käsittää segmentin, joka koodittaa heterologista proteiinia tai polypepti-diä, jota seuraa myötävirtaan segmentti, joka koodittaa vähintään BARl-geenituotteen C-terminaalisen domeenin osaa. Vaihtoeh-25 toisesti voi toinen DNA-sekvenssi käsittää segmentin, joka koodittaa vähintään BARl-geenituotteen C-terminaalisen domeenin « !” osaa, jota seuraa myötävirtaan segmentti, joka koodittaa hetero logista proteiinia tai polypeptidiä.
30 Eräässä esillä olevan keksinnön muodossa käsittää C-terminaalisen domeenin osa kuvion 1 mukaisen aminohapposekvenssin, joka alkaa seriinistä numero 391 ja päättyy seriiniin numero 526. ·*. Esillä olevaan keksintöön liittyvän näkökohdan mukaan käsittää C-terminaalisen domeenin osa kuvion 1 mukaisen aminohapposek-35 venssin, joka alkaa alaniinista numero 423 ja päättyy seriiniin numero 526.
Toisaalta toinen DNA-sekvenssi käsittää lisäksi segmentin, joka koodittaa pilkontapaikkaa, joka on segmentin vieressä, joka koo-40 dittaa heterologista proteiinia tai polypeptidiä.
- 96121 5
Edullisissa suoritusmuodoissa pilkontapaikka on kaksi emäksinen pilkontapaikka tai trombiinipiIkontapaikka.
Vielä eräässä keksinnön muodossa toinen DNA-sekvenssi mutage-noidaan hiilihydraattiaddition estämiseksi BAR1 -geenituotteen 5 joko toisessa tai kummassakin aminohapossa 468 ja 503. Toinen DNA-sekvenssi koodittaa edullisesti glutamiinitähdettä asemassa 468 ja/tai asemassa 503.
Esillä olevaa keksintöä voidaan käyttää erilaisten proteiinien ilmentämiseen, jotka proteiinit käsittävät urokinaasin, insu-10 liinin, verihiutaleista johdetun kasvutekijän ja niiden analogit. Edullisissa suoritusesimerkeissä on transkriptionaalinen promoottori sen geenin, joka koodittaa trioosifosfaatti-isome-raasi(TPI)entsyymiä tai alkoholidehydrogenaasi(ADH)entsyymiä. Hiivasolut ja nisäkässolut, jotka on transformoitu tällaisella 15 DNA-rakenteella selostetaan myös.
Eräänä esillä olevan keksinnön kohteena on esitetty menetelmä mielenkiinnon kohteena olevan proteiinin valmistamiseksi. Menetelmä käsittää yleisesti: (a) isäntäsolun kasvattamisen, joka solu sisältää DNA-rakenteen, joka käsittää transkriptio-20 naalisen promoottorin kytkettynä toimivasti DNA-sekvenssiin, joka koodittaa signaalipeptidiä, jota seuraa lukemis järjestyksessä toinen DNA-sekvenssi, joka koodittaa heterologista proteiinia tai polypeptidiä ja vähintään BAR1-geenituotteen C-terminaalisen domeenin osaa sopivassa väliaineessa; ja (b) 25 proteiini- tai polypeptidituotteen eristämisen isäntäsolusta. Edulliset isäntäsolut käsittävät hiivasolut ja nisäkässolut. Menetelmä voi myös sisältää eristämisvaiheen jälkeen proteiinituotteen puhdistamisen.
Nämä ja muut esillä olevan keksinnön kohteet käyvät ilmeisiksi 30 seuraavasta yksityiskohtaisesta selostuksesta ja oheen liitetyistä piirroksista.
Kuvio 1 esittää BAR1-geenin nukleotidisekvenssiä ja primaarin translaatiotuotteen johdettua aminohapposekvenssiä. Linjojen 96121 6 yläpuolella olevat luvut viittaavat nukleotidisekvenssiin; negatiiviset luvut esittävät 51-ei-koodaavaa sekvenssiä. Linjojen alapuolella olevat luvut viittaavat aminohapposekvenssiin. Oletettu signaalipeptidipilkontapaikka on osoitettu nuo-5 lella. Tähti tarkoittaa potentiaalisia glykosylaatiopaikkoja.
Kuvio 2 esittää plasmidin pZV134 rakennetta.
Kuvio 3 esittää plasmidin pGLY2/3 rakennetta.
Kuvio 4 esittää plasmidin pSW22 rakennetta.
Kuvio 5 esittää plasmidin pSWl51 rakennetta.
10 Kuvio 6 esittää ekspressiovektoreiden pSWl67 ja pSW200 rakennetta.
Kuvio 7 esittää plasmidin pSW207 rakennetta.
Kuvio 8 esittää plasmidin pSW84 rakennetta.
Kuvio 9 esittää ekspressiovektorin pSW210 rakennetta.
15 Kuvio 10 esittää ekspressiovektorin pSW219 rakennetta.
Kuvio 11 esittää ekspressiovektorin pZV187 rakennetta.
Kuvio 12 esittää plasmidin pDR2012 rakennetta.
Kuvio 13 esittää plasmidin pZV125 rakennetta.
Kuvio 14 esittää plasmidin pSWl63 rakennetta.
20 Kuvio 15 esittää plasmidien pKP24 ja pKP26 rakennetta.
Kuvio 16 esittää plasmidin pKP36 rakennetta.
Kuvio 17 esittää plasmidin pKP51 rakennetta.
II
» - 96121 7
Kuvio 18 esittSS ekspressiovektorin pSW304 rakennetta.
Kuvio 19 esittää ekspressiovektorin pZY76 rakennetta.
Kuten edellä mainittiin, esillä olevassa keksinnössä käytetään sekvenssejä, jotka koodittavat S. cerevisiae BAR1 -geenituot-5 teen C-terminaalisen domeenin osaa (kolmas domeeni) yhdessä sekvenssin (signaalisekvenssi) kanssa, joka koodittaa signaa-lipeptidiä, isäntäsolussa tuotettujen vieraiden proteiinien erittymisen ohjaamiseksi. Signaalisekvenssi ja sekvenssi, joka koodittaa Barrier-C-terminaalisen alueen osaa, koodittavat 1 0 yhdessä hybridierityspeptidiä. Tätä hybridierityspeptidiä käytetään sitten ohjaamaan heterologisten proteiinien tai poly-peptidien eritystä isäntäsoluista. Signaalipeptidi ja kolmas domeeni voivat olla vieraan proteiinin tai polypeptidin vieressä, joka on fuusioitunut hybridierityspeptidiin myötävir-15 taan (C-terminaalisessa) päässä tai vieras proteiini tai poly-peptidi voi sijaita hybridierityspeptidin osien välissä. Kummassakin järjestelyssä voidaan käyttää käsittelysignaaleja, edullisesti kaksiemäksistä pilkontapaikkaa, joka koostuu aminohapoista Lys-Arg, Arg-Arg, Lys-Lys tai Arg-Lys, erityspepti-20 din ja heterologisen proteiinin välisen pilkonnan aikaansaamiseksi. Edullinen kaksiemäksinen pilkontapaikka on KEX2-pil-kontapaikka Lys-Arg. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää trombii-nipilkontapaikkaa käsittelypaikkana erityspeptidin ja hetero-·* logisen proteiinin välissä.
25 Edullisessa suoritusmuodossa koostuu hybridierityspeptidi oleellisesti signaalipeptidistä ja C-terminaalisesta domeenis-ta tai Barrierin C-terminaalisen domeenin osasta. Barrierin ensimmäisestä ja toisesta domeenista johdetut sekvenssit ovat oleellisesti poissa. Kuten edellä selostettiin, voidaan myös 30 sisällyttää proteolyyttisiä käsittelysignaaleita.
Samaten kuten edellä mainittiin, edullinen signaalisekvenssi on BAR1-signaalisekvenssi, vaikkakin muita signaalisekvensse-jä, kuten S. cerevisiae PH05-geenin signaalisekvenssiä, voi- - 96121 8 daan myös käyttää. Barrier-proteiinin prekursori, joka on koodattu BAR1-geenillä, sisältää oletetun signaalipeptidin amino-terminaalissaan. Tämä oletettu signaalipeptidi karakterisoidaan hydrofobisten aminohappojen ytimellä ja sen otaksutaan 5 ulottuvan aminohaposta 1 aminohappoon 24 (kuvio 1 ). Tämän BAR1 primaarin translaatiotuotteen osan oletetaan olevan poistettavissa Barrierin käsittelyn aikana eritysreitin kautta ja sitä nimitetään tässä "BAR1-signaalipeptidiksi”* Vastaavaa BAR1-geenin osaa nimitetään tässä "signaalisekvenssiksi".
10 Ekspressioyksikkojen esimerkit sisältävät vähintään BAR1-sig-naalisekvenssin ja kolmannen domeenin koodaavan sekvenssin ja voivat sisältää myös muita BAR1-sekvenssejä. Esimerkiksi eräs sopiva ekspressioyksikko käsittää TPI1-promoottorin (US-pa-tentti no 4 599 311), BAR1-signaalisekvenssin, osan sekvens-15 sistä BAR1 C-terminaalista domeenia varten, joka koodaa aminohappoja 391-526, sekvenssin, joka koodaa kaksiemäksistä pil-kontapaikkaa ja heterologista proteiinia koodaavan sekvenssin, kuten DNA-sekvenssin, joka koodaa insuliiniprekursoria MI-3 (tunnetaan myös "B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A( 1-21):nä"), kuvattu EP 20 163 529:ssä.
Toinen ekspressioyksikkoesimerkki käsittää TPI1-promoottorin, BAR1-geenin aloitteesta ATG Eco R1 -paikkaan +1572 epissä, sekvenssin, joka koodaa kaksiemäksistä pilkontapaikkaa, ja heterologista proteiinia koodaavan sekvenssin, kuten DNA-sek-·* 25 venssin, joka koodaa insuliiniprekursoria MI-3.
Vielä eräs ekspressioyksikkoesimerkki käsittää TPI1-promoottorin, hiiva-PH05-(tukahdutettava hapan fosfataasi)-signaali-sekvenssin, sian urokinaasi-cDNA:n, osan BAR1-kolmatta domee-. nisekvenssiä, joka koodaa aminohappoja 423-526, ja TPI1-termi- 30 naattorin.
Trombiinipilkontapaikan vaihtoehtoinen käyttö käsittelypaikkana erityspeptidin ja heterologisen proteiinin välissä antaa muita ekspressioyksikkoesimerkkejä. Eräs tällainen ekspressioyksikko käsittää TPI1-promoottorin, BAR1-signaalisekvenssin,
II
- 96121 9 BAR1 -terminaalista domeenia koodaavan sekvenssin, sekvenssin, joka koodaa trombiinipilkontapaikan (aminohapot proliini ja arginiini), ja heterologista proteiinia koodaavan sekvenssin, kuten DNA-sekvenssin, joka koodaa insuliiniprekursoria MI-3.
5 BAR1-geenisekvenssin analyysi osoittaa Barrierin ja useiden pepsiinin kaltaisten proteaasien välistä homologiaa. Lisäksi Barrier sisältää kolmannen domeenin C-terminaalissa, joka ei ole homologinen näiden proteaasien kanssa. Tutkijoiden suorittamat lisätutkimukset ovat osoittaneet, että tässä domeenissa 10 olevat sekvenssit ovat edellytyksenä Barrierin poistamiseksi solusta. Yhdistämällä BAR1-putatiivinen signaalisekvenssi kolmannen (C-terminaalisen) alueen 136 aminohappoa koodaavaan alueeseen ovat tutkijat saaneet vieraiden proteiinien eritys-tasoja, jotka ovat suurempia kuin käyttämällä analogisia ra-15 kenteita, jotka käsittävät MFa1 -pre-pro-sekvenssin.
Lisäksi C-terminaalisen domeenin 136 aminohappo-osan käyttämisen ohella voidaan käyttää tämän domeenin pienempiä segmenttejä. Käyttämällä restriktioentsyymipilkontaa ja eksonukleaa-sihaj otusta generoidaan kolmannen domeenin pienempiä fragment-20 teja ja testataan niiden kykyä erittää proteiineja transformoiduista soluista. Esimerkiksi eräässä koesarjassa BAR1-geeni pilkottiin useassa sopivassa restriktiopaikassa C-terminaa-listen deleetioiden generoimiseksi. Tulokseksi saadut geeni-fragmentit fuusioitiin sitten fragmenttiin, joka koodaa sub-25 stanssin P C-terminaalista osaa (Munro and Pelham, EMBO J. 3_,:3087-3093, 1984). Tulokseksi saatu fuusioproteiini voitiin löytää ja määrittää käyttämällä substanssin P vasta-ainetta. Nämä tutkimukset osoittivat, että alue asemasta 1267 (kuvio 1) Eco Rl -paikkaan asemassa 1572 voidaan yhdistää sopivaan 30 signaalipeptidiä koodaavaan sekvenssiin vahvan hybridieritys-peptidin saamiseksi.
Voi olla myös edullista generoida ekspressioyksikköjä, jotka sisältävät BAR1-kolmannen domeenin mutantteja siten, että N-kytketyt glykosylaatiopaikat aminohapoissa 468-470 (glyskosy- . 35 laatiopaikka #7) tai aminohapoissa 503-505 (glykosylaatiopaik- « - 96121 10 ka 08) tai kumpikin paikka mutagenoidaan hiilihydraattiaddi-tion estämiseksi aminohapossa 468 tai 503 vastaavasti. N-kyt-ketty glykosylaatio esiintyy Asn-X-Ser:n tai Asn-X-Thr:n ak-septoritripeptidisekvensseissä, jolloin X voi olla mikä tahan-5 sa aminohappo, vaikkakin kaikki näistä tripeptidisekvensseistä eivät ole isäntiä N-kytketylle glykosylaatiolle. DNA-sekvens-sit, jotka koodittavat N-kytkettyjä glykosylaatioakseptori-paikkoja, voidaan mutagenoida hiilihydraattiosuuksien addition estämiseksi substituoimalla vaihtoehtoiset aminohappokodonit 10 missä tahansa tripeptidiakseptorisekvenssin paikassa. Esimerkiksi proliinitähde joko akseptorisekvensin Asn-X-Ser tai Asn-X-Thr toisessa asemassa voi estää glykosylaatiota hiivassa (Marshall, Biochem. Soc. Symp. 4£:17-26, 1974). Akseptoritri-peptidin kolmas aminohapposekvenssi voidaan myös vaihtaa. 15 Eräässä erityisen edullisessa suoritusmuodossa tripeptidiakseptorisekvenssin ensimmäisessä asemassa oleva asparagiinitäh-de korvataan toisella aminohapolla. Edullisimmin Asn-tähde substituoidaan glutamiinitähteellä (Gin). Kuitenkin voidaan tehdä mitä tahansa substituutioita tripeptidiakseptorisekvens-20 sin missä tahansa kolmesta asemasta hiilihydraattiaddition estämiseksi.
Mutaatiot, jotka estävät hiilihydraattiosuuksien N-kytketyn addition joko paikassa #7 tai #8 tai kummassakin paikassa tuotetaan edullisesti paikkaohjatulla mutageneesillä. Erityisen 25 edullinen mutaatio aiheuttaa Gln-tähteen substituution Asn-·' tähteen tilalle tripeptidiakseptorisekvenssin ensimmäisessä asemassa. Generoimalla BAR1-kolmas alue-glykosylaatiopaikka-mutantit asemissa 01 ja #8 on saatu vieraiden proteiinien erity stasoja, jotka ovat suurempia kuin analogisia rakenteita 30 käyttämällä saadut, jotka rakenteet sisältävät MFal-pre-pro-sekvenssin tai BAR1 -signaalipeptidin ja BAR1 -kolmannen alueen, jossa on villityyppinen glykosylaatio. Solujen, jotka on transformoitu BAR1-rakenteilla, jotka sisältävät glykosylaa-tiopaikkamutaatiot asemissa 01 tai #8, ja solujen, jotka on 35 transformoitu täydellisesti glykosyloiduilla BAR1 -rakenteilla, välisessä kasvukäyrävertailussa kasvu lag, joka esiintyy täydellisesti glykosyloityneessa BAR1-rakennetransformanteissa * li 11 96121 puuttuu mutagenoiduista rakennetransformanteista.
Esillä olevan keksinnön mukaiset ekspressioyksikot, jotka sisältävät kaksiemäksisen pilkontapaikan, tuotetaan edullisesti ligatoimalla sopiva promoottori, sopiva BAR1-geenin osa, 5 ja adapteri, joka koodaa kaksiemäksistä pilkkomispaikkaa, he-terologinen geeni tai cDNA, ja transkriptionaalinen terminaat-tori, kuten TPI1-terminaattori. Esillä olevan keksinnön mukaiset ekspressioyksikot, jotka sisältävät trombiinipilkontapai-kan, valmistetaan edullisesti kaksiemäksisen käsittelypaikan 10 in vitro -mutageneesillä, joka paikka sisältyy edellä mainittuihin ekspressioyksikkoihin, esimerkiksi vaihtamalla Lys-Arg Pro-Argiksi, tai yhdistämällä ekspressioyksikkoön adapteri, joka koodittaa trombiinipilkkomispaikkaa.
Tuloksena saadut ekspressioyksikot ligatoidaan sitten sopivaan 15 vektoriin. Sopivat hiivavektorit käsittävät YRp7:n (Struhl et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:1 035-1 039,1 978), YEp13 (Broach et ai., Gene, 8.:121-133, 1979), pJDB248 ja pJDB219 (Beggs, Nature 275:104-108, 1978) ja niiden johdannaiset. Tällaiset vektorit sisältävät yleisesti valikoitavan merkitsimen, 20 kuten ravitsemusmerkitsimen LEU2, joka sallii valikoinnin isäntälajissa, jossa on leu2-mutaatio, tai glykolyyttisen geenin P0T1 , joka on peräisin Schizosaccharomyces pombesta (EP 171 142), joka sallii valikoinnin isäntälajissa, jossa on tpi1-mutaatio. Edulliset promoottorit käsittävät ne, jotka ·' 25 ovat peräisin hiivan glykolyyttisistä geeneistä (Hitzeman et ai., J. Biol. Chem. 255:12073-1 2080, 1980; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appi. Genet. 1_:419-434, 1982) tai alkoholidehydroge-naasigeeneistä (Young et ai.. Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et ai. (toim.), s. 355, Ple-. 30 num, N.Y., 1982; Ammerer, Meth. Enzymol. 101: 192-201, 1983).
Tässä suhteessa on TPI1-promoottori erityisen edullinen promoottori (US-patentti no 4 599 311). Edullinen transkriptionaalinen terminaatiosignaali on TPI1-terminaattori.
Rakenteet, jotka käsittävät ekspressioyksikon hiivavektorissa, 35 transformoidaan hiivaan, kuten Saccharomyces cerevisiae -la- 12 - 96121 jit. Hiivan transformointitekniikat ovat hyvin tunnettuja kirjallisuudessa ja esimerkiksi Beggs (ibid.) ja Hinnen et ai. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:1929-1933, 1978) ovat kuvanneet niitä. Transformantteja viljellään sopivassa väliaineessa, 5 joka sisältää hiili- ja typpilähteitä samoin kuin muita ravintoaineita, joita erityinen isäntälaji voi tarvita. Plasmideil-la transformoidut hiivasolut, joka sisältävät P0T1-valikoivan merkitsimen, voidaan viljellä yhdisteväliaineessa, joka sisältää glukoosia hiililähteenä.
10 Hiivalajeilla, jotka ovat sopivia käytettäväksi esillä olevassa keksinnössä, on geneettinen puute, joka voidaan täydentää plasmidisyntyisellä merkitsimellä. Valikoitavat merkitsimet ovat yleisesti geenejä, jotka täydentävät auksotrofiaa isän-täsoluissa. Hiivalajeja, joissa on tällaisia puutteita, on 15 laajalti saatavissa, esimerkiksi American Type Culture Collec-tionista, Rockville, MD, tai Yeast Genetic Stock Centeristä, Berkeley, Kalifornia, tai ne voidaan valmistaa käyttämällä standardeja mutaatio- ja valikointitekniikoita. Erityisen isännän ja valikoitavan merkitsimen valinta on hyvä tavanomai-20 sen alan tekniikan tasolla. Heterologisten proteiinien tuottamisen optimoimiseksi on edullista, että isäntälajissa on mutaatio, kuten pep4-mutaatio (Jones, Genetics 8J5:23, 1977), joka saa aikaan vähentyneen proteolyyttisen toiminnan.
Nisäkässoluekspressiovektorit ovat alalla hyvin tunnettuja.
: 25 Erilaisia promoottoreita on saatavissa mukaan lukien virus- (esim. SV40- ja adenovirus-) ja solu- (esim. metallotioneiini-geeni; US-patentti no 4 601 978; ja US-patentti no 4 579 821 ) promoottorit. Muut elementit, transkriptioterminaatiosignaa-lit, polyadenylaatiosignaalit ja transkriptionaaliset tehos-30 tinsekvenssit mukaan lukien, voidaan valita niiden toiminnan ! erityisessä solulinjassa takia. Kaufman ja Sharp (J. Mol.
Biol. 159:601-621. 1982), Southern ja Berg (J. Mol.Appi. Genet. 1_;327-341 , 1982) Loyter et ai. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:422-426, 1 982) ja Neumann et ai. (EMBO J. 1_:841-845, 35 1982) ovat kuvanneet menetelmiä nisäkässolujen transfektoimi- seksi ja kloonattujen DNA-sekvenssien ilmentämiseksi. Soluja 11 13 - 96121 viljellään seerumia sisältävässä tai seerumittomassa väliaineessa, joka sisältää sopivia lisäyksiä. Sopivia väliaineita on saatavissa kaupallisilta välittäjiltä tai niitä voidaan valmistaa julkaistujen reseptien mukaisesti. (Katso esim. Ame-5 rican Type Culture Collectionin luetteloita).
Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistetut proteiinit voidaan puhdistaa tavanomaisilla menetelmillä. Erityispuhdistus-järjestelmät määrittyvät puhdistettavan spesifisen proteiinin luonteesta. Tällainen määrittely on teknikan tason mukainen. 10 Yleensä solunviljelyväliaine erotetaan soluista ja proteiini eristetään väliaineesta. Käyttökelpoiset puhdistustekniikat käsittävät presipitaation, immunoabsorption ja fraktonoinnin erilaisilla kromatografisilla menetelmillä ioninvaihtokromato-grafia, affiniteettikromatografia ja geelisuodatus mukaan lu-15 kien.
Esimerkki 1: S. cerevisiaesta peräisin olevan BAR1-geenin kloonaaminen BAR1-geeni kloonattiin, kuten US-patentissa 4 613 572 on kuvattu. Lyhyesti, plasmidijoukko, joka sisältää S. cerevisiaes-20 ta johdettujen hiivan genomisten DNA-fragmenttien satunnais-seosta vektorissa YEp13, transformoitiin hiivalajiin, jonka genotyyppi on MATa leu2 bar1. Transformantit valikoitiin kykynsä kasvaa synteettisessä väliaineessa takia, josta väliaineesta puuttuu leusiini. Transformoidut solut seulottiin li-: 25 säksi, jotta selvitetään kykeneekö kloonattu DNA täydentämään isäntäsolussa olevan bar1-puutteen. Hiiva-MATa-solut, joista puuttuu funktionaalinen BAR1-geeni, eivät ole tavallisesti herkkiä α-faktorin inhibitiolle. Hiivatransformantit, joiden havaittiin olevan resistantteja α-faktori-inhibitiolle, seu-30 lottiin sitten, jotta selvitetään kykenevätkö ne erittämään ! Barrier-toimintaa. Plasmidin pBAR2 (ATCC #3941 0), joka sisäl tää vektorin YEp13 ja 9,2 ke hiivagenomisen liitteen, havaittiin täydentävän täydellisesti bar1-puutteen.
BAR1-geeni ja siihen liittyvät sivuavat sekvenssit subkloonat-35 tiin vektoriin pUC13 (Vieira and Messing, Gene 19^:259, 1982) » r- __ 96121 1 4
Hind III - Xho I -fragmenttina. Plasmidi pBAR2 hajotettiin Hind III:11a ja Xho 1:11a suunnilleen 3 ke:n fragmentin, joka sisältää BAR1-geenin, eristämiseksi. Plasmidi pUC13 lineari-soitiin hajottamalla Hind III:11a ja Sai I:llä. Linearisoitu 5 vektori ligatoitiin pBAR2 peräisin olevaan 3 ke:n fragmenttiin. Tulokseksi saatu plasmidi nimettiin pZV9:ksi (tallennettu transformanttina E. coli -lajiin RRI, ATCC #53283).
Kloonatun BAR1-geenin sekvenssi ja primaarin translaatiotuot-teen aminohapposekvenssi on esitetty kuviossa 1.
10 Esimerkki2: TPI1-promoottorin i a -terminaattorin subkloonaami-nen
Viitaten kuvioon 2 käytettiin plasmidia pM220 (tunnettu myös pM210:nä) sekä TPI1-promoottorin että -terminaattorin lähteenä (Alber and Kawasaki, J. Mol. Appi. Gen., 1_:419-434, 1982).
15 pM220:lla transformoitu E. coli RR1 on talletettuna ATCC:ssä tallennenumerolla 39853. Plasmidi pDRl107, joka käsittää TPI1-promoottorin ja -terminaattorin, kontruoitiin subkloonaamalla ensin pM220:n 900 ep Bgl II - Eco Rl -TPI-promoottorifragment-ti pIC7:ään (Marsh et ai., Gene 32:481-485, 1984) plasmidin 20 pDRl101 generoimiseksi. Sitten plasmidi pDR1101 hajotettiin Hind 111:11a ja Sph I:llä 700 ep osittaisen TPI1-promoottori-fragmentin eristämiseksi. Plasmidi pDR1100, joka sisältää pM220:n 800 ep Xba I - Bam HI -TPI1 -terminaattorifragmentin subkloonattuna PUCl8:aan, leikattiin Hind III:lla ja Sph ? 25 i:llä. 700 ep osittainen TPI1-promoottori ligatoitiin linea- risoituun pDRH00:aan pDR1107:n valmistamiseksi. pM220:stä peräisin olevaa TPI1-promoottoria, joka on modifioitu liittämään Xba I -paikka promoottorisekvenssin 3'-päähän, käytettiin korvaamaan pDRl107:ssä oleva TPI1-promoottori. Plasmidi pM220 .· 30 hajotettiin Eco Ri:llä ja 0,9 ke fragmentti, joka käsittää TPI1-promoottorin, eristettiin agaroosigeelielektroforeesilla ja päät tasoitettiin DNA-polymeraasilla 1 (Klenow-fragmentti). Kinasoidut Xba I -liittäjät lisättiin fragmenttiin, joka hajotettiin sitten Bgl II:11a ja Xba 1:11a. Tämä modifioitu TPI1-35 promoottorifragmentti ligatoitiin sitten pDR1107:n 3,4 ep Bgl II - Xba I -vektorifragmenttiin pZV118:n valmistamiseksi.
15 96121
Sitten Eco Rl -paikka, joka generoitiin uudelleen pZV118:ssa olevassa TPI1-promoottorin 3'-päässä, tuhottiin. Plasmidi hajotettiin Hind III:lla ja Eco Rl:llä ja 0,9 ke:n fragmentti eristettiin ja ligatoitiin synteettiseen liittäjään, joka 5 konstruoitiin lämpoliittämällä oligonukleotidit ZC708 (5'aaT-TGCTCGAGT3') ja ZC709 (3'CGAGCTCAGATC3'). (Oligonukleotidit syntetoitiin Applied Biosystems malli 380A -syntetisaattorilla ja puhdistettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla.) ZC708 ja ZC709 kinatoitiin ja lämpoliitettiin menetelmällä, 10 jonka ovat kuvanneet Maniatis et ai. (Molecular Cloning, A Laboratory Method, s. 122, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982). Adapteriadditio eliminoi TPI1-pro-moottorifragmentin 3'-terminaalissa olevan Eco Rl -paikan ja lisää Xho I- ja Xba I -paikat. Tämä fragmentti liitettiin sit-15 ten Hind III - Xba I -leikattuun pUC13:een. Tulokseksi saatu plasmidi nimettiin pZV134:ksi (kuvio 2).
Esimerkki 3: Plasmidin pGLY2,3 kontruointi 0,5 ke fragmentti, joka käsittää hiivakodonioptimoituja sekvenssejä, jotka koodittavat MFa1-ohjaajaa ja insuliiniprekur-20 soria MI-3 (tunnettu myös B(1 -29)-Ala-Ala-Lys-A(1 -21 :nä), joka fragmentti on johdettu plasmidista pMT610 (EP 163 529; katso kuvio 3), mutagenoitiin kahden, MFa1-ohjaajassa olevan potentiaalisen glykosylaatiopaikan poistamiseksi. Paikat, jotka alkavat MF<*1 -ohjaajan aminohaposta 57 (glykosylaatiopaikka #2) 25 ja aminohaposta 67 (glykosylaatiopaikka #3), poistettiin vaih-: : tamalla Asn-kodoni Gln-kodoniksi kussakin tapauksessa. Mutage- neesia varten pMT610:stä johdettu 0,5 ke Eco Rl - Xba I -MF<*1-fragmentti ligatoitiin Ml3mp11:een, joka oli linearisoitu hajottamalla Xba l;llä ja Eco RIillä. Tulokseksi saatu yhdistel-30 mäfaagi nimettiin mCa68:ksi. Oligonukleotidit ZC457 (5'tgt TTA TCC AAA CTA CTA TTG CC3') ja ZC458 (5'gCC ATT TTC CCA ATC CAC - CAA T31) syntetoitiin Applied Biosystems malli 380A -DNA-syn- tetisaattorilla ja puhdistettiin polyakryyliamidigeelielektro-foreesilla. Sitten MFa1 -ohjaajaglykosylaatiopaikka #3 muutet-35 tiin in vitro -mutageneesilla (Zoller and Smith, DNA 3:479-488, 1984; ja Zoller and Smith, Meth. Enzymology 100:468-500. 1983) käyttämällä oligonukleotidia ZC457 ja mCo68-templaattia.
• ( 16 - 96121
Positiiviset kloonit sekventoitiin ja virheetön klooni nimettiin mCa75:ksi. Oligonukleotidia ZC458, joka muutti MFa1-gly-kosylaatiopaikan 02, käytettiin mCa75-templaatin mutagenoin-tiin käyttämällä Zollerin ja Smithin (ibid.) mutageneesimene-5 telmää. Positiiviset kloonit sekventoitiin ja virheetön klooni nimettiin mCa88:ksi. 0,515 ke Eco Rl - Xba I -fragmentti, joka käsittää mutagenoidun MFa1 -ohjaajan ja MI-3:a koodittavan geenin, poistettiin mC<x88:sta ja subkloonattiin pUC19:ään, joka oli linearisoitu hajottamalla Eco RI:llä ja Xba I:llä. Tulok-10 seksi saatu plasmidi nimettiin pGLY2,3:ksi (kuvio 3).
Esimerkki 4; Ekspressiovektorin pSW167 kontruointi Ekspressiovektori pSWl67 käsittää sekvenssin, joka koodittaa Barrierin ensimmäistä 526 aminohappoa fuusioituneena MI-3:a koodaavaan sekvenssiin hiivavektorissa YEp1 3. Ekspressioyksik-15 kö konstruoitiin käyttämällä TPI1-promoottoria ja 1578 ep BAR1-fragmentin ja MI-3:a koodaavan sekvenssin välistä fuusiota käyttämällä adapteria, joka koodittaa kaksiemäksistä pil-kontapaikkaa, kahden sekvenssin liittämiseksi runkoon. Fuusiota konstruoitaessa saatiin BAR1 :ä koodaava sekvenssi pSW8:sta 20 ja sen johdannaisesta pSW81, jotka konstruoitiin seuraavasti.
Plasmidi pZV9, joka käsittää kokonaisen BAR1:ä koodaavan alueen ja siihen liittyvät sitä sivuavat alueet, leikattiin Sai i:llä ja Bam HI:11a 1 ,3 ke BAR1-fragmentin eristämiseksi. Tämä fragmentti subkloonattiin pUC13:aan, joka oli leikattu Sai 25 Iillä ja Bam Hiillä, plasmidin generoimiseksi, joka plasmidi nimettiin pZV17lksi (kuvio 4). Plasmidi pZV1 7 hajotettiin Eco Rilliä BAR1lä koodaavan alueen enimmän 3' 0,5 kein poistamiseksi. Vektori-BAR1-fragmentti ligatoitiin uudelleen plasmidin, joka nimettiin pJH66lksi, luomiseksi. Plasmidi pJH66 li- . 30 nearisoitiin Eco Rilliä ja päät tasoitettiin DNA-polymeraasil- « • la 1 (Klenow-fragmentti). Kinatoidut Bam Hl -liittäjät (5'cCGGATCCGG^') lisättiin ja ylimääräiset liittäjät poistettiin hajottamalla Bam Hiillä ennen uudelleenligatointia. Tulokseksi saatu plasmidi nimettiin pSW8:ksi (kuvio 4).
35 Plasmidi pSW81, joka käsittää ΤΡΙ1-promoottorin, BAR1lä koo- 11 i7 96121 daavan alueen fuusioituneena substanssin P C-terrainaalisen osan koodaavaan alueeseen (Munro ja Belham, ibid.) ja TPI1-terminaattorin, johdettiin pSW8ista, kuten kuvioissa 4 ja 5 esitetään. Plasmidi pSW8 leikattiin Sai I:llä ja Bam Hiillä 5 Barrierin aminohappoja 252-526 koodittavan 824 ep fragmentin eristämiseksi. Plasmidi pPM2, joka sisältää synteettisen oli-gonukleotidisekvenssin, joka koodittaa M13mp8:ssa olevan substanssin P C-terminaalisen osan dimeeristä muotoa, saatiin Munrolta ja Pelhamilta. Plasmidi pPM2 linearisoitiin hajotta-10 maila Bam Hiillä ja Sai Iillä ja se ligatoitiin pSW8ista peräisin olevaan 824 ep BAR1-fragmenttiin. Tulokseksi saatu plasmidi pSW14 hajotettiin Sai Iillä ja Sma Iillä 871 ep BAR1-substanssi P -fragmentin eristämiseksi. Plasmidi pZV16, joka käsittää BAR1 in fragmentin, joka koodittaa aminohappoja 1-250, 15 leikattiin Xba Iillä Sai Iillä 767 ep BAR1-fragmentin eristämiseksi. Tähän fragmenttiin ligatoitiin 871 ep BAR1-substanssi P -fragmenttiin kolmiosaisella ligaatiolla pUC18 kanssa, joka oli leikattu Xba Iillä Sma Iillä. Tulokseksi saatu plasmidi, joka nimettiin pSWl5iksi, hajotettiin Xba Iillä ja Sma Iillä 20 1 ,64 ep BAR1-substanssi P -fragmentin eristämiseksi. ADH1-pro moottori saatiin pRL029istä, joka käsittää ADHI-promoottorin ja pUC18issa olevan 116 ep BAR1 5'-koodaavan alueen (WO 87/02670). Plasmidi pRL029 hajotettiin Sph Iillä ja Xba Iillä 0,42 ke ADH1-promoottorifragmentin eristämiseksi. TPI1-termi-25 naattori (Alber ja Kawasaki, ibid.) saatiin aikaan tasoitettuna Xba I -Sph I -fragmenttina, joka käsittää 0,7 kein TPI1- · : terminaattorin (tasoitettu Xba I Eco Rlieen) liitettynä pUC18iaan (Eco Rl - Sph I). Tähän fragmenttiin ligatoitiin 0,42 ke ADH1-proraoottorifragmentti ja 1,64 ke BAR1-substanssi 30 P -fragmentti kolmiosaisessa ligaatiossa plasmidin pSW22 valmistamiseksi (kuvio 4).
• Plasmidissa pSW22 oleva ADH1-promoottori korvattiin TPI1 -pro moottorilla plasmidin pSW81 konstruoimiseksi (kuvio 5). TPI1-promoottori saatiin aikaan 900 ke Hind II - Xba I -fragment-35 tina. 2,3 ep fragmentti, joka sisältää BAR1-substanssi P -fuusion ja TPI1-terminaattorin, eristettiin plasmidista pSW22 Xba I - Sst I -fragmenttina. TPI1-promoottorifragmentti ja BAR1- 18 - 96121 substanssi P - TPI1-terminaattorifragmentti liitettiin kolmiosaisessa ligaatiossa pUC18:aan, joka oli linearisoitu Hind Ulilla ja Sst 1:11a. Tulokseksi saatu plasmidi nimettiin pSW81iksi.
5 BAR1:n ja MI-3:n välinen fuusio tehtiin käyttämällä synteettistä oligonukleotidiadapteria, joka koodittaa Lys-Arg-pilkon-tapaikkaa. Oligonukleotidit ZC794 (5'gaT CCT TGG ΑΤΑ AAA g3 ') ja ZC795 (5'aäT CTT TTA TCC Aäg3' ) kinatoitiin ja lämpoliitet-tiin adapterin valmistamiseksi, joka adapteri käsittää Bam HI 10 ja Hinf I -adhesiiviset päät ja sekvenssin, joka koodittaa Lys-Arg-pilkontapaikkaa. Plasmidi pGLY2,3 (esimerkki 3) leikattiin Eco RIillä ja Xba Iillä 0,515 ke fragmentin, joka sisältää modifioidut MFa1 -pre-pro- ja MI-3-sekvenssit, saamiseksi. Sitten fragmentti leikattiin Hinf Iillä 180 ep MI-3-frag-15 mentin vapauttamiseksi. Edellä kuvattu plasmidi pSW22 leikattiin Eco RIillä ja Bgl Ilillä 240 ep BAR1-fragmentin eristämiseksi. Tähän fragmenttiin liitettiin 180 ep MI-3-fragmentti ja ZC794/ZC795-adapteri neliosaisessa ligaatiossa pUCl8:n kanssa, joka oli linearisoitu Eco RIillä ja Xba Iillä. Tulok-20 seksi saatu plasmidi, joka nimettiin pSW123:ksi (esitetty kuviossa 5), leikattiin Eco RIillä ja Xba Iillä 3,2 ke BAR1-MI- 3-fragmentin eristämiseksi. Plasmidi pSW81 pilkottiin Hind Ulilla ja Eco RIillä 1,1 ke TPI1-proraoottori-BAR1-fragmentin eristämiseksi. Terminaattori saatiin aikaan 0,76 ke Xba I-25 Bam HI -fragmenttina. 1,1 ke TPI1-BAR1-fragmentti, 3,2 ke : BAR1-MI-3-fragmentti ja TPI1-terminaattorifragmentti liitet tiin neliosaisessa ligaatiossa pUC18iaan, joka oli linearisoitu Hind Ulilla ja Bam Hiillä. Tulokseksi saatu plasmidi, joka nimettiin pSW127:ksi, sisältää TPI1-promoottorin, BAR1-sek-30 venssin, joka koodittaa aminohappoja 1-115, sekvenssin, joka . Lys-Arg-pilkontapaikkaa koodittavan sekvenssin ja MI-3:a koo- - daavan sekvenssin, ja TPI-terminaattorin.
Plasmidi pSW151 konstruoitiin pSW127:ssä esiintyvän BAR1iä koodaavan sekvenssin korvaamiseksi BAR1 -geenistä peräisin ole-35 van aminohappoja 251-526 koodaavalla alueella (kvuio 5). Plasmidi pSW127 hajotettiin Xho Ilillä ja Eco RIillä 965 ep frag-
II
- 96121 19 raentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää ZC794/ZC795-synteettisen adapterin fuusioituneena MI-3:een, johon kytketty TPI1-terminaattori. Plasmidi pSW8 hajotettiin Sai Iillä ja Bam Hiillä BAR1 in C-terminaalisia 275 aminohappoja koodittavan 821 5 ep fragmentin eristämiseksi. Plasmidi pIC19H (Marsh et ai., ibid.), joka on linearisoitu Sai Iillä ja Eco Rilliä liitettiin 965 ep ja 821 ep fragmentteihin kolmiosaisessa ligaati-ossa. Tulokseksi saatu plasmidi nimettiin pSWl51iksi.
Plasmidi pSWl67, joka käsittää BAR1 in kodonit 1-526 fuusioitu-10 neena MI-3-sekvenssiin hiivavektorissa YEp13, konstruoitiin seuraavasti. Plasmidia pSW81 varustettuna TPI1-promoottorilla ja BAR1-sekvenssillä edellytetään BAR1:ä koodaavan sekvenssin täydentämiseksi, kun se liitetään pSW81issä olevaan BAR1-sekvenssiin. Plasmidi pSW81 hajotettiin Hind Ulilla ja Sai Iil-15 lä 1,67 ke TPI1-promoottori-BAR1-fragmentin eristämiseksi. Plasmidi pSW151 pilkottiin Sai Iillä ja Bgl Hilla 1,61 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää BAR1-MI-3-fuusion ja TPI1-terminaattorin. Tähän fragmenttiin liitettiin 1,67 ke TPI1-proraoottori-BAR1-fragmentti ja YEp13 (Broach et 20 ai., Gene 8_i 121-133, 1979), joka oli linearisoitu Hind Ulilla ja Bam Hiillä. Tulokseksi saatu plasmidi nimettiin pSW167iksi (kuvio 6). Plasmidi pSW167 on tallennettu American Type Culture Collectioniin E. coli HB101 -transformanttina tallennenumerolla 67523.
> < : 25 Esimerkki 5i Ekspressiovektorin pSW200 konstruointi
Rakenne, joka käsittää BAR1-signaalisekvenssin, BAR1-kolmas domeenisekvenssin ja MI-3ia koodaavan sekvenssin, yhdistettiin ensin vektoriin pIC19H (Marsh et ai., ibid.), kloonattiin sitten hiivavektoriin YEp13 (kuvio 6). Plasmidi pSW81 (esimerkki , 30 4) linearisoitiin Eco Rilliä. Eco Rl -adhesiiviset päät täy- » tettiin käsittelemällä DNA-polymeraasilla I (Klenow-fragment-ti). Tulokseksi saatu päistään tasainen fragmentti leikattiin sitten Bgl Hilla 1,1 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää TPI1 -promoottorin ja BAR1 -signaalisekvens-35 sin. Plasmidi pSWl51 (esimerkki 3) leikattiin Eco RVillä ja Cla Iillä 1,37 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti 20 96121 käsittää 403 ep BAR1-kolmas domeenisekvenssin, MI-3:a koodaa-van sekvenssin ja TPI1-terminaattorin. Tämä fragmentti liitettiin 1,1 ke fragmenttiin, joka on johdettu pSW81:stä, kolmiosaisessa ligaatiossa pIC1911:n kanssa, joka oli linearisoitu 5 hajottamalla Bgl II:lla ja Cla I:llä. Tulokseksena saatu plas-midi, joka nimettiin pSWl95:ksi, hajotettiin Bgl 11:11a ja Sma Iillä 2,4 ke ekspressioyksikon eristämiseksi, joka yksikkö ligatoitiin sitten YEp13:een, joka oli linearisoitu hajottamalla Bam Hiillä ja Pvu Hilla. Tulokseksi saatu plasmidi ni-10 mettiin pSW200:ksi. Plasmidi pSW200 on tallennettu American Type Culture Collectioniin E. coli HB101 -transformanttina tallennenumerolla 67524.
Esimerkki 6: Vektorin pSW207 konstruointi pSWl67:n sisältämä ekspressioyksikko sijoitettiin myös vekto-15 riin käyttäen S. pombe POTI-geeniä valikoitavana merkitsimenä tpi1-puutteen täydentämiseksi isäntäsolussa. P0T1-geeni mahdollistaa vain tpi1-puutteen alhaisen tason kompensaation hii-vaisäntälajissa. Tämä alhaisen tason kompensaatio tuottaa kompensoivan lisäyksen ekspressiovektorin kopioluvussa. Tämä vek-20 tori johdettiin vektorista pCPOT (tallennettu ATCCihen E. coli -laji HB101 -transformanttina, tallenne no 39685). Kuten kuvio 7 esittää, vektori pCPOT muutettiin korvaamalla 750 ep Sph I-Bam Hill -fragmentti, joka sisältää 2 mikronia ja pBR322-sek-venssejä, 186 ep SPH I - Bam Hill -fragmentilla, joka on joh-25 dettu pBR322-tetrasykliiniresistanssigeenistä, plasmidin pDPOT konstruoimiseksi. Plasmidi pDPOT modifioitiin Sph I -paikan tuhoamiseksi ja Not I -paikka 5' :n asettamiseksi Bam HI -paikkaan. Oligonukleotidit ZC994 (5'gaT CCG CGG CCG CAC ATG3') ja ZC995 (5'tGC GGC CGC G3' ) kinatoitiin ja lämpoliitettiin adap-30 terin muodostamiseksi, jossa adapterissa on 5'-Sph-yhteenso-, piva pää, Not I -paikka ja 3'-BamHI-adhesiivinen pää. Plasmidi pDPOT linearisoitiin hajottamalla Sph Iillä ja Bam Hiillä. Linearisoitu pDPOT ligatoitiin ZC994/zC995-adapteriin plasmidin pSW197 muodostamiseksi (kuvio 7).
35 TPI1-promoottori lisättiin plasmidiin pSWl 97 pSW207ln konstruoimiseksi. Plasmidi pZVl34 (esimerkki 2) hajotettiin Bgl IIll- ii 21 96121 la ja Eco Rilliä 0,9 ke promoottorifragmentin eristämiseksi. Edellä kuvattu TPI1 -promoottorifragmentti ja ZC994/ZC995-adapteri ligatoitiin kolmiosaisessa ligaatiossa pUC18:aan, joka oli linearisoitu hajottamalla Sph l:llä ja Eco Rilliä. Tulok-5 seksi saatu plasmidi pSW198 hajotettiin Not I:llä ja Bam Hiillä 0,9 ke ΤΡΠ-promoottorifragmentin eristämiseksi. Tämä fragmentti ligatoitiin pSWl97:ään, joka oli linearisoitu hajottamalla Not l:llä ja Bam Hiillä. Tulokseksi saatu plasmidi nimettiin pSW207iksi (kuvio 7).
10 Esimerkki 7j Ekspressiovektorin pSW210 konstruointi
Ekspressiovektori, joka koodittaa Barrierin ensimmäiset 526 aminohappoa fuusioituneena MI-3ia koodaavaan sekvenssiin, konstruoitiin, kuten kuvioissa 8 ja 9 on esitetty.
Manipulaation helpottamiseksi fragmentti, joka käsittää 15 ZC794/ZC795-adapterin, MI-3:a koodaavan sekvenssin ja TPI1 -terminaattorin, subkloonattiin pIC19H:hon. Plasmidi pSW127 (esimerkki 4) hajotettiin Eco Rilliä 1 ,2 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää BAR1 ;n 3'-osan, ZC794/ZC795-adapterin, MI-3:a koodaavan sekvenssin ja TPI1-terminaattorin. 20 1,2 ke fragmentti hajotettiin Xho 11:11a 0,96 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää ZC794/ZC795-adapterin, MI-3:a koodaavan sekvenssin, ja TPI1-terminaattorin. Tämä fragmentti ligatoitiin pIC19H:hon, joka oli linearisoitu hajottamalla Bam Hiillä ja Eco Rilliä. Tulokseksi saatu plasmidi *· 25 nimettiin pSW150:ksi (esitetty kuviossa 9).
TPI1-promoottorifragmentti saatiin plasmidista pSW84. Plasmidi pSW84 sisältää TPI1-promoottorin, mutatoidun BAR1-geenin fuusioituneena substanssi P -sekvenssiin ja TPI1-terminaattorin, ja se kontruoitiin, kuten on esitetty kuviossa 8. 0,54 ke Sph 30 I - Eco Rl -fragmentti, joka käsittää ADH1-promoottorin ja BAR1:n ensimmäiset 119 ep, joka fragmentti on johdettu plasmidista pSW22 (esimerkki 4) ligatoitiin M13mp1 8laan, joka oli linearisoitu hajottamalla Sph Iillä ja Eco Rilliä. Tuloksena saatu faagi, joka nimettiin pSW54:ksi, alistettiin in vitro 35 -mutageneesiin (Zoller ja Smith, ibid.) käyttämällä mutagee- 22 - 96121
nista oligonukleotidia ZC634 (5'ATT ACT GCT CCT ACA AAC
GAT^'). Tämä mutaatio vaihtoi asemassa 25 olevan leusiiniko-donin proliinikodoniksi signaalipeptidipilkontapaikkamutantin generoimiseksi. Positiiviset kloonit sekventoitiin mutaation 5 vahvistamiseksi ja positiiviset kloonit nimettiin mZC634-7:ksi. mZC634-7:n replikatiivisen muodon DNA hajotettiin Sph l:llä ja Eco Rl:llä 0,54 ke fragmentin eristämiseksi. Tämä fragmentti ligatoitiin pUC18:aan, joka oli linearisoitu hajottamalla Sph I:llä ja Eco RI:llä. Tuloksena saatu plasmidi 10 pSW66 hajotettiin Hind 111:11a ja Xba I:llä ADH1-promoottori-fragmentin poistamiseksi. 2,8 ke fragmentti, joka sisältää mutagenoidun BAR1-fragmentin ja pUC18:n, ligatoitiin plasmi-dista pZV134 peräisin olevaan Hind III - Xba I -fragmenttiin (esimerkki 2), joka käsittää TPI1-promoottorin. Tulokseksi 15 saatu plasmidi nimettiin pSW82:ksi. Plasmidi pSW82 hajotettiin Hind 111:11a ja Eco Rl:llä 1,02 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää TPI1-promoottorin ja mutagenoidun BAR1-fragmentin. Plasmidi pSW82 alistettiin osittaiseen hajotukseen Eco RI:llä ja täydelliseen hajottamiseen Sst l:llä 2,6 20 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää BAR1-geenin C-terminaalisen osan fuusioituneena substanssi P -sekvenssiin ja TPI1-terminaattorin. Nämä kaksi fragmenttia ligatoitiin kolmiosaisessa ligaatiossa PUC18:aan, joka oli linearisoitu hajottamalla Hind III:11a ja Sst l:llä. Tulokseksi 25 saatu plasmidi pSW84 käsittää TPI1-promoottorin, mutagenoidun BAR1-geenin ja TPI1-terminaattorin.
I t
Manipuloinnin helpottamiseksi pSW84:stä peräisin oleva TPI1-promoottorifragmentti ligatoitiin pSW150:n MI-3-TPI1-termi-naattorifragmenttiin vektorissa pIC19R (Marsh et ai, ibid.). 30 Kuten kuviossa 9 esitetään, plasmidi pSWl 50 linearisoitiin ha-. jottamalla Acc i:llä ja adhesiiviset päät tasoitettiin DNA- polymeraasilla I (Klenow-fragmentti). Sitten tasoitetut fragmentit leikattiin Bgl II:11a 0,97 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää ZC994/ZC995 adapterin, MI-3:a koodaa-35 van sekvenssin ja TPI1-terminaattorin. Plasmidi pSW84 hajotettiin Eco Rl:llä ja adhesiiviset päät tasoitettiin DNA-polyme-raasilla I (Klenow-fragmentti). Sitten tasoitetut päät leikat- « 11 - 96121 23 tiin Hind 111:11a 1,02 ke TPI-promoottori-BARl-fragmentin eristämiseksi. pSW150:stä peräisin oleva 0,97 ke fragmentti ja pSW84:stä peräisin oleva 1,02 ke fragmentti liitettiin kolmiosaisessa ligaatiossa pICl9R:ään, joka oli linearisoitu ha-5 jottamalla Hind 111:11a ja Bgl II:lla. Tulokseksi saatu plas-midi nimettiin pSW204:ksi.
pSW204:ssä oleva ekspressioyksikko sijoitettiin pSW207:ään (esimerkki 6) plasmidin pSW212 valmistamiseksi. Plasmidi pSW204 leikattiin Sph 1:11a ja Bgl II:lla 1,3 ke ekspressioyk-10 sikSn eristämiseksi. Plasmidi pSW207 leikattiin Sph I:llä ja Bam Hl:llä osittaisen TPI1 -promoottori-vektorifragmentin eristämiseksi. Nämä kaksi fragmenttia ligatoitiin yhteen plasmidin pSW212 valmistamiseksi (kuvio 9).
Täysipituinen BAR1 -MI-3-fuusio konstruoitiin korvaamalla 15 pSW212:ssa oleva BAR1-fragmentti BAR1-fragmentilla, joka on peräisin pSWl67:stä (esimerkki 4). Plasmidi pSW21 2 hajotettiin Sph I:llä ja Bam HI:llä vektorifragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää osittaisen TPI1 -promoottorin, ZC794/ZC795-adapterin, MI-3:a koodaavan sekvenssin ja TPI1-terminaattorin. 20 Plasmidi pSW167 hajotettiin Sph I:llä ja Bam Hl:llä 1,81 ep osittaisen TPI1-promoottorin ja BAR1 -sekvenssien eristämiseksi. Tämä fragmentti ligatoitiin pSW212-vektorifragmenttiin ekspressiovektorin pSW210 valmistamiseksi (kuvio 9).
Esimerkki 8: Ekspressiovektorin pSW219 konstruointi 25 Plasmidi pSW219, joka käsittää pSW200:ssa olevan ekspressioyk-sikon (esimerkki 5) ja POTI-valikoitavan merkit s imen, konstruoitiin seuraavasti (kuvio 10). Plasmidi pSWl95 (esimerkki 5) hajotettiin Bgl II:11a ja Cla l:llä 2,4 ke fragmentin eristä-; mi seksi, joka fragmentti käsittää TPI1-promoottorin. BARl-sig- *. 30 naalisekvenssin, BAR1 -kolmatta domeenia koodaavan sekvenssin, MI-3-sekvenssin ja TPI1-terminaattorin. Tämä fragmentti ligatoitiin Bam HI - Cla I -linearisoituun pICl9H:hon. Tulokseksi saatu plasmidi pSW21 7 sisältää pSWl95:stä peräisin olevan eks-pressioyksikon, jossa on Bgl II -paikka TPI1-terminaattorin . 35 3'-päässä. Plasmidi pSW217 hajotettiin Sph i:llä ja Bgl Ii:lla 24 - 96121 1,7 ep fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää osittaisen TPI1-promoottorin, BAR1 -signaalin ja kolmannet do-meenisekvenssit, MI-3:a koodaavan sekvenssin ja TPI1-termi-naattorin. Plasmidi pSW207 (esimerkki 6) hajotettiin Sph 1:1-5 lä ja Bam Hiillä osittaisen TPI1 -promoottori-vektorifragmentin eristämiseksi. Tämä fragmentti ligatoitiin pSW217:stä peräisin olevaan 1,7 ke fragmenttiin ekspressiovektorin pSW219 valmistamiseksi.
Esimerkki 9: Ekspressiovektorin pZV187 konstruointi 10 Vaihtoehtoinen käsittelypaikka kaksiemäksiseen pilkontapaik-kaan on trombiinipilkontapaikka. Vaihtoehtoisen ekspressioyk-sikon konstruoimiseksi modifioitiin plasmidi pSWl95 in vitro -mutageneesillä Lys-Arg-pilkontapaikan korvaamiseksi trombii-nipilkontapaikalla. Tämä modifikaatio sai aikaan kodonit, jot-15 ka koodittavat aminohappoja proliini ja arginiini, niiden ko-donien sijasta, jotka liittyvät kaksiemäksiseen käsittelypaikkaan. Tulokseksi saatu MI-3-ekspressiovektori, joka käsittää BAR1-signaalisekvenssin ja kolmatta domeenia koodaavan sekvenssin, nimettiin pZV187:ksi.
20 Kuvio 11 esittää pZV187:n kontruktiota. Plasmidi pSWl95 hajotettiin Sph l:llä ja Sai l:llä 1,7 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää BAR1-MI-3-fuusion ja TPI1-termi-naattorin. Tämä fragmentti ligatoitiin Ml3mp18:aan, joka oli hajotettu edeltä käsin täydellisesti Sph i:llä ja Sai l:llä. 25 Tulokseksi saatu faagiklooni nimettiin mp1 8-ZV1 72:ksi. Oligo-nukleotidia ZC1083 (5'tcc TTG GAT CCA AGA TTC GTT3') käytettiin mp18-ZV172:n mutagenoimiseksi käyttämällä urasiilimene-telmää (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82^:488-492, 1985). Tulokseksi saadut mutantit sekventoitiin mutageneesin vahvis-- 30 tamiseksi ja positiivinen klooni nimettiin ZV172/1083:ksi.
·. Sopivuuden takia ZV172/1083:ssa oleva lisäys subkloonattiin pUC18:aan. ZV172/1083:sta peräisin oleva 1,7 ke Sph I - Sai I -lisäys eristettiin ja ligatoitiin pUC18:aan, joka oli hajotettu täydellisesti Sph i:llä Sai i:llä. Tulokseksi saatu 35 plasmidi pZV180 hajotettiin täydellisesti Sai i:llä. Linearisoidun pZV180 adhesiiviset päät tasoitettiin käyttämällä DNA-
II
- 96121 25 polymeraasia I (Klenow-fragmentti) ja ligatoitiin kinatoitui-hin Bgl II-liittajiin. Ylimääräiset liittäjät poistettiin hajottamalla Bgl II:11a. Liittäjillä varustetty DNA leikattiin täydellisesti Sph l:llä 1,7 ke lisäyksen eristämiseksi. 1,7 5 ke lisäys, joka käsittää osittaisen TPI-promoottorin, BAR1-MI- 3-fuusion ja TPI1 -terminaattorin, ligatoitiin plasmidin pSW207 Sph I - Bam HI -osittaiseen TPI1 -promoottorivektorifragment-tiin pZV187:n konstruoimiseksi.
Esimerkki 10: Isäntäsolujen transformaatio 1a insuliinianalo-10 gin MI-3-ekspressio
Ekspressiovektorit pSW1 67 ja pSW200, jotka käsittävät ekspres-sioyksikot vektorissa YEp13; ja ekspressiovektorit pSW210, pSW219 ja pZV187, jotka käsittävät ekspressioyksikot vektorissa pSW197, transformoitiin sopiviin hiivaisäntiin standardi-15 menetelmillä. S. cerevisiae -hiivaisännät sisälsivät mutaatioita, jotka täydennettiin plasmideissa esiintyvillä valikoitavilla merkitsimillä.
Plasmldi pSWl67, joka käsittää BAR1:n koodaavan alueen ensimmäiset 526 aminohappoa koodaavan sekvenssin fuusioituneena MI-20 3:a koodaavaan sekvenssiin YEp13:ssa, ja plasmidi pSW200, joka käsittää BAR1-signaalipeptidiä ja BAR1 -kolmatta domeenia koo-daavat sekvenssit fuusioituneena MI-3:a koodaavaan sekvenssiin, transformoitiin S. cerevisiae -lajiin ZA521 (MATa leu2-3 leu2-112 ura3 pep4::URA3 bar1 gal2). Transformant it välikö i-: 25 tiin kykynsä kasvaa synteettisessä viljelyväliaineessa, josta puuttuu leusiini, takia.
Transformantteja kasvatettiin yön yli 30° C:ssa 5 mlissa -LeuDrtä (Wickerham, L. J., J. Bact. 52^293-301 , 1946; sisäl-. tää Difco Yeast Nitrogen Base:a typpi lähteenä). Transformantit • 30 laimennettiin 1:100 20 tai 50 ml:aan -LeuD:tä ja viljeltiin 30° Clssa 24 tai 48 tuntia. Solut pelletoitiln ja pestiin ennen jäädyttämistä -70° Cissa. Käytetty väliaine lingottiin kahdesti ja dekantoitiin pois solumateriaalista ennen -70° C:ssa jäädyttämistä. MI-3-tasot, jotka määritettiin radioim-35 muunianalyysillä (RIA, katso esimerkki 14), osoittivat pSWl 67- 26 96121 transformanttien tuottavan 38 pg/ml MI-3-immuunireagoivaa materiaalia ja pSW200-transformanttien tuottavan 113 pg/ml MI- 3-immuunireagoivaa materiaalia 54 tunnissa.
Plasmidi pSW210, joka käsittää sekvenssin, joka koodittaa 5 BAR1 :n ensimmäiset 526 aminohappoa, fuusioituneena MI-3:a koo-daavaan sekvenssiin pSW197:ssä, ja plasmidi pSW219, joka käsittää BAR1 -signaalipeptidiä ja BAR1 -kolmatta domeenia koodaa-vat sekvenssit, fuusioituneena MI-3:a koodaavaan sekvenssiin pSW197:ssä, transformoitiin S. cerevisiae -lajeihin GA18-1C 10 (MATa leu2-3 leu2-112 ura 3 tpi1::LEU2) ja ZM114 (MATa leu2-3,112 ura3-52 ade 2-1 pep4::TPI-CAT tpi::URA3 vpt3). Transfor-mantit valikoitiin kykynsä kasvaa glukoosin läsnäollessa takia.
MI-3:n ekspressio ja sekreetio lajista GA18-1C, joka oli 15 transformoitu plasmidilla pSW210 ja pSW219, saavutettiin transformanttien ensimmäisellä yön yli viljelyllä 30° C:ssa 5 ml:ssa MED 1:ä (2 % Bacto Yeast Extractia, 0,5 % ammonium-sulfaattia, 6 % glukoosia). Transformantit laimennettiin suhteessa 1 :100 20 tai 50 ml saan MED 1 :a ja niitä viljeltiin 30° 20 C:ssa 24 tai 48 tuntia. Solut pelletoitiin, pestiin ja jäädytettiin -70° C:ssa. Käytetty väliaine lingottiin kahdesti ja dekantoitiin pois solumateriaalista ja jäädytettiin sitten -70° C:ssa. MI-3-tasot, jotka määriteltiin RIA:lla, osoittivat pSW210-transformanttien tuottavan 0,3 pg/ml MI-3-immuunirea-' 25 goivaa materiaalia ja pSW219-transformanttien tuottavan 0,15 pg/ml MI-3-immuunireagoivaa materiaalia 24 tunnissa.
MI-3:n ekspressio ja sekreetio lajin ZM11 4 pSW219-transforman-teista mitattiin myös korkeapainenestekromatograf ia(HLPC)ana-. lyysillä. Transformantteja viljeltiin y5n yli 30° Cissa 5 • 30 ml:ssa täydennettyä YEPDitä (YEPD + 10 mg/L Ade + 80 mg/L Leu + 1 0 mM CaCl2, säädettynä 6 % glukoosiin). Yonyliviljelmä laimennettiin 1:100 50 ml:aan täydennettyä YEPD:ta ja viljeltiin 30° C:ssa. Duplikaatit 4 ml:n näytteet otettiin 30, 48 ja 75 tunnin kuluttua. Näytteet sentrifugoitiin ja supernatantit . 35 säästettiin. Supernatanttien 0,5 ml:n alikvootit sekoitettiin li 27 96121 0,5 ml:n fermentointiliemeen (552 g 96 % EtOH + 349 g H2O + 5 ml kons. H2SO4) ja annettiin inkuboitua huoneenlämpötilassa 30 min. Sitten seokset suodatettiin 0,2 pm Acrodiscien läpi (Gelman Sciences, Ann Arbor, Mich.) ja jäädytettiin -20° C:s-5 sa. MI-3-tasot, jotka määriteltiin HPLC-analyysillä (esimerkki 14B), osoittivat pSW219-transformanttien tuottavan 14 pg/ml MI-3:a 75 tunnissa.
Plasmidi pZV187, joka sisälsi trombiinipilkontapaikan BAR1 -kolmannen domeenin ja MI-3:a koodaavan sekvenssin välissä, 10 transformoitiin S. cerevisiae -lajeihin GA18-1C ja ZM114. Transformantit valikoitiin kykynsä kasvaa glukoosin läsnäollessa takia. Transformantteja viljeltiin yön yli 5 mltssa YEP + 6 % glukoosia (1 % Bacto Yeast Extractia, 2 % Bacto Yeast Peptonea lisättynä 6 % dekstroosia autoklaavauksen jälkeen). 15 Yön yli viljellyt viljelmät laimennettiin 1:100 10 ml:aan YEP + 6 % glukoosia ja niitä viljeltiin 30° C:ssa. Näytteet otettiin 26 ja 48 tunnin kuluttua. Näytteet sentrifugoitiin solujen pelletoimiseksi ja supernatantit dekantoitiin ja jäädytettiin -70° C:ssa. MI-3-tasot määritettiin radioimmuunianalyy-20 sillä. GA18-1 C-transformanttien osoitettiin tuottavan 0,9 ng/-ml MI-3-immuumireagoivaa materiaalia 48 tunnissa. ZM114-trans-formanttien osoitettiin tuottavan 0,52 ng/ml MI-3-immuunirea-goivaa materiaalia 48 tunnissa.
Esimerkki 11: Ekspressiovektoreiden pSW290 la pSW281 konstruk-25 tio
Konstruktio, joka käsittää TPI1-promoottorin, BAR1-signaali-sekvenssin, BAR1-kolmas domeeni -sekvenssin, jossa on glykosy-laatiopaikkamutaatio asemassa no 7, MI-3:a koodaavan sekvenssin, TPI1-terminaattori- ja pDPOT-vektorisekvenssin, koottiin 30 pZC891:stä, joka konstruoitiin seuraavasti. pSWl95 Sph I -Bam HI -fragmentti (esimerkki 5), joka käsittää TPI1-promoottorin osan, BAR1-signaalisekvenssin ja BAR1-kolmannen alueen, kloonattiin Ml3mp18:aan, joka oli linearisoitu hajottamalla Sph i:lla ja Bam Hi:llä. Yksijuosteinen templaatti-DNA, joka val-35 mistettiin tuloksena olevasta konstruktiosta, alistettiin in vitro mutageneesiin käyttämällä ZC891:ä (5' AGT CGA TGC TCT
96121 28 ACG 3') käyttämällä oleellisesti menetelmää, jonka ovat kuvanneet Zoller ja Smith (ibid., 1983). Mutageneesi käyttämällä ZC891:ä tuotti Asn -> Gin -mutaation BAR1-kolmannen domeenin asemassa no 7. Positiivinen klooni, joka identifioitiin plak-5 kihybridisaatiolla ja varmistettiin dideoksisekvennoinnilla, nimettiin pZC891:ksi.
Repiikatiivisen muodon pZC891-DNA valmistettiin ja hajotettiin Sph Ijllä ja Bam Hiillä 0,73 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää TPI1-promoottorin osan, BAR1 -signaalisek-10 venssin ja BAR1-kolmannen domeenin, joka sisältää ZC891-mutaation glykosylaatiopaikassa no 7. Plasmidi pSW210 (esimerkki 7) hajotettiin Sph Iillä ja Bam Hiillä 12,3 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää 5' 0,7 ke TPI1-promoottorista, MI-3ia koodaavan sekvenssin, TPI1-terminaattori-15 ja pDPOT-vektorisekvenssit. pSW210-fragmentti liitettiin pZC891-fragmenttiin ligatoimalla plasmidin pSW290 generoimiseksi.
Rakenne, joka käsittää TPI1-promoottorin, BAR1-signaalisek-venssin, BAR1-kolmas domeeni -sekvenssin, jossa on glykosylaa-20 tiopaikkamutaatio asemassa no 8, MI-3ia koodaavan sekvenssin ja TPI1-terminaattori- ja pDPOT-vektorisekvenssin, koottiin tavalla, joka on analoginen pSW290 konstruoinnin kanssa. Paik-kasuunnattu in vitro -mutageneesi pSW253:n yksijuosteisella templaatti-DNAi11a käyttämällä ZC1330:ä (5' AAA CCT CTC AAG : 25 AAA CCA A 3' ) ja Zollerin ja Smithin (ibid.) kuvaamaa menetel mää tuotti mutaation, joka sai aikaan Asn -> Gin -substituution glykosylaatiopaikassa no 8. Positiivinen klooni identifioitiin ja hajotettiin Sph Iillä ja Bam Hiillä 0,73 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti sisältää ZC1330-mutaa- . 30 tion. Sitten 0,73 ke fragmentti liitettiin plasmidin pSW210 « • 12,3 ke Sph I - Bam Hl -fragmenttiin. Tulokseksi saatu plas midi nimettiin pSW281iksi.
Esimerkki 12l Isäntäsoluien transformaatio ia insuliiniprekur-sori-MI-3ln ekspressio plasmidista pSW29Q 35 Insuliiniprekursorin ekspressiota plasmidista pSW290 verrat-
II
29 96121 tiin vektoriin pDPOT ja analogisiin kontruktioihin plN4A, jotka käsittävät TPI1-promoottorin, MF«1-signaalisekvenssin; MI-3:a koodaavan sekvenssin, TPI1-terminaattori- ja pDPOT-vekto-risekvenssit, ja pSW219:ään (esimerkki 8), joka käsittää TPI1-5 promoottorin, BAR1-signaalisekvenssin, villintyyppisen BAR1 -kolmas domeeni -sekvenssin, MI-3:a koodaavan sekvenssin, TPI1-terminaattori- ja pDPOT-vektorisekvenssin. Ekspressio analysoitiin kasvukäyräkokeissa. Plasmidit pSW290, pDPOT, plN4A ja pSW219 transformoitiin S. cerevisiae -lajiin ZM114 (esimerkki 10 10) standardimenetelmillä. Viisi ml:aa YEPD + ade + leu (1 % hiivauutetta, 2 % peptonia, 2 % glukoosia, 40 mg/1 adeniinia, 80 mg/1 leusiinia) ySnyliheräteviljelmiä viljeltiin kutakin transformanttia varten. Heräteviljelmät laimennettiin 0,1 :n OD600:aan 60 ml:ssa YEPD + ade + leu ja niitä viljeltiin 30° 15 C:ssa ilmastuksella. Näytteet otettiin 22, 34,5 36,5 ja 57,2 tuntia ymppäyksen jälkeen.
Kunakin ajankohtana ODgoo määriteltiin ja kustakin viljelmästä otettiin 5 ml:n näytteet. ZM11 4[SW90]-viljelmästä havaittiin, ettei se osoita mitään kasvu-lagia, kuten havaittiin 20 analogisesta rakenteesta pSW219, joka koodittaa villintyyppis-tä glykosylaatiota BAR1-kolmannessa domeenissa (taulukko 1). Solut poistettiin sentrifugoimalla 4° C:ssa ja supernatantit säästettiin. Kaksi 0,5 ml alikvoottia kustakin supernatantti-näytteestä jaettiin kahteen mikrofugiputkeen. 0,5 ml:n alik-25 vootit valmistettiin HPLC-analyysiä varten laimentamalla 0,5 ml:11a fermentointilientä, mitä seurasi inkubointi 30 min ajan huoneenlämpötilassa, sentrifugointi 5 min Eppendorf-mikrofu-gissa (Brinkmann, Westbury, N.Y.) 4° C:ssa ja suodattaminen 0,45 pm:n suodattimen läpi uuteen mikrofugiputkeen. Näytteitä 30 varastoitiin -70° C:ssa ennen analysointia. Korkeapaineneste-kromatograf ia-analyysit suoritettiin viljelmäsupernatanteilla, kuten esimerkissä 16B on kuvattu. Testien tulokset (taulukko 2) osoittivat, että ZM114[pSW290]:llä on suurempi MI-3:n eritys kuin analogisella rakenteella plN4A transformoituna 35 ZMl14:ään.
Taulukko 1 30 - 96121
Transformantti; PDPOT p1N4A pSW219 pSW290
Tuntia 22 15,6 11,8 0,98 14,1 34.5 17,0 15,0 3,8 16,4 46.5 18,6 17,6 8,6 16,6 57.2 18,2 21,0 10,2 19,5 5 Taulukko 2 MI-3-pitoisuus (mg/L) määritettynä HPLC-analyysillä Transformantti; pDPOT p1N4A pSW219 pSW290 tuntia 22 0 17,7 2,31 29,4 10 34,5 0 20,7 8,42 31,8 46.5 0 31,7 34,2 37,6 57.2 0 35,1 42,7 50,2
Esimerkki 13: Hybridierityspeptidi, joka käsittää PH05-sicrnaa-lipeptidin ia BAR1-kolmas domeeni -sekvenssin 15 Ekspressioyksikkö, joka käsittää PH05-signaalipeptidin, BAR1 -kolmas domeeni -sekvenssin ja sian urokinaasi(uPA)-cDNA:n, * konstruoitiin ja sijoitettiin vektoriin YEp13. uPA-cDNA joh dettiin plasmidista pYNl5 (Nagamine et ai., Nuc. Acids Res. 1_2:9525-9541 , 1984), joka käsittää uPA-cDNAin 2,3 lisäyksenä 20 vektorissa pBR322 (kuvio 12). cDNA-sekvenssi muutettiin ensin Xba I -paikan 3' sijoittamiseksi uPA-lopetuskodoniin. Plasmidi ·, pYNl5 leikattiin Xba Iillä 1,9 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti sisältää uPA:ta koodaavan sekvenssin. Fragmentti ligatoitiin pUCl3:een, joka oli hajotettu täydellisesti 25 Xba 1:11a. Ligatointiseos transformoitiin E. coli -lajiin JM83. Plasmidi-DNA valmistettin transformanteista ja plasmidi, jossa oli lisäys oikeassa orientaatiossa, nimettiin pDR2010:k-. si. Plasmidi pDR2010 linearisoitiin hajottamalla Apa Iillä ja 31 96121 adhesiiviset päät tasoitettiin T4-DNA-polyraeraasilla. Tasoitettu fragmentti leikattiin Sma 1:113 585 ep 3'-ei-koodaavan alueen poistamiseksi, ja ligatoitiin uudelleen, jolloin tuloksena oli plasmidi pDR2011.
5 pDR2011 peräisin oleva cDNA-fragmentti muutettiin sitten Bgl II -paikan 5' sijoittamiseksi uPA:n ensimmäiseen aminohappo-kodoniin. Plasmidi pDR2011 leikattiin sitten Xba I:llä ja Eco RI:llä 1,35 ke uPA-fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti ligatoitiin Ml3mp19:ään, joka oli hajotettu täydellisesti Xba 10 I:llä ja Eco RI:llä. Tulokseksi saatu faagiklooni nimettiin M13mp19-2011:ksi. Oligonukleotidi ZC558 (5'äGT TCA TGA GAT CCT TTG GAG T^ ) suunniteltiin Bgl II -paikan luomiseksi uPA:n ensimmäiseen aminohappoon. Plasmidi Ml3mp19-2011 alistettiin in vitro -mutageneesiin Zollerin ja Smithin (1984, ibid.) kak-15 si-aloittajaraenetelmällä käyttämällä ZC558:aa ensimmäisenä aloittajana ja ZC87:ää (5'tcc CAG TCA CGA CGT^') toisena aloittajana. Positiiviset kloonit, jotka identifioitiin hybri-disaatiolla kinatoiduksi ZC558:ksi, leikattiin Bgl II:11a ja Eco RI:llä Bgl II -paikan sisäänviemisen vahvistamiseksi. Tu-20 lokseksi saatu faagi mp19-2011-558 hajotettiin Xba I:llä ja Sst I:llä 1,35 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää mutagenoidun uPA-sekvenssin. Tämä fragmentti liitettiin pUC18:aan, joka oli linearisoitu hajottamalla Xba I:llä ja Sst I:llä. Tulokseksi saatu plasmidi nimettiin pDR2012:ksi 25 (kuvio 12).
Plasmidissa pDR2012 oleva uPA-cDNA-fragmentti modifioitiin Xba I -paikan 3' lisäämiseksi lopetuskodoniin. Plasmidi pDR2012 linearisoitiin hajottamalla Eco Rilliä ja adhesiiviset päät tasoitettiin käsittelemällä DNA-polymeraasi 1:113 (Klenow-30 fragmentti). Tylppäpäinen fragmentti ligatoitiin kinatoituihin * Xba I -liittäjiin (CTCTAGAG) ja transformoitiin E. coli -la jiin JM83. Plasmidi-DNA, joka eristettiin transformanteista, analysoitiin hajottamalla Bgl II:11a ja Xba l:llä. Positiiviset kloonit nimettiin pZV112:ksi.
. 35 Plasmidissa pZV112 oleva uPA-cDNA-fragmentti substituoitiin 32 96121 kudosplasrainogeeniaktivaattori(tPA)-cDNA-sekvenssin tilalle plasmidiin pDRl298, joka sisältää osittaisen TPI1-promoottorin, MFa1-pre-pro-sekvenssin ja tPA-cDNA:n (kuvio 13). Plas-midi 1298 hajotettiin Bgl II:11a ja Xba l:llä 3,25 ke fragmen-5 tin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää TPI1-promoottorin, MFa1-signaalisekvenssin ja pUC1 8-vektorin. Plasmidi pZV112 hajotettiin Bgl II:11a ja Xba I;llä uPA-cDNA:n eristämiseksi. Tämä fragmentti ligatoitiin 3,25 ke pDR1298-fragmenttiin. Tulokseksi saatu plasmidi pZV117 hajotettiin Sph I:llä ja Xba 10 I:llä osittaisen TPI1-promoottorin, MFa1-signaalisekvenssin ja uPA-cDNA:n eristämiseksi. Plasmidi pDR1107 (esimerkki 2) hajotettiin Sph I:llä ja Xba I:llä 3,6 ep fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää osittaisen TPI1-promoottorin, TPI1-terminaattorin ja pUC13-vektorin. Sitten tämä fragmentti 15 ligatoitiin 3,25 ke pZV117-fragmenttiin, jolloin tulokseksi saatiin plasmidi pZV120. Plasmidi pZV120 hajotettiin Hind III: 11a ja Sma I:llä ekspressioyksikon eristämiseksi. Plasmidi YEp13 hajotettiin Bam Hl:llä ja päät tasoitettiin DNA-polyme-raasilla I {Klenow-fragmentti). Sitten tasoitettupäinen frag-20 mentti leikattiin Hind III:lla vektoriosan eristämiseksi, joka vektoriosa ligatoitiin sitten pZV120:n ekspressioyksikköön plasmidin pZV125 valmistamiseksi.
uPA-cDNA plasmidissa pZV125 modifioitiin Sal I -paikan 3' sijoittamiseksi uPA-cDNA-lopetuskodoniin käyttämällä synteettis-25 tä adapteria. Plasmidi pZV125 hajotettiin Hind III:11a ja Bam Hl:llä 2,5 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää TPI1-promoottorin, MFe1 -pre-pro-sekvenssin, ja osittaisen uPA-cDNA:n. Oligonukleotidit ZC830 (5’tCG ACG TGA GCT AGC CCG TTT TCA CCA CCA ACG TGA GTG TG3') ja ZC831 (5'gAT CCA CAC TCA 30 CGT TGG TGG TGA AAA CGG GCT AGC TCA CG3') kinatoitiin ja läm-pSliitettiin hiivakodonioptimoidun adapterin aikaansaamiseksi, joka koodittaa uPA:n terminaaliset 13 aminohappoa, ja jossa on Bam HI- ja Sal I -adhesiiviset päät. ZC830/ZC831-adapteri ja pZVl25:stä peräisin oleva 2,5 ke fragmentti liitettiin kol-35 miosaisessa ligaatiossa pUC13:aan, joka oli linearisoitu hajottamalla Hind III:11a ja Sai i:llä. Tulokseksi saatu plas-raidi, joka nimettiin pZVl57:ksi, käsittää uPA-cDNA:n, jossa • «
II
33 96121 on Bgl II -paikka 5' kohti uPA:n ensimmäistä kodonia ja Sal I -paikka 3' kohti uPA-lopetuskodonia.
pZV157:stä peräisin oleva uPA-cDNA-fragmentti liitettiin TPI1-promoottoriin ja PH05-signaalipeptidisekvenssiin pSWl48:n 5 konstruoimiseksi. Plasmidi pZVl57 hajotettiin Bgl II:11a ja Sai Ulla 1,3 ke uPA-cDNA.n eristämiseksi. 0,96 ke Bgl II -fragmentti, joka käsittää TPI1-promoottori-PH05-signaalipep-tidisekvenssin, ja joka on johdettu plasmidista pDR1394 [pUC18:aan perustuva plasmidi, joka sisältää TPI1-promoottorin 10 liitettynä syntetoituun sekvenssiin, joka koodittaa hiiva-PH05- (Arima et ai., Nuc. Acids Res. 1_1_: 1657—1672, 1983) sig-naalipeptidiä], ja uPA-cDNA-fragmentti liitettiin kolmiosaisessa ligaatiossa Bgl II - Sai Iillä leikattuun pIC19H:hon. Tulokseksi saatu plasmidi nimettiin pSW148:ksi.
15 Plasmidi pSWl52, joka käsittää BAR 1-kolmas domeeni -sekvenssin fuusioituneena substanssi P -sekvenssiin ja TPI1-terminaatto-riin, konstruoitiin seuraavasti. Plasmidi pSW22 (esimerkki 4) hajotettiin Pvu 1:11a 1,16 ke BAR1-substanssi P -fragmentin eristämiseksi. Kinatoidut ja lämpoliitetyt Sal I -liittäjät 20 (5'cGT CGA CCS') ligatoitiin 1,16 ke fragmenttiin. Ylimääräiset liittäjät poistettiin hajottamalla Sai I:llä ja Sst I:llä.
1,0 ke fragmentti eristettiin ja ligatoitiin pIC19R:ään, joka oli linearisoitu Sai Ullä ja Sst I:llä. Tulokseksi saatu plasmidi nimettiin pSW 152:ksi.
> 25 Plasmidi pSWl48 hajotettiin Hind 111:11a ja Sai Iillä 2,2 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää TPI1-promoottorin, PH05-signaalisekvenssin ja uPA-cDNA:n. Plasmidi PSW152 hajotettiin Sai Iillä ja Bgl Ililla 1,1 ke fragmentin . eristämiseksi, joka fragmentti käsittää BAR1-kolmas domeeni- • 30 substanssi P -fuusion ja TPI1-terminaattorin. 2,2 ke pSWl48- fragmentti liitettiin 1 ,1 ke pSW1 52-fragmenttiin kolmiosaisessa ligaatiossa Hind III - Bam HI -leikatulla YEp13:11a. Tulokseksi saatu plasmidi nimettiin pSWl63iksi (kuvio 15).
* < 34 96121
Esimerkki 14; Isäntäsoluien transformolnti 1a urokinaasin eks-pressio
Plasmidi pSWl63, joka käsittää TPI-promoottorin, PH05-signaa-lisekvenssin, uPA-cDNA:n, BAR1-kolmannen domeenin ja TPI1-ter-5 minaattorin hiivavektorissa YEp1 3, transformoitiin hiivalaj ei-hin ZY100 (MATa ade2-101 leu2-3,112 ura3-52 suc2-a9 gal2 pep4:CAT) ja ZY200 (MATa ade2-101 leu2-3,112 ura3-52 suc2-ä9 gal2 pep4:CAT vpt3). Transformantit valikoitiin kykynsä kasvaa synteettisessä viljelyväliaineessa/ josta puuttuu leusiini, 10 takia.
pSWl 63-transf ormanteista peräisin olevan sian urokinaasin eks-pressio ja eritys saatiin aikaan kasvattamalla transformant-teja ensin yön yli 30° C:ssa 5 ml:ssa -Leu6%D +0,1 M sukki-naattia pH 5,5 (-Leu sisälsi 6 % glukoosia ja 0,1 M sukkinaat-15 tia, pH säädetty pHihon 5,5 NaOHjlla ennen autoklaavausta). Yön yli viljellyt viljelmät laimennettiin 1:1000 5 ml:ssa-Leu6%D +0,1 M sukkinaattia pH5,5 ja niitä viljeltiin 37 tuntia 30° C:ssa. Solut pelletoitiin ja supernatantti dekantoi-tiin ja otettiin talteen. uPA-toiminta mitattiin fibriinilyy-20 sianalyysilla (esimerkki 16C). Tätä menetelmää käyttämällä uPA havaittiin tasoilla 7,2 pg/l solu-uutteessa ja 38 pg/l super-natantissa, joka oli peräisin ZY200:n pSWl63-transformanteis-ta.
Esimerkki 15: PDGF BB:n ekspressio ja eritys käyttämällä BAR1 -·*< 25 erityssignaalia A. PDGF-sekvenssien kloonaus US-patenteissa 4 766 073 ja 4 769 328, jotka on liitetty tähän viitteenä, on selostettu sekvenssin, joka koodittaa BDGFin B-ketjua, konstruktio. Kuten US-patentissa 4 766 073 on kuvattu, 30 ekspressiovektori pB12 (kuvio 15) käsittää DNA-sekvenssin, joka koodittaa ihmisen PDGF B-ketjua toimivasti kytkettynä S. cerevisiae TPI1-promoottoriin, MFo1 -pre-pro-sekvenssiin ja TPI1-terminaattoriin. Samoin kuten US-patentissa 4 766 073 on selostettu, vektori pSB1 (kuvio 15) käsittää ekspressioyksi-35 kon, joka koostuu TPI1-promoottorista, MFa1-pre-pro-sekvens-sistä, v-sis:ä koodaavasta sekvenssistä ja TPI1-terminaatto- 35 96121 rista.
MFa 1/B-ketj usekvenssi substituoitiin MFa1 /v-sis-sekvenssin tilalle pSB1 -vektoriin. pSB1 -ekspressioyksikkö lisättiin modifioituun pBR322-plasmidiin# josta puuttuu Eco Rl -paikka. Tu-5 lokseksi saatu vektori# joka nimettiin pKP10:ksi (kuvio 15)# hajotettiin Eco RI:lla ja Xba l:llä MFa1/v-sis-fragmentin poistamiseksi. pBl2 MFa1/B-ketjufragmentti lisättiin sitten pKP1 O-ekspressioyksikköön pKP26:n konstruoimiseksi (kuvio 15).
Kodonioptimoitu alfa-tekijäsekvenssi vietiin sitten ekspres-10 sioyksikköön. Eco Rl - Xba I -fragmentti, joka käsittää alfa-tekijä-pre-pro- ja insuliinisekvenssit (esimerkki 3) kloonattiin Eco Rljeen# Xba Iillä hajotettu pUC118 (Vieira and Messing# Meth. Enzymology 153:3-11# 1987) ja valmistettiin yksi-juosteinen templaatti-DNA. Tämä templaatti mutagenoitiin sit-15 tenn kaksi-aloittajamenetelmän mukaisesti (Zoller and Smith# DNA 3_:479-488, 1984) käyttämällä mutageenista oligonukleotidia ZC862 (5' CGA ATC TTT TGA GCT CAG AAA CAC C 3'). Mutageneesi sai aikaan Sst I -paikan syntymisen alfa-tekijäohjaajan 3'-päähän. Virheettömästi muuttunut plasmidi valikoitiin ja ni-20 mettiin pKP23;ksi. Ohjaajasekvenssi poistettiin pKP23:sta hajottamalla Eco RI:llä ja Sst I:llä ja ohjaajafragmentti sub-kloonattiin Eco RI:llä + Sac I:llä leikattuun pIC19H:hon (Marsh et ai.# Gene 32:481-486, 1984). Tulokseksi saatu plasmidi nimettiin pKP24:ksi (kuvio 15). Plasmidi pKP26 leikattiin 25 Eco Rl:llä ja Sst I:llä α-tekijäsekvenssin poistamiseksi. Kodonioptimoitu α-tekijäsekvenssi poistettiin sitten pKP24:stä Eco Rl - Sst I -fragmenttina ja liitettiin linearisoituun pKP26:een. Tulokseksi saatu vektori nimettiin pKP28:ksi (kuvio 16).
96121 36 laatti mutagenoitiin kaksialoittajamenetelmällä käyttämällä mutageenista oligonukleotidia ZC1019 (5' ACC CAA GGA TCT OTT GTC CAA AGA AAC TTC TTC 3' ). Virheettömästi mutagenoitu plas-midi nimettiin pKP32:ksi.
5 Kokonainen ekspressioyksikkö rekonstruoitiin sitten kuten kuviossa 16 esitetään. Plasmidi pKP32 hajotettiin Eco Rilliä ja Xba I:llä ja alfa-tekijä-B-ketjufragmentti otettiin talteen. Tämä fragmentti lisättiin Eco Rl - Xba I:llä leikattuun pKPlO:een pKP34;n konstruoimiseksi. Plasmidi pKP34 hajotettiin 10 Cla I:llä ja Bam Hiillä ja ekspressioyksikkö otettiin talteen. Tämä fragmentti lisättiin Cla I - Bam HI -hajotettuun pMPOT2ieen ( hiiva - 2 mikroniperäinen plasmidi, joka sisältää hiiva- ja bakteerireplikaatioalkuperiä, ampisilliiniresis-tanssigeenin ja P0T1-valikoitavan merkitsimen) pKP36in raken-15 tamiseksi.
Plasmidista pA7 peräisin oleva kodonioptimoitu PDGF A-ketju -sekvenssi (US-patentti 4 766 073) yhdistettiin kodonioptimoi-tuun alfa-tekijäohjaajasekvenssiin konstruointivaihesarjoina, jotka ovat yhdenmukaisia edellä B-ketjua varten kuvattujen 20 kanssa (kuvio 2). pA7 A-ketju -sekvenssi eristettiin Sat I-Xba I -fragmenttina ja lisättiin Sst I - Xba I -leikattuun pKP28:aan pKP27:n konstruoimiseksi. Plasmidi pKP27 hajotettiin Eco Ritilä ja Xba Itllä ja alfa-tekijä-A-ketjufragmentti kloonattiin pUC118:aan.
* 25 Mutageneesi käyttämällä oligonukleotidia ZC1018 (5' TTC GAT AGA TCT CTT GTC CAA AGA AAC ACC TTC TTC 3' ) suoritettiin kuten edellä kuvattiin Sst I -paikan poistamiseksi ja villityyppisen alfa-tekijäsekvenssin palauttamiseksi. Virheetön plasmidi ni-. mettiin pKP31tksi.
30 Sitten konstruoitiin kodonioptimoitu ekspressiovektori. Plasmidi pKP31 hajotettiin Eco Ritilä ja Xba Itllä ja alfa-tekijä-A-ketjufragmentti liitettiin Eco Rl - Xba Itllä leikattuun pKPlOteen. Tulokseksi saatu vektori, joka nimettiin pKP33 (kuvio 7), sisältää kokonaisen ekspressioyksikön. Plasmidi pKP33
II
37 96121 hajotettiin Cla Iillä ja Bara Hiillä ja ekspressioyksikkofrag-mentti otettiin talteen. Tämä fragmentti lisättiin Cla I - Bam Hiillä leikattuun pM0T2ieen ekspressiovektorin pKP35 konstruoimiseksi.
5 PDGP B-ketjua koodaava sekvenssi johdettiin plasmidista pKP51 , joka konstruoitiin, kuten kuviossa 17 on esitetty. Plasmidi pKP32 transformoitiin E. coli -lajiin MV1193. Yksijuostelnen templaatti-DNA valmistettiin ja templaatti mutagenoitiin käyttämällä mutageenista oligonukleotidiä ZC1078 (taulukko 3). 10 Templaatin ZC1078illa mutageneesi sai aikaan Bam HI -restrik-tiopaikkalisäyksen PDGF B-ketjua koodaavan sekvenssin 5'-päässä. Positiiviset kloonit identifioitiin plakkihybridisäätiöllä, restriktioanalyysillä ja dideoksisekvennoinnilla. Positii-. vinen klooni nimettiin pKP47:ksi.
15 pKP47:ssä oleva MFe1-signaalisekvenssi korvattiin synteettisellä signaalisekvenssillä. Plasmidi pKP47 hajotettiin Eco Rl:11a ja Bam HI:llä fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää humaani-B-ketjusekvenssin ja pUC118-vektorisekvens-sit. Oligonukleotidien ZC1157, ZC1158, ZC1076 ja ZC1077 (tau-20 lukko 3) osoitettiin koodittavan, kun ne on lämpoliitetty, Eco Rl - Bam HI -adapteria, joka koodittaa synteettistä signaali-sekvenssiä. Oligonukleotldit ZC1158 ja ZC1076 kinatoitiin. Oligonukleotidit ZC1158 ja ZC1157 lämpdliitetttiin ja ZC1076 ja ZC1077 lämpoliitettiin erillisissä reaktioissa. pKP47:stä 25 peräisin oleva Eco Rl - Bam HI -fragmentti liitettiin ZC11 58/ZC1157 :ään ja ZC1 076/ZC1 077:ään kolmiosaisessa ligaati-ossa. Tulokseksi saatu plasmidi, joka nimettiin pKP49:ksi, sisältää synteettisen signaalisekvenssin, PDGF B-ketj usekvenssin ja pUCl18-vektorisekvenssin.
» ·' 30 Ekspressioyksikko, joka käsittää TPI1-promoottorin, synteet tisen signaalisekvenssin ja TPI1 -terminaattorin, konstruoitiin plasmidista pKP49 hiivaekspressiovektoriin seuraavaksi sub-kloonaamista varten. Plasmidi pKP34 hajotettiin Cla I:llä ja Bam Hiillä 2,3 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti 35 käsitttää TPI1-promoottorin, MFa1-signaalisekvenssin, PDGF B- 38 96121 ketjusekvenssin j a TPI1 -terminaattoriekspressioyksikon. Plas-midi pUC12 linearisoitiin hajottamalla Hind 111:11a ja Eco Rilliä. Oligonukleotidit ZC1016 ja ZC1017 (taulukko 3) kina-toi tiin ja lämpoliitettiin polyliittäjäadapterin muodostami-5 seksi, joka adapteri käsittää Cla I-, Hind III-, Xho I-, Acc I-, Xba I- ja Bam HI -restriktiopaikat. Lineaarivektori liitettiin kinatoituun ja lämpoliitettyyn ZC1016/ZC1017-adapte-riin ligaatiolla, jolloin tuloksena oli pUC12 - Hind III ja Eco Rl -paikkojen häviäminen. Tulokseksi saatu vektori pUCl2* 10 linearisoitiin hajottamalla Acc I:llä ja Bam Hiellä. 2,3 ke ekspressioyksikkofragmentti liitettiin linear isoituun pUCl2*:een ligaatiolla. Tulokseksi saatu plasmidi nimettiin pKP38;ksi. Plasmidi pKP38 hajotettiin Eco Rilliä ja Xba I:llä 4,3 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää 15 TPI1-promoottori-, TPI1-terminaattori- ja pUC12*-vektorisek-venssit. Plasmidi pKP49 hajotettiin Eco Ritilä ja Xba Iillä 0,8 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää synteettisen signaalisekvenssin ja PDGP B-ketjusekvenssin. 0,8 ke fragmentti liitettiin pKP37:stä peräisin olevaan 4,3 ke 20 fragmenttiin ligaatiolla. Tulokseksi saatu plasmidi nimettiin pKP51:ksi.
B. Ekspressiovektorikonstruktio PDGF B-ketjusekvenssi liitettiin sitten erityssignaaliin, joka käsittää S. cerevisiae BAR1-geenin ohjaaja- ja kolmatta domee-25 nia koodaavat sekvenssit. BAR1-erityssignaali yhdistettiin ·' sitten B-ketjua koodaavan sekvenssiin ekspressiovektoreiden pSW304 ja pZY76 konstruoimiseksi.
Taulukko 3
Olicronukleotidi Sekvenssi (51 — >3') «
i I
30 ZC1 01 6 AAT TTA TCG ATA AGC TTG ACT CGA GAG TCG
ACT CTA GAG GAT CCG
ZC1 01 7 AGC TCG GAT CCT CTA GAG TCG ACT CTC GAG
TCA
AGC TTA TCG ATA
t 11 39 96121
ZC1 076 AGC TTT CTT GTT CTT GTT GGC TGG TTT CGC
TGC TAA GAT TTC TCC AGG TGC TTT CG ZC1 077 GAT CCG AAA GCA CCT GGA GAA ATC TTA GCA
GCG AAA CCA GCC AAC AAG AAC AAG AA 5 ZC1 078 GAA CCC AAG GAT CCG AGC TCC AAA GAA ACA
ZC1136 AAT TCA TTG GAT AAG A
ZC1135 GAT CTC TTA TCC CAT G
ZC1157 AAT TCT AAA AAT GCT TTT GCA
ZC1158 AGC TTG CAA AAG CAT TTT TAG
10 ZC1551 GAT CCC CGG GGA GCT CCT CGA GGC ATG
ZC1552 CCT CGA GGA GCT CCC CGG G
Plasraidi pSW255f joka käsittää TPI1-promoottorin ja BAR1-eri-tyssignaalin, konstruoitiin ensin. Plasmidissa pSW195 (esi-15 merkki 5) oleva BAR1:n kolmatta domeenia koodaava sekvenssi fuusioitiin synteettiseen adapteriin, joka koodittaa alfa-tekijän aminohappoja 81-85, Lys-Arg-pilkontapaikkaa, 5' Eco Rl adhesiivista päätä, 3' Bgl II adhesiivista päätä ja PDGF B-ketjun ensimmäistä aminohappoa. Oligonukleotidit ZC1135 ja 20 ZC1136 (taulukko 3) kinatoitiin ja lämpoliitettiin oleellises ti, kuten Maniatis et ai. (ibib.) ovat kuvanneet. Plasmidi pSW295 hajotettiin Hind III:11a ja Eco RI:llä 1,4 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää TPI1 -promoottoria ja BAR1:ä koodaavat sekvenssit. 1,4 ke fragmentti liitettiin 25 ZC1135/ZC1136-adapteriin ja pIC19R:ään, joka on linearisoitu : hajottamalla Hind III:11a ja Bgl 11:11a kolmiosaisessa ligaa- tiossa. Tulokseksi saatu plasmidi nimettiin pSW255:ksi (kuvio 18).
Plasmidissa pKP51 oleva PDGF B-ketjusekvenssi liitettiin TPI1-30 promoottoriin, BAR1-signaalisekvenssiin, BAR1-kolmanteen do-meeniin ja ZC1135/ZC1136-adapteriin (joka koodittaa Lys-Arg-pilkontapaikkaa) plasmidin pSW262 konstruoimiseksi (kuvio 10). Plasmidi pKP51 hajotettiin Bam Hiillä 1,09 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää PDGF B-ketjua koodaavan 35 sekvenssin ja TPI1-terminaattorin. Plasmidi pSW255 hajotettiin Sph Iillä ja Bgl Hilla 0,75 ke fragmentin eristämiseksi, joka 96121 40 fragmentti käsittää osittaisen TPI1 -promoottorin, BAR1 -signaalisekvenssin, BAR1 -kolmannen domeenin ja ZC11 35/ZC1136-adapte-rin. Nämä kaksi fragmenttia liitettiin kolmiosaisessa ligaa-tiossa pUC18iaan, joka oli linearisoitu hajottamalla Sph 1:11a 5 ja Bam Hiillä. Identifioitiin plasmidi, joka sisälsi kompo-nenttifragmentit virheettömässä orientaatiossa, ja se nimettiin pSW262iksi.
Hiivaekspressiovektori pSW304, joka käsittää TPI1-promoottorin, BAR1-signaalisekvenssin, BAR1-kolmannen domeenin, PDGF 10 B-ketjun ja TPI1 -terminaattorin vektorissa pMPOT2, konstruoitiin sitten, kuten kuviossa 18 on esitetty, Plasmidi pKP36 hajotettiin Cla I:llä ja Sph I:llä TPI1-promoottorin 0,76 ke 5'-osan eristämiseksi. Plasmidi pKP36 (kuvio 16) hajotettiin myös Cla 1:111 ja Bgl 11:11a 11 ke vektorin sisältävän frag-15 mentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää PDGF B-ketju-sekvenssin, TPI1-terminaattori- ja pMPOT2-vektorisekvenssit. Plasmidi pSW262 hajotettiin Sph I:llä ja Bgl Il:lla 0,75 ke osittaisen TPI1-promoottorin, BAR1-signaalisekvenssin, BAR1-kolmannen alueen ja ZC11 35/ZC11 36:n. Kolme fragmenttia liitet-20 tiin kolmiosaisessa ligaatiossa ja tulokseksi saatu plasmidi nimettiin pSW304iksi.
Ekspressiovektori pZY76 (kuvio 19) konstruoitiin lisäämällä B-ketjuekspressioyksikk5 vektoriin pRPOT. pRPOT-vektori johdettiin pCPOTista (ATCC 39685) korvaamalla ensin pCPOT:n 750 * 25 ep Sph I - Bam HI -fragmentti pBR322:n 186 ep Sph I - Bam Hl -fragmentilla. Tulokseksi saatu plasmidi pDPOT hajotettiin Sph Iillä ja Bam Hiillä 10,8 ke fragmentin eristämiseksi. Oligo-nukleotidit ZC1551 ja ZC1551 (taulukko 1) kinatoitiin ja läm-poliitettiin adapterin muodostamiseksi, jossa on Bam HI -adhe-. 30 siivinen pää ja Sph I -adhesiivinen pää, jota sivuaa Sma I-, • Sst I- ja Xho I -restriktiopaikat. 10,8 ke pDPOT-fragmentti uudelleenkierrätettiin ligaatiolla ZC1551/ZC1552-adapteriin. Tulokseksi saatu plasmidi nimettiin pRPOTlksi.
TPI1 -terminaattori subkloonattiin seuraavasti. Plasmidi pSWl 95 , 35 (kuvio 11) hajotettiin Bgl Hilla ja Sma Iillä 2,38 ke frag-
II
41 96121 mentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää TPI1-promoottorin, BAR1-aminoterminaalin ja BAR1-kolmannen alueen, MI-3:a koodaavan sekvenssin ja TPI1-terrainaattorin. 2,38 ke fragmentti ligatoitiin plasmidiin pRPOT, joka oli linearisoitu hajot-5 tamalla Sma I:llä ja Bgl II:lla. Tulokseksi saatu plasmidi, joka nimettiin pSW313:ksi, hajotettiin Xba l:llä ja Sph lilla 0,76 ke TPI1-terminaattorifragmentin eristämiseksi. 0,76 ke fragmentti liitettiin pUC18:aan, joka oli linearisoitu hajottamalla Sph Iillä ja Xba Iillä. Tulokseksi saatu plasmidi ni-10 mettiin pZY75iksi.
Sitten koottiin plasmidi pZY76. Plasmidi pSWl95 hajotettiin Bgl Hilla ja Eco Rilliä 1 ,4 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää TPI1 -promoottorin ja BAR1 -aminoterminaalin ja BAR1-kolmannen alueen. Plasmidi pSW262 (kuvio 18) hajotet-15 tiin Eco Rilliä ja Xba Iillä 0,35 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää ZC1136/ZC1136-adapterin ja PDGF B-ketjua koodaavan sekvenssin. Plasmidi pZY75 hajotettiin Xba Iillä ja Sph Iillä 0,75 ke fragmentin eristämiseksi, joka fragmentti käsittää TPI1-terminaattorin. Nämä kolme fragment-20 tia liitettiin pRPOTihen, joka oli linearisoitu hajottamalla Bam Hiillä ja Sph Iillä neliosaisessa ligaatiossa. Tulokseksi saatu plasmidi, joka käsittää TPI1 -promoottorin, BAR1-aminoterminaalin ja kolmannen domeenin, PDGFiää koodaavan sekvenssin, TPI1-terminaattori-ja pRPOT-vektorisekvenssit, nimettiin 25 pZY76iksi.
• | C. BB-homodimeerin ekspressio
Hiivalajeista, jotka oli transformoitu pSW304illä ja pZY76il-lä, peräisin olevan PDGF BBin ekspressiota verrattiin kontrol-liplasmideista pBl70m (Murray et ai. US-sarjano 896 485) ja 30 pKP57 (joka käsittää pKP34-ekspressioyksikon pRPOTissa) pe-• räisin olevan PDGFin ekspressioon. Plasmidit pSW304, pZY76, pBl70m ja pKP57 transformoitiin hiivalajeihin E18 #9 (MATa leu2-3,112 his4-580 pep4-3 tpi1IILEU2/MATa leu2-3,112 pep4-3 tpi1 ::LEU2), XB13-5B (MATa leu2-3,112 ura3 bar1 gal2 35 tpi1IILEU2) ja ZM114 (MATa ade2-101 leu2-3,112 ura3-52 tpi1-IIURA3 vpt3 suc2-9 gal2 pep4iitpiiICAT) oleellisesti kuten 96121 42
Beggs (Nature 275:104-108. 1978) on kuvannut. Yksittäisistä kolonioista peräisin olevat transformantit ympättiin fermen-tointiväliaineeseen (taulukko 4) ja niitä viljeltiin 24 tuntia 30° C:ssa. 24 tunnin kuluttua viljelmiin lisättiin glukoosia 5 2 %:n loppupitoisuuteen ja viljelmiä viljeltiin 24 tuntia 30° C:ssa.
Taulukko 4
Fermentointiväliaine: 20 g NZ Amine Type A 10 7 g KH2PO4 6 g NH4SO4 2 g MgS04
Liuota kiintoaineet veteen ja saata yhden litran tilavuuteen. Laita autoklaaviin 25 minuutiksi. Lisää autoklaavin jälkeen 15 2 ml/1 hivenalkuaineliuosta (resepti jäljempänä), 3 ml vita- miiniliuosta (resepti jäljempänä), 2 M natriumsukkinaattia, pH5,5 0,1 M loppumoolisuuteen ja 50 % glukoosia 2 %:n loppu-pitoisuuteen.
Hivenalkuaineliuos: 20 9,45 mg ZnSC>4 284,8 mg Fe2(804)3 48 mg CuS04*5H20
Liuota kiintoaineet tislattuun veteen ja saata 100 ml:n lop-putilavuuteen. Steriloi suodattamalla.
25 Vitamiiniliuos: . 420 mg riboflaviinia 5.4 g pantoteenihappoa 6,1 g niasiinia 1.4 g pyridoksiinia 30 60 mg biotiinia 40 mg foolihappoa 6,6 g inositolia
II
43 96121 1 ,3 g tiamiinia
Liuota tislattuun veteen ja saata litran lopputilavuuteen. Steriloi suodattamalla.
Solut poistettiin väliaineesta sentrifugoimalla. Supernatantit 5 suodatettiin seuraavaksi 0,45 pm suodattimien läpi minkä tahansa solujen tai solujätteiden poistamiseksi. Suodatetuille vilj elysupernatanteille suoritettiin mitogeneesianalyysit, kuten Raines ja Ross ovat kuvanneet (Meth. Enzymology 1 09:749-773, 1985). Tulokset ilmaistuna ng:ssa PDGF-toimintaa 10 per ml viljelyväliainetta, ovat esitetty taulukossa 5.
Taulukko 5 E18#9 XB13-5B ZM114
Plasmidi: pMPOT2 00- 15 pSW304 800-930 930-1630 pB170m 625-830 1600-2300 pMP0T2 000 pSW304 1266-2300 3100-3200 826-1125 pB170m 1000-1150 20 pRPOT 000 pZY76 2066-2250 2300-3000 2250-2500 : pKP57 1500-2325 1600-2500
Transformoiduilla hiivasoluilla tuotetut PDGF-analogit puhdistettiin konsentroiduista viljelysupernatanteista sarjalla kro-25 matografia- ja konsentrointivaiheita.
«
Viljelysupernatantit konsentroitiin käyttämällä Millipore Pel- lican Casetteja (Millipore, Bedford, Mass.) ja konsentraatit pelletoitiin sentrifugoimalla Beckman J-6B -sentrifugissa (Beckman Instruments, Inc., Brea, Kalif.) 4200 rpm 30 minuut-30 tia sameuden poistamiseksi. EDTA:ta lisätään 10 mM loppupitoi-suuteen ja seoksien pH säädetään pH:hon 5,5 5 Milla NaOH. Sit- 44 96121 ten konsentraatit laimennetaan vedellä noin 10 millimhon johtavuuteen.
Tulokseksi saadut konsentraatit kromatografoidaan S-Sepharose Past Flow -pylväässä (Pharmacia, Piscataway, N. J.). Pylväs 5 pestään 20 mN natriumfosfaatilla, 0,1 M natriumkloridillä, pH
7,3. Sitten pylväs eluoidaan 20 mM natrimfosfaatilla, 1 M nat-riumkloridilla, pH 7,3. Eluaatin absorbanssia 280 nmjssä seurataan ja huippufraktiot kerätään ja yhdistetään.
Eluaatit jäädytetään -20° C:ssa ja sulatetaan sitten. Partik-10 kelimainen aines poistetaan eluaateista sentrifugoimalla. Supernatant it kootaan ja pH säädetään 3,0:ksi 0,87 M etikkaha-polla. Eluaatit konsentroidaan sitten käyttämällä Amicon YM1 0 . -suodatinta (Amicon, Danvers, Mass.). Konsentroidut eluaatit laimennetaan viidellä tilavuudella 1 M etikkahappoa natrium-15 kloridipitoisuuden pienentämiseksi noin 0,2 M:iin.
Sitten eluaatit kromatografoidaan toisessa S-Sepharose-pylväässä. Pylväs pestään 1 M etikkahappoa ja eluaattien absorbanssia 280 nm:ssä seurataan kunnes se palaa peruslinjalle. Pylväs eluoidaan 1 M etikkahapolla, 1,5 M ammoniumkloridillä, 20 pH 4,8-5,0. Eluaattien A280*t® seurataan ja PDGF kerätään viimeisenä A280-huippuna. Huippufragmentit yhdistetään ja konsentroidaan käyttämällä Amicon YM10 -suodatinta.
« : Sitten konsentroidut eluaatit levitetään Sephadex G-50 Super fine -pylvääseen (Pharmacia, Piscataway, N.J.) käyttämällä 25 pylvästilavuuden noin 1 % näytetilavuutta. Pylvästä ajetaan 5 cm/h virtausnopeudella 1 M ammoniumasetaattia, ph 9,0. Puhtaimmat fraktiot, kuten määritettiin SDS-geelielektroforeesil-. la, yhdistetään ja pH säädetään 4,0:aan etikkahapolla.
Esimerkki 16: Analyysien kuvaus 30 A. Radioimmunoanalyysi MI-3-immunoreaktiiviselle ainekselle Radioimmunoanalyysit suoritettiin viljelysupernateilla (valmistettiin kuten esimerkissä 9 kuvattiin). Näytteet (50 μΐ/kolo) lisättiin 96-koloisiin V-pohjaisiin mikrotiitterile-
IJ
45 96121 vyihin (Flow Labs, McLean, VA.). Standardit, jotka koostuvat sian insuliinin laimennuksista NaFAM:ssa (0,6 g NaCl ja 5,9 g naudan seerumialbumiinia, liuotettuna 100 ml:aan 0,04 M Na-fosfaattipuskuria, pH 7,4, joka sisältää 0,1 % naudan seeru-5 mialbumiinia, lopullisen pH:n ollessa säädetty 7,3:een NaOH:l-la), sisällytettiin kuhunkin levyyn. Jokaiseen koloon lisättiin 50 μΐ marsun anti-insuliini-antiseerumia. 2,5 x 1 θ5 cpm/ 50 μΐ 1 -hiiri-anti-insuliinia lisättiin per kolo. Tätä seosta inkuboitiin huoneenlämpötilassa 2 tuntia. Staph A- so-10 lut (Pansorbin, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) laimennettiin 1:10 NaFAMiään ja lisättiin 50 μΐ kuhunkin koloon, mitä seurasi 45 minuutin pituinen huoneenlämpötilassa inkubointi. Levyä sentrifugoitiin 5 minuuttia 4° C:ssa 3000 rpm Beckman TJ-6 -sentrifugissa. Supernatantit erotettiin ja kolot pestiin 15 kahdesti 150 piillä naudan seerumialbumiinia (BSA) TNEN:ssä (50 mM Tris-emästä, 100 mM Nacl, 1 mM EDTA, 0,5 % NP40, säädettynä pH:hon 8,0). Solut suspendoitiin uudelleen 1 % BSA:han TNENissä ja laskettiin gammalaskijalla.
B. Korkean paineen nestekromatografia(HPLC)analyysi MI-3:lle 20 Taulukko 6 HPLC-puskuri-reseptit Puskuri A: 56,8 g Na2S04 1800 ml HPLC-luokan H2O (Omnisolv, EM Science, : Cherry Hill, N.J.) 25 5,4 ml H3PO4 (väh. 85¾) Säädä pH 2,3:een etanoliamiinilla. Säädä pH 3,6:een 4 N NaOH. Lisää 156 g HPLC-luokan asetonitriiliä (Am. Burdick & Jackson Laboratory, Muskegon, Mich.). Säädä tilavuus 2 l:aan HPLC-luo-- kan H20:lla. Suodata 0,45 μιηίη suodattimen läpi.
30 Puskuri B: 780 g HPLC-luokan asetonitriiliä
1044 g HPLC-luokan H2O
96121 46 HPLC-analyysit suoritettiin vilj elysupernatanteilla käyttämällä VISTA 5500 HPLCrtä (Varian). Supernatanttinäytteet (valmistettiin kuten esimerkissä 10 kuvattiin) sulatettiin ja sent-rifugoitiin mikrofugissa 1 minuutti huoneenlämpötilassa minkä 5 tahansa presipitaatin poistamiseksi näytteistä. 2,0, 10,0 ja 0,5 pg:n MI-3-standardit (saatiin Novo Industri A/S:stä, Bag-svaerd, Tanska) tehtiin 0,025 M muurahaishapossa, 100 μΐ kutakin näytettä ja standardia panostettiin C18-kääntesifaasipyl-vääseen (LiChroprep RP-18 (5 pm), E. Merck, Darmstad, Saksan 10 liittotasavalta).
Pylväs ajettiin käyttämällä isokraattista gradienttia, joka käsittää 60 % puskuria A ja 40 % puskuria B (reseptit annettu taulukossa 4) 50° C:ssa 1 ml/min virtausnopeudella 214 nm:n havainnointi tasolla, 0,05 AUFS (absorbanssiyksikot täysiraäärä) 15 Kutakin näytettä ajettiin 30 min MI-3-huipun esiintyessä 18 minissa. MI-3-aimeksen määrittäminen perustuu näyteainekseen vertaamiseen tunnetuilla MI-3-standardeilla.
C. Kvantitatiivinen fibriinilyysianalyysi uPA-toimintaa varten 20 Sopivasti viljellyt viljelmät, kuten esimerkeissä kuvattiin, sentrifugoitiin solujen pelletoimiseksi. Supernatantit dekan-toitiin ja säästettiin. Solupelletit pestiin kerran vedellä ja suspendoitiin uudelleen fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS, Sigma Chemical Co.) i 5 mH EDTArssa. Lasihelmiä : : 25 (400-500 pm) lisättiin puoleen kokonaistilavuudesta. Sekoituk sia pyorteitettiin täydellä nopeudella minuutin ajan kolme kertaa ja näytteet jäähdytettiin jäällä pyorteitysten välillä. Neste poistettiin putkista pasteur-pipeteillä ja siirrettiin mikrofugiputkiin. Sitten lysaatteja sentrifugoitiin Eppendorf-30 mikrofugissa (Brinkmann, Westbury, N.Y.) huippunopeudella 15 min 4° C:ssa. Supernatantit poistettiin huolellisesti analysointia varten.
Fibriinilyysianalyysi perustuu Binderin et al.:n menetelmään (J. Biol.Chem. 254:1998, 1979). 150 mg Agarose B:tä (Pharma-35 cia) lisättiin 15 mliaan Fibrin Plate Bufferia (4,36 g Tris-
II
47 96121 emästä, 8,48 g NaCl, 15 mg CaCl2, 200 mg NaN3 1 litrassa, pH säädettynä pH:hon 8,4). Sitten agaroosiseos sulatettiin ja pidettiin 55e C:ssa. Tähän liuokseen lisättiin 10 μΐ naudan trombiinia (500 U/ml). Fibrinogeeni (Sigma Chemical Co.) liu-5 otettiin Fibrin Plate Bufferiin, suodatussteriloitiin, laimennettiin sitten 5;n O.D. 280:een Fibrin Plate Bufferilla. 5 ml fibrinogeeniliuosta lisättiin agaroosi-trombiiniliuokseen. Seos kaadettiin Gelbond-agaroosikannatinlevylle (FMC Corp., Rockland, Me) ja sen annettiin jäähtyä. Kolot leikattiin aga-10 roosiin ja koloihin lisättiin 1 0 μΐ tai 20 μΐ testattavaa näytettä. Tuloksia verrattiin ihmisen urokinaasistandardikäyrään ja säädettiin sian urokinaasin vähentyneeseen spesifiseen toimintaan. Kirkkaan sädekehän kehittyminen kolon ympärille osoittaa biologisesti aktiivisen sianurokinasin läsnäolon.
15 Edellä esitetystä on otettava huomioon, että vaikka tässä on kuvattu keksinnön erityisiä suoritusmuotoja esimerkkien takia, erilaisia muunnelmia voidaan tehdä poikkeamatta keksinnön piiristä ja hengestä. Vastaavasti keksintöä ei pidä rajoittaa muuhun kuin oheisiin patenttivaatimuksiin.
»

Claims (17)

96121
1. DNA-rakenne, tunnettu siitä, että se käsittää transkrip-tionaalisen promoottorin kytkettynä toimivasti DNA-sekvenssiin, joka koodittaa signaalipeptidiä, mitä seuraa lukemis- 5 järjestyksessä toinen DNA-sekvenssi, joka koodittaa BARl-gee-nituotteen osaa, joka on vähintään osa C-terminaalisesta do-meenista ja joka ohjaa yhdessä signaalipeptidin kanssa hete-rologisten proteiinien erittymistä, sekä viimeisenä osana DNA-sekvenssin, joka koodaa heterologista proteiinia. 10
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että C-terminaalisen domeenin osa käsittää kuvion 1 mukaisen aminohapposekvenssin, joka alkaa seriinistä numero 391 ja päättyy seriiniin numero 526. 15
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että C-terminaalisen domeenin osa käsittää kuvion 1 mukaisen aminohapposekvenssin, joka alkaa alaniinista numero 423 ja päättyy seriiniin numero 526. 20
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että sanottu heterologinen proteiini tai polypeptidi on proteiini, joka on valikoitu ryhmästä, joka koostuu uro-kinaasista, insuliinista, verihiutaleista johdetusta kasvu- 25 tekijästä ja niiden analogeista.
5 BAR1 -geenituotteen C-terminaalisen domeenin osan.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että sanottu transkriptionaalinen promoottori on sen geenin, joka koodittaa TPI-entsyymiä tai ADH-entsyymiä, pro- 30 moottori.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu '· siitä, että signaalipeptidi on Barrier-signaalipeptidi tai hiivarepressoitava hapan fosfataasi -signaalipeptidi. 35
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että sanottu toinen DNA-sekvenssi käsittää segmentin, joka koodittaa vähintään BAR1-geenituotteen C-terminaalisen domeenin osaa, jota seuraa myötävirtaan segmentti, joka koo- 40 dittaa heterologista proteiinia tai polypeptidiä. il 96121
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että sanottu toinen DNA-sekvenssi käsittää segmentin, joka koodittaa heterologista proteiinia tai polypeptidiä, jota seuraa myötävirtaan segmentti, joka koodittaa vähintään
9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että sanottu toinen DNA-sekvenssi käsittää lisäksi segmentin, joka koodittaa pilkontapaikkaa, joka sijaitio see segmentin vieressä, joka segmentti koodittaa heterologista proteiinia ja/tai polypeptidiä.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että pilkontapaikka on kaksiemäksinen pilkontapaikka 15 tai trombiinipilkontapaikka.
11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että toinen DNA-sekvenssi mutagenoidaan hiilihydraat-tiaddition estämiseksi BAR1-geenituotteen joko 468 tai 503 20 aminohapossa tai molemmissa.
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että toinen DNA-sekvenssi koodittaa glutamiinitähdettä aminohapossa 468. 25
13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen DNA-rakenne, tunnettu siitä, että toinen DNA-sekvenssi koodittaa glutamiinitähdettä aminohapossa 503.
14. Hiivasolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu min kä tahansa patenttivaatimuksen 1-13 mukaisella DNA-rakenteella. J ·
15. Menetelmä heterologisen proteiinin tuottamiseksi, tun-35 nettu siitä, että se käsittää: isäntäsolun, joka sisältää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-13 mukaisen DNA-rakenteen, kasvattamisen sopivassa väliaineessa; ja solusta erittyneen proteiini- tai polypeptidituotteen eristä-40 misen kasvatusalustasta. 96121
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää sanotun proteiinituotteen puhdistamisen eristysvaiheen jälkeen.
17. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että sanottu isäntäsolu on hiiva- tai nisäkässolu.
FI884550A 1987-10-02 1988-10-03 DNA-rakenne ja menetelmä heterologisen proteiinin tuottamiseksi FI96121C (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10431687A 1987-10-02 1987-10-02
US10431687 1987-10-02
US22907488A 1988-08-05 1988-08-05
US22907488 1988-08-05

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI884550A0 FI884550A0 (fi) 1988-10-03
FI884550A FI884550A (fi) 1989-04-03
FI96121B true FI96121B (fi) 1996-01-31
FI96121C FI96121C (fi) 1996-05-10

Family

ID=26801396

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI884550A FI96121C (fi) 1987-10-02 1988-10-03 DNA-rakenne ja menetelmä heterologisen proteiinin tuottamiseksi

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP0310137B1 (fi)
JP (1) JP2730923B2 (fi)
AU (2) AU2334088A (fi)
CA (1) CA1314830C (fi)
DE (1) DE3887425T2 (fi)
DK (1) DK555488A (fi)
ES (1) ES2061585T3 (fi)
FI (1) FI96121C (fi)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2120947T3 (es) * 1989-06-16 1998-11-16 Genencor Int Secuencias de adn, vectores y polipeptidos de fusion para incrementar la secrecion de polipeptidos deseados a partir de hongos filamentosos.
AU8106091A (en) * 1990-06-08 1991-12-31 Zymogenetics Inc. Barrier protease
US5281520A (en) * 1990-09-12 1994-01-25 Zymogenetics, Inc. Method for producing acyloxyacyl hydrolase
WO1997039130A2 (en) * 1996-04-18 1997-10-23 North Carolina State University Method for expressing and secreting keratinase
KR100547402B1 (ko) * 1996-09-13 2006-02-01 트랜스케리오틱 쎄러피스, 인코포레이티드 α-갈락토시다아제 Ａ 결핍을 치료하는 방법

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI88932C (fi) * 1982-04-15 1993-07-26 Genentech Inc Framstaellning av funktionellt maenskligt urokinasprotein
US4546082A (en) * 1982-06-17 1985-10-08 Regents Of The Univ. Of California E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins
US4613572A (en) * 1983-08-15 1986-09-23 Kansas State University Research Foundation Yeast BAR1 gene plasmid
RU2091490C1 (ru) * 1985-10-25 1997-09-27 Зимодженетикс, Инк. Способ получения гетерологичного полипептида в эукариотических микроорганизмов
WO1987002670A1 (en) * 1985-10-25 1987-05-07 Mackay Vivian L Method of using bar1 for secreting foreign proteins

Also Published As

Publication number Publication date
ES2061585T3 (es) 1994-12-16
EP0310137A3 (en) 1990-06-06
AU660172B2 (en) 1995-06-15
EP0310137A2 (en) 1989-04-05
FI96121C (fi) 1996-05-10
AU2334088A (en) 1989-05-18
CA1314830C (en) 1993-03-23
FI884550A (fi) 1989-04-03
FI884550A0 (fi) 1988-10-03
JPH0216984A (ja) 1990-01-19
DE3887425D1 (de) 1994-03-10
DK555488D0 (da) 1988-10-03
DK555488A (da) 1989-06-14
EP0310137B1 (en) 1994-01-26
AU1498792A (en) 1993-01-21
DE3887425T2 (de) 1994-06-23
JP2730923B2 (ja) 1998-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5037743A (en) BAR1 secretion signal
Clare et al. Production of mouse epidermal growth factor in yeast: high-level secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies
US5102789A (en) Production of epideramal growth factor in pichia pastoris yeast cells
Dmochowska et al. Yeast KEX1 gene encodes a putative protease with a carboxypeptidase B-like function involved in killer toxin and α-factor precursor processing
AU614121B2 (en) Improvements in the production of polypeptides
CA2090969C (en) Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells
FI90352C (fi) Menetelmä heterologisten proteiinien tuottamiseksi Yarrowia lipolytica -transformanttien avulla, menetelmä Yarrowia lipolytica -transformanttien valmistamiseksi ja toteamiseksi sekä menetelmä transformanttien valmistamiseen käyttökelpoisten plasmidien valmistamiseksi
CA1304022C (en) Insulin precursors, process for their preparation and process for preparing human insulin from such insulin precursors
USRE37343E1 (en) Expression and secretion of heterologous proteins in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences
FI87801C (fi) Foerfarande foer framstaellning av maenniskoinsulinprekursorer samt i foerfarandet anvaenda dna-sekvensen och plasmider
US6110703A (en) Method for the production of polypeptides
FI80720B (fi) Saccharmyces cerevisiae-hybridvektorer och deras anvaendning foer framstaellning av plypeptider.
FI86746B (fi) Foerfarande foer framstaellning av maensklig vaevnads-plasminogenaktivator (tpa) med hjaelp av saccharomyces cerevisiae -jaest och i foerfarandet anvaenda hybridvektorer.
WO1987002670A1 (en) Method of using bar1 for secreting foreign proteins
US5612198A (en) Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells
WO1992013951A1 (en) Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells
FI96121B (fi) DNA-rakenne ja menetelmä heterologisen proteiinin tuottamiseksi
US5258302A (en) DNA for expression of aprotinin in methylotrophic yeast cells
RU2091490C1 (ru) Способ получения гетерологичного полипептида в эукариотических микроорганизмов
DD274053A5 (de) Verfahren zur Produktion eines menschlichen, einkettigen Plasminogenaktivators
US6103515A (en) Production of polypeptides by use of novel protease deficient yeast strains
NZ248558A (en) Recombinant production of desulphatohirudin; recombinant yeast strain

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
FG Patent granted

Owner name: ZYMOGENETICS, INC.

MA Patent expired