FI86746B - Foerfarande foer framstaellning av maensklig vaevnads-plasminogenaktivator (tpa) med hjaelp av saccharomyces cerevisiae -jaest och i foerfarandet anvaenda hybridvektorer. - Google Patents

Foerfarande foer framstaellning av maensklig vaevnads-plasminogenaktivator (tpa) med hjaelp av saccharomyces cerevisiae -jaest och i foerfarandet anvaenda hybridvektorer. Download PDF

Info

Publication number
FI86746B
FI86746B FI844544A FI844544A FI86746B FI 86746 B FI86746 B FI 86746B FI 844544 A FI844544 A FI 844544A FI 844544 A FI844544 A FI 844544A FI 86746 B FI86746 B FI 86746B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
ser
gly
leu
cys
arg
Prior art date
Application number
FI844544A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI844544A0 (fi
FI86746C (fi
FI844544L (fi
Inventor
Albert Hinnen
Bernd Meyhack
Original Assignee
Ciba Geigy Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB838331045A external-priority patent/GB8331045D0/en
Application filed by Ciba Geigy Ag filed Critical Ciba Geigy Ag
Publication of FI844544A0 publication Critical patent/FI844544A0/fi
Publication of FI844544L publication Critical patent/FI844544L/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI86746B publication Critical patent/FI86746B/fi
Publication of FI86746C publication Critical patent/FI86746C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C12N9/60—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

86746
Menetelmä ihmisen kudos-plasminogeeniaktivaattorin (ΤΡΔ) valmistamiseksi Saccharomyces cerevisiae -hiivan avulla ja menetelmässä käytettävät yhdistelmävektorit
Keksintö koskee fibrinolyyttisten aineiden tuottamista hiivassa yhdistelmä-DNA-tekniikalla se1 ä välikappaleita ja menetelmiä tällaista tuottamista varten. Tarkemmin sanottuna keksintö koskee hiivan yhdistelmä-vektoreita, jotka sisältävät kudoksissa olevaa plasmi-nogeenin aktivaattoria koodittavan DNA-sekvenssin liittyneenä toiminnallisesti promoottorisysteemiin, joka saa aikaan mainitun koodittavan sekvenssin ilmentymisen, hiivasoluja, jotka ovat transformoituneet mainituilla yh-distelmävektoreilla tai sisältävät kudoksissa olevan plasminogeenin aktivaattorin geenin kromosomeihinsa integroituneena, ja menetelmiä mainittujen yhdistelmä-vektorien valmistamiseksi, mainittuja hiivasoluja ja mainittuja kudosten sisältämiä plasminogeenin aktivaattorei-ta.
Veritulpat ovat huomattava ihmisten sairastumis- ja kuolinsyy kehittyneissä maissa. Verihyytymät muodostuvat fibriinistä, joka on syntynyt liukoisesta prekurso-ristaan fibrinogeenistä trombiinientsyymin vaikutuksesta. Mitä erilaisimmat entsyymit ja muut aineet takaavat sen, että hyytymiä muodostuu tavallisesti vain silloin ja sellaisissa paikoissa, joissa niitä tarvitaan estämään verenhukkaa .
Nisäkkäiden plasma sisältää entsyymisyteemin, joka kykenee liuottamaan verihyytymien fibriinin. Eräs fib-rinolyyttisen järjestelmän komponentti on entsyymiryhmä nimeltään plasminogeenin aktivaattorit, jotka muuntavat plasminogeenin (plasmiinin inaktiivinen proentsyymi) proteolyyttiseksi plasmiinientsyymiksi. Sen jälkeen plasmiini hajottaa hyytymien fibriiniverkon liukoisiksi tuotteiksi. Jos kehon verenhyytymiä hajottava kyky on riittämätön poistamaan verisuonten sisäiset tukokset, kuten on laita esim,thromboemboliaa tai leikkauksen jäi- 2 86746 keisiä komplikaatioita sairastavilla, saattaa olla välttämätöntä antaa trombolyyttisiä aineita ulkoa päin.
Kahta ihmisen plasminogeenin aktivaattoria on kaupallisesti saatavissa trombolyyttistä hoitoa varten; nimittäin urokinaasi, joka on ihmisen virtsasta tai viljellyistä munuaissoluista eristetty seriiniproteaasi, ja streptokinaasi, joka on streptokokeista saatavissa oleva bakteeriproteiini. Koska kummallakaan näistä entsyymeistä ei ole spesifistä affiniteettia fibriinin suhteen, liittyy näiden aineiden aiheuttama trombolyysi plasminogeenin koko elimistöön kohdistuvaan aktivoitumiseen, mistä saattaa aiheutua koagulaatioproteiinien rajoittamaton hajoaminen ja merkittävä sisäisten verenvuotojen riskin kasvu hoidon aikana. Lisäksi streptokinaasi on ihmiselle vieras proteiini ja näin ollen neutraloivien vasta-aineiden tuotanto lisääntyy tukkien streptokinaasin vaikutuksen ja aiheutuu allergisia reaktioita, jotka ovat haitallisia ja mahdollisesti kuolemaan johtavia.
Tiedetään, että useimmissa ihmisen kudoksissa esiintyy toinen plasminogeenin aktivaattorien ryhmä, nimeltään kudosten sisältämät plasminogeenin aktivaattorit (tissue plasminogen activators, käytetään lyhennettä "TPA").
Eri kudoksista peräisin olevat TPA-laadut mahdollisesti eroavat toisistaan molekyyliominaisuuksiensa suhteen, mutta ovat immunologisesti samanlaisia. Ne eroavat urokinaasista kemiallisten ja immunologisten ominaisuuk-siensa suhteen, kyvyltään paremmin toimia fibrinolyyt-tisesti fibriinin läsnäollessa sekä suurelta affiniteetiltaan fibriinin suhteen ((1), (2)). Koska TPA-laadut kiinnittyvät fibriiniin, niiden vaikutus kohdistuu hyytymän sijaintipaikkaan niin, että säätelemättömän verenvuodon vaara vähenee huomattavasti.
TPA esiintyy kahdessa molekyylimuodossa eli aktiivisessa kaksisäikeisessä muodossa (nimeltään TPA) ja inaktiivisessa yksisäikeisessä muodossa (prekursori-TPA
3 66746
tai "pro-TPA"; ks. viitteet (2), (3), (4)). Pro-TPA
voidaan muuntaa aktiiviseksi TPArksi inkuboimalla katalyyttisen plasmiinimäärän kanssa mielellään fibriinin läsnäollessa. Näin ollen siis plasmiini laukaisee oman syntetisoitumisensa.
Ihmisen TPA:n lähteitä ovat esim. uutot erilaisista ihmisen kudoksista (jotka eivät ole tarjolla kaupalliseen hyödyntämiseen) ja erilaisista ihmisen kasvainso-luista, joiden on osoitettu vapauttavan TPA-laatuja eri määriä ((5) , (6)) .
Äskettäin virastoon jätetyssä patenttihakemuksessa (EP 41766, keksijät D. Collen, D.C. Rijken ja 0. Matsuo) selostetaan TPA:ta, jonka molekyylipaino on 72 000, ja joka on eristetty viljellystä ihmisen melanoomasolulin-jasta (Bowes).
Kuitenkin transformoituneiden syöpäsolulinjojen (kuten melanoomasolujen) käyttö pakostakin rajoittaa niistä eristettyjen TPA-laatujen käyttöä terapeuttisina aineina. Lisäksi on osoittautunut vaikeaksi kasvattaa nisäkässoluja suuressa mittakaavassa, joka on edellytys näiden solujen erittämien proteiinien halvalle ja kannattavalle tuotannolle. Nisäkässolujen generaatioaika on huomattavasti pitempi kuin mikro-organismien generaatioaika, joten nisäkässoluilla tarvitaan pitempi fermentointiaika riittävän suuren solu-tiheyden saavuttamiseen. Toisaalta solutiheys, joka saavutetaan viljelemällä nisäkässoluja, on huomattavasti pienempi kuin se, joka yleensä saavutetaan viljel-täessä mikro-organismeja suuressa mittakaavassa. Myös kantoja on vaikeampi parantaa verrattuna mikro-organis-meihin.
Näin ollen TPA:n tuottaminen mikro-organismeilla käyttämällä apuna teollisen mikrobiologian pitkälle kehittynyttä teknologiaa ja viime aikoina kehitettyä yh-distelmä-DNA-tekniikkaa näyttää lupaavalta.
Aivan äskettäin ihmisen melanoomasolulinjasta joh- 4 86746 dettu ihmisen kudostyypin sisältämä plasminogeenin ak-tivaattorin cDNA on kloonattu ja saatu ilmentymään Escherichia colissa ((7), (8)). Yhdessä tapauksessa (7) ilmentyneen polypeptidin on osoitettu omaavan fibri-nolyyttisiä ominaisuuksia, jotka ovat tunnusomaisia aidolle ihmisen TPA:lle.
E. colista saaduista proteiinivalmisteista kuitenkin löytyy usein endotoksiiniepäpuhtauksia. Ne on poistettava kalliita puhdistusvaiheita käyttäen, jotta saataisiin käyttökelpoinen farmaseuttinen tuote.
Koska kaikilla eukaryooteilla on samat geneettisen informaation ilmentymismekanismit, voi eukaryoottisten geenien ilmentyminen tapahtua eukaryoottisessa isännässä suuremmalla teholla kuin E. colissa. Hyödynnettävistä eukaryoottisista organismeista hiivaa on helpoin käsitellä. Hiivan eritysmekanismi muistuttaa korkeampien eläin-solujen vastaavaa ja tiedetään, että hiivasolut kykenevät muokkaamaan proteiineja katkaisemalla signaalisek-venssin (proteiinin varaukseton N-pään osa, joka tavallisesti katkaistaan irti erittymissiirron aikana) (9). Näyttää lisäksi siltä, että proteiinit, jotka läpäisevät eukaryoottisen isännän eritysmekanismin, ovat taipuvaisia muodostamaan suuren määrän tertiääristä rakennetta verrattuna sellaisiin proteiineihin, jotka syntetisoituvat sytoplasmassa. On mielenkiintoista havaita, että prokaryooteilla, kuten E. colilla ei näytä olevan rakenteeltaan korkeammin järjestyneitä proteiineja. Erit-tymismekanismiin liittyy glykosyloituminen. Glykosyloi-tuneisiin proteiineihin johtavat perusmekanismit ovat samat kaikilla eukaryooteilla ja on odotettavissa, että hiivasolut, toisin kuin prokaryoottisolut, kuten E. coli, kykenevät tuottamaan glykosyloituneita proteiineja (vaikkakin eräät hiivan glykosylointimekanismin loppuvaiheet eroavat nisäkässolujen vastaavista, josta syystä niitä ehkä täytyy muokata hiivassa) .
Koska hiiva on mikro-organismi, sitä on helppo vil- 5 86746 jellä. Kasvuliuoksen tilavuusyksikköä kohti saatava solumassa on hiivalla huomattavasti suurempi kuin E. colilla. Lisäksi hiivan käyttäytyminen fermentoin-nissa tunnetaan hyvin ja suurimittakaavaisten fermen-tointien olosuhteet ovat vakiintuneet. Hiivasolut ovat lisäksi vapaita endotoksiineista.
Ennestään tunnetaan useita menetelmiä kudosten sisältämien plasminogeenin aktivaattorien tuottamiseksi soluviljelytekniikalla tai yhdistelmä-DNA-tekniikalla käyttämällä E. colia isäntäorganismina. Menetelmää TPA:n tuottamiseksi hiivan avulla, jolloin yhdistyy mikro-organismin helppo käsiteltävyys ja viljeltävyys sekä eukaryoottisen organismin edullisuus, ei ole tähän mennessä kuvattu. Näin ollen on esillä olevan keksinnön tarkoituksena tarjoata tällainen menetelmä. Lisäksi esillä olevan keksinnön tarkoitus on tarjota hiivavektorisysteemejä, jotka kykenevät ilmentämään niihin sisällytettyä TPA:ta koodittavaa sekvenssiä tehokkaasti.
1. TPArta koodittavan sekvenssin sisältäviä yhdistelmä-vektoreita
Keksintö koskee hiivan yhdistelmävektoreita, joissa on hiivan promoottori ja TPArta koodattava alue, jota mainittu promoottori säätelee.
TPA-DNA, joka on osana keksinnön mukaisissa hiivan yhdistelmävektoreissa, on erityisesti ihmisestä peräisin olevaa ja voidaan johtaa mistä tahansa ihmisen solusta, joka kykenee tuottamaan TPArta. Tällaiset solut ovat peräisin syöpäsoluista tai ei-syöpäsoluista ja mielellään ne on johdettu vakiintuneesta solulinjasta.
Sopivia soluja ovat esimerkiksi melanoomasolut, kuten Bowes- tai Malme-solut, fibrosarkooma-, epider-maaliset karsinooma-, rakkokarsinooma-, hypernephroma-tai liposarkoomasolut, HeLa-solut, fibroblastit, lymfosyytit, keratosyytit tai rinnan epiteeli- tai sikiökau-tiset munuaissolut. Keksinnön edullisessa toteutusta- 6 86746 vassa käytetään HeLa-soluja. TPA-DNA voi olla kromoso-maalista tai cDNArta. Kromosomaalinen TPA-DNA voidaan eristää geenikirjastosta, joka sisältää TPA-geenin, ja TNA:n cDNA voidaan valmistaa mRNA:n kautta käyttämällä alalla tunnettuja menetelmiä. On myös mahdollista käyttää TPA:ta koodittavan sekvenssin osia tai geenin mutatoituneita variantteja, joilla voi olla identtiset tai muuttuneet proteolyyttiset ominaisuudet ja/tai aktivointikäyttäytyminen pro-TPA:n muuttuessa aktiiviseksi TPA:ksi. Joillakin näistä geenituotteista saattaa olla uusia toivottuja ominaisuuksia.
Esillä olevan keksinnön mukaiset hiivan promoottorit on johdettu hiivan, erityisesti Saccharomyces cere-visiaen perimän DNA:sta. TPA:n ilmentymisessä käytetty promoottori on mielellään voimakkaasti ilmentyvän hii-vageenin promoottori. Niinpä voidaan käyttää TRP1-geenin, ADHI- tai ADHII-geenin, happofosfataasin (PH03 tai PH05) geenin tai isosytokromi C-geenin promoottoria tai glyko-lyyttisiä entsyymejä koodittavien geenien promoottoreita, kuten enolaasi-, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaa-si- (GADPH), 3-fosfoglyseraattikinaasi- (PGK), heksoki-naasi-, pyruvaattidekarboksylaasi-, fosfofruktokinaasi-, glukoosi-6-fosfaatti-isomeraasi-, 3-fosfoglyseraattimu-taasi-, pyruvaattikinaasi-, trioosifosfaatti-isomeraasi-, fosfoglukoosi-isomeraasi- tai glukokinaasigeenin promoot-teria, tai a- tai α-tekijää koodittavien hiivan pariutu-misferomonigeenien promoottorit. Esillä olevan keksinnön kannalta edullisissa promoottoreissa on transkriptionaa-linen ohjaus. Tätä tyyppiä olevat promoottorit, esim. PH05- ja GADPH-geenin promoottorit, voidaan kytkeä päälle ja pois päältä muuntelemalla kasvuolosuhteita. Esimerkiksi PH05-promoottori voidaan kytkeä pois päältä tai kytkeä päälle kokeen suorittajan toivomusten mukaan vain lisäämällä tai vähentämällä elatusalustan epäorgaanisen fosfaatin pitoisuutta. Näin ollen promoottori voidaan pitää 7 86746 pois kytkettynä hiivan eksponentiaalisen kasvuvaiheen aikana ja se voidaan pitää kytkettynä päälle vain aikaisessa stationäärivaiheessa, jolloin solutiheys on suurimmillaan niin, että PH05-promoottorin ohjauksessa oleva geeni ilmentyy. Tämä ominaisuus, johon liittyy voimakas transkriptoituminen, tekee PH05-promoottorista edullisen esillä olevassa keksinnössä.
Keksinnön mukaisissa yhdistelmävektoreissa hiivan promoottori on liitetty toimivasti TPA:ta koodittavaan alueeseen, jotta TPA ilmentyisi tehokkaasti. Eräässä tämän keksinnön edullisessa toteutustavassa hiivan promoottori liittyy välittömästi kypsää TPA:ta koodittavaan alueeseen niin, että luennanaloitussignaali (ATG) sijaitsee liitoskohdassa. Edullinen alue hiivan promoottorin liittämiseksi TPA:n koodittavaan alueeseen on suuren mRNA:n alun ja geenin ATG:n välillä, joka luonnostaan on liittyneenä mainittuun promoottoriin.
Esillä olevan keksinnön toisessa edullisessa toteutustavassa rakenteeseen sisältyy signaalisekvenssi. Sopivia signaalisekvenssejä ovat käytettyyn promoottoriin luontaisesti liittyvät, erityisesti PH05-signaalisekvens-si tai TPA-signaalisekvenssi. Voidaan myös käyttää muita signaalisekvenssejä, kuten hiivan invertaasigeenin tai α-tekijän geenin signaalisekvenssiä. Vaihtoehtoisesti voidaan rakentaa yhteenliitettyjä signaalisekvensse-jä liittämällä osa käytetyn promoottorin luontaisesta signaalisekvenssistä yhteen TPA:n signaalisekvenssin osan kanssa. Sellaiset yhdistelmät asetetaan etusijalle, joiden ansiosta tapahtuu katkeaminen tarkasti signaalisekvenssin ja kypsän TPA:n aminohapposekvenssin välistä. Rakenteisiin voidaan myös sisällyttää lisäsekvenssejä, jotka helpottavat prekursorimolekyylien tarkkaa prosessointia, kuten pro- tai kiinnityssekvenssejä (spacer), joissa on tai ei ole spesifisiä prosessointisignaaleja. Vaihtoehtoisesti voidaan muodostaa sisäisiä prosessointi- 8 06746 signaaleja sisältäviä fuusioproteiineja, joiden kypsyminen voi tapahtua in vivo tai in vitro. Prosessointi-signaalit sisältävät mielellään Lys-Arg-tähteen, jonka Golgin kalvoissa sijaitseva hiivan endopeptidaasi tunnistaa .
TPA-geenin ilmentymisen tuloksena syntynyt geenituo-te siirtyy erittymismekanismiin ja kulkeutuu periplasmi-seen tilaan. Jos voitaisiin saada aikaan erittyminen edelleen solunseinän läpi elatusaineeseen, olisivat suuremmat saannot mahdollisia. Talteenottoprosessia voidaan myös yksinkertaistaa, jos soluja ei tarvitse rikkoa. Lisäksi TPA voidaan saada talteen ilman N-pään lisämetioniinia, koska ei tarvita ATG:tä luennan aloitus-signaalina kypsää proteiinia koodittavan sekvenssin edessä. Koska eritysmekanismiin liittyy glykosylointi, on odotettavissa, että tuotettu TPA on glykosyloitunut. On olemassa useita seikkoja, joiden vuoksi glykosyloitunut TPA on edullisempaa kuin glykosyloitumaton TPA. Glykosy-loitunut TPA muistuttaa nisäkässolujen aitoa TPA:ta enemmän kuin glykosyloitumaton TPA. Lisäksi proteiinien, kuten TPA:n tertiäärinen rakenne luultavasti riippuu glykosyylitähteiden läsnäolosta tietyssä määrin. On ilmeistä, että TPA-molekyyleissä läsnäolevilla hiili-hydraattitähteillä on edullinen vaikutus kemialliseen stabiilisuuteen ja farmakologiseen aktiivisuuteen.
Hiivan promoottorin ja TPA:ta koodittavan alueen lisäksi keksinnön mukaiset yhdistelmävektorit sisältävät lisä-DNA-sekvenssin(sejä), jotka eivät ole välttämättömiä, tai jotka ovat vähemmän tärkeitä promoottorin toiminnan eli TPA:ta koodittavan alueen ilmentymisen kannalta, mutta joilla saattaa olla tärkeitä toimintoja esimerkiksi mainituilla yhdistelmävektoreilla transformoituneiden hiivasolujen lisääntymisessä. Lisä-DNA-sekvenssi(t) voidaan johtaa prokaryoottisista ja/tai eukaryoottisista soluista ja ne voivat sisältää kro-mosomaalisia ja/tai ekstrakromosomaalisia DNA-sekvensse-jä. Lisä-DNA-sekvenssit voivat olla peräisin (tai 9 S6746 muodostua) plasmidi-DNA:sta, kuten bakteeriperäisestä tai eukaryoottisesta plasmidi-DNA:sta, virus-DNA:sta ja/tai kromosomaalisesta DNA:sta, kuten bakteerin, hiivan tai korkeamman eukaryootin kromosomaalisesta DNA:sta. Edulliset yhdistelmävektorit sisältävät lisä-DNA-sekvenssejä, jotka on johdettu bakteeriplasmideis-ta, erityisesti Escherichia colin plasmidista pBR322 tai sen sukulaisplasmideista, bakteriofaagi >.:sta, hiivan 2 p-plasmidista ja/tai hiivan kromosomaalisesta DNA:sta.
Lisä-DNA-sekvenssit sisältävät mielellään hiivan replikoitumisen alkukohdan ja hiivan geneettisen valin-tamerkin. Sellaiset yhdistelmävektorit, jotka sisältävät hiivan replikoitumisen aloituskohdan, esim. kromo-somaalisen autonomisesti replikoituvan segmentin (ars), säilyvät transformoitumisen jälkeen hiivassa ekstrakro-mosomaalisesti ja replikoituvat autonomisesti mitoosissa. Voidaan myös käyttää yhdistelmävektoreita, jotka sisältävät hiivan 2ii-plasmidi-DNA:n kanssa homologisia sekvenssejä. Nämä yhdistelmävektorit integroituvat hiivasoluissa jo läsnäoleviin 2p-plasmideihin tai replikoituvat autonomisesti. 2y-sekvenssit ovat erityisen sopivia suurella taajuudella transformoiville plasmideille ja ne saavat aikaan suuria kopiomääriä.
Lisäksi voivat keksinnön mukaiset yhdistelmävektorit sisältää DNA-sekvenssin isäntähiivan kromosomissa läsnä olevan geenin osana (esim. PH05-geeni tai sen promoottori liittyneenä TPA:ta koodittavaa alueeseen). Homologisen sekvenssin ansiosta, jonka pituuden tulisi olla noin 20 - 100 deoksinukleotidia, voidaan koko vektori tai sen lineaarisia osia sisällyttää stabiilis-ti isäntäorganismiin rekombinaation tuloksena. Näin ollen jälkeläissoluissa säilyy tuotu geenimateriaali jopa ilman valintapainetta. Esimerkiksi TPA-geeni, jonka ohessa on hiivan kromosomaalisen geenin luontaisesti sisältämiä sekvenssejä, kuten hiivan kromosomaa- 10 86746 lisen geenin promoottorialue 5'-päässä ja (osa) mainitun geenin 3'-oheisaluetta 3'-päässä, voidaan intergoida stabiilisti mainitun kromosomaalisen geenin kyseiseen kohtaan. Tämän keksinnön erässä edullisessa toteutustavassa käytetään lineaarista DNA-segmenttiä, joka sisältää PH05-promoottorin, TPA:ta koodittavan alueen ja PH05-3'-oheisalueen, integroimaan TPA-geeni vastaavaan hiivakromosomiin eli hiivan kromosomiin II PH05-kohdassa.
Mitä tulee hiivan valintamerkkigeeniin, voidaan tarkoitukseen käyttää mitä tahansa merkkigeeniä, joka mahdollistaa transformanttien valinnan merkin fenotyyp-pisen ilmentymisen seurauksena. Hiivoille sopivia merkkejä ovat erityisesti sellaiset, jotka saavat aikaan vastustuskyvyn antibiootin suhteen, tai auksotrofisten hiivamutanttien ollessa kyseessä geenit, jotka täydentävät isännän puutteellisuudet. Vastaavat geenit antavat esim. vastustuskyvyn sykloheksimidiantibiootin suhteen tai antavat prototrofian auksotrofiselle hiivamutan-tille, kuten URA3-, Leu2-, HIS3- tai TRP1-geenin. On myös mahdollista käyttää merkkeinä rakennegeenejä, jotka ovat yhteydessä autonomisesti replikoituvaan segmenttiin, edellyttäen, että transformoitava isäntä on auksotrof inen merkin ilmentämän tuotteen suhteen.
Keksinnön mukaisissa yhdistelmävektoreissa läsnäolevat lisä-DNA-sekvenssit sisältävät mielellään myös bakteeri-isännän, erityisesti Escherichia colin, repli-koitumisen alkukohdan ja valintamerkkigeenin. On olemassa etuja, jotka liittyvät E. colin replikoitumisen alkukohdan ja E. colin merkkigeenin läsnäoloon hiivan yhdistelmävektorissa. Ensinnäkin voidaan saada aikaan suuria määriä yhdistelmävektori-DNA:ta kasvattamalla ja vahvistamalla sitä E. colissa, ja toiseksi yhdistelmä-vektorien rakentaminen on edullista suorittaa E. colissa käyttämällä apuna koko laajaa E. coliin perustuvaa kloonausteknologiaa. E. colin plasmidit, kuten pBR322 11 86746 tms., sisältävät sekä E. colin replikoitumisen aloituskohdan että E. colin geneettisiä merkkejä, jotka antavat vastustuskyvyn antibioottien suhteen, kuten tetrasykliinin tai ampisilliinin suhteen, ja sopivat hyvin hiivan yhdistelmävektorien osiksi.
Keksinnönmukaiset yhdistelmävektorit sisältävät mielellään myös hiivageenin 3'-oheissekvenssin, jossa on tarvittavat signaalit transkription päättymiselle ja polyadenylaatiolle.Sopivia 3'-oheissekvenssejä ovat esim. hiivageenin vastaavat, jotka luontaisesti liittyvät käytettyyn promoottoriin, erityisesti PH05-geenin oheissekvenssit.
Lisä-DNA-sekvenssejä, jotka sisältävät esim. hiiva-ja bakteeri-isännän replikoitumisen aloituskohdat ja geneettiset merkit (ks. edellä), kutsutaan seuraavassa "vektori-DNA":ksi, joka yhdessä hiivan promoottorin ja TPA:ta koodattavan alueen kanssa muodostaa keksinnönmu-kaisen yhdistelmävektorin.
Esillä olevan keksinnön edullinen toteutustapa liittyy yhdistelmävektoreihin, jotka kykenevät replikoitu-maan ja saamaan aikaan fenotyyppisen valinnan hiivaisän-täkannassa, jotka vektorit sisältävät hiivan promoottorin sekä kudosten sisältämää plasminogeenin aktivaatto-ria koodittavatn DNA-sekvenssin, ja mainittu DNA-sek-venssi, transkription aloitus- ja lopetussignaalit sekä luennan aloitus- ja lopetussignaalit si jaitsevat mainitussa vektorissa mainitun promoottorin ohjauksessa niin, että geeni ilmentyy transformoituneessa hiivakannassa tuottaen kudosten sisältämää plasminogeenin aktivaatto-ria.
Yhdistelmävektorit valmistetaan ennestään tunnetulla tavalla, kuten sijoittamalla vektori-DNA:hän hiivan promoottori ja mainitun promoottorin ohjauksessa oleva TPA:tu koodit Lava alue.
On edullista käyttää kartoitettua lineaarista tai mieluummin rengasmaista vektori-DNA:ta, kuten bakteeri- 12 667 46 plasmidi-DNA:ta tms. (ks. edellä), jossa on vähintään yksi restriktiokohta, mielellään kaksi tai useampia tunnistuskohtia. On edullista, jos vektori-DNA sisältää jo ennestään replikoitumisen aloituskohdat ja geenimer-kit hiivaa ja/tai bakteeria varten. Vektori-DNA katkaistaan sopivalla restriktioendonukleaasilla. Katkaistuun DNA:han liitetään DNA-jakso, joka sisältää hiivan promoottorin ja TPA:ta koodittavan DNA-sekvenssin,
On myös mahdollista toimia niin, että hiiva- tai bakteeri-isännän replikoitumisen aloituskohdat ja/tai merkit liitetään ennen promoterin ja TPA:ta koodittavan alueen liittämistä tai sen jälkeen (tai samanaikaisesti). Kaikissa tapauksissa katkaisu- ja yhteenliittämisolosuhteet valitaan siten, etteivät ne häiritse vektori-DNA:n eivätkä promoottorin oleellisia toimintoja. Yhdistelmä-vektori voidaan rakentaa peräjärjestyksessä tai liittämällä yhteen kaksi DNA-jaksoa, jotka sisältävät kaikki tarvittavat sekvenssit.
DNA-jaksojen yhteenliittämisessä in vitro voidaan käyttää eri menetelmiä. Tylpät päät (sisältävät DNA-kahdenteet täysin emäspariutuneina), joita saadaan aikaan tietyillä restriktioendonukleaaseilla, voidaan liittää yhteen T4 DNA-ligaasilla. Tavallisesti DNA-jaksot liitetään yhteen yksisäikeisten kohesiivsiten päidensä avulla ja suljetaan kovalenttisesti DNA-ligaasilla, esim. T4 DNA-ligaasilla. Tällaisia yksisäikei-siä kohesiivisia päitä voidaan saada aikaan katkaisemalla DNA toisentyyppisillä endonukleaasei11a, jotka tuottavat lomittaisia päitä (DNA-kahdenteen kaksi säiettä katkeavat kohdista, jotka ovat muutaman nukleotidin päässä toisistaan). Yksisäikeisiä jaksoja voidaan myös muodostaa lisäämällä nukleotideja tylppiin päihin tai lomittaisiin päihin käyttämällä terminaalista trans-feraasia ("homopolymeerinen hännitys") tai yksinkertaisesta vaan syömällä tylppäpäisen DNA-segraentin toista säiettä sopivalla eksonukleaasilla, kuten λ-eksonukle- 13 86746 aasilla. Vielä eräs mahdollisuus lomittaisten päiden valmistamiseksi on liittää tylppäpäiseen DNA-seg-menttiin kemiallisesti syntetisoitu kytkijä-DNA, joka sisältää lomittaisia päitä muodostavan endo-nukleaasin tunnistuskohdan, ja katkaista näin saatu DNA vastaavalla endonukleaasilla.
Tullakseen tehokkaasti ilmentyneeksi pitää TPA-geenin sijaita oikealla tavalla transkriptionaalisten (hiivan promoottori) ja kemiallisten (ribosomin sitoutumiskohta) funktioiden suhteen. Ensinnäkin DNA-jakso, joka sisältää promoottorin ja TPA:ta koodittavan alueen, pitää saada liitetyksi oikeassa suunnassa. Jos kaksi suuntaa on mahdollista, määritetään oikea tavanomaisella restriktioanalyysillä. Väärässä suunnassa olevan TPA-geeniliitännäisen sisältävissä yhdistelmävektoreissa suoritetaan liitännäisen kääntäminen leikkaamalla se irti sopivalla restriktioendonukle-aasilla ja liittämällä geeni uudestaan yhdistelmävektori-jaksoon. Väärä suunta voidaan välttää liittämällä yhteen kaksi sellaista DNA-jaksoa, joissa kussakin on päissään eri restriktiokohdat. Lisäksi yhdistelmävektori pitäisi rakentaa siten, että oikea transkription aloitus ja lopetus ovat mahdollisia. Mitä tulee viimeksimainittuun seikkaan, transkription pitäisi mielellään loppua hiivan kromosomaalisesta DNArsta tai hiivan 2\\ -plasmidista johdettuun DNA-sekvenssiin. Transkriptio päättyy mielellään DNA-sekvenssiin, joka sisältää hiivageenin, esim. PH05 tai TRP1, transkription päättymissignaalin. Toiseksi pitää olla olemassa oikea lukukehys. Uleensä promoottorialueen ja TPA:ta koodittavan alueen nukleotidisekvenssi tunnetaan ennen yhteenliittämistä tai ne voidaan helposti määrittää (esdm . (10)), joten oikean lukukehyksen aikaansaamisessa ei ole ongelmia.
Jos halutaan saada aikaan kypsän TPA:n suora ilmentyminen, pitää poistaa signaalisekvenssit tai niiden osat, jotka mahdollisesti seuraavat promoottorialuetta ja/tai mahdollisesti edeltävät kypsää TPA:ta koodittavaa aluetta, suorittamalla esim. katkaisu eksonukleaasilla, ku- 14 86746 ten Bal31:llä. Edullinen alue hiivan promoottorin suoralle liittämiselle TPA:ta koodittavaan alueeseen on suuren mRNA:n alun ja geenin koodittavan alueen ATG:n välissä, joka ATG on luonnostaan hiivan promoottorissa. Jos liittäminen tapahtuu tällä alueella, pitäisi TPA:ta koodattavalla sekvenssillä olla oma luennanaloitus-ATG tai sen pitää olla varustettu lisätyllä synteettisellä oligonukleotidilla. Hiivan promoottori voi myös olla liitetty TPA:ta koodittavaan sekvenssiin käyttämällä kytkijämolekyylinä synteettistä oligodeoksinukleotidia. Tällöin promoottorialue voidaan mahdollisesti katkaista läheltä 3'-päätään niin, että siitä puuttuu tietty määrä emäspareja. Vastaavasti voidaan TPA:ta koodittava sekvenssi katkaista läheltä 5'-päätään. Sen jälkeen voidaan rakentaa synteettinen oligodeoksinukleotidi siten, että liitettäessä hiivan promoottori ja TPA:ta koodittava sekvenssi yhteen kytkijäoligodeoksinukleotidin välityksellä puuttuvat emäsparit saadaan takaisin luennanaloi-tussignaali ATG ja TPA:ta koodittava sekvenssi mukaanlukien oikeassa lukukehyksessä promoottorin suhteen.
Bakteeri-isäntä, erityisesti E. coli, voidaan transformoida välituotteilla, kuten vektoreilla, joista vielä puuttuu yksi tai useampia oleellisia toimintoja, tai keksinnönmukaisilla lopullisilla yhdistelmävekto-reilla edellämainituista syistä (esim. jotta saadaan tuotetuksi suuria määriä välituotteita tai yhdistelmä-plasmideja vastaavasti). Tästä syystä bakteerivekto-rit, kuten E. colin plasmidi pBR322, ja niiden osat, jotka sisältävät bakteerin replikoitumisen aloituskohdan ja geenimerkin(kejä), ovat edullisimpia. Kun käytetään tällaista bakteerivektoria, kuuluu hiivan yhdis-telmävektorien valmistuksen loppuvaiheisiin myös hiivan geneettisen merkin ja replikoitumisen aloituskohdan liittäminen.
is 86746 2. Hiivan transformointi TPA:ta koodittavan sekvenssin sisältävillä yhdistelmävektoreilla
Keksintö koskee myös menetelmää sellaisten transformoituneiden hiivasolujen tuottamiseksi, jotka kykenevät tuottamaan kudosten sisältämää plasminogeenin aktivaattoria, jossa menetelmässä transformoidaan hiivasolut millä tahansa kohdassa 1 kuvatulla yhdistelmävektorilla tai kudosten sisältämän plamni-nogeenin aktivaattorin geeni integroidaan hiivan kromosomiin Saccharomyces-, Schizosaccharomyces- ja Toru-lopsis-suvun ja vastaavien sukujen lajit, erityisesti Saccharomyces cerevisiae-kannat, ovat käyttökelpoisia hiivoja (ks. (11)).
Hiivojen transformointi yhdistelmävektoreilla voidaan suorittaa ennestään tunnetuilla menetelmillä, kuten käyttämällä menetelmää Hinnen et ai. (12). Tämä menetelmä voidaan jakaa kolmeen vaiheeseen: (1) Hiivan soluseinän poisto (2) "Alastomien" hiivasolujen (sferoplastit) käsittely transformoivalla DNA:11a PEG:n (polyetyleeniglykoli) ja Ca^+-ionien läsnäollessa.
(3) Soluseinän regenerointi ja transformoituneiden solujen valinta kiinteästä agarkerroksesta.
Edulliset menetelmät:
Kohta (1): Hiivan soluseinä poistetaan entsymaatti sesti käyttämällä erilaisia glukosidaasivalmisteita, 0¾ kuten etanan suolinestettä (esim. Glusulase^ tai Helicase^ tai mikro-organismeista saatuja entsyymi-seoksia (esim. Zymolase^') osmoottisesti stabiloidussa liuoksessa (esim. 1M sorbitoli).
Kohta (2): Hiivan sferoplastit aggregoituvat PEG:n läsnä ollessa ja aiheutuu sytoplasmisten kalvojen paikallisia fuusioita. "Fuusionkaltaisten" olosuhteiden syntyminen on välttämätöntä ja monista transformoitavia- ie 86746 ta hiivasoluista tulee diploidisia tai jopa triploidi-disia transformoinnin aikana. Menetelmiä, joilla voidaan valita fuusioituneita sferoplasteja, voidaan käyttää transformanttien rikastamisessa eli transformoituneet solut voidaan helposti seuloa ennalta valittujen fuusiotuotteiden joukosta.
Kohta (3): Koska hiivasolut, joissa ei ole soluseinää, eivät pysty jakautumaan, soluseinä pitää regeneroida. Regenerointi on edullista suorittaa peittämällä sfero-plastit agariin. Esimerkiksi sferoplastit sekoitetaan sulatettuun (noin 50°C) agariin. Kun liuos jäähdytetään hiivan kasvulämpötilaan (noin 30°C), saadaan kiinteä kerros. Agarkerroksen tarkoitus on estää nopea diffuusio ja sferoplasteille välttämättömien makromolekyylien menetys, josta syystä agarkerros edesauttaa so-luseinän regeneroitumista. Soluseinien regeneroituminen voidaan kuitenkin saada aikaan (vaikkakin pienemmällä teholla) kasvattamalla sferoplasteja valmiilla agarkerroksilla.
Regenerointiagar on edullista valmistaa siten, että regeneroituminen ja transformoituneiden solujen valinta tapahtuu samaan aikaan. Koska valintamerkkeinä käytetään yleensä hiivageenejä, jotka koodittavat aminohappojen biosynteesin entsyymejä (ks. kohta 1), on regenerointi edullista suorittaa hiivan minimikasvu-alustassa. Jos tarvitaan hyvin suuria regeneroitumis-tehoja, on edullista käyttää kaksivaiheista menetelmää: (1) suoritetaan soluseinän regenerointi ravinnerik-kaassa alustassa ja (2) valitaan transformoituneet solut kasvattamalla solukerros uudestaan selektiivisillä agarlevyillä.
Jos yhdistelmävektori ei sisällä merkkigeeniä, voidaan transformoituneet solut tunnistaa myös vaihtoehtoisilla menetelmillä. Tällaisia menetelmiä ovat mm. in situ-hybridisointi käyttämällä leimattua DNA-jak-soa, joka on homologinen yhdistelmävektorin sekvenssien kanssa (esim. menetelmällä Hinnen et ai. (12)), in 17 86 / 46 situ-inununomäärityksiä edellyttäen, että geenin tuotteelle on olemassa vasta-aine, tai muita seulontamenetelmiä, jotka mittaavat transformoivan plasmidin(ien) koodit-tamia geenituotteita.
Vaihtoehtoisesti voidaan hiiva sekatransformoida keksinnönmukaisella yhdistelmävektorilla ja hiivan geneettisen merkin sisältävällä toisella vektorilla. Jos näillä kahdella eri vektorilla on samoja DNA-sekvensse-jä (nämä voivat olla vektoreissa läsnäolevia bakteeriperäisiä sekvenssejä), tapahtuu rekombinaatio, joka johtaa fuusioituneeseen valittavissa olevaan yhdistelmä-molekyyliin .
Hiiva voidaan myös sekatransformoida lineaarisella DNA-jaksolla, joka sisältää TPA-geenin ja reunasek-venssejä, jotka ovat homologisia hiivan kromosomin sekvenssien kanssa, ja vektorilla, joka sisältää hiivan valintamerkin. Sekatransformointi tekee mahdolliseksi niiden hiivasolujen rikastamisen, jotka ovat ottaneet vastaan DNA:n, jota ei voida suoraa löytää valitsemalla. Koska kaikki transformointikypsät solut ottavat vastaan minkä tahansa tyyppistä DNA:ta, sisältää suuri osa valintavektorilla transformoituneista soluista myös muuta DNA:ta (kuten lineaarisen jakson, jossa on TPA-geeni ja reunasekvenssejä (50)). Sisältämiensä pitkien homologisten sekvenssien (esim. noin 20 -100 deoksinukleotidin pituisia) ansiosta TPA-geeni integroituu stabiilisti isäntäkromosomiin. Lineaarinen DNA-jakso sisältää erityisesti TPA-geeniä ohjaavan PH05-promoottorin ja PH05-lopetussekvenssit. Tämä rakenne johtaa TPA-geenin stabiiliin integroitumiseen PH05-geenin kromosomikohtAan hiivan kormosomissa II.
Esillä oleva keksintö koskee myös lineaarista DNA-segmenttiä, joka sisältää hiivan promoottorin, mainitun promoottorin ohjauksessa olevan geenin, joka koo-dittaa kudosten sisältämää plasminogeenin aktivaattoria, ja DNA-sekvenssin, jossa on hiivageenin transkription lopetussignaalit.
is 86 7 46
Saatuja hiivakantoja, jossa on keksinnön mukaisia yhdistelmäplasmideja, voidaan parantaa TPA-tuotannon suhteen käyttämällä alalla tunnettuja mutatointi-ja valintamenetelmiä. Mutaatioita voidaan saada aikaan esim. UV-säteilyllä ja sopivilla kemiallisilla aineilla .
Esillä oleva keksintö koskee myös transformoituneita hiivaisäntiä, joiden transformoituminen on tapahtunut yhdistelmävektoreilla, jotka sisältävät hiivan promoottorin ja TPArta koodattavan alueen, joka on mainitun promoottorin ohjauksessa, ja hiivaisäntiä, joissa kudosten sisältämää plasminogeenin aktivaatto-ria koodittava geeni on stabiilisti integroituneena hiivan kromosomiin ja hiivan kromosomaalisen promoottorin ohjauksessa, sekä näiden mutantteja.
3. Transformoituneiden hiivasolujen viljely ja ilmentyneen TPA:n eristäminen
Hiivassa keksinnön mukaisesti ilmentyvän TPA-gee-nin päätuote on yksisäikeinen TPA:n prekursoriproteii-ni ("pro-TPA"). Kuitenkin, jos hiivaisäntäsolussa, periplasmisessa tilassa tai elatusnesteessä on läsnä proteaaseja, voi primäärisesti ilmentynyt pro-TPA ainakin osittain muuttua kaksisäikeiseksi TPArksi. Näin ollen eristetty tuote voi todellisuudessa sisältää TPArta, pro-TPA:ta tai niiden seosta. Jos keksinnön mukaisissa yhdistelmävektoreissa TPArta koodittavaa aluetta edeltää signaalisekvenssi, liittyy erittymiseen ainakin osittainen glykosyloituminen. Näin ollen saatu tuote voi sisältää myös glykosyloituneita ja glykosyloitumattomia proteiineja.
Keksintö koskee myös menetelmää TPArn, pro-TPA:n tai näiden seosten tuottamiseksi, joissa TPA ja pro-TPA ovat läsnä glykosyloituneessa tai glykosyloitumattomassa muodossa tai näiden muotojen seoksena, jossa menetelmässä viljellään sopivissa ravinneolosuhteissa hiivakantaa, 19 66746 joka on transformoitunut yhdistelmävektorilla, joka sisältää hiivan promoottorin ja mainitun promoottorin ohjauksessa olevan TPA:ta koodittavan alueen, tai hiivakantaa, jossa on kudosten sisältämän plasminogeenin aktivaattorin geeni stabiilisti integroituneena hiivan kromosomiin ja hiivan kromosomaalisen promoottorin ohjauksessa, tai tällaisen hiivakannan mutanttia, ja eristetään ja puhdistetaan mainitut proteiinit ja haluttaessa erotetaan saatu TPA:n ja pro-TPA:n seos yksittäisiksi komponenteiksi, ja haluttaessa saada aikaan TPA:ta, joka on vapaa pro-TPA:sta, muunnetaan tuotettu pro-TPA TPAtksi, ja haluttaessa erotetaan gly-kosyloitunut tuote glykosyloitumattomasta tuotteesta, jotka on saatu seoksena, ja haluttaessa tuottaa glykosy-loitumatonta proteiinia, joka on vapaa glykosyloitu-neesta proteiinista, poistetaan glykosyylitähteet saaduista proteiineista.
a. Transformoituneiden hiivasolujen viljely
Keksinnön mukaisia transformoituneita hiivasoluja viljellään nestemäisessä elatusaineessa, joka sisältää assimiloituvia hiili- ja typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja.
Voidaan käyttää erilaisia hiililähteitä. Edullisia hiililähteitä ovat assimiloituvat hiilihydraatit, kuten glukoosi, maltoosi, mannitoli tai laktoosi,tai asetaatit, joita voidaan käyttää joko yksintai sopivina seoksina. Sopivia typpilähteitä ovat mm. aminohapot, kuten kasmianohapot, peptidit ja proteiinit ja niiden hajoamistuotteet, kuten tryptoni, peptoni tai lihauutteet, ja edelleen hiivauute, mallasuute, maissin-liuotusvesi sekä ammoniumsuolat, kuten ammoniumkloridi, -sulfaatti tai -nitraatti, joita voidaan käyttää joko yksin tai sopivina seoksina. Sopivia epäorgaanisia suoloja ovat esim. natriumin, kaliumin, magnesiumin ja kalsiumin sulfaatit, kloridit, fosfaatit ja karbonaatit. Ravintoliuos voi lisäksi sisältää kasvua edistä- 20 86746 viä aineita. Kasvua edistäviä aineita ovat esim. hivenaineet, kuten rauta, sinkki, mangaani tms. tai yksittäiset aminohapot.
Hiivasolut, jotka ovat transformoituneet autonomisesti replikoituvilla plasmideilla, kuten hiivan 2u-plas-midi-DNA:ta sisältävillä plasmideilla, ovat tietyssä määrin taipuvaisia menettämään yhdistelmäplasmidin (ks.
(13)). Tästä syystä tällaisia hiivasoluja pitää kasvattaa valintapaineessa eli olosuhteissa, jotka kasvun tapahtumiseksi vaativat plasmidin koodittaman geenin ilmentymistä. Useimmat tällä hetkellä käytetyt merkit ovat geenejä, jotka koodittavat aminohapposynteesin tai puriinisynteesin enstyymejä. Tämä tekee tarpeelliseksi käyttää synteettisiä minimialustoja, joista puuttuu vastaavaa aminohappoa tai puriiniemästä. Yhtä hyvin voidaan kuitenkin käyttää joitakin geenejä, jotka antavat vastustuskyvyn sopivan biosidin suhteen (esim. geenejä, jotka antavat sykloheksimidiresistenssin,amino-glykosidi G 418-resistenssin (14) tai raskasmetalli-resistenssin tai vastaavan). Sellaisia hiivasoluja, jotka ovat transformoituneet vektoreilla, joissa on antibioottiresistenssigeeni, viljellään vastaavaa antibiottia sisältävässä kasvualustassa, jolloin saavutetaan suuremmat kasvunopeudet ja solutiheydet.
Kromosomeihin integroituneella DNA:11a transformoituneet hiivasolut eivät tarvitse valintapainetta kasvatusolosuhteissa. Näin transfromoituneet solut ovat riittävän stabiileja kasvamaan ilman valintapainetta. Tästä syystä soluja voidaan edullisesti kasvattaa runsasravinteisissa kasvualustoissa.
Hiivasolut, joiden yhdistelmäplasmideissa on rakenteellinen promoottori (esim. PH03 tai ADHI), ilmentävät mainittuun promoottoriin liittynyttä TPA-geeniä ilman induktiota. Mutta, jos TPA-geeni on säädellyn promoottorin (esim. GAPDH, PGK tai PH05) ohjauksessa, pitää elatusaineen koostumus säätää niin, että 21 8 6 7 4 6 saadaan aikaan mahdollisimman suuri määrä mRNA-trans-kripteja eli käytettäessä PH05-promoottoria pitää ela-tusaineen sisältää epäorgaanista fosfaattia pienenä pitoisuutena, jotta tämäi promoottorin toiminta kytkeytyisi päälle.
Viljely suoritetaan tavallisilla menetelmillä. Viljelyolosuhteet, kuten lämpötila, kasvualustan pEi ja fermentaatioaika valitaan siten, että saadaan aikaan mahdollisimman suuri määrä TPA:ta. Valittua hiivakan-taa on edullista kasvattaa aerobisissa olosuhteissa pinnanalaisviljelmänä ravistellen tai sekoittaen noin 25 - 35°C:ssa, mielellään noin 30°C:ssa, pH-alueella 4-8, esim. noin pH:ssa 7, noin 4-20 tuntia, mielellään, kunnes on saavutettu maksimaalinen määrä proteiineja .
b. Ilmentyneen TPA:n eristäminen ja puhdistaminen
Kun transformoituneet hiivasolut ovat kasvaneet tyydyttävään solutiheyteen, on ilmentyneen proteiinin talteenoton ensimmäisenä vaiheena proteiinin vapauttaminen solun sisältä. Useimmissa menetelmissä soluseinä poistetaan ensin suorittamalla entsymaattinen hajotus glukosidaaseilla (ks. kohta 2). Sitten näin syntyneet sferoplastit käsitellään pinta-aktiivisilla aineilla, kuten Tritonilla. Vaihtoehtoisesti voidaan solujen rikkomiseen käyttää mekaanisia voimia, kuten leikkaus-voimaa (esim. X-puristin, ranskalainen puristin) tai ravistelua lasikuulien kanssa. Saatu proteiiniseos rikastetaan TPA:n suhteen tavallisilla menetelmillä, kuten poistamalla suurin osa ei-proteiinimateriaalista po-lyetyleeniamiinikäsittelyllä, saostamalla proteiinit kyllästämällä liuos ammoniumsulfaatilla tai trikloori-etikkahapolla, suorittamalla geelielektroforeesi, dialyysi tai kromotografia, kuten ioninvaihtokromatografia, kokoja poissulkeva kromatografia, HPLC tai käänteisfaasi-HPLC, molekyylikoon erottelu sopivassa Sephadex -pyi- 22 8 6 7 4 6 väässä tms. Esipuhdistetun tuotteen lopullinen puhdistus suoritetaan esimerkiksi affiniteettikromatografiällä, kuten vasta-aineaffiniteettikromatografiällä, erityisesti monoklonaalisella vasta-aineaffini teettikromatograf iällä käyttämällä monoklonaalisia anti-TPA-vasta-aineita liukenemattomaan matriisiin kiinnitettyinä, kuten alalla on tapana, tms.
Muihin edullisiin menetelmiin TPA:n eristämiseksi kasvuliuoksista kuuluu TPA:n selektiivinen adsorbointi kantajaan, johon on kovalenttisesti kiinnitetty liukoisia fibriinifragmentteja; liukenematon matriisi voi olla esim. dekstraani (esim. (15) )^ tai adsortio on erityisen edullista suorittaa DE-3 SepharosJ^-pylvää-seen. DE-3 on trypsiinin inhibiittori, jota on Erythri-na latissima-palkokasvin siemenissä (16). Nyt on havait-ty, että DE-3 kykenee myös inhiboimaan TPA-aktiivisuut-ta. Näin ollen puhdistettu DE-3-inhibiittori voidaan liittää liukenemattomaan matriisiin, esim. BrCN:llä ak ti) tivoituun Sepharoseen , käyttämällä tavanomaisia menetelmiä. TPA adsorboituu inhibiittorimatriisiin ja voidaan eluoida puskurilla, joka sisältää kaotrooppista ainetta.
Esillä olevan keksinnön edullisen toteutustavan mukaan kasvualusta, joka mahdollisesti on ensin läpäissyt yhden tai useampia edellämainittuja puhdistusvaihei-ta, lasketaan huoneenlämpötilassa pylvään läpi, jossa on BrCN:llä aktivoitua SepharoseJ^, johon DE-3-inhibiit-tori on liitetty. Pylväs pestään ensin ja sen jälkeen adsorboitunut kudosten sisältämä plasminogeenin aktivaat-tori eluoidaan käsittelemällä pylväs puskuriliuoksella, kuten fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella, jonka PH on noin 5,5 - 6,0, ja joka sisältää kaotrooppista ainetta, kuten KSCN pitoisuutena noin 1,4 - noin 2,0 M, mielellään 1,6M. Vaihtoehtoisesti voidaan vapautusai-neeksi valita bentsimidiini tai arginiini. Puhdis-tusvaiheissa käytettyihin puskuriliuoksiin on edullis- 23 86 7 46 ta lisätä pinta-aktiivista ainettam kuten Triton x-10cf^ tai Tween 8C^, jottei kudosten sisältämä plasminogee-nin aktivaattori adsorboituisi astian pintoihin sekä stabiilisuuden parantamiseksi. Lisätyn pinta-aktiivi-sen aineen lopullinen väkevyys voi olla 0,01 - 0,1%.
Jos kudosten sisältämä plasminogeenin aktivaattori erittyy hiivasolun periplasmiseen tilaan, voidaan käyttää yksinkertaistettua menetelmää: Proteiini ote taan talteen soluja hajottamatta, mutta suorittamalla soluseinän poisto entsymaattisesti tai käsittelemällä kemiallisilla aineilla, kuten tiolilla tai EDTA:lla, jotka saavat aikaan solunseinän rikkoutumisen niin, että tuotettu TPA vapautuu. Jos TPA erittyy kasvualustaan, se voidaan ottaa siitä suoraan talteen.
Kromosomiin integroituneen TPA-geenin sisältäviä hiivasoluja viljellään ja ilmentynyt TPA eristetään ja puhdistetaan edelläkuvatulla tavalla.
Jotta saataisiin valmistetuksi sellaista TPA:ta, joka on oleellisesti ottaen vapaa pro-TPA:sta, pro-TPA muunnetaan entsymaattisesti TPA:ksi, esimerkiksi käyttämällä plasmiinia tai entsyymiä, jolla on ekvi-valenttinen vaikutus pro-TPA:han.
Jotta saataisiin valmistetuksi pro-TPA:ta, joka on oleellisesti ottaen vapaa TPArsta, on edullista käyttää proteaasien inhibiittoria, kuten aprotiniinia (Trasylol®) tai emäksistä haiman trypsiinin inhibiittoria, puhdistuksessa, jotta saataisiin estetyksi niiden pienten proteaasimäärien toiminta, joita voi olla läsnä, ja jotka saattavat aiheuttaa (osittain) pro-TPA:n muuttumisen TPA:ksi. Lopullinen puhdistus on edullista suorittaa kromatografiapylväässä, joka sisältää selektiivistä affiniteettiainetta, kuten DE-3, inhibiittorin läsnäollessa (kuten di-isopropyylifluori-fosfaatti (DFP) tai nitrofenyyliguanidinobentsoaatti), joka sitoo selektiivisesti vain TPA:ta eikä pro-TPA:ta. Nämä reagenssit estävät TPA:ta adsorboitumasta affi-niteettipylvääseen. Näin ollen TPA läpäisee DE-3-pylvään, kun taas pro-TPA adsorboituu pylvääseen ja voi- 24 86746 daan eluoida edelläkuvatulla tavalla.
Glykosyloituneiden ja glykosyloitumattomien prote-nien seos voidaan erottaa esim. kromatografisesti käyttämällä concavalin A-Sepharose^-pylvästä. Glykosy-loitumattomat tuotteet läpäisevät pylvään, kun taas glykosy loituneet tuotteet adsorboituvat selektiivisesti ja voidaan eluoida tavanomaiseen tapaan, kuten käyttämällä α-metyylimannosidia yhdessä kaotrooppisen aineen, kuten KSCN, kanssa.
On myös mahdollista poistaa glykosyylitähteet entsymaattisesti, esim. käyttämällä endoglykosidaasi H:ta. Tällä menetelmällä voidaan valmistaa glykosyloitumatto-mia tuotteita oleellisesti ottaen puhtaassa muodossa.
Keksinnön mukaisesti valmistetuilla TPA-laaduilla ja pro-TPA-laaduilla on arvokkaita farmakologisia ominaisuuksia. Näin ollen näitä proteiineja voidaan käyttää samoin kuin ennestään tunnettuja kudosten sisältämiä plasminogeenin aktivaattoreita ihmisillä veritulppien hoidossa ja ehkäisyssä ja muiden tilojen hoidossa, kun halutaan saada aikaan paikallinen fibrinolyyttinen tai proteolyyttinen vaikutus plasminogeenin aktivoitumisen kautta, kuten arterioskeloosissa, sydän- ja ai-voinfraktissa, laskimotulpassa, thromboemboliassa, lei-kausta seuraavissa veritulpissa, thrombophlebitiksessä ja diabeteksen aiheuttamissa verisuonisairauksissa.
Keksintö koskee myös TPA-laatuja ja pro-TPA-laa-tuja ja näiden seoksia, joissa on hiivoille ominainen glykosyloituminen, tarkemmin sanottuna Saccharomyces-suvulle ominainen glykosyloituminen ja erityisesti Saccha-romyces cerevisiaelle ominainen glykosyloituminen.
Edelleen keksintö koskee TPA-laatuja, pro-TPA-laatuja ja näiden seoksia, jotka on valmistettu keksinnön mukaisilla menetelmillä.
Edelleen keksintö koskee TPA-laatuja, pro-TPA-laa-tuja ja näiden seoksia, jotka on saatavissa keksinnön mukaisella menetelmällä.
25 6 6 / 4 6
Keksintö koskee erityisesti yhdistelmävektoreita, transformoituneita hiivakantoja ja menetelmiä niiden valmistamiseksi sekä menetelmää TPA-laatujen, pro-TPA-laatujen ja niiden seosten valmistamiseksi, kuten esimerkeissä on selostettu.
Farmaseuttiset valmisteet
Keksinnön mukaisesti saatavissa olevilla uusilla proteiineilla, erityisesti TPArlla ja prc-TPA:lla on arvokkaita farmakologisia ominaisuuksia. Näin ollen , TPA:ta ja pro-TPA:ta voidaan käyttää ihmisten hoidossa samoin kuin ennestään tunnettuja plasminogeenin ak-tivaattoreita veritulppien hoidossa ja ehkäisyssä ja muiden tilojen hoidossa, kun halutaan saada aikaan paikallinen fibrinolyyttinen tai proteolyyttinen aktiivisuus plasminogeenin aktivoitumisen kautta esim. arterio-skleroosisa, sydän- ja aivoinfraktissa, laskimotulpassa, thromboemboliassa, leikkausta seuraavissa veritulpissa, thrombophlebitiksessä ja diabeteksen aiheuttamissa verisuonisairauksissa .
Keksintö koskee myös farmaseuttisia valmisteita, jotka sisältävät terapeuttisesti tehokaan määrän vaikuttavaa ainetta (erityisesti TPA:ta, pro-TPA:ta tai näiden seosta) sekä orgaanisia tai epäorgaanisia, kiinteitä tai nestemäisiä farmaseuttisesti hyväksyttäviä kantaja-aineita, jotka soveltuvat parenteraalisesti, so. intramuskulaarisesti, subkutaanisti tai intraperi-toneaalisesti, annettaviksi eivätkä toimi haitallisesti vuorovaikutuksessa vaikuttavien aineiden kanssa.
Erityisen sopivia ovat infuusioliuokset, mielellään vesiliuokset tai -suspensiot, jotka on mahdollista valmistaa ennen käyttöä esim. lyofilisoiduista valmisteista, jotka sisältävät pelkkää vaikuttavaa ainetta tai myös mannitolia, laktoosia, glukoosia, albumiinia tms. Farmaseuttiset valmisteet voidaan steriloida ja haluttaessa niihin voidaan sekoittaa apuaineita, kuten 26 6 6 7 46 säilöntäaineita, stabilointiaineita, emulgointiaineita, liuotusaineita ja puskurointiaineita ja/tai suoloja osamoottisen paineen säätelyyn. Sterilointi voidaan suorittaa suodattamalla pienihuokoisten suodattimien läpi (halkaisija 0,45 ym tai pienempi), jonka jälkeen valmiste voidaan haluttaessa lyofilisoida. Voidaan myös lisätä antibiotteja steriilisyyden sailymistarkoi-tuksessa.
Keksinnön mukaiset farmaseuttiset valmisteet annetaan yksikköannoksina, jotka sisältävät 1 - 2000 mg farmaseuttisesti hyväksyttävää kantaja-ainetta yksikkö-annosta kohti ja noin 1-20 mg, mielellään noin 3-15 mg vaikuttavaa ainetta (TPA, pro-TPA tai näiden seos) yksikköannosta kohti.
Riippuen sairauden laadusta, potilaan iästä ja tilasta on noin 70 kg painavan potilaan hoitoannos vuorokaudessa 3-15 mg, mielellään 5-10 mg.
Keksintö koskee myös menetelmää farmaseuttisen valmisteen valmistamiseksi siten, että keksinnön mukainen biologisesti aktiivinen proteiini sekoitetaan farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja-aineen kanssa.
Edelleen keksintö koskee uusien proteiinien käyttöä ihmisissä ennaltaehkäisevässä ja hoidollisessa tarkoituksessa.
Seuraavassa kokeellisessa osassa tämän keksinnön toteutustapoja selostetaan liitteenä olevien kuvien avulla:
Kuva 1 esittää plasmidien pJDB207/PHO5,PHO3 ja pBR322/ PH05Bam-Sal osittaisia restriktioendonukleaasikarttoja, joita plasmideja käytetään PH05-geenin lähteenä ja DNA-sekvenssin määrityksessä, vastaavasti.
Kuva 2 esittää PH05- ja PH03-happofosfataasigeenin paikkaa 5,1 kc:n BamHI-jaksossa, joka on eristetty hiivan geenikirjastosta.
Kuvissa 3a ja 3b on esitetty PH05:n ja PH03:n promoottorialueen DNA-sekvenssit vastaavasti.
27 86746
Kuva 4 on kaavio yhdiste iirapiasrruain p3u rakentamisesta.
Kuva 5 on kaavioesitys plasmidin p31 rakentamisesta, joka sisältää PH05- päätösjakson.
Kuva 6 esittää Sau3A-PstIPH05-nukleotidisekvenssiä, joka on transkription päätösjakso.
Kuva 7 on kaavioesitys PH05-signaalisekvenssin poistamisesta ilmentämisplasmidista p31 ja erityisesti esitetään plasmidin p31/R rakentaminen.
Kuva 8 on kaavioesitys klooneista, jotka on saatu kuvassa 7 esitetyllä menetelmällä.
Kuvat 9 ja 10 esittävät BamHI-EcoRI-restriktiojaksojen nukleotidisekvenssejä, joissa on PH05/R- ja PH05/Y-pro-moottorialue.
Kuva 11 esittää HeLa-soluista eristetyn TPA cDNA-kloo-nin DNA-sekvenssiä ja vastaavaa aminohappojärjestysä. Kuva 12 on kaavioesitys kloonausvälineen M13mp9/PH05-TPA rakentamisesta
Kuva 13 esittää PH05-signaalisekvenssin sisältävän plasmidin pJDB207/PHO5-TPA(1A) rakentamista Kuva 14 on kaavioesitys plasmidin pJDB207/PHO5-TPA rakentamisesta, joka sisältää transkription päätösjakson PH05 lyhennettynä.
Kuva 15 esittää lyhennetyn transkription päätösjakson PH05-sekvenssiä.
Kuva 16 esittää yhdistelmäplasmidin p31RL/TPA(12-2 ) rakentamista ilman signaalisekvenssiä. Kypsää TPA:ta koodattava sekvenssi liitetään PH05-promoottoriin.
Kuva 17 on kaavioesitys plasmidin pJDB207R/PHO5-TPA(12-2) rakentamisesta.
Kuva 18 esittää plasmidin p31/PH05-TPA18 rakentamista. Kuva 19 esittää PH05-signaalisekvenssin ja kypsää TPA: ta koodittavan alueen liitoskohtaa plasmidissa p31/PH05-TPA18.
Kuva 20 on kaavioesitys sellaisten DNA-jaksojen eristämisestä, jotka sisältävät osia prepro-TPA:ta koodattavasta alueesta.
Kuva 21 esittää plasmidin p31R/SS-TPA^2 rakentamista.
28 86746
Kuva 22 esittää väliplasmidin pBR322/PH05Bam-Rsa 637 rakentamista .
Kuva 23 esittää sellaisen plasmidin rakentamista, jossa PH05-signaalisekvenssi ulottuu PH05:ttä koodittavalle alueelle.
Kuva 24 on kaavioesitys PH05-promoottorin ja PH05:ttä koodittavan sekvenssin osan sekä kypsää TPA:ta koodit-tavan sekvenssin liitoksesta kytkijän A, B tai C välityksellä .
Kuva 25 on kaavioesitys PH05-geenin korvaamisesta TPA-geenillä kromosomissa.
Keksintöä valaistaan, mutta ei rajoiteta seuraa-villa esimerkeillä.
Esimerkeissä käytetään seuraavia lyhenteitä: BSA: naudan seerumialbumiini DTT: 1,4-ditiotreitoli (1,4-dimerkapto-2,3-butaanidioli) EDTA: etyleenidiamiinitetraetikkahappo SDS: natriumdodekyylisulfaatti TNE: liuos, joka sisältää 100 mM NaCl, 10 mM Tris.HCl
(pH 7,5) ja 1 mM EDTA
Tris.HCl tris-(hydroksimetyyli)-aminometaani, pH säädetty suolahapolla
TE: liuos, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 1 mM EDTA
MOPS: 3-morfoliini-propaani-1-sulfonihappo
Esimerkki 1: Hiivan geenikirjaston valmistaminen 30 vkj villityyppisestä Saccharomyces cerevisiae-kannasta S288C saatua kokonaista, suurimolekyylipainois-ta hiiva-DNA:ta (17) inkuboidaan 30 minuuttia 37°C:ssa 2 yksikön kanssa EcoRI-metylaasia (New England Biolabs) 250 yl;ssa EcoRI-metylointipuskuria valmistajan ohjeiden mukaan. DNA saostetaan etanolilla, suspendoidaan uudestaan 500 ui:aan liuosta, jossa on 25 mM Tris.HCl, pH 8,5 ja 2 mM MgC^ (EcoRI*-puskuri) (18) , ja pilkotaan EcoRI:llä (Boehringer), kunnes DNA-jaksojen kokojakautu-man maksimi on alueella 30 - 50 ke (λϋΝΑ:η Xhol-pilkko-mistuote antaa sopivat 33 ke:n ja 17 ke:n merkit).
29 86746
EcoRI*-olosuhteissa pilkottua hiivan DNA:ta fraktioidaan koon mukaan sakkaroosigradientissa (5-20 % sakkaroosia 10 mM Tris.HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) 6 tuntia nopeudella 38 000 rpm SW 40-roottorissa. Gradientin päältä kerätään 30 kpl 0,4 ml:n jaetta: Jae 16 sisältää DNA- jaksot, joiden koko on 30 - 40 ke. Tämän jakeen DNA (3 yg) saostetaan etanolilla ja sitä liitetään 16 tuntia 15°C:ssa 15 yl:n kokonaistilavuudessa yhteen 1 yg:n kanssa kosmidivektoria pYcl (19), joka on linearisoitu EcoRI: llä. Liittäminen suoritetaan 300 yksiköllä T4 DNA-ligaa-sia (New England Biolabs), käyttämällä valmistajan kuvaamaa puskurisysteemiä. DNA pakataan in vitro bakte-riofaagiin λ (20) ja koostetuilla faageilla suoritetaan E. coli-kannan HB101 (r^, , leu , pro , recA ) trans- duktio. Transduktion tehokkuus on noin 5000 ampisil-liinille vastustuskykyistä pesäkettä per yg pYcl-vek-toria. 3000 amp -pesäkettä poimitaan ja kasvatetaan yksitellen mikrotitrauslevyjen koloissa LB-alustassa (10 g Bacto-Tryptonia (Difco), 5 g Bacto-hiivauutetta (Difco), 10 g NaCl), jossa on 100 yg/ml ampisilliinia.
Esimerkki 2: Säädellyn happofosfataasigeenin PH05 eris täminen
Geenikirjaston kaksoiskappaleita kasvatetaan LB-afarlevyillä (LB-alusta + 15 g/1 agaria), joissa on 100 ig/ml ampisilliinia. 500 pesäkkeen solumateriaali pestään levyiltä ja yhdistetään. Kustakin yhteenkerätystä erästä eristetään DNA seuraavalla tavalla:
Solut sentrifugoidaan talteen (Sorval, GSA-roottori, 10 minuuttia, 6000 1/min, 4°C), suspendoidaan uudestaan 100 ml:aan TE:tä (10 mM Tris.HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) ja sentrifugoidaan uudestaan edelläkuvatuissa olosuhteissa. Solupelletti suspendoidaan uudestaan 3 ml:aan Tsuc-liuosta (50 mM Tris.HCl, pH 7,5, 25 % (paino/tilav) sakkaroosia) ja siirretään SS-34-polypropyleeni Sor-vall-putkiin. Kaikki loput vaiheet suoritetaan jään päällä: Lisätään 0,3 ml lysotsyymiliuosta (10 mg/ml, 30 8 6 7 4 6 hankittu Worthingtoniitä, 1 1 000 U/mg) , 5 minuutin kuluttua lisätään 1,2 ml EDTA:ta (500 mM, pH 8,0) ja tästä 5 minuutin kuluttua 4,8 ml pinta-aktiivista ainetta (0,1 « Triton X-100 (Merck), 50 mM EDTA, 50 mM Tris.HCl, pH 8,0). 5 minuutin kuluttua lysaatti sentri- fugoidaan ja esijäähdytetään SS-34-roottorissa 40 minuuttia 4°C:ssa. Emäliuos poistetaan huolellisesti ja lisätään kiinteätä CsCl:aä (8,3 g CsCl/8,7 ml emä-liuosta). Lisätään etidiumbromidia (Sigma) (lopullinen väkevyys 1 mg/ml) ja liuos siirretään 13,5 ml:n Quick Seal polyallomeeriputkiin (Beckman) ja sentri-fugoidaan Beckman Ti50-roottorissa 40 tuntia nopeudella 40 000 1/min. Kaksi fluoresoivaa vyöhykettä voidaan nähdä pitkäaaltoisella UV-valolla (366 nm). Alempi vyöhyke sisältää moninkertaisesti kiertynyttä plasmi-di-DNA:ta, joka otetaan talteen puhkaisemalla putki sivusta 2 ml:n ruiskulla (18G neula). Etidiumbromidi poistetaan uuttamalla 5 kertaa yhtä suurella tilavuudella isopropanolia (kyllästetty CsCl:llä) ja tuote siirretään 30 ml:n Corex-putkiin. Lisätään 2,5 tilavuutta TE:tä ja DNA saostetaan etanolilla. Sitten liuosta pidetään 12 - 15 tuntia -20°C:ssa. Saostunut DNA sent-rifugoidaan talteen Sorvali HB-4-roottorilla (30 min, 12 000 1/min, 0°C) ja liuotetaan uudestaan 200 yltään TEttä. 100 mltsta viljelmää saadaan talteen 50 - 100 yg yhdistelmäplasmidi-DNA:ta.
Näistä yhteenkerätyistä eristä saadulla plasmidi-DNAtlla transformoidaan S. cerevisiae-kanta AH216 (a, his3, leu2, pho3, pho5) menetelmällä Hinnen et ai. (12). Hiivatransformantit replikoidaan matala-P^minimi-alustassa ("Difco yeast minimal medium without amino-acids", johon on lisätty 20 g/1 glukoosia, mutta joka on valmistettu aineosista Difcon reseptin mukaan (Difco Manual, Difco laboratories, Detroit, USA), ja jossa on 0,03 g/1 ΚΗ2?0^ plus 1 g/1 KC1 eikä 1 g/1 KH^PO^)ja värjätään happofosfataasiaktiivisuuden toteamiseksi levittämällä päälle värjäysagar (1 %:nen Difco-agar 100 mM
31 86 7 46 asetaattipuskurissa, pH 4,0, 2 rag/ml Fast Blue B-suolaa (Serva) ja 0,2 mg/ml α-naftyylifosfaattia (Serva)). Pesäkkeet, joissa on toimiva PH05-geeni, värjäytyvät punaisiksi, kun geeni kytketään päälle matala-P^-alus-tassa. Kun geenikirjastosta suoritettiin jatkokasvatuksia ja valintoja (subpooling) (21), saatiin 3 riippumatonta kloonia, joilla oli repressoituva fosfataasi-aktiivisuus.
Yhtä näistä klooneista (pG7) analysoidaan tarkemmin. Yhdistelmäplasmidin koko on 42 ke. Kloonin pG7 EcoRI- ja BamHI-jakso alakloonataan plasmidiin pBR322/ HIS3 (13) ja plasmidiin pJDB207 (22) vastaavasti. Katkaisut suoritetaan valmistajan ohjeiden mukaan (New England Biolabs) ja liitetään 20 yl:ssa käyttämällä 150 yksikköä T4-DNA-ligaasia (New England Biolabs) ja 20 yg/ml kutakin pilkottua plasmidia (New England Biolabsin ehdottamissa olosuhteissa). 5,1 ke:n BamHI-jakso, joka on 8 ke:n EcoRI-jakson osa, alakloonataan hiivavektoriin pJDB207, ja kun suoritetaan hiivakannan AH216 transfor-mointi tällä yhdistelmäplasmidilla (pJDB207/PHO5,PHO3, ks. kuva 1), saavutetaan suuri fosfataasiaktiivisuus päällekvtkentäolosuhteissa (matala-P^) (PH05-geeni) ja pieni aktiivisuus normaalissa hiivan minimialus-tassa (PH03-geenin ilmentyminen).
Esimerkki 3: PH05- ja PH03-geenin paikantaminen ja DNA- sekvenssin määritys a. PH05-geeni PH03- ja PH05-geenin paikantamisessa BamHI-jakson sisällä käytetään hyväksi Sau3A- katkaisukohtia ja ainutta Pstl-kohtaa. Kun BamHI-jakso pilkotaan Sau3A-restriktioendonukleaasilla (New England Biolabs), saadaan 6 palaa (A - F, kuva 2). Kun osittaisesti Sau3A: 11a pilkottu tuote alakloonataan itsereplikoituvan hii-vavektorin pJDB207 BamHI-kohtaan, saadaan aikaan plasmi-deja, joissa on erilaisia Sau3A-yhdistelmiä. Sitten 32 86 746 näillä plasmideilla transformoidaan S. cerevisiae AH216-hiivan pho3,pho5-mutantti. Transformanttien happofosfa-taasiaktiivisuus tutkitaan sen jälkeen, kun niitä on kasvatettu matala-P^-levyillä tai normaalia minimi-alustaa sisältävillä levyillä. Kloonit, jotka sisältävät vähintään Sau3A-jaksot A ja B (kuva 2, no:t 1-4) ilmentävät happoosiataasia samalla tasolla (kvalitatiiviset arviot tehty peittämällä happofosfataasin vär-jäysagarilla, kuten esimerkissä 2 on selostettu) kuin koko 5,1 ke:n BamHI-jakso. Ilmentymistä säätelee normaalisti kasvualustan sisältämä epäorgaanisen fosfaatin väkevyys. Kloonit, joissa on pelkkä Sau3A-jakso A (kuva 2, no:t 5, 6) ilmentävät pieniä happofosfataasimääriä, joihin ei vaikuta kasvualustan sisältämä epäorgaanisen fosfaatin pitoisuus. Tämä viittaa siihen, ettei Sau3A-jakso A sisällä riittävästi informaatiota rakenteellisen happofosfataasin ilmentämistä varten (PH03). Sau3A-jakso B (kuva 2, no. 7) ei yksin johda lainkaan happofosfataasin ilmentymiseen repressoiduissa tai päälle kytkevissä olosuhteissa. Kuitenkin alaklooni, joka sisältää BamHI- ja Pstl-kohdan välisen täydellisen sekvenssin (kuva 2, no. 10) osoittaa säädeltyä, mutta ei rakenteellista happofosfataasin synteesiä. Näin ollen tämän alakloonin pitää sisältää hiivan PH05-geeni (13).
PH05-geenin tarkka sijainti määritetään DNA:n sek-ventoinnilla käyttämällä Maxamin ja Gilbertin menetelmää (10). 623 ke:n BamHI-Sall-jakso kloonataan plasmi- diin pBR322 (ks. kuva 1) korvaamalla BamHI-Sall-jakso, joka ulottuu asemasta 375 asemaan 650 (pBR322:ssa käytetty numerointi), käyttämällä edelläkuvattuja pilkko-mis- ja yhteenliittämisominaisuuksia (kaikki entsyymit ovat New England Biolabsin tuotteita). BamHI-Sall-DNA-liitännäisten 5'-pää leimataan asymmetrisesti seuraa-vista kohdista: BamHI (-541), Sau3A (-200) ja Sali (+82) (numerointi selviää kuvasta 3a). 623 emäsparin pitui sen BamHI-Sall-DNA-liitännäisen nukleotidisekvenssi on esitetty kuvassa 3a. Siitä ilmenee, että liitännäi- 33 86746 nen sisältää PH05-promoottorialueen ja osan PH05-fos-fataasiproteiinia koodittavasta alueesta.
b. PH03-geeni PH03-geenin tarkka sijainti määritetään suorittamalla DNA-sekvenssin määritys menetelmällä, joka on selostettu käsikirjassa "M13 cloning and DNA sequencing system", New England Biolabs. 415 emäsparin (5')PstI-Rsal(3')-jakso alakloonataan vektoreihin M13mp8 ja M13mp9 (23) käyttämällä ainoita PstI- ja Smal-katkaisukohtia.
416 emäsparin Pstl-Rsal-DNA-liitännäisen nukleotidisek-venssi on esitetty kuvassa 3b. Siitä ilmenee, että liitännäinen sisältää PH03-promoottorialueen ja osan PH03-happofosfataasia koodittavasta sekvenssistä.
Esimerkki 4: Plasmidin p30 rakentaminen (ks. kuva 4) a) Ball-katkaisukohdan poistaminen plasmidista pBR322 3 VJg plasmidia pBR322 pilkotaan täysin restriktio-endonukleaaseilla Ball (BRL) ja PvuII (Biolabs) valmistajien ohjeiden mukaan. Kun pBR322:lle suoritetaan Ball/PvuII-kaksoishajotus, saadaan kaksi palasta, joiden koko on 3738 emäsparia ja 622 emäsparia. Kyseiset kaksi palaa erotetaan 1 %:sessa matalalla sulavassa aga-roosigeelissä (Sigma), joka on tehty TBE-puskuriin (90 mM Tris.HCl, pH 8,3, 2,5 mM EDTA, 90 mM boorihappo). DNA-vyöhykkeet värjätään etidiumbromidilla ja tehdään näkyviksi UV-valolla, jonka aallonpituus on 366 nm. Se agaroosipala, joka sisältää 3738 emäsparin palan, leikataan geelistä, nesteytetään 65°C:ssa, pitoisuudeksi säädetään 500 mM NaCl ja inkuboidaan 65°C:ssa 20 minuuttia. Lisätään yksi tilavuus fenolia (tasapainotettu pitoisuuteen 10 mM Tris.HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl). Vesifaasi uutetaan uudelleen kahdesti fenolilla ja kerran kloroformilla. DNA saostetaan 2,5 tilavuudella absoluuttista etanolia ja sentrifugoidaan talteen.
34 86 7 46 DNA-pelletti pestään kylmällä 80 %:sella etanolilla ja kuivataan sen jälkeen vakuumissa. DNA suspendoidaan uudestaan TE:hen väkevyyteen 0,15 mg/ml.
Eristetyssä 3738 emäsparin jaksossa on kaksi tylppää päätä, jotka johtuvat Ball- ja Pvul-kaksoispilkkomi-sesta. DNA:sta tehdään renkaanmuotoinen liittämällä tylpät päät yhteen. 0,6 yg DNA:ta inkuboidaan yön yli huoneenlämpötilassa 30 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM ATP ja 900 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs). 5 ul:n erät liitäntäseosta lisätään 50 yl:aan kalsiumilla käsiteltyjä, transformointikelpoisia E. coli HB101-SO-luja, jotka on valmistettu menetelmällä Mandel et ai.
(24). Seosta pidetään jään päällä 5 minuuttia ja sen jälkeen inkuboidaan 2 minuuttia 37°C:ssa ja jätetään 10 minuutiksi huoneenlämpötilaan ennen levittämistä LB- agarlevyille, joissa on 100 yg/ml ampisilliiniä. Poi-£ mitään 6 amp -pesäkettä, joita kasvatetaan erikseen 100 mlrssa LB-alustaa (kuten edellä, mutta ei sisällä agaria), joka sisältää 100 yg/ml ampisilliiniä. Soluista valmistetaan plasmidi-DNA käyttämällä esimerkissä 2 kuvattua menetelmää. Plasmidit pilkotaan HaeIII:lla (hankittu Biolabsilta, pilkkomisolosuhteet valmistajan ehdottamat), PvuIIrlla ja Balltllä ja analysoidaan 1,5 %-sessa agaroosigeelissä, joka on tehty TBE-pusku-riin. Restriktiokaavio ja vasta muodostuneen liitos-jakson ennustettu koko viittaavat siihen, että plasmidit ovat identtisiä ja jokainen sisältää kaikki pBR322:n sekvenssit, lukuunottamatta Ball-PvuII-jaksoa. Näistä plasmideista puuttuu Ball-restriktiokohta ja niistä käytetään nimitystä pBR322Λ Ball.
b) Hiivan PH05:n ja PH03:n sisältävän, 5,1 ke:n pituisen BamHI-jakson kloonaus plasmidiin pBR322ÄBalI
pJDB207/PHO5,PH03 (ks. kuva 1) sisältää hiivan 35 86 746 5,1 BanHI-liitännäisen, jossa on hiivan säädeltävän ja rakenteellisen happofosfataasin geenit (PH05 ja PH03). Plasmidit pJDB207/PHO5,PH03 ja pBR322^BalI pilkotaan restriktioendonukleaasilla BamHI. Täydellisen pilkkomisen jälkeen entsyymiä inaktivoidaan 2 minuuttia 65° C:ssa. Kumpinin DNA saostetaan etanolilla ja suspen-doidaan uudestaan 10 mM Tris.HCl-puskuriin, pH 8,0, väkevyyteen 0,2 mg/ml kutakin. 0,5 yg kutakin kahta BamHI:llä pilkottua DNA:ta yhdistetään ja liitetään yhteen 20 tuntia 15°C:ssa 20 ylissa liitospuskuria (New England Biolabsin ehdotuksen mukaan), jossa on 300 yksikköä T4 DNA-ligaasia. 5 μ1:η erät yhteenliittämisseos-ta lisätään 50 yliaan kalsiumilla käsiteltyjä E. coli-soluja ja transformointi suoritetaan esimerkissä 4a kuvatulla tavalla. Transformoituneista E. colisoluis- ta tutkitaan vastustuskyky ampisilliinin ja tetrasyklii-
R S
nin suhteen. Eristetään 8 amp ,tet -pesäkettä ja niitä kasvatetaan 100 ml:ssa LB-alustaa, jossa on 100 yg/ ml ampisilliiniä. Soluista eristetään plasmidi-DNA (ks. esimerkki 2). Kun suoritetaan pilkkominen BamHI:llä, havaitaan, että 4 plasmidia sisältää 5,1 ke:n liitännäisen sekä 3,7 ke:n vektorijakson (pBR322ABall). Suorittamalla pilkkominen Sällillä (New England Biolabs) saadaan määritetyksi liitetyn 5,1 kein jakson suunta: kah dessa plasmidissa liitännäinen on kuvassa 4 esitetyssä suunnassa. Yhdelle näistä annetaan nimi p30. 5,1 kein liitännäisen sisältämien PH05,PH03-geenien transkription suunta on vastapäivään, kuten kuvasta 4 näkyy.
Esimerkki 5: Sellaisen ilmentymisplasmidin rakentami nen, joka sisältää PH05-promoottorin ja PH05:n transkription lopetussignaalin (ks. kuva 5) a) EcoRI-kohdan poistaminen plasmidista p30 5 yg p30-DNA:ta (ks. esimerkki 4) pilkottiin täysin EcoRI-restriktioendonukleaasilla (Boehringer). Jotta 36 8 6 7 4 6 syntyneet lomittaiset päät saataisiin täytetyiksi, 1 μg EcoRI:llä pilkottua p30:tä inkuboitiin 50 ylrssa liuosta, jossa oli 50 mM NaCl, 10 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,25 mM dATP ja 0,25 mM dTTP, 30 minuuttia 37uC:ssa 1 yksikön kanssa DNA-polymeraa-sia (suuri Klenow-palanen, BRL). Etanolisaostuksella saatu DNA liitettiin yhteen tavalliseen tapaan ja sillä transformoitiin transformointikypsät E. coli HB101-solut esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Klooneja, jotka ovat vastustuskykyisiä EcoRI-pilkkomiselle nimi-tetään plasmideiksi p30(EcoRI ).
b) PH05:n transkription lopetusjakson eristäminen, joka on 0,37 ke:n Sau3A-PstI-jakso PH05:n transkripti on kartoitettu S1-nukleaasikar-toituksella (25). Transkription päättämissignaalien on osoitettu olevan PH05-geenin 0,37 ke:n Sau3A-PstI-jaksossa. Sau3a-Pstl-jakson nukleotidisekvenssi on esitetty kuvassa 6.
5 yig pJDB207/PHO5 ,PH03-DNA: ta (ks. esimerkki 3) pilkotaan täysin restriktioendonukleaaseilla Sau3A ja Pstl. Katkaisussa syntyneet jaksot erotetaan pystysuorassa 1 %:sessa matalalla sulavassa agaroosigeelissä, joka on tehty TBE-puskuriin. 0,37 ke:n Sau£A-Pstl-jak so paikannetaan etidiumbromidivärjäyksellä ja geelipala, joka sisältää DNA-jakson, leikataan irti mahdollisimman pienenä.
c) Sau3A-PstI-PH05-jakson kloonaaminen M13mp9:ään M13mp9-faagin DNA on hyödyllinen kloonausvektori, jossa on joukko ainoita katkaisukohtia (23). 5 ug M13mp9-DNA:ta pilkotaan täysin restriktioensonukleaaseil-la BamHI ja Pstl. Suurempi 7,1 ke:n DNA-jakso erotetaan hyvin pienestä (8 emäsparia) jaksosta 0,8 %:sessa matalalla sulavassa agaroosigeelissä. Suuren DNA-jakson sisältävä geelipala leikataan irti geelistä. Geelipalat, 37 8 6 7 4 6 jotka sisältävät JDB207/PHO5,PH03:sta saadun 0,37 ke:n Sau3A-PstI-jakson (ks. esimerkki 5b) ja M13mp9:stä saadun 7,2 ke:n BamHI-PstI-jakson, nesteytetään 65°C:ssa, sekoitetaan suunnilleen ekvimolaarisina määrinä ja laimennetaan vedellä niin, että agaroosiväkevyydeksi tulee 0,3 %. Yhteenliittäminen suoritetaan 200 ylrssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgC^r 10 mM DTT, 1 mM ATP ja 600 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Bio-labs). E. coli-kannan JM101(Ca++) transdusointikelpoi-set solut transdusoidaan menetelmällä, jota on selostettu käsikirjassa "M13 cloning and DNA sequencing system", julkaisija New England Biolabs. Faagit muodostavat lukuisia valkoisia täpliä, joista analysoidaan niiden sisältämän DNA-liitännäisen koko suorittamalla pilkkominen restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja PstI.
Eristetään Ml3mp9:stä johdettu klooni, joka sisältää PH05:n transkription päättämisjakson (Sau3A-Pstl), ja kloonille annetaan nimi M13mp9/PH05(Sau3A-Pstl).
d) PH05:n transkription päättämisjakson kloonaus plas-midiin p39(EcoRIR)
Alkuperäinen PH05:n transkription päättämisjakso, joka on kloonattu faagiin M13mp9 (M13mp9/PH05(Sau3A-PstI) kloonataan uudestaan Haelll-Hindlll-jaksona plasmidiin p30(EcoRI ), joka on katkaistu Ball:llä ja HindIII:lla. M13mp 9/PH05(Sau3A-PstI)-DNA pilkotaan täysin restriktioendonukleaaseilla Haelll ja Hindlll. Saadut kaksi DNA-jaksoa erotetaan 1,5 %:sessa pystysuorassa, matalalla sulavassa agaroosigeelissä, joka on tehty TBE-pusku-riin. 0,39 ke:n jakson sisältävä geelipala leikataan irti geelistä. p30(EcoRI )-DNA pilkotaan Ball:llä ja HindIII:lla. Suuri 3,98 ke:n jakso erotetaan 0,8 %:ses-sa matalalla sulavassa agaroosigeelissä, joka on tehty TBE-puskuriin, ja eristetään leikkaamalla irti kyseisen DNA-jakson sisältävä geelipala.
38 86746
Geelipalat, joissa on 0,39 ke:n Haelll-Hindlll-PH05:n transkription päättämisjakso ja 3,98 ke:n Ball-Hindlll-jakso, joka on saatu plasmidista p30(EcoRI ), sulatetaan 65°C:ssa ja sekoitetaan keskenään suunnilleen ekvimolaarisina määrinä. Yhteenliittäminen ja käsiteltyjen E. coli HB101-solujen transformointi on selostettu esimerkissä 4. Transformoituneiden solujen sisältämä DNA analysoidaan ja sille annetaan nimeksi p31 (ks. kuva 5).
Ilmentämisplasmidi p31 sisältää PH05-promoottori-alueen sekä osan PH05:n signaalisekvenssiä ja sen vieressä DNA-jakson, jossa on PH05:n transkription päättämis-signaalit. Tässä vektorissa ilmennetyiksi tarkoitetut vieraat koodittavat sekvenssit on edullista sijoittaa promoottorin ja transkription päättämissginaalin väliin.
Esimerkki 6: PH05:n signaalisekvenssin poistaminen il- mentämisplasmidista p31 (ks. kuva 7)
Ilmentämisplasmidi p31 sisältää PH05-promoottorisek-venssin, jossa on happofosfataasin mRNA:n alkukohdat, luennanaloituskodoni ATG ja vielä 40 nukleotidia, jotka koodittavat osaa happofosfataasin signaalisekvenssistä. Esillä olevaa rakentamista suoritettaessa signaalisekvenssin nukleotidit ja ATG poistetaan Bal31-katkaisulla. Tuodaan EcoRI-kytkijä , jotta PH05-promoottori voidaan liittää kypsää TPA:ta koodittavaan sekvenssiin.
a) Ball:llä katkaistun plasmidin p30 pilkkominen Bal31: llä 20 μ g p30-DNA:ta (ks. esimerkki 4b) pilkotaan rest-riktioendonukleaasilla, jolloin syntyy 2 jaksoa, joiden koot ovat 3,7 ke ja 5,1 ke. DNA uutetaan fenoli/kloro-formilla ja sen jälkeen se saostetaan etanolilla. DNA suspendoidaan uudestaan 10 mM Trisiin, pH 8,0, väkevyyteen 0,5 μ g/ml. 9 pg Ballrllä pilkottua p30-DNA:ta pii- 39 86746 kotaan 2 yksiköllä eksonukleaasia Bal31 (BRL) 100 yl: ssa liuosta, jossa on 20 mM Tris pH 8,0, 199 mM NaCl, 12 mM MgCl2, 12 mM CaCl2 ja 1 mM EDTA. DNAjSta otetaan 5 0g:n erät 15 sek, 30 sek, 45 sek ja 60 sek inkuboinnin jälkeen 30°C:ssa ja sekoitetaan välittömästi seokseen, jossa on 50 yl fenolia ja 60 yl TNE: tä. DNA uutetaan fenoli/kloroformilla ja saostetaan etanolilla ja suspendoidaan uudestaan 10 mM Trisiin, pH 8,0, väkevyyteen 100 yg/ml. Jotta saataisiin selville, missä määrin Bal31 on pilkkonut eksonukleolyyt-tisesti, 0,5 yg kussakin vaiheessa saatua DNArta pilkotaan endonukleaasilla BamHI ja analysoidaan 1,5 %:ses-sa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraattipusku-riin, pH 8,3. 45 sekunnin kuluttua on jakson päästä pois tunut keskimäärin 70 emäsparia Bal31-pilkkomisessa. Jatkokokeissa käytetään 45 sekunnin kohdalla saatua DNA: ta.
b) EcoRI-kytkijän lisääminen Bal31:llä käsiteltyyn DNA:hän
Kaksi A2(-Q-yksikköä EcoRI-kytki jää (5 1 -GGAATTCC-3 ' , BRL) suspendoidaan uudestaan 250 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris, pH 8, ja 1 mM EDTA. 2 yg EcoRI-kytkijää kinasoidaan 75 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgC12, 15 mM DDT ja 10 yM ATP ja 33 yksikköä T4 polynukleotidikinaasia (Boehringer). Kun on pidetty 1 tunti 37°C:ssa, seoksen annetaan jäähtyä huoneenlämpötilaan ja sen jälkeen seosta säilytetään -20°C: ssa.
Saadut kaksisäikeiset EcoRI-kytkijät liitetään tylppine päineen Bal31:llä käsiteltyihin DNA-jahoihin, 0,5 yg Bal31:llä käsiteltyä DNA:ta (ks. esimerkki 6a) inkuboidaan 16 tuntia huoneenlämpötilassa 50-kertaisen ylimäärän kanssa kinasoituja EcoRI-kytkijöitä 20 yl: ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM ATP ja 600 yksikköä T4-DNA-ligaasia 40 8 6 74 6 (Biolabs). T4 DNA-ligaasin inaktivoinnin (10 min 65° C:ssa) EcoRI-kytkijäylimäärä pilkotaan 50 yksiköllä EcoRI: tä (Boehringer) 50 yl:n tilavuudessa. DNA uutetaan fe-noli/kloroformilla, saostetaan etanolilla ja suspendoi-daan uudestaan liuokseen, jossa on 10 mM Tris ja 1 mM EDTA.
Restriktioendonukleaasi EcoRI katkaisee kummankin Ball-jakson (3,7 ke ja 5,1 ke) päihin liitetyt EcoRI-kytki jät sekä 5,1 ke:n jakson sisällä olevan EcoRI-koh-dan niin, että syntyy 3,9 ke:n ja 1,2 ke:n jakso. 3,7 ke:n jakso ja 3,9 ke:n jakso erotetaan 1,2 ke:n jaksosta 0,8 %:sessa matalalla sulavassa agaroosigeelissä (Sigma), joka on tehty liuokseen, jossa on 90 mM Tris.
HCL, pH 8,3, 90 mM boorihappoa ja 2,5 mM EDTA. DNA-vyöhykkeet värjätään etidiumbromidilla ja tehdään näkyviksi pitkäaaltoisella UV-valolla, jonka aallonpituus on 366 nm. Kyseistä kahta 3,7 ja 3,9 kein pituista suurta DNA-jaksoa ei eroteta. Ne leikataan irti geelistä yhtenä geelipalana ja uutetaan esimerkissä 4a kuvatulla tavalla.
Lineaarisista, lomittaisiin EcoRI-päihin päättyvistä jaksoista tehdään renkaita yhteenliittämällä. Noin 0,25 yg jaksoja liitetään yhteen 4 tunnin ajan 15°C:ssa 100 ylissa puskuria, jossa on 60 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgC^, 10 mM DDT, 1 mM ATP ja 600 yksikköä T4 DNA-ligaasia.
10 ylin erät liittämisseosta lisätään 100 yliaan kalsiumilla käsiteltyjä, transformointikelpoisia E. coli HB101-soluja (ks. esimerkki 4a). 35 transformoitunutta amp -pesäkettä kasvatetaan yksittäin LB-alustassa, jossa on 100 yg/ml ampisilliinia. Plasmidi-DNA valmistetaan menetelmällä Holmes et ai. (26) ja se analysoidaan EcoRI/ BamHI-kaksoiskatkaisulia.
c) Nukleotidisekvenssin määritys, jotta saadaan selville lisätyn EcoRI-kytkijän paikka 41 86 746 35 kloonista useimmat eroavat toisistaan PH05-pro-moottorialueeseen lisätyn EcoRI-kytkijän sijainnin suhteen riippuen yksittäisten DNA-molekyylien Bal31-pilkon-nan asteesta. Nukleotidisekvenssianalyysiä varten plas-midi-DNA leikataan EcoRIrllä. Katkaistu DNA uutetaan fenoli/kloroformilla ja saostetaan etanolilla. DNA defosforyloidaan ja leimataan 5'-päästä. Leimatut DNA-jaksot katkaistaan toisella restriktioendonukleaasilla,
BamHI. Tuotteet erotetaan matalalla sulavassa 8,0 %: sessa agaroosigeelissä. 0,5 - 0,6 ke:n pituinen, 5’- leimattu EcoRl-BamHI-jakso eristetään matalalla sulavasta agaroosista esimerkissä 4a kuvatulla tavalla. Jotta saataisiin määritetyksi EcoRI-kytkijän vieressä oleva nukleotidisekvenssi, eri DNA-jaksot hajotetaan kemiallisesti ja tuotteet erotetaan polyakryyliamidigeelielektro-foreesilla Maxamin ja Gilgertin (10) kuvaamalla tavalla.
Taulukossa 1 on esitetty eri kloonit ja PH05-senvenssin viimeisen nukleotidin paikka (jota seuraa EcoRI-kytkijä) (ks. myös kuva 8).
Taulukko 1 klooni PH05-sekvenssin viimeisen nukleotidin paikka PE +25 pG +16 pe +15 pd +12
pY
pR -10 pP -16 pV -18 PL -21 pN “22 PC -24 pH -27 PS -28 pk -29 pl -38 pM -50 pO -53 42 86 7 46
Taulukko 1 (jatkuu) klooni PH05-sekvenssin viimeisen nukleotidin paikka pF -59 pm -67 PK -73 pi -81 ph -137 d) PH05R-promoottorin sisältävän 0,53 ke:n pituisen
BamHI-EcoRI-jakson eristäminen
Plasmidi pR sisältää PH05R-promoottorin 534 emäs-parin pituisessa BamHI-EcoRI-jaksossa. Kuvan 3a numeroinnin mukaan jakso kattaa PH05-promoottorin sekvenssit nukleotidista -541 (BamHI-kohta) nukleotidiin -10. EcoRI-kytkijä, joka on liittynyt nukleotidiin -10 (ks. esimerkki 6b) antaa kaksi G-tähdettä EcoRI-katkaisussa.
Plasmidi pR katkaistaan restriktioendonukleaaseil-la BamHI ja EcoRI. 0,53 ke:n BamHI-EcoRI-jakso erotetaan 0,8 %:sessa matalalla sulavassa agaroosigeelissä ja eristetään esimerkissä 4a kuvatulla tavalla. Nukleotidisek-venssi on esitetty kuvassa 9.
Plasmidi pY katkaistaan vastaavalla tavalla ja siitä ersitetään 0,53 ke:n BamHI-EcoRI-jakso, joka sisältää PH05Y-promoottorin. Nukleotidisekvenssi on esitetty kuvassa 10.
e) Plasmidin p31 Sall-EcoRI-jakson korvaaminen uusien rakenteiden Sall-EcoRI-jaksolla 5 tg plasmidia p31 (ks. esimerkki 5d) katkaistaan restriktioendonukleaasilla Sali. Katkaistu DNA saoste-taan etanolilla ja suspendoidaan uudestaan 50 yl:aan puskuria, jossa on 100 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl ja 5 mM MgC^· DNA pilkotaan täysin EcoRI :llä. Katkai-sutuotteet erotetaan 0,8 %:sessa matalalla sulavassa 43 86746 agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-pus-kuriin, pH 8,3. 3,5 ke:n DNA-jakso eristetään kysei sestä pienestä DNA-vyöhykkeestä.
5 yg kutakin kloonia pR ja pY (ks. taulukko 1 ja kuva 8) pilkotaan Sallrllä ja EcoRI:llä edelläkuvatulla tavalla. 0,8 ke:n DNA-jaksot eristetään pienissä, matalalla sulavissa agaroosigeelipaloissa.
0,67 yg vektorin p31 3,5 ke:n pituista Sall-EcoRI-jaksoa liitetään yhteen plasmidin pR tai pY 0,8 ke:n pituisen Sall-EcoRI-jakson kanssa vastaavasti (0,34 yg kutakin). Vastaavat geelipalat, joissa on DNA-jakso, sekoitetaan keskenään ja sulatetaan 65°C:een. Nestey-tetty geeli laimennetaan kolminkertaisesti. Yhteenliittäminen suoritetaan 240 yl:n kokonaistilavuudessa liuoksessa, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgC^, 10 mM DTT, 1 mM ATP ja 750 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Bio-labs), yön yli 15°C:ssa. 2 yl kutakin liitosseosta li sätään 100 yl:aan kalsiumilla käsiteltyjä, transformoin- tikelpoisia E. coli HB101-soluja (ks. esimerkki 4a).
£ 8 transformoitunutta amp -pesäkettä kasvatetaan erikseen LB-alustassa, jossa on 100 yg/ml ampisillii-niä. Plasmidi-DNA analysoidaan restriktioanalyvsillä. Kunkin ryhmän kloonit ovat identtisiä. Kustakin ryhmästä valitaan yksi klooni jatkokäyttöön ja klooneille annetaan vastaavasti nimet p31R ja p31Y (kuva 7).
Esimerkki 7: TPA-geenin valmistus a. mRNA:n valmistus
Falcon-solunviljelypulloih in (175 ml) siirrostetaan primäärisenä siirrosteena 10 x 10 HeLa-solua ja niitä kasvatetaan 25 ml:ssa Dulbeccon muunnettua Eagle-alustaa DME), johon on lisätty 5 % vasikan sikiön seerumia. Ela-tusaine vaihdetaan kolmen vuorokauden välein, kunnes saavutetaan yhtyminen (confluency).
Yhtyneet yksikerroksiset viljelmät pestään kahdesti PBS:llä (fosfaatilla puskuroitu suolaliuos: 80 g 44 86 746
NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPC>4 ja 2 g KH2PC>4 per litra liuosta) ja sen jälkeen kasvatetaan 16 tuntia DMErssä, johon on lisätty 100 ng/ml TPA:ta. Kokonais-RNA uutetaan viitteessä (27) kuvatulla tavalla lisäämällä lyysi-puskuri suoraan yhtenä kerroksena oleviin soluihin. Ko-konais-RNA:sta eristetään poly(A)-rikkaat sekvenssit menetelmällä Nagamine et ai. (28).
Sakkaroosigradienttisentrifugointi suoritetaan Beckman-ultrasentrifugilla, joka on varustettu SW-41-roottorilla. 100 yg poly(A)-RNA:ta sentrifugoidaan 12 tuntia 18°C:ssa 200 yl:ssa vettä 15-30 %:sessa sak-karrosigradientissa, joka on tehty liuokseen, jossa on 0,02 M Tris.HCl pH 7,4, 0,1 % SDS, 0,01 M EDTA, 0,04 M NaCl, nopeuden ollessa 30 000 1/min. Gradientti fraktioidaan pohjasta 36 jakeeseen ja RNA saostetaan lisäämällä natriumkloridia väkevyyteen 0,2 M ja 2,5 tilavuutta etanolia. Kun on inkuboitu yön yli -20°C:ssa, RNA otetaan talteen sentrifugoimalla ja liuotetaan 20 )jl:aan vettä.
Valitaan vaiheen kuusi varhaismunasoluja silmä-määrällä pidetään niitä Barthin elatusaineessa ja injektoidaan niihin mRNAtta sakkaroosigradienttijakeista noudattamalla oleellisesti menetelmää, jota on selostettu viitteessä (29). Plasminogeenin aktivaatto-rin erittyminen ruiskeen saaneista varhaismunasoluis-ta tutkitaan radiaalisella kaseinolyysilla (Nagamine et ai. (28)). Maksimaalinen TPA:n erittyminen havaitaan niissä munasoluissa, joihin on injektoitu ja-keita 21 - 23S.
b. cDNAtn synteesi ja molekyylikloonaus
HeLa-poly(A)-RNA, joka on rikastettu TPA-mRNA:n suhteen, kopioidaan cDNArksi. 8 pg 22 S mRNA:ta läm-pödenaturoidaan 2 min. 60°C:ssa 300 yl:ssa seosta, jossa on 50 mM Tris.HCl, pH 8,3, 75 mM KCl, 8 mM MgCl2, 1 tilavuus-% etanolia, 0,2 mM EDTA, 25 yg/ml oligo- 45 86746 dT.j2_.jg, 0,5 mM kutakin dNTP:tä ja 12 pCi /7^P/dCTP: tä (New England Nuclear). Liuos jäähdytetään 0°C:een ja lisätään natriumpyrofosfaattia (3 mM), DTT:tä (1 mM) ja 144 yksikköä käänteistranskriptaasia (Life Sciences Ltd). Kun seosta on inkuboitu 60 minuuttia 39°C:ssa, lisätään vielä 32 yksikköä käänteistranskriptaasia. Kun on inkuboitu 100 minuuttia, reaktio pysäytetään lisäämällä SDS:ää pitoisuuteen 0,2 % ja EDTArta pitoisuuteen 15 mM. /tx^^P/dCTPin liittyminen cDNArhan todetaan saostamalla reaktioseoksen eriä trikloorietikkahapol-la. 8 pg:sta RNA:ta syntetisoituu 1,15 pg cDNA:ta (14,4 %:nen kopioituminen). Vesifaasi uutetaan kahdesti klo-roformi-isoamyylialkoholiseoksella (24:1 tilavuusosina) ja sen jälkeen siitä poistetaan suola 4 ml:n Sephadex G50 fine-pylväässä (5 x 0,5 cm) sentrifugoimalla liuoksessa, jossa on 20 mM Tris.HCl, pH 9, 100 mM NaC.l ja 1 mM EDTA. Välisijatilavuusjakeet yhdistetään ja li sätään natriumhydroksidia pitoisuuteen 0,3 N. Kun seosta on pidetty 12 tuntia 20°C:ssa, lisätään suolahappoa pitoisuuteen 0,3N ja nukleiinihapot saostetaan lisäämällä 3 tilavuutta etanolia. Toinen säie syntetisoidaan 200 pl:ssa liuosta, jossa on 200 mM N-(2-hydroksietyyli)-piperatsiini-N'-etaani-sulfonihappoa (Hepes), pH 6,9, 30 mM KC1, 10 mM DTT, 10 mM MgCl2, öATP, dCTP, dTTP 0,5 mM kutakin ja 25 yksikköä Kle-now-palasta cDNA-mikrogrammaa kohti. Kun reaktioseos-ta on inkuboitu 2 tuntia 25°C:ssa, reaktio pysäytetään lisäämällä SDS:ää pitoisuuteen 0,1 % ja liuoksesta poistetaan suola 4 ml:n Sephadex G50 fine-pylväässä sentrifugoimalla liuoksessa, jossa on 30 mM natrium-asetaattia, pH 4,5, 0,2 mM NaCl, 3 mM ZnCl2 ja 0,1 % SDS. Välisijatilavuusjakeisiin lisätään 2,5 yksikköä/ ml S1-nukleaasia ja saatua liuosta inkuboidaan 30 minuuttia 37°C:ssa. Liuos uutetaan fenoli-kloroformi-isoamyylialkoholiseoksella (24:24:1, tilavuusosina) ja vesifaasin sisältämät nukleiinihapot saostetaan natriumkloridilla (0,3 M) ja etanolilla (3 tilavuutta).
32 « 86746 76 % /a P/dCTP:stä, joka on liittyneenä ensimmäiseen säikeeseen, pysyy trikloorietikkahapolla saostuvana S1-hajotuksen jälkeen, ja kun suoritetaan analyysi alka-lisessa agaroosigeelissä (30), havaitaan kaksisäikei-nen cDNA, jonka koko on 500 - yli 3000 emäsparia. Kak-sisaikeinen cDNA fraktioidaan koon perusteella 5 - 20 % sakkaroosigradientissa liuoksessa, jossa on 10 mM Tris.
HC1, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA ja 0,1 % SDS. Kun on sentrifugoitu 10 tuntia 12°C:ssa SW41-roottorissa 39 Kissa, kerätään yhteen ne jakeet, jotka sisältävät suurikokoisimman cDNAin (43 % koko näytteistä) ja saos-tetaan se lisäämällä natriumkloridia väkevyyteen 0,3 M, 5 yg/ml BSAita ja 3 tilavuutta etanolia. 25 ng koon mukaan fraktioitua cDNA:ta hännitetään dCillä viitteessä (31) kuvatulla tavalla 85 yl:n reaktiotilavuudessa, joka sisältää 450 yksikköä/ml terminaalista transferaasia, 0,1 M kaliumkakodylaattia, pH 7,5, 2 mM CoC^» 1 mM EDTA, 0,1 mM DTT ja 5 yM /a32P/dCTP (20 yCi). Kun reaktion on annettu edetä 3 minuuttia 30°C:ssa, se pysäytetään lisäämällä EDTA:ta pitoisuuteen 10 mM, SDS:ää 0,2 %:iin (paino/tilavuus) ja tRNA:ta pitoisuuteen 100 yg/ml. Liuos uutetaan kahdesti kloroformi-isoamyyli-alkoholiseoksella ja siitä poistetaan suola 5 ml:n Sepha-dex G50 fine-pylväässä liuoksessa, jossa on 20 mM Tris. HCl, pH 9, 100 mM NaCl ja 1 mM EDTA. Välisijatilavuus-jakeet yhdistetään ja nukleiinihappo saostetaan lisäämällä natriumkloridia pitoisuuteen 0,3 M, 25 yg/ml tRNAita ja 3 tilavuutta etanolia. 20 ng hännitettyä kaksisäi-keistä cDNA:ta liitetään emäspareiksi Pstl-kohdastaan dG-hännitetyn pBR322:n kanssa (60 ng) (32) 20 yl:ssa liuosta, jossa on 0,4 M NaCl, 10 mM Tris.HCl, pH 7,5, ja 1 mM EDTA, inkuboimalla 10 minuuttia 65°C:ssa, 2 tuntia 45°C:ssa, 2 tuntia 22°C:ssa ja jäähdyttämällä sen jälkeen hitaasti yön aikana 4°C:een. Yhteenlii-tetty cDNA sekoitetaan 0°C:ssa 100 yliaan transformointi-kelpoista E. coli HB101/LM1035-suspensiota (33).
47 86 746
Kun on inkuboitu 15 minuuttia 0°C:ssa ja 5 minuuttia 37°C:ssa, bakteerisuspensioon lisätään 1,9 ml LB-alustaa ja inkubointia jatketaan 2 tuntia 37°C:ssa.
Soluja viljellään LB-agarlevyillä, jotka sisältävät 10 ug/ml tetrasykliiniä. Näin saadaan 100 transformant-tia/ng vektoria uudelleenliittyneen vektorin tausta-frekvenssin ollessa 13 %. 5400 transformanttia poimi taan eristetyistä pesäkkeistä hammastikuilla 96 koloa sisältävien mikrotitrauslevyjen koloihin, joissa on 200 μΐ LB-alustaa ja 10 yl/ml tetrasykliiniä, kasvatetaan yön yli 37°C:ssa ja lisätään glyserolia 5 tilavuusprosentin pitoisuuteen ja säilytetään -80°C:een sulatettuina .
c. TPA-DNA-sekvenssien seulonta
Ihmisen kudosten sisältämän plasminogeenin akti-vaattorin cDNArn kaksi synteettistä oiiqonukleotidia d5 ' -GGCAAAGATGGCAGCCTGCAAG-3' ja d5'-GCTGTACTGTCTCAGGCCGCAG-3' (34) syntetisoidaan muunnetulla triesterimenetelmällä (35) , puhdistetaan käänteisfaasi-HPLC:1lä ja prepara- tiivisella polyakryyliamidielektroforeesilla. Oligonuk- 32 leotidit leimataan 5'-päästään /γ P/ATP:llä (New England Nuclear) käyttämällä T4-kinaasia niin, että ominaisak- g tiivisuudeksi tulee 1 x 10 cpm (Cherenkov)/pmol (10).
Mikrotiitterilevyt sulatetaan ja transformantti-viljelmät siirretään 6/8-ristikkoryhmitelmiin 82 mm:n Millipore HATF-nitroselluloosasuotimille ja plasmideja lisätään 12 tuntia LB-agarlevyillä, joissa on 10 yg/ml tetrasykliiniä ja 10 yg/ml kloramfenikolia. DNA kiinnitetään suotimiin täplittämällä jokaista suodinta Whatman 3M-paperille, joka on kyllästetty liuoksella, jossa on 10 % SDS, 3 minuuttia; -liuok
sella, jossa on 0,5 N NaOH ja 1,5 M NaCl, 5 minuuttia; liuoksella, jossa on 0,5 M Tris.HCl, pH 8, ja 1,5 M NaCl, 5 minuuttia; ja liuoksella, jossa on 2 x SSPE
48 8 6 7 4 6 (SSPE: 0,15 M NaCl, 10 mM NaH2PC>4, pH 7,4, 1 mM EDTA) 5 min (42). Suotimet kuivataan ilmassa ja sen jälkeen niitä paistetaan vakuumissa 80°C:ssa 2 tuntia. Kiinnittyneiden bakteeri jätteiden poistamiseksi suotimia pestään 2 tuntia 37°C:ssa liuoksella, jossa on 50 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA, 1 M NaCl ja 1 % SDS. Hybridisoin-ti ja pesu suoritetaan Wallace et al:n selostamalla menetelmällä (1981) käyttämällä kokeellisia suhteita, jotka vallitsevat nukleotidien pituuden, G + C-pitoisuuden ja Tm:n välillä, jotka on määritetty menetelmillä Suggs et ai. (45) ja Smith (46). Suotimia esihybridisoidaan (2 tuntia) ja sen jälkeen niitä hybridisoidaan (12 tuntia) 60°C:ssa 1,6 ml:ssa suodosta jossa on 900 mM NaCl, 60 mM NaH2PC>4, pH 7,4, 7,2 mM EDTA (6 x SSPE), 0,1 % (paino/tilavuus) kutakin BSA: ta, polyvinyylipyrrolidonia ja Ficoll 400 (5 x Denhardtin- liuos), 200 ug/ml tRNA ja 0,1 % (paino/tilavuus) SDS.
32
Kummankin P-leimatun oligonukleotidin seosta lisätään esihybridisointiliuokseen 0,3 pmol/ml. Hybridisoinnin jälkeen suotimia pestään 6 x SSC:ssä (SSC: 0,15 mM NaCl, 15 mM trinatriumsitraattia) 3 x 10 min 4°C:ssa ja 3 x 10 min 60°C:ssa. Kuivatut suotimet valotetaan Kodakin XB5 röntgenfilmillä (36 tuntia, -70°C) käyttämällä Dupontin vahvistusvarjostinta. Ne mikrotitraus-kolot, jotka antavat positiivisen hybridisoitumissignaa-lin, tunnistetaan ja näistä viljelmistä saadut yksittäiset pesäkkeet seulotaan uudestaan edelläkuvatulla tavalla siten, että hybridisoidaan kustakin näytteestä , o erikseen kopiosuodin käyttämällä hybridisoinnissa 63 C lämpötilaa ja pesemällä suotimet. Ne pesäkkeet, jotka osoittautuvat positiivisiksi kummassakin kokeessa, poimitaan alkuperäissuotimesta ja kasvatetaan yön yli 37°C:ssa LB-a 1 ust assa, jossa on 10 |ig/ml tetrasykliiniä. Yhdelle näistä pesäkkeistä annetaan nimi pW349F.
49 8 6 7 46
Plasmidivalmisteet saadaan käyttämällä muunnettua alkalista lysointimenetelmää (36), jota seuraa CsCl-ta-sapainosentrifugointi.
Plasmidin pW349F DNA analysoidaan pilkkomalla restriktioendonukleaaseilla PstI ja Bglll. Restriktio-jaksot ovat kooltaan odotettuja. Näin ollen vedetään se johtopäätös, että plasmidi pW349F (7,1 ke) sisältää ihmisen kudosten sisältämän plasminogeenin aktivaattorin rakennegeenin täydellisenä.
d. TPA-cDNA-kloonin DNA-sekvenssi (ks. kuva 11) TPA-cDNA-kloonin sekvenssi määritettiin käyttämällä Maxamin ja Gilbertin (10) sekä Sangerin (53) menetelmän yhdistelmää. Tulokset on esitetty kuvassa 11. Kun verrataan Pennica et al:n (7) julkaisemaan sekvenssiin, voidaan havaita vain yksi muutos, joka on nukleotidiasemassa 113 ja antaa aiheen muutokselle TPA:n presekvenssin aminohapon hiljaisessa asemassa (CTG~>CTA) .
Esimerkki 8: Plasmidien pJDB207/PH05-TPA(1 A) ja pJDB207/PHO5-TPAÄ· rakentaminen (kuvat 12 - 15) PH05-promoottori ja PH05-signaalisekvenssi liitetään kehykseen kypsää TPA:ta koodittavan sekvenssin kanssa. Rakenteeseen sisällytetään myös PH05:n transkription lopetussignaali.
a) M13mp9/PH05Bam-Sal:n rakentaminen (ks. kuva 12) 623 emäsparin mittainen BamHI-Sall-jakso, joka sisältää PH05-promoottorin (esimerkki 3a, kuva 3a), saadaan katkaisemalla 2 yg plasmidia pBR322/PH05Bam-Sal (ks. kuva 1) restriktioendonukleaaseilla BamHI ja Sali (Kumpikin Biolabsilta) noudattamalla valmistajan ohjeita. 2 yg yksisäikeisen faagivetorin M13mp9 rep-likoitunutta muotoa (RF) (23) leikataan samoilla entsyymeillä. Kumpikin DNA-valmiste sijoitetaan 0,6 %: so 867 46 seen pehmeäagaroosigeeliin, kuten seimerkissä 5 on selostettu. Plasmidista pBR322/PH05Bam-Sal saatu 623 emäsparin pala ja M13mp9:stä saatu 7,2 ke:n pala uutetaan esimerkissä 5c kuvatulla tavalla. 150 ng 623 emäsparin palaa ja 150 ng 7,2 ke:n Ml3mp9-DNA-palaa liitetään yhteen 4 tuntia 15°C:ssa käyttämällä 200 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs) liuoksessa, jossa on 60 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgC^/ 10 mM DTT ja 1 mM ATP. E. coli-kanta JM 101 transformoidaan Messingin kuvaamalla tavalla (23) ja 12 valkoista täplää poimitaan ja niille suoritetaan RF-plasmidin restriktioanalyysi (38). Kaikki analysoidut kloonit sisältävät 623 emäsparin jakson sijoittuneena M13mp9:n Bam-Sal-kohtaan. Valitaan yksi edustaja ja sille annetaan nimi M13mp9/PH05Bam-Sal (ks. kuva 12).
b) TPA-proteiinia koodittavan sekvenssin liittäminen PH05-signaalisekvenssiin 2 yg plasmidia pW349F (ks. esimerkki 7) katkaistaan Bglll-endonukleaasilla (New England Biolabs) valmistajan ohjeiden mukaan. DNA saostetaan etanolilla ja suspendoidaan uudestaan liuokseen, jossa on 6 mM Tris.HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 6 mM MgC^· DNA:n lovetut 3’-päät täytetään käyttämällä E. colin DNA-poly-meraasin Klenow-palasta. Reaktio tapahtuu 50 yltn kokonaistilavuudessa 30 minuutissa 37°C:ssa käyttämällä 2 yksikköä entsyymiä ja 80 |iM dATP, dGTP, dGTP ja dTTP. Inkubointi pysäytetään fenoliuutolla ja DNA saostetaan etanolilla.
2 yg RF-plasmidi-M1 3mp9/PH05Bam-Sal-DNA:ta leikataan restriktioendonukleaasilla Kpnl (Biolabs) valmistajan ohjeiden mukaan. DNA saostetaan etanolilla ja suspendoidaan uudestaan 10 yltään liuosta, jossa on 200 mM NaCl, 1 mM ZnSO^ ja 60 mM Na-asetaattia, pH
4,6. Lisätään yksi yksikkö S1-eksonukleaasia ja saatua seosta inkuboidaan 60 minuuttia 37°C:ssa. Reaktio 51 86 7 46 pysäytetään fenoliuutolla ja DNA saostetaan etanolilla ja suspendoidaan uudestaan 50 ui:aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl, pH 7,5, 1 mM MgCl2· Lisätään 10 yksikköä vasikan sisäelinten emäsfosfataasia (Boehringer) ja saatua seosta inkuboidaan 60 minuuttia 37°C:ssa ja sen jälkeen 60 minuuttia 65°C:ssa. DNA puhdistetaan DE52 (Whatman) ioninvaihtokromatografiällä (ks. esimerkki 9Aa) ja sen jälkeen saostetaan etanolilla.
1,5 ug BglII:lla katkaistua, Klenow DNA-polyme-raasilla käsiteltyä plasmidia pW349F (ks. edellä) liitetään yhteen 0,5 yg:n kanssa Kpnl:llä leikattua, SI: llä pilkottua ja fosfataasilla käsiteltyä M13mp9/PH05 Bam-Sal-DNA:ta 10 yl:n tilavuudessa käyttämällä 900 yksikköä T4 DNA-ligaasia edelläkuvatussa puskurissa paitsi, että käytetään 4 mM ATP:tä ja inkubointi tapahtuu 18 tunnissa huoneenlämpötilassa. E. coli JM101-solut transfromoidaan, valitaan 6 valkoistä täplää ja valmistetaan yksisäikeinen faagitemplaatti viitteessä (38) kuvatulla tavalla. 2,0 ke:n Bglll-jakson ja M13mP9-vektorin väliseen liitoksen DNA-sekvenssi määritetään käyttämällä dideoksiketjunkatkaisumenetel-mää (39). Käytetään seuraavaa oligodeoksinukleotidi-aluketta: 5' AGTATGGCTTCATCTCTC 3'
Oligodeoksinukleotidi syntetisoidaan fosfotriesteri-menetelmällä (40, 41). Se hybridisoituu PH05-promoot-torin alueella ja mahdollistaa pidentämisen E. colin DNA-polymeraasin Klenow-palasella halutun DNA-liitos-kohdan yli. Näin löydetään yksi oikea yhdistelmä, jossa on seuraava DNA-sekvenssiryhmitelmä (alkaa PH05-proteiinia koodittavan sekvenssin ATG:stä):
ATG TTT AAA TCT GTT GTT TAT TCA ATT TTA GCC GCT TCT TTG GCC AAT GCA GGA TCT_TAC_CAA_GTG
_ tarkoittaa PH05-proteiinia koodittavaa sekvenssiä ----- tarkoittaa TPA-proteiinia koodittavaa sekvenssiä Tämä rakenne on nimeltään M13mp9/PH05-TPA (kuva 12).
52 86746
Lyhennetyn PH05:n transkription päätösjakson rakentaminen (ks. kuva 13) 10 yg p31R-plasmidi-DNA:ta (ks. kuva 7) katkaistaan restriktioentsyymillä Smal, DNA uutetaan fenolilla ja saostetaan etanolilla. DNA suspendoidaan uudestaan väkevyyteen 0,5 mg/ml liuokseen, jossa on 10 mM Tris.
HC1, pH 8,0. 10 yg Smal:llä katkaistua DNA:ta pilkotaan 2 yksiköllä Bal31-endonukleaasia (BRL) 100 yl:ssa liuosta, jossa on 20 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 12 mM MgCl2, 12 mM CaCl2 ja 1 mM EDTA. DNA: s ta otetaan 0,3 Pg:n erä sen jälkeen, kun on inkuboitu 90, 120 ja 150 sekuntia 30°C:ssa, ja erät sekoitetaan välittömästi seokseen, jossa on 50 yl fenolia ja 60 yl TNE:tä. DNA uutetaan fenoli/kloroformilla ja saostetaan etanolilla ja sen jälkeen se suspendoidaan uudestaan väkevyyteen 100 yg/ml liuokseen, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 8,0. Jotta saataisiin selville Bal31:n suorittama eksonukleo-lyyttinen pilkkominen, 0,7 yg:n erät kunakin ajankohtana saatua DNA:ta pilkotaan Hindlllilla 3a analysoidaan agaroosi-geel ielektroforeesi Ha. Jatkoanalysoinnissa käytetään 90 sekunnin kohdalla otettua DNA:ta. 2,2 yg plasmidi-DNA:ta inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa 2,8 yksikön kanssa Klenow DNA-polymeraasia (polymeraasi I:n suuri jakso, BRL) 35 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2 ja 0,1 mM dNTP-laatuja.
3 yg Xhol-kytkijää (5'-CCTCGAGG-3', Collaborative Research) kinasoidaan 50 yl-.ssa liuosta, jossa on 6 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 4 mM DTT, 0,5 mM ATP ja 35 yksikköä T4 polynukleotidikinaasia (Boehringer), 30 minuuttia 37°C:ssa.
0,67 yg kinasoitua Xhol-kytkijää ja 0,4 yg Ball: llä käsiteltyä tylppäpäistä plasmidi-p31R-DNA:ta liitetään yhteen yön yli huoneenlämpötilassa 25 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP ja 450 yksikköä T4 DNA-ligaasia. Yh-teenliitetty DNA erotetaan kytkijäylimäärästä suoritta- 53 8 6 7 4 6 maila isopropanolisaostus 10 mM EDTA:n, 0,3 M natrium-asetaatin pH 6,0 ja isopropanolin (0,54 tilvauutta) läsnäollessa. Kun on inkuboitu 35 minuuttia huoneenlämpötilassa, DNA sentrifugoidaan pohjaan. Pelletti kuivataan ilmassa ja suspendoidaan uudestaan 17 yl: aan liuosta, jossa on 6 mM Tris pH 7,9, 150 mM NaCl, 6 mM MgCl2 ja 6 mM merkaptoetanolia. DNA:han liitetyt Xhol-kytkijät katkaistaan XhoI:llä, DNA saostetaan iso-propanolilla edelläkuvatulla tavalla ja liitetään yhteen renkaiksi. Kun on liitetty yhteen 6 tuntia 15°C:ssa 50 ylsssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP ja 600 yksikköä T4 DNA-ligaasia, lisätään 10 yl kutakin yh-teenliittämisseosta 100 ylraan kalsiumilla käsiteltyjä, transformointikelpoisia E. coli HB101-soluja (ks. esimerkki 4a).
24 amp pesäkettä kasvatetaan erikseen LB-alus-tassa, jossa on 100 mg/1 ampisilliiniä. Plasmidi-DNA (p3lR(XhoI) eristetään ja analysoidaan HaeIII-kat-kaisulla. Valitaan kaksi plasmidia ja päätösjakson nukleotidisekvenssi, joka on Xhol-kohdan vieressä, määritetään Maxamin ja Gilbertin menetelmällä (10). Sekvenssi on esitettu kuvassa 15.
d) PH05-TPA-yhdistelmägeenin siirtäminen hiivavekto-riin pJDB207 (ks. kuva 13) M13mp9/PH05-TPA:sta valmistetaan RF-plasmidival-miste edelläkuvatulla tavalla. 2 Pg tätä DNA:ta katkaistaan restriktioendonukleaasilla BamHI (Biolabs) ja Sali (Biolabs) ja 2,6 ke:n jakso eristetään elektroforeesilla matalalla sulavassa agaroosigeelissä (ks. esimerkki 5c). Vastaavalla tavalla valmistetaan 100 ng 134 emäsparin pituista Hindlll-XhoI-jaksoa plasmidista p31R(XhoI), joka jakso sisältää PH05:n päätösjakson. Lisäksi pilkotaan 1 yg plasmidia pJDB207 (22) BamHI:llä ja HindIII:lla ja 6,5 ke:n jakso eris- 54 86746 tetään elektroforeesilla matalalla sulavassa agaroosi-geelissä.
0,5 yg kutakin kolmea jaksoa liitetään yhteen yön yli 15°C:ssa 20 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP ja 200 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs). E. coli HB101 transformoidaan esimerkissä 4a kuvatulla tavalla ja valitaan ampisilliinille vastustsukykyiset pesäkkeet. Poimitaan neljä pesäkettä, valmistetaan plasmidi-DNA (käyttäen esimerkissä 2 kuvattua menetelmää) ja DNA analysoidaan käyttämällä kiintopisteinä seuraavia restrktiokohtia: BamHI, Hindlll ja BstEII. Kaikki eristetyt DNA-laadut havaitaan oikeiksi. Yhdelle plasmidille annetaan nimi pJDB207/PHO5-TPA(1A).
e) Plasmidin pJDB207/PHO5-TPAA rakentaminen (ks. kuva 14) 10 Vig kaksisäikeistä M1 3mp9/PH05-TPA:n DNA:ta pilkotaan Sällillä. DNA uutetaan fenolilla ja saostetaan etanolilla ja suspendoidaan sen jälkeen väkevyyteen 0,5 mg/ml liuokseen, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 8,0. Pilkkominen Bal31:llä suoritetaan oleellisesti ottaen esimerkissä 8c) kuvatulla tavalla ja lisätään Xhol-sidoksenmuodostajat. Suoritetaan E. coli-kannan JM101 transformointi, RF-DNA eristetään ja Xhol-kytkijän paikka määritetään dideoksisekvenssinmääritysmenetelmällä (39) käyttämällä oligodeoksinukleotidialuketta 5'-GAACGGTAGGTATTGATTG-3'.
M13-johdannaisille, joissa on Xhol-sidoksenmuodos-taja eri asemissa, annetaan nimet
Ml 3mp9/PH05-TPA (Xhol-l) M13mp9/PH05-TPA (XhoI-2) M13rap9/PH05-TPA (XhoI-3) M13mp9/PH05-TPA (Xhol-4) 55 86 746
Xhol-kytkijoiden paikat 1-4 ovat seuraavat: 2 CGACC(fTGA jCCAGGAACACCCGACTCCTCAAAAGCAAATGAGATCC-i-CGCCTCTTCTTCTTCA 1 3 4
GAAGACACTgJ-CAAAGG-I-CGCAGTGJ-CTTCTCT
TGA| TPA:n luennanlopetuskodoni 1, 2, 3, 4 Xhol-kytkijän (51-CCTCCAGG-3') sijaintipaikat 2 yg kustakin edellämainitusta M13-johdannai-sesta /M13mp9/PH05-TPA(XhoI-1-4)/ saatua RF-DNA:ta pilkotaan BamHI:llä ja Xholrllä ja 2,5 ke:n jakeet eristetään matalalla sulavassa agaroosigeelissä käyttämällä elektroforeesia (ks. esimerkki 5c). Vastaavasti 2 yg 31R (XhoI)-DNA:ta pilkotaan Xholrllä ja Hindlllrlla ja 134 emäaparin jakso eristetään. 2 yg hiivaplasmidin pJDB207 DNA:ta pilkotaan BamHIrllä ja Hindlllrlla ja 6,5 ke:n jakso eristetään edelläkuvatulla tavalla. Näitä kolmea jaksoa liitetään yhteen 15 °C:ssa 15 tuntia ja E. coli HB101-transformoidaan am-pisilliinille vastustuskykyiseksi. Plasmidi-DNA eristetään 12 pesäkkeestä ja rakenteet todetaan suorittamalla restriktioanalyysi Hindlllrlla, Xholrllä ja BamHI: llä. Neljästä kloonauskokeesta otetaan pesäkkeet talteen ja niille annetaan nimet PJDB207/PH05-TPAA 1. pJDB207/PH05-TPAA 2, PJDB207/PH03-TPAA 3, PJDB207/PH05-TPAA A.
56 8 6 7 4 ό
Esimerkki 9: Plasmidin p31RL/TPA(12-2) rakentaminen (kuva 16) PH05-promoottorin ja kypsää TPA:ta koodittavan sekvenssin liitoskohta valmistetaan synteettisestä oligodeoksinukleotidista. Plasmidia, joka sisältää tämän oligodeoksinukleotidikytkijän PH05-promoottorin 3'-päässä, käytetään vastaanottaja-DNA:na kypsän TPA:n sekvenssiä kloonattaessa.
A. Vastaanottajaplasmidin p31RL valmistaminen (kuva 16): a) Plasmidin p31R pilkkominen EcoRI:llä ja emäsfos-fataasilla 3 ug plasmidin p31R-DNA:ta (ks. esimerkki 6e) pilkotaan 6 yksiköllä restriktioendonukleaasia EcoRI 60 minuuttia 37°C:ssa valmistajan suositusten mukaan (Boehringer). Kun pilkkoutuminen on tapahtunut täydellisesti, näytettä kuumennetaan 10 minuuttia 65°C: ssa entsyymin inaktivoimiseksi. Lisätään 0,05 tilavuutta 1 M Tris.HCl pH 8,0 ja 2 yksikköä vasikan sisäelinten emäsfosfataasia. Seosta inkuboidaan 60 minuuttia 37°C:ssa ja sen jälkeen 1 tunti 65°C:ssa, jotta fosfa-taasi inaktivoituu lämmön vaikutuksesta. DNA puhdistetaan DE52-ioninvaihtokromatografiällä (Whatman). DNA adsorboidaan DE52:een (pakatun kolonnin tilavuus 100 ui silikonoidussa Pasteurin pipetissä) vähäsuolaisessa puskurissa (150 mM NaCl, 10 mM Tris.HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) ja se eluoidaan paljon suolaa sisältävällä puskurilla (1,5 M NaCl, 10 mM Tris.HCl. 1 mM EDTA). Eluoi-tunut DNA saostetaan etanolilla ja suspendoidaan uudestaan väkevyyteen 0,15 mg/ml liuokseen, jossa on 10 mM Tris.HCl, pH 8,0.
b) Kemiallisesti syntetisoidun DNA-kytkijän liittäminen EcoRI:llä ja emäsfosfataasilla käsiteltyyn p31R:ään 57 86 7 46
Oligodeoksinukleotidi, jonka kaava on seuraava 5'-GAATTCCATGGTACCATGGAATTC-3' syntetisoidaan fosfotriesterimenetelmällä (Itakura et ai. (40i, de Rooij et ai. (41)). Oligodeoksinukleotidin sekvenssi on itsekomplementaarinen. Pariuttamalla saadaan kaksisäikeinen DNA-kytkijä, jossa on 24 emäsparia.
5 yg synteettistä oligodeoksinukleotidia fosforyloi- daan 5'-päistään 7,5 yCiillä /γ-3^Ρ/-ΑΤΡ:tä (5000 -1
Ci.mmol , Amersham) 50 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2/ 4 mM DTT, 0,5 mM ATP ja 35 yksikköä T4 polynukleoitdikinaasia (Boehringer), 30 minuuttia 37°C:ssa. Sitten seosta inkuboidaan vielä 5 minuuttia 75°C:ssa ja sen jälkeen sen annetaan jäähtyä huoneenlämpötilaan ja varastoidaan -20°C:ssa.
2,5 yg radioaktiivisesti fosforyloitua, pariu-tettua DNA-kytkijää liitetään yhteen itsensä kanssa yön aikana 6 C:ssa 50 ylrssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 3,5 mM ATP, 5 mM DTT ja 2000 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs). T4 DNA-ligaasi inakti-voidaan inkuboimalla 10 minuuttia 65°C:ssa. Näin saadut DNA-kytkijän multimeerit pilkotaan restriktio-endonukleaasilla EcoRI 60 ylrssa liuosta, jossa on 100 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgC^, 50 mM NaCl ja 55 yksikköä EcoRI (Boehringer) (60 minuuttia, 37 °C:ssa). Reaktio pysäytetään jäädyttämällä näyte nes-tetypellä.
0,5 yg fosforyloitua, EcoRI:llä pilkottua DNA:ta liitetään yhteen EcoRI:llä ja emäsfosfataasilla pilkotun p31R:n kanssa 3 tuntia 15°C:ssa 10 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl,,, 1 mM ATP, 5 mM DTT ja 300 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs). 4 yl:n erät yhteenlittämisseosta lisätään 100 yl:aan kalsiumilla käsiteltyjä, transformointikelpoisia E. coli HB 101-soluja (ks. esimerkki 4a).
£ 4 transformoitunutta, amp -pesäkettä kasvatetaan 58 8 6 7 46 erikseen LB-alustassa, jossa on 100 yg/ml ampisilliiniä. Plasmidi-DNA valmistetaan menetelmällä Holmes et ai.
(26) ja analysoidaan Kpnl- ja Smal/BamHI-katkaisuilla.
Yksi klooni, joka katkeaa Kpnl-endonukleaasilla, ja joka antaa odotetut restriktiojaksot Smal/BamHI-kak-soiskatkaisussa, valitaan jatkotutkimuksiin ja sille annetaan mini p31RL.
Plasmidi p31R voidaan korvata plasmidilla p31Y tai millä tahansa seuraavista esimerkissä 6c mainituista plasmideista: p31P, p31V, p3lL, p3lN, p31C, p3lH, p31S, p31k tai p31l. EcoRI:llä pilkottu, defosfory-loitu p31Y-DNA liitetään fosforyloituun, EcoRIrllä pilkottuun DNA-kytkijään. Transformointi ja amp -pesäkkeiden analysointi suoritetaan edelläkuvatulla tavalla. Valitaan yksi klooni, jossa on odotetut restriktiojaksot, ja sille annetaan nimeksi p31YL.
B. TPA-DNA:n liittäminen plasmidiin p31RL (kuva 16): a) Plasmidin p3lRL pilkkominen NcoI:llä: 5 yg p31RL-DNA:ta pilkotaan restriktioendonukle-aasilla Ncol valmistajan suositusten mukaan (Biolabs). Täydellisen pilkkomisen jälkeen liuoksesta poistetaan proteiini fenoli/kloroformiuutolla ja DNA väkevöidään etanolisaostuksella. DNA liuotetaan uudestaan väkevyyteen 0,25 mg/ml liuokseen, jossa on 10 mM Tris.
HC1 pH 8.
b) Klenow-DNA-polymeraasin reaktio NcoI:llä katkaistun p31RL-DNA:n kanssa: 5 yg NcoI:llä pilkottua p31RL-DNA:ta inkuboidaan 100 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 32 mM MgC^/ 0,4 yM dATP:tä, 30 yCi /a- P/-dATP:tä, 0,1 mM dTTP:tä, 0,1 mM dCTP:tä, 0,1 mM dGTP:tä ja 8 yksikköä Klenow-l)NA-pol ymcr.i.is i a (suuri jakso; BRL) .
Kun on inkuboitu 15 minuuttia huoneenlämpötilassa, lei-maamattoman dATP:n väkevyys nostetaan pitoisuuteen 0,1 I! 59 86 7 46 mM. Inkubointia jatketaan vielä 45 minuuttia huoneenlämpötilassa. Reaktio pysäytetään fenoli/kloro-formiuutolla. DNA väkevöidään etanolisaostuksella ja liuotetaan uudestaan väkevyyteen 0,25 mg/ml liuokseen, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 8.
Vaihtoehtona reaktioille a) ja b) voidaan p31RL-DNA käsitellä myös restriktioendonukleaasilla Kpnl ja T4 DNA-polymeraasilla, kuten reaktiossa c) ja d) on selostettu: c) Plasmidin p3lRL pilkkominen Kpnlrllä 10 yg p3lRL-DNA:ta pilkotaan täysin valmistajan ohjeiden mukaan (Biolabs). Seos uutetaan fenoli/klo-roformilla. DNA saostetaan etanolilla ja liuotetaan uudestaan väkevyyteen 0,4 mg/ml liuokseen, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 8,0 ja 0,1 mM EDTA.
d) T4-DNA-polymeraasin reaktio Kpnl:llä pilkotun p31RL-DNA:n kanssa: 9 yg Kpnl:llä pilkottua p31RL-DNA:ta inkuboidaan 2,5 minuuttia 37°C:ssa 10 yksikön kanssa T4 DNA-poly-meraasia (42) 100 yltssa liuosta, jossa on 33 mM Tris. asetaattia pH 7,9, 66 mM kaliumasetaattia, 10 mM mag-nesiumasetaattia ja 0,5 mM DTT (tasoitusvaihe). Tasoitetun DNA-säikeen uucfelleensynteesi suoritetaan 200 yl:n tilavuudessa, jossa on 33 mM Tris-asetaattia pH 7,9, 66 mM kaliumasetaattia, 10 mM magnesiumasetaat-tia, 0,5 mM DTT, 0,4 μΜ dATP, 30 yCi /a-32P/-dATP, 0,1 mM dTTP, 0,1 mM dCTP ja 0,1 mMdGTP. Kun on inku-boitu 18 minuuttia 37°C:ssa, leimaamattoman dATP:n väkevyys nostetaan pitoisuuteen 0,1 mM ja inkubointia jatketaan vielä 35 minuuttia 37°C:ssa. Reaktio pysäytetään fenoli/klorofromiuutolla. DNA saostetaan etanolilla ja liuotetaan uudestaan väkevyyteen 0,4 mg/ml liuokseen, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 8.
60 86746 e) Lineaarisen, DNA-polymeraasilla käsitellyn p31RL-plasmidi-DNA:n pilkkominen Smalillä 4,5 yg NcoI:llä ja Klenow-DNA-polymeraasilla käsiteltyä p31RL-DNA:ta (esimerkki 9Bb) tai 4 yg Kpnl:llä ja T4-DNA-polymeraasilla käsiteltyä p31RL-DNA:ta (esimerkki 9Bd) pilkotaan täysin restriktio-endonukleaasilla Smal. Reaktiot pysäytetään fenoli/ kloroformiuutolla. DNA saostetaan etanolilla ja sus-pendoidaan uudestaan 100 yliaan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl pH 8,0.
f) 4,3 kein suurten DNA-jaksojen eristäminen ja de-fosforylointi 1,4 yksikköä vasikan sisäelinten emäsfosfataasia (Boehringer) lisätään kuhunkin DNA-näytteeseen. Näytteitä inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa ja sen jälkeen 1 tunti 65°C:ssa entsyymin inaktivoimiseksi. Seosten suolapitoisuus säädetään määrään 150 mM NaCl ja DNA puhdistetaan DE52-ioninvaihtokromatografiällä esimerkissä 9Aa kuvatulla tavalla. DNA saostetaan etanolilla ja liuotetaan uudestaan 45 yliaan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 8.
Suuret 4,3 kein DNA-jaksot eristetään preparatiivi-sella 0,8 %:sella agaroosigeelillä, joka on tehdy Tris-boraatti-EDTA:han pH 8,3, leikkaamalla irti geelipalat, jotka sisältävät DNAin. Kunkin geelipa-lan sisältämä DNA elektroeluoidaan erikseen dialyysi-pussissa, jossa on 1,5 ml 5-kertaisesti laimennettua Tris-boraatti-EDTA-puskuria pH 8,3. Suljetut pussit upotetaan Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. Kun on pidetty 30 minuuttia 100 mA:n virrassa, sen polaarisuus käännetään 45 sekunniksi, jotta DNA saadaan irroitetuksi dialyysikalvosta. Dialyysissä geelipalaa ympäröinyt puskuri otetaan talteen, sen pitoisuudeksi säädetään 150 mM NaCl ja lasketaan DE52 (Whatman) ioninvaihto-pylvään läpi. DNA eluoidaan paljon suolaa sisältävällä 61 86746
puskurilla (1,5 M NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 8,0 ja 1 mM EDTA), saostetaan etanolilla ja liuotetaan uudestaan väkevyyteen 0,2 mg/ml liuokseen, jossa on 10 mM Tris pH
8,0. DNA-jaksoille annetaan nimi p31RL&.
Reaktiot a) - f) voidaan myös suorittaa vastaavalla tavalla käyttämällä p31YL-DNA:ta p31RL-DNA:n tilalla, jolloin saadaan p31 YL-Δ DNA-jaksot.
g) Plasmidin pW349F pilkkominen Ballrllä
Plasmidi pW349F sisältää ihmisen kudosten sisäl-tämäm plasminogeenin aktivaattorin rakennegeenin kloonattuna plasmidin pBR322 Pstl-kohtaan (ks. esimerkki 7c).
Jotta saataisiin valmistetuksi plasmidi-DNA:ta, siir-rostetaan yksi plasmidilla pW349F transformoitunut E. coli HB101-pesäke 100 ml:aan LB-alustaa, jossa on 10 mg/ml tetrasykliiniä. Viljelmää ravistellaan yön yli 37°C:ssa nopeudella 200 1/min. Plasmidi-DNA valmistetaan esimerkissä 2 kuvatulla tavalla.
10 yg pW349F-plasmidi-DNA:ta pilkotaan 2 tuntia 37°C:ssa 10 yksiköllä restriktioendonukleaasia Ball (BRL) 200 yl:ssa liuosta, jossa on 6 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM NaCl, 6 mM MgC^, 6 mM 2-merkaptoetanolia ja 0,1 mg/ml naudan seerumialbumiinia. Kun pilkkoutuminen on tapahtunut täydellisesti, liuoksesta poistetaan proteiini fenoli/kloroformiuutolla. DNA saostetaan etanolilla ja suspendoidaan uudestaan väkevyyteen 0,2 mg/ml liuokseen, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 8,0.
Xhol-kytkijoiden liittäminen Ball:llä leikatun DNA:n tylppiin päihin on valinnaista ja sen tarkoitus on saada aikaan edullinen kloonauskohta jatkorakentamista silmällä pitäen.
h) Ball:llä pilkotun pW349F-DNA:n katkaisu Bglllrlla 4 yg Ball:llä pilkottuapW349F-DNA :ta katkaistaan restriktioendonukleaasilla Bglll valmistajan ohjeiden mukaan (Biolabs). Täydellisen pilkkoutumisen jälkeen 62 86746 proteiinit uutetaan fenoli/klorofromilla. DNA seostetaan etanolilla ja liuotetaan uudestaan väkevyyteen 0,2 mg/ml veteen.
i) Klenow-DNA-polymeraasin ja S1-nukleaasin rajoitettu reaktio Bglll-katkaisukohdassa: 4 yg Ball:llä ja BglII:lla katkaistua pW349F-DNA:ta inkuboidaan 30 minuuttia huoneenlämpötilassa 100 jjl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgC^, 0,1 mM dATP ja 0,1 mM dGTP ja 8 yksikköä Klenow-DNA-polymeraasia. Reaktio pysäytetään lisäämällä EDTA:ta lopulliseen väkevyyteen 10 mM. Proteiini uutetaan fenoli/kloroformilla. DNA saostetaan etanolilla ja suspendoidaan uudestaan väkevyyteen 0,2 mg/ml veteen.
Pilkkomista jatketaan S1-nukleaasilla 30 minuuttia 37°C:ssa 50 yl:ssa liuosta, jossa on 30 mM natrium-asetaattia pH 4,6, 200 mM NaCl, 1 mM ZnSO^ ja 1,5 yksikköä S1-nukleaasia (Sigma). DNA uutetaan fenoli/klorofromilla ja saostetaan etanolilla ja liuotetaan uudestaan 45 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 8,0.
k) 1,86 ke:n Bglll-Ball-restriktiojakson eristäminen: 1,86 ke:n Bglll-Ball-DNA-jakso, jonka Bglll-restriktiokohta on muunnettu tylppäpäiseksi Klenow-DNA-polymeraasilla ja S1-nukleaasilla edelläkuvatulla tavalla, eristetään preparatiivisella 0,8 %:sella aga-roosigeelillä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-pusku-riin pH 8,3. DNA otetaan talteen geelipaloista elektro-eluutiolla, kuten esimerkissä 9Bf on selostettu.
l) 1,86 ke:n DNA-jakson kloonaus sopivaan vastaanottaja-DNA:hän: 0,3 yg 1,86 ke:n tylppäpäistä DNA-jaksoa (ks. esimerkki 9Bk) liitetään 0,6 yg:aan plasmidia p31RLA (ks. esimerkki 9Bf). Reaktio suoritetaan 20 tunnissa 15°C:ssa 63 B 6 7 4 6 10 ulissa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgC^» 5 mM DTT, 3,5 mM ATP ja 400 yksikköä T4-DNA-ligaasia (Biolabs).
3 μ1:η tai 6 μ1:η erät liittämisseosta lisätään 100tl:aan kalsiumilla käsiteltyjä, transformointikel-poisia E. coli HB101-soluja (ks. esimerkki 4a).
48 transformoitunutta, amp -pesäkettä kasvatetaan erikseen LB-alustassa, jossa on 100 ug/ml ampisillii-niä. Plasmidi-DNA valmistetaan menetelmällä Holmes et ai. (26) ja analysoidaan EcoRI-katkaisulla. 12 kloo nissa on 1,86 ke:n jakso liittyneenä oikeassa suunnassa. Nämä kloonit analysoidaan tarkemmin määrittämällä PH05-promoottorin ja TPA-rakennegeenin välisen liitoskohdan sekvenssi. Käytetään synteettistä oligodeoksinukleoti-dia, joka hybridisoituu lähelle PH05-promoottorin mRNA:n aloituskohtaa ja mahdollistaa liitoskohdan alapuolella olevan alueen sekventoinnin. M13:n käänteisiä priimeri- aloitusolosuhteita (43) käytetään kaksisäikeisen plas-midi-DNA:n denaturoinnissa ja synteettisen oligodeoksi-nukleotidin hybridisoinnissa. DNA-sekvenssin määritys suoritetaan viitteessä (39) kuvatulla tavalla:
Kahdessa kloonissa on seuraava oikea liitoskohdan sekvenssi:
> PH05 mRNA
GAATA AGAACAACAACAAATAGAGCAAGCAAATTCGGAATTCC ATG TCT_TAC_CAA .....
Met Ser Tyr Gin........
> PH05-mTNA:n alku
_ PH05 DNA
........ DNA-kytkijä
-------- TPA DNA
64 867 46 Nämä kloonit ovat identtisiä ja niille annetaan nimeksi p31RL/TPA(12-2).
Esimerkki 10: Geenirakenteiden alakloonaus suuren kopiomäärän tuottavaan hiivavektoriin pJDB207 (ks. kuva 17)
Esimerkissä 9 kuvattu rakenne sisältää PH05-pro-moottorin ilman signaalisekvenssiä, TPA:ta kooditta-van alueen ja PFI05:n transkriptionpäätössignaalit perä-järjestyksessä liitettyinä pBR322:sta johdettuun vektoriin. Hiivassa tapahtuvaa ilmentymistä varten koko liitännäinen alakloonataan hiivavektoriin pJDB207 (22) valitsemalla leusiinille prototrofiset pesäkkeet.
2 yg p31RL/TPA(12-2)-DNA:ta pilkotaan restriktio-endonukleaaseilla Sali ja Hindlll. Restriktiofragmen-tit erotetaan preparatiivisella 0,8 %:sella matalalla sulavalla agaroosigeelillä ja pieni 2,8 ke:n jakso leikataan irti geelistä.
5 yg pJDB207-DNA:ta katkaistaan restriktioendo-nukleaaseilla Sali ja Hindlll. Suuri 6,2 ke:n jakso eristetään preparatiivisesta 0,8 %:sesta matalalla sulavasta agaroosigeelista. DNA-jaksot sisältävät geeli-palat nesteytetään 65°C:ssa ja laimennetaan vedellä niin, että agaroosipitoisuudeksi tulee 0,3 %.
2,8 ke:n Sall-Hindlll-jakso (plasmidi p3lRL/TPA (12-2)) sekoitetaan ekvimolaarisen määrän kanssa 6,2 ke:n Hindlll-Sall-jaksoa (pJDB207). Yhteenliittämi-set suoritetaan 100 yl:ssa liuosta 4 tunnissa 15°C:ssa.
10 ulilla liittämisseosta transformoidaan transformointi-kelpoiset E. coli HBl01-solut esimerkissä 4a kuvatulla p tavalla. Kustakin kokeesta kasvatetaan useita amp -pesäkkeitä erikseen LB-alustassa, jossa on 100 yg/ml ampi-silliiniä. Plasmidi-DNA:sta analysoidaan liitännäisen koko suorittamalla katkaisu restriktioendonukleaasei11a Hindlll ja Sali. Yhdelle kloonille, jossa on oikea liitännäinen, annetaan nimi pJDB207/PHO5-TPA(12-2).
65 86746
Esimerkki 11: Saccharomyces cerevisiae GRFl8:n trans- formointi
Kukin plasmideista pJDB207/PHO5-TPA(1 A) , pJDB207/ PH05-TPA A 1, pJDB207/PHO5-TPAA2, pJDB207/PHO5-TPA A* 3, pJDB207/PHO5-TPAA4 ja pJDB207R/PHO5-TPA(12-2) siirretään Saccharomyces cerevisiae GRF18-kantaan (a, his3-1y, his-3-15, leu2-3, leu2-112,can) käyttämällä transformoinnissa menetelmää Hinnen et al. (12). 1 yg kutakin plasmidi- DNA:ta lisätään 100 yl:aan sferoplastisuspensiota ja seos käsitellään polyetyleeniglykolilla. Sferoplastit sekoitetaan 10 ml:aan regenerointiagaria ja kasvatetaan levyillä hiivan minimielatusaineessa ilman leusiinia.
Kun on inkuboitu 3 vuorokautta 30°C:ssa, saadaan 200 transformoitunutta solua.
Jokaisesta hiivan transformoinnista poimitaan yksi pesäke. Eri pesäkkeille annetaan nimet:
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05~TPA(IA),
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05~TPA/\ 1,
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05~TPA/\ 2,
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-TPA/\ 3,
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-TPA/\ 4 ja
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-TPA(12-2).
Hiivasoluja kasvatetaan 30°C:ssa 10 ml:ssa hiivan minimielatusainetta 100 ml:n Erlenmeyer-pullossa ravistelemalla 24 tuntia, kunnes solutiheys on saavuttanut arvon noin 2 - 3 x 10^ solua/ml. Solut pestään kerran 20 ml:lla matala-P.-minimialustaa. 3 ml:lla uudelleen- suspendoituja soluja ympätään 300 ml matala-P^-mini-mialustaa ja 300 ml normaalia minimialustaa vastaavasti 1000 ml:n Erlenmeyer-pulloissa. Inkubointi suoritetaan 30°C:ssa nopeudella 160 1/min. PH05-promoot-torin indusoitumista seurataan mittaamalla happofosfataa-siaktiivisuus kokonaisista soluista menetelmällä Toh-e et ai. (44). Solut kasvatetaan pitoisuuteen noin 1- 2 x 7 66 86 746 10 solua/ml (26 - 30 tunnin inkubointi) .
Esimerkki 12: Hiivasolu-uutteiden valmistua ja 1 r'\~ aktiivisuuden määrittäminen 35 ml:ssa matala-P.-kasvualustaa (48) tiheyteen 7 1 1-2x10 /ml kasvatetut solut otetaan talteen sent-rifugoimalla Sorvali SS34-roottorissa 10 minuuttia nopeudella 3000 1 /min. Solut pestään pusku ·: i ssa . ΊΟ" on kasvuliuoksen suolat (so. ei aminohappoja, olu..jos -vitamiineja, hivenaineita). Solut sentrifugoida n huoneenlämpötilassa 5 minuuttia nopeudella 3000 "/min. Laskeutuneet solut suspendoidaan uudestaan 4 ml:n kokonaistilavuuteen kylmää liuosta, jossa un 66 mM nai rium-fosfaattipuskuria pH 7,4 ja 0,1 tilavuus-% Triton X-100. Solususpensio siirretään 30 ml:n Corex-putveen, lisätään 8 g lasihelmiä ( halkaisija 0,4 mm) ja suspensiota ravistellaan Vortex Mixerissä (Scientific Instruments Inc., USA) täydellä nopeudella 4 minuuttia ja sen jälkeen jäähdytetään jäähauteella. Tällä tavalla rikkoutuu yli 90 ° soluista. Rikkoutunut solu-materiaali ja lasihelmet sentrifugoidaan pohjaan 10 minuutissa nopeudella 8000 1/min 4°C:ssa Sorvali HB-4-roottorissa. Emäliuos siirretään Eppendorf-putkiin, jäädytetään nestetypellä ja säilytetään -60°C:ssa.
TPA-aktiivisuus määritetään Ränbyn menetelmällä (49) hieman muuntaen. Substraattina käytetään D-Val-Leu-Lys-pNA:ta (Kabi S-2251). Adsorptio allonpituu-dessa 405 nm korjataan epäspesifisen katkaisun suhteen ja suhteutetaan urokinaasistandardiin. Saadut tulokset on esitetty taulukossa 2.
67 β 6 7 4 6
Taulukko 2: Eri yhdistelmäplasmidei11a transfor moituneiden S. cerevisiae GRF18-kantojen TPA-aktii-visuus TPA-aktiivisuus (yksikkö/1 hiiva- soluviljelmää/OD^.-)
6UU
plasmidi kitketty pääl- kytketty päälle __(korkea ΡΊ·) (iriatala P^) pJDB207R/PH05-TPA(12-2) 60 pJDB207/PH05-TPA(IA) 20 625 PJDB207/PH05-TPA Λ 1 - 600 pJDB207/PH05-TPA Λ 2 - 700 PJDB207/PH05-TPAA 3 - 650 PJDB207/pH05-TPAA A - 625
Esimerkki 13: Sellaisen plasmidin rakentaminen, jossa on tarkka liitoskohta PH05-signaalisekvenssin ja kypsää TPA:ta koodittavan alueen välillä (kuva 18).
Tällä rakentamisella saadaan aikaan oikea liitos PH05:n signaalisekvenssin ja kypsää TPArta koodittavan sekvenssin välille käyttämällä synteettistä oli-godeoksinukleotidia. Mukavuussyistä plasmidin pJDB207/PHO5-TPAΔ2 (ks. esimerkki 8e) relevantti alue alakloonataan plasmidiin p31 (ks. esimerkki 5).
a) Plasmidin p31/ΡΗ05-ΤΡΑΔ2 eristäminen: 2 |iq kutakin plasmidin pJDM207/PHO52^ 2 ja p31 (ks. esimerkit 8e ja 5) pilkotaan restriktioendonukle-aaseilla Hindlll ja Sali. Täydellisen pilkkomisen jälkeen DNA-fragmentit erotetaan 0,6 %:sessa matalalla 68 86 7 46 sulavassa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. Geelistä leikataan pJDB207/PH05-TPA A 2:n 2,6 ke:n Hindlll-Sall-jakso ja p31:n 3,1 ke:n Hindlll-Sall-jakso. Geelipalat nestey-tetään 65°C:ssa ja laimennetaan vedellä niin, että aga-roosin pitoisuudeksi tulee 0,3 %. Kumpaakin jaksoa sekoitetaan keskenään ekvimolaariset määrät ja niitä liitetään yhteen 100 yl:ssa 4 tuntia 15°C:ssa. 10 yl: 11a littämisseosta transformoidaan transformointi-kelpoiset E. coli HB101-solut. Useita amp -pesäkkeitä analysoidaan. Yhdelle kloonille, jossa on oikea liitännäinen, annetaan nimi p31/ΡΗ05-ΤΡΑΔ 2.
Sama rakentaminen suoritetaan plasmideilla pJDB207/ PH05-TPA Δ1 , pJDB207/PHO5-TPA Δ3 ja pJDB207/PHO5-TPAA4 (ks. esimerkki 8e). Näin saaduille plasmideille annetaan nimet p31/PH05-TPA A 1, p31/PH05-TPA V3 ja p31/PH05-TPA A 4.
b) Plasmidin p31/PH05-TPA18 rakentaminen (kuva 18) 30 μg plasmidia p31/PH05-TPA Δ2 katkaistaan rest-riktioendonukleaasilla Xhol. Linearisoitu DNA uutetaan kloroformilla, saostetaan etanolilla ja liuotetaan uudestaan väkevyyteen 0,5 mg/ml liuokseen, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 8 (p31/PH05-TPA^2 .Xhol).
5 yg Xho:lla katkaistua DNA:ta pilkotaan vielä Ballrllä. Kun pilkkoutuminen on tapahtunut täydellisesti, DNA uutetaan kerran fenoli/kloroformilla, saostetaan 2,5 tilavuudella etanolia ja suspendoidaan uudestaan liuokseen, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 8. Rest-riktiofragmentit erotetaan 1,2 %:sella agaroosigeelillä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3.
Suuri 3,9 ke:n XhoI-Ball-fragmentti leikataan irti geelistä. DNA-fragmentti (jakso A, ks. kuva 18) otetaan talteen geelipalasta elektroeluutiolla ja ED52-ioninvaihtokromatografiällä, kuten esimerkissä 9Bf on selostettu. DNA sasotetaan etanolilla ja liuo- 6 9 8 6 7 4 6 tetaan uudestaan väkevyyteen 0,2 mg/ml liuokseen, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 8.
20 yg plasmidia p31 /PH05-TPA 2 . XhoI (ks. edellä) pilkotaan osittain (45 minuuttia, 37°C:ssa) restriktio-endonukleaasilla PstI (0,75 yksikköä/ug DNA:ta) 200 yl: ssa liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 6 mM MgC^, 50 mM NaCl, 6 mM merkaptoetanolia ja 0,01 mg/ml etidium-bromidia. Reaktio pysäytetään uuttamalla fenoli/klo-rofromilla. DNA saostetaan etanolilla ja liuotetaan uudestaan liuokseen, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 8. Restriktiofragmentit erotetaan 1,2 % agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. 1,6 ke:n XhoI-PstI-jakso (jakso B, ks. kuva 18), joka sisältää suurimman osan kypsää TPA:ta koodittavasta alueesta, otetaan talteen geelipalasta suorittamalla elektroeluutio edelläkuvatulla tavalla. DNA saostetaan etanolilla ja liuotetaan uudestaan liuokseen, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 8, väkevyyteen 40 yg/ml.
PH05-signaalisekvenssin ja kypsää TPA:ta koodattavan alueen välinen oikea liitoskohta saadaan aikaan synteettisellä kytkijällä, jonka kaava on [c] 5'-CCAATGCATCTTACCAAGTGATCTGCA-3' [d] 3’-GGTTACGTAGAATGGTTCACTAG -5’
Kahdeksan nukleotidia kytkijän 5'-päästä lukien (5'-CCAATGCA....) edustavat osaa PH05:n signaalisek-venssistä Ball kohdasta loppuun ja 19 nukleotidia täydentävät kypsän TPA:n sekvenssin koodittavan alueen 5'-päästä ensimmäiseen Pstl-kohtaan asti (ks. kuva 19). Oligodeoksinukleotidit C ja D syntetisoidaan fosfotri-esterimenetelmällä. Ne fosforyloidaan erikseen 5'-päistään, sekoitetaan keskenään yhtä suurina määrinä ja pariutetaan esimerkissä 9Ab kuvatulla tavalla.
60 ng (4 pmol) fosforyloitua, pariutettua DNA-kytkijää liitetään 16 tunnin ajan 15°C:ssa 0,4 ug:n (0,4 pmol) kanssa 1,6 ke:n XhoI-PstI-jaksoa (jakso B, 70 86 746 ks. edellä) 15 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris. HC1 pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 5 mM DTT ja 600 yksikköä T4 DNA-ligaasia. liigaasi inaktivoidaan kuumentamalla 10 minuuttia 85°C:ssa. Ylimääräinen kytkijä poistetaan saostamalla DNA liuoksessa, jossa on 10 mM EDTA, 300 mM natriumasetaattia pH 6,0 ja 0,54 tilavuutta isopropanolia. Multimeeriset kytkijät ja DNA-jakso pilkotaan Ball:llä ja XhoI:llä. Koska 1,6 ke:n Xhol-Pstl-jakson Pstl-kohtaan on liitetty kytkijä, muuttuu jakso Xhol-Ball-jaksoksi.
0,4 yg tätä 1,6 ke:n XhoI-Ball-DNA-jaksoa ja 1 yg 3,9 ke:n Xhol-Ball-jaksoa (jakso A, ks. edellä) liitetään yhteen 16 tuntia huoneenlämpötilassa 10 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 3,5 mM ATP, 5 mM DTT ja 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia.
Yhteenliittämisseosta lisätään 3 yl:n ja 7 yl:n erät 100 Eliaan kalsiumilla käsiteltyjä, transformointi-kelpoisia E. coli HB101-soluja (ks. esimerkki 4a).
10 transformoitunutta, amp -pesäkettä kasvatetaan erikseen LB-alustassa, jossa on 100 yg/ml ampisilliinia. Plasmidi-DNA valmistetaan menetelmällä Holmes et ai.
(26). Kloonit analysoidaan sekventoimalla kytkijä-alueen yli.
Yhdelle kloonille, jossa on oikeakehyksinen liitos PH05-signaalisekvenssin ja kypsää TPArta koo-dittavan alueen välissä (ks. kuva 19), annetaan nimi p31/PH05-TPA18.
Plasmidi p31/PH05-TPAΔ2 voidaan korvata p31/PH05-TPA Δ1:llä, p31/PH05-TPAΔ3:11a tai p31/PH05-TPAΔ4:llä. Rakentamiset suoritetaan edelläkuvatulla tavalla. Erityisesti yhdelle plasmidista p31 /ΡΗ05-ΤΡΑΔ3 johdetulle kloonille annetaan nimi p31/PH05-TPA42.
Esimerkki 14: Sellaisten plasmidien rakentaminen, jois sa on prepro-TPA:ta koodittava DNA (kuvat 20,21) PH05-promoottori liitetään prepro-TPA:ta koodit- 71 8 6 7 4 6 tavaan DNA-sekvenssiin. Preproalueen 35 aminohappoa koodattavaa nukleotidisekvenssiä seuraa kypsää TPA:ta koodittava sekvenssi.
a) TPA:n signaalisekvenssin sisältävän TPA:ta koodattavan alueen eristäminen (ks. kuva 20) 30 \ig plasmidia pW349F katkaistaan restriktioendo-nukleaasilla Bgll. Uutetaan fenoli/klorofromilla ja DNA saostetaan etanolilla ja pilkotaan vielä EcoRIillä ja BamHItllä. Restriktiofragmentit erotetaan 1 %:sessa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-pus-kuriin pH 8,3. Geelistä paikannetaan 0,9 ke:n Bgll-EcoRI-jakso ja kyseinen kohta leikataan irti. DNA otetaan talteen esimerkissä 9Bf kuvatulla elektroeluutiolla.
3,5 yg 0,9 ke:n Bgll-EcoRI-jaksoa pilkotaan täysin Hgalrllä, jolloin saadaan 3 fragmenttia. Seos uutetaan fenoli/klorofromilla ja DNA-jaksot saostetaan etanolilla. Hgal-katkaisussa syntyneet lomittaiset päät täytetään suorittamalla reaktio Klenow DNA-polymeraasin kanssa (1 yksikkö/yg DNA:ta) liuoksessa, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 MgCl2, 0,1 mM TTP, 0,1 mM dCTP ja 0,1 mM dGTP. Kun on inkuboitu 60 minuuttia 20°C:ssa reaktio pysäytetään etanolisaostuksessa. Tylppäpäiset DNA-jaksot sekoitetaan 40-kertaiseen molaariseen ylimäärään fosforyloitua, pariutettua EcoRI-kytkijää (Biolabs). Yhteenliittäminen suoritetaan 50 ylrssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP ja 2000 yksikköä T4 DNA-ligaasia, 16 tuntia 15 °C:ssa. Ylimääräiset kytkijämolekyylit poistetaan saostamalla DNA liuoksessa, jossa on 10 mM EDTA pH 7,5, 300 mM natriumasetaattia pH 6,0 ja 0,54 tilavuutta isopropanolia. DNA-jaksojen seos pilkotaan EcoRI:llä kyt-kijämul tUflteerien poistamiseksi ja sen jälkeen pilkotaan vielä Narlrllä. Täydellisen pilkkomisen jälkeen jaksot erotetaan 1 %:sessa agaroosigeelissä, joka on tehty 1 % : seen Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. Geelistä 72 86746 leikataan irti 446 emasparin EcoRI//HgaI/-NarI-jakso ja DNA otetaan talteen elektroeluutiolla (ks. esimerkki 9Bf) .
b) Sellaisen DNA-jakson eristäminen, joka sisältää TPArta koodittavan sekvenssin 3'-osan ja hiivan transkription lopetussignaalit (ks. kuva 20) 10 yg plasmidia p31/PH05-TPAΛ 2 katkaistaan HindIII:lla. DNA uutetaan fenoli/kloroformi1la ja saostetaan etanolilla ja liuotetaan uudestaan veteen väkevyyteen 0,1 mg/ml ja pilkotaan Narl:llä. Nämä restriktiofragmentit erotetaan 1%:sessa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. 1,4 ke:n Nar-HindIII-jakso erotetaan ja otetaan talteen agaroosigeelipalasta elektroeluutiolla (ks. esimerkki 9Bf) .
c) Sellaisen DNA-jakson eristäminen, joka sisältää vektorisekvenssejä ja PH05-promoottorin (ks. kuva 21) 5 yg plasmidia p3lR katkaistaan restriktioendo-nukleaaseilla Hindlll ja EcoRI. Restriktiofragmentit erotetaan 1 %:sessa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. 3,9 ke:n Hindlll-
EcoRI-DNA-jakso eristetään ja otetaan talteen agaroosigeelipalasta elektroeluutiolla.
d) Jaksojen yhteenliittäminen (ks. kuva 21) 0,3 pmol 3,9 ke:n Hindlll-EcoRIjaksoa, 0,3 pmol 1,4 ke:n Narl-Hindlll-jaksoa ja 0,6 pmol 446 e:n EcoRI-Narl-jaksoa liitetään yhteen 6,5 tuntia 15°C:ssa 12 uL: ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgC^» 1 mM ATP, 5 mM DTT ja 480 yksikköä T4 DNA-ligaa-sia. 5 yL aj 7 UL erät yhteenliittämisseosta lisätään 100 Ml:aan kalsiumilla käsiteltyjä, transformointi-kelpoisia E. coli HBl01-soluja (ks. esimerkki 4a).
23 transformoitunutta, amp -pesäkettä kasvatetaan 73 8 6 7 46 erikseen LB-alustassa, jossa on 100 ug/ml ampisillii-nia. Eri kloonien plasmidi-DNA analysoidaan Pstl-kat-kaisulla. Yhdelle kloonille, jossa on odotettu rest-riktiojaksoyhdistelmä, annetaan nimi p31R/SS-TPAA 2.
Plasmidi p31/PH05-TPAA2 voidaan korvata plasmi-dilla p31/PH05-TPAA 3 tai jollakin muulla esimerkissä 13a mainituista klooneista. Rakentamiset suoritetaan edelläkuvatulla tavalla. Yhdelle plasmidista p31/PH05-TPAA3 johdetulla kloonille annetaan nimi p31R/SS-ΤΡΑΛ3.
Esimerkki 15: Sellaisten plasmidien rakentaminen, jois sa PH05:n signaalisekvenssi ulottuu PH05:ttä koodit-tavalla alueelle (ks. kuvat 22 - 24)
Aina kun vieras DNA liitetään PH05:n signaalisek-venssiin, on signaalipeptidin katkaisukohdan läheisyydessä syntyvä aminohapposekvenssi erilainen kuin aidon PH05-proteiinin vastaava. Muutokset aminohapposekvenssissä saattavat vaikuttaa signaalipeptidaasin suorittaman proteiinin prosessoinnin tehokkuuteen. Tästä syystä seuraavissa rakentamistoimenpiteissä käytetään PH05:n signaalisekvenssiä, joka ulottuu kypsää happofosfataa-sia koodittavalle alueelle. Signaalisekvenssin jälkeen liitetään eri etäisyyksille kypsää TPA:ta koodittava alue kehykseen sellaisten synteettisten oligodeoksinukleo-tidikytkijoiden kautta, joissa on hiivan endopeptidaa-sin prosessointikohdat. Näistä kohdista tapahtuva katkaisu estää fuusioproteiinien muodostumisen.
a) Sellaisten PH05-sekvenssien alakloonaus, jotka ulottuvat kypsää happofosfataasia koodittavalle alueelle (kuva 22)
Eristetään sellaiset DNA-jaksot, joissa on PH05-promoottori, PH05:n signaalisekvenssi ja kypsää happo-fosfataasia koodittava sekvenssi eri pituuksina. Rsal:n katkaisukohdat sijaitsevat kohdissa 595, 637, 811 ja 74 86746 1312 BamHI-kohdan alapuolella (48). Koska PH05:n signaalisekvenssi ulottuu asemaan 592, eri Rsal-koh-dat sijaitsevat emäskohdissa 3, 45, 219 ja 720 kypsää happofosfataasia koodittavassa sekvenssissä vastaavasti. BamHI-RsaI-jaksot alakloonataan synteettisen oligo-deoksinukleotidin kautta muuttamalla Rsal-kohta Xbal-kohdaksi.
Plasmidin pJDB207/PH05,PH03 DNA (ks. esimerkki 2) katkaistaan BamHI:llä ja Hpal:llä ja saatu 3,9 ke:n jakso, jossa on PH05- ja PH03-geeni, eristetään preparatiivi-sella geelielektroforeesilla. 3,9 ke:n BamHI-Hpal-jakso alakloonataan vektoriin pBR322, joka on sitä ennen leikattu BamHIrllä ja PvuII:lla. Saadulle plasmidille, joka sisältää PH05- ja PH03-geenin, annetaan nimeksi p2 9.
30 yg plasmidia p29 katkaistaan restriktioendonuk-leaaseilla BamHI ja EcoRI. Kun on suoritettu täydellinen katkaisu, DNA uutetaan fenoli/kloroformilla ja sa ostetaan etanolilla. DNA liuotetaan uudestaan väkevyyteen 0,5 mg/ml liuokseen, jossa on 10 mM Tris.
HC1 pH 8,0.
15 yg BamHl+EcoRI-katkaistua p29-DNA:ta pilkotaan osittain (45 minuuttia, 37°C) Rsal:llä (0,9 yksikköä/ yg DNA:ta) 300 yl:ssa liuosta, jossa on 10 mM Tris.
HC1 pH 8,0, 6 mM MgC^, 50 mM NaCl, 6 mM merkaptoetano-lia ja 5 Ug/ml etidiumbormidia. Pilkkoutuminen pysäytetään fenoliuutolla. DNA saostetaan etanolilla ja liuotetaan uudestaan veteen väkevyyteen 1 mg/ml.
Oligodeoksinukleotidi, jonka kaava on 51-CTAGATCTAG-31 fosforyloidaan 5'-päästään ja pariutetaan itsensä kanssa esimerkissä 9Ab kuvatulla tavalla. 4 ^g (1400 pmol) fosforyloitua, pariutettua kytkijä-DNA:ta liitetään yhteen 14 yg:n (140 pmol) kanssa katkaistua p29-DNA: ta (ks. edellä) 80 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris. HC1 pH 7,5, 10 mM MgCl2, 3,5 mM ATP, 5 mM DTT ja 3200 75 86 7 46 yksikköä T4 DNA-ligaasia (20°C/ 16 tuntia). T4 DNA-ligaasi inaktivoidaan kuumentamalla 10 minuuttia 65°C:ssa. Kytkijäyliraäärä poistetaan saostamalla liuoksessa, jossa on 10 mM EDTA, 300 mM natriumasetaat-tia pH 6,0 ja 0,54 tilavuutta isopropanolia. Kun DNA pilkotaan BamHItllä ja Xbal:llä (4 yksikköä/ug DNArta), moninkertaiset rakenteet hajoavat ja syntyy lomittai-set Xbal-päät. Koska on lisätty kytkijät tylppäpäisiin Rsal-kohtiin ja kytkijä on katkaistu Xbalrllä, ovat kaikki p29-BamHI-RsaI-restriktiofragmentit muuttuneet BamHI-Xbal-fragmenteiksi. Ne erotetaan 1 %:sessa matalalla sulavassa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. Geelistä leikataan irti palat, joissa on BamHI-Xbal-jaksot, joiden koot ovat 595, 637, 811 ja 1312 emäsparia.
Plasmidi pBR322/PH05 Eco-Bam johdetaan plasmidista pG7 (esimerkki 2). pG7 katkaistaan restriktioendonuk-leaaseilla EcoRI ja BamHI. Saadut DNA-jaksot erotetaan preparatiivisella geelielektroforeesilla. Eristetään 2,1 ke:n EcoRI-BamHI-jakso, joka edustaa PH05:n BamHI-kohdan yläpuolella olevia reunasekvenssejä. Kyseinen 2,1 ke:n jakso liitetään vektorin pBR322 4 ke:n EcoRI-BamHI-jaksoon. Näin saadun plasmidin nimi on pBR322/PH05 Eco-Bam.
Plasmidi pBR322/PH05 Eco-Bam sisältää 2,1 ke:n EcoRI-BamHI-jakson, jossa on PH05:n BamHI-kohdan yläpuolella sijaitsevia reunasekvenssejä. 15 yg plasmi-di-;DNA:ta katkaistaan BamHI :llä ja Xbal:llä. Restrik-tiofragmentit erotetaan 0,6 lisessa matalalla sulavassa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin pH 8,3. 4,25 ke:n BamHI-Xbal-jakso leika taan irti geelistä.
Geelipalat sisältävät DNA-jaksot nesteytetään 65 °C:ssa ja laimennetaan vedellä agaroosipitoisuuteen 0,3 %. Ekvimolaariset määrät 637 emäsparin BamHI-Xbal-jaksoa 76 86 7 46 ja 4,24 ke:n BamHI-Xbal-vektorijaksoa sekoitetaan keskenään ja liitetään yhteen 125 Ulissa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl^, 5 mM DTT, 1 mM ATP ja 600 yksikköä T4 DNA-ligaasia (15°C, 16 tuntia).
10 yl yhteenliittämisseosta lisätään 100 yltään transformointikelpoisia E. coli HBl01-soluja esimerkissä 4a kuvatulla tavalla. 5 amp -pesäkettä viljellään erikseen LB-alustassa, jossa on 100 yg/ml ampisillii-nia. Plasmidi-DNA:sta analysoidaan liitännäisen koko katkaisemalla resti&tioendonukleaaseilla EcoRI ja BamHI. Yhdelle kloonille, jossa on oikea liitännäinen, annetaan nimi pBR322/PH05Bam-Rsa 637.
637 emäsparin BamHI-Xbal-jakso voidaan korvata BamHI-Xbal-jaksoilla, joiden koko on 595, 811 tai 1312 emäs-paria. Oikeankokoisen liitännäisen sisältävien kloonien edustajille annetaan vastaavasti nimet pBR322/ PH05Bam-Rsa 595, pBR322/PH05Bam-Rsa 811 ja pBR322/PH05 Bam-Rsa 1312.
b) Synteettisten oligodeoksinukleotidien lisääminen 637 emäsparin BamHI-Xbal-jakso sisältää PH05-pro-moottorin ja PH05:n signaalisekvenssin, jonka jatke ulottuu kypsää happofosfataasia koodittavaan sekvenssiin asemassa 637 olevaan Rsal-kohtaan asti. DNA-jakso liitetään kehykseen kypsää TPA:ta koodittavan sekvenssin kanssa synteettisen oligodeoksinukleotidin välityksellä, joka koodittaa aminohappojärjestystä Leu-Glu-Gly-Val-Ser-Leu-Asp-Lys-Arg. Tämä sekvenssi löytyy myös hiivan α-tekijää koodittavan sekvenssin yläpuolelta (54).
5 yg plasmidia pBR322/PH05Bam-Rsa 637 leikataan restriktioendonukleaasilla Xbal. Täydellisen katkaisun jälkeen DNA uutetaan fenoli/kloroformilla ja saostetaan etanolilla. DNA liuotetaan uudestaan väkevyyteen 50 yg/ ml liuokseen, jossa on 50 mM Tris.HCl pH 8,0, ja pilkotaan 11 yksiköllä vasikan sisäelinten emäsfosfataasia (Boehringer) 1 tunti 37°C:ssa. Entsyymiä inaktivoidaan 1 tunti 65°C:ssa. DNA puhdistetaan DE52-ioninvaihtokro- 77 86746 kromatografiällä ja saostetaan etanolilla esimerkissä 9Aa kuvatulla tavalla.
Kaksi synteettistä oligodeoksinukleotidia, joiden kaavat ovat 5'- CTAGAAGGGGT AT CTTTGGAT AAGA -3’ 3’- TTCCCCATAGAAACCTATTCTCTAG -5’ fosforyloidaan 5'-päistään erikseen esimerkissä 9Ab kuvatulla tavalla. Fosforyloidut oligodeoksinukleoti-dit sekoitetaan keskenään ekvimolaarisinä määrinä. Seosta kuumennetaan 10 minuuttia 75°C:ssa ja sen jälkeen sen annetaan jäähtyä hitaasti huoneenlämpötilaan ja sitä säilytetään -20°C:ssa. Tämä kytkijä on nimeltään C-kytki j ä.
1 pg (120 pmol) fosforyloitua, pariutettua C-kyt-kijää ja 5 pg (1m5 pmol) Xbalrllä katkaistua/ defosfo-ryloitua pBR322/PH05Bam-Rsa 637-DNA:ta liitetään yhteen 10 minuuttia 85°C:ssa 40 yl:ssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HClpH 7,5, 10 mM MgCl2> 5 mM DTT, 1 mM ATP ja 1600 yksikköä T4 DNA-ligaasia. DNA-ligaasi inakti-voidaan kuumentamalla 10 minuuttia 85°C:ssa ja ylimääräinen kytkijä poistetaan isopropanolisaostuksella.
DNA liuotetaan uudestaan veteen väkevyyteen 0,25 mg/ml. Kytkijämultimeerit poistetaan suorittamalla katkaisu Bgll-endonukleaasilla. DNA saostetaan etanolilla, liuotetaan uudestaan ja pilkotaan vielä BamHI:llä. Restriktio-fragmentit erotetaan 0,6 %:sessa matalalla sulavassa aga-roosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-pusku-riin pH 8,3. 662 emäsparin BamHI-Bglll-jakso (johdettu 637 emäsparin BamHI-RsaI-jaksosta) paikannetaan ja leikataan irti geelistä.
c) Kypsää TPA:ta koodittavan sekvenssin sisältävän vektorijakson eristäminen (kuva 23) 78 86 7 46 5 pg plasmidia p31R/SS-TPA Δ2 pilkotaan restriktio-endonukleaaseilla BamHI ja Bglll. Kun pilkkoutuminen
on tapahtunut täydellisesti, DNA saostetaan etanoliini ja suspendoidaan uudestaan väkevyyteen 75 yg/ral liuokseen, jossa on 50 mM Tris.HCl pH 8,0. DNA-fragment-tien 5'-päät defosforyloidaan inkuboimalla 1 tunti 37 °C:ssa 1 yksikön kanssa vasikan sisäelinten emäsfosfa-taasia (Boehringer) 60 yl:ssa liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl pH 8,0. Fosfataasi inaktivoidaan inkuboimalla 1,5 tuntia 65°C:ssa. DNA puhdistetaan DE52-ioninvaihtokromatografiällä (Whatman) esimerkissä 9Aa kuvatulla tavalla. DNA saostetaan etanolilla, liuotetaan uudestaan liuokseen, jossa on 10 mM Tris.HCl pH
8,0, ja levitetään 0,6 %:selle matalalla sulavalle aga~ roosigeelilie. 5,2 ke:n suuri BamHI-Bglll-fragmentti leikataan irti geelistä.
d) Eristettyjen DNA-jaksojen yhteenliittäminen ja E. coli HB 101:n transformointi (ks. kuvat 23 ja 24)
Kaksi matallalla sulavaa agaroosigeelipalaa, joissa on 0,1 pmol p31R/SS-TPA^2:n 5,2 ke:n BamHI-Bglll-fragmenttia ja 0,2 pmol pBR322/PH05Bam-Rsa 637:n 662 emäsparin BamHI-Bglll-fragmenttia, sekoitetaan keskenään, nesteytetään 65°C:ssa ja laimennetaan niin, että agaroo-sipitoisuudeksi tulee 0,3 %. Yhteenliittäminen suoritetaan 15°C:ssa 16 tunnissa 150 ylrssa liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP ja 800 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs). 10 yl:n ja 30 μ1:η erät sekoitetaan 100 yl:aan transformointikel-poisia E. coli HB191-soluja, kuten esimerkissä 4a on selostettu.
6 transformoitunutta, amp -pesäkettä kasvatetaan erikseen LB-alustassa, jossa on 100 ug/ml ampisilliinia. Plasmidi-DNA:sta analysoidaan liitännäisen koko ja suunta suorittamalla katkaisu restriktioendonukleaasilla BamHI. Yhdelle kloonille, jossa liitännäinen on oikeas- li 79 86 746 sa suunnassa annetaan nimi p31/PH05 637C-TPA (ks. kuva 23) .
Plasmidi pBR322/PH05Bam-Rsa 637 korvataan myös plasmideilla pBR322/PH05Bam-Rsa 595, pBR322/PH05Bam-Rsa 811 ja pBR322/PH05Bam-Rsa 1312. Kun noudatetaan edel-läkuvattua menetelmää, saadaan kloonit p31/PH05 595C-TPA, p31/PH05 811C-TPA ja p31/PH05 1312C-TPA, joissa liitännäinen on kooltaan oikea ja oikeassa suunnassa.
C-kytkijä korvataan B-kytkijällä, jonka kaava on seuraava: 5'- CTAGATAAGAGATCTGC -3' 3·- TATTCTCTAGACG -5 *
Synteettisten oligodeoksinukleotidien fosforyloin-ti, pariuttaminen ja liittäminen vastaaviin DNA-frag-mentteihin, tapahtuu samoin kuin C-kytkijän kohdalla on selostettu. Näin saadaan B-kirjaimella merkityt kloonit eli p31/PH05 595B-TPA, p31/PH05 637B-TPA, P31/PH05 811B-TPA ja p31/PH05 1312B-TPA. Näissä rakenteissa B-kytkijä koodittaa aminohapposekvenssiä Leu-Asp-Lys-Arg.
C-kytkijä korvataan myös A-kytkijällä, jonka kaava on seuraava: 5’- AAGAGATCTGC -3’ 3'- TTCTCTAGACG -5' joka koodittaa aminohapposekvenssiä Lys-Arg lopullisessa rakenteessa (kuva 24). Synteettiset oligonukleo-tidit fosforyloidaan ja pariutetaan samoin kuin C-kytkijän kohdalla on selostettu.
Kytkijän liittämistä varten 5 pg Xbal:llä pilkottua plasmidia pBR322/PH05Bam-Rsa 637 pilkotaan 40 minuuttia 37°C:ssa 2 yksiköllä S1-nukleaasia (Sigma) 50 pl:ssa liuosta, jossa on 30 mM natriumasetaattia pH 4,6, 200 mM NaCl ja 1 mM ZnSO^, jolloin saadaan tylpät päät (ks. kuva 23). DNA uutetaan fenoli/kloroformilla ja saostetaan etanolilla ja liuotetaan uudestaan veteen 8o 867 46 väkevyyteen 0,25 mg/ml. 0,4 gg (120 pmol) fosforyloi-tua, pariutettua A-kytkijää ja 5 gg (1,5 pmol) Xbal/S1: llä pilkottua plasmidia pBR322/PH05Baxn-Rsa 637 liitetään yhteen tylppäpäisesti samalla tavalla kuin C-kytkijä käyttämällä 3,5 mM ATP:tä. Jatkorakentaminen tapahtuu edelläkuvatulla tavalla. Näin saadut kloonit merkittään kirjaimella A eli p31/PH05-TPA, p31/PH05 637A-TPA, p31/PH05 811A-TPA ja p31/PH05 1312A-TPA.
Esimerkki 16: Geenirakenteiden alakloonaus suuren kopiomäärän tuottavaan hiivavektoriin pJDB207 ja S. cerevisiae GRF18:n transformointi
Esimerkkien 13-15 mukaiset rakenteet sisältävät PH05-promoottorin, jossa on PH06-geenin alueelle ulottuva jatke, tai jatketta ei ole, TPA:ta koodittavan alueen, jossa on preprosekvenssi, tai sitä ei ole sekä PH05:n transkription lopetussignaalit peräkkäisessä järjestyksessä kaikki plasmidista pBR322 johdetussa vektorissa. BamHI-HindIII-fragmentit, jotka sisältävät koko ryhmitelmän, liitetään pJDB207:n 6,4 ke:n BamHI-HindIII-fragmenttiin noudattamalla esimerkissä 10 kuvattua reaktiota. Transformointikelpoiset E. coli HB101-solut transformoidaan ja useita amp -pesäkkeitä kasvatetaan erikseen LB-alustassa, jossa on 100 gg/ml ampisilliinia. Plasmidi-DNA analysoidaan suorittamalla katkaisu restriktioendonukleaaseilla Hindlll, BamHI ja Pstl.
Kun lähdetään plasmideista p3l/PH05-TPA18, p3l/PH05-TPA42, p31R/SS-TPA/^ 2, p31R/SS-TPA3, p3l/PH05 595C-TPA, p3l/PH05 637C-TPA, p3l/PH05 811C-TPA, p3l/PH05 1312C-TPA, Ρ31/ΡΗ05 595B-TPA, p3l/PH05 637B-TPA, P3l/PH05 811B-TPA, p3l/PH05 1312B-TPA, p3l/PH05 595A-TPA, p3l/PH05 637A-TPA, p3l/PH05 811A-TPA ja p3l/PH05 1312A-TPA saadaan seuraavat kloonit, joissa on oikea liitännäinen : ei 8 6 7 4 6 pJDB207/PH05-TPAl8 PJDB207/PH05-TPA42 pJDB207R/PH05-SS-TPAA 2 PJDB207R/PH05-SS-TPAΛ 3 pJDB207/PH05 595C-TPA pJDB207/PH05 637C-TPA PJDB207/PH05 811C-TPA PJDB207/PH05 1312C-TPA pJDB207/PH05 595B-TPA PJDB207/PH05 637B-TPA PJDB207/PH05 811B-TPA pJDB207/PH03 1312B-TPA pJDB207/PH05 595A-TPA PJDB207/PH05 637A-TPA PJDB207/PH05 811A-TPA pJDB207/PH05 1312A-TPA .
Nämä plasmidit siirretään Saccharomyces cerevisiae-GRF-kantaan esimerkissä 11 kuvatulla tavalla:
Jokaisesta hiivan transformoinnista poimitaan yksi hiivapesäke. Näin saaduille klooneille annetaan nimet:
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-TPA18 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-TPA42 Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207R/PH05-SS-TPA/\ 2 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-SS-TPA /\ 3 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 595C-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 637C-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 811C-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 1312C-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 595B-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 637B-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 811B-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 1312B-TPA
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 595A-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 637A-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 811A-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 1312A-TPA
82 86746
Hiivasoluja kasvatetaan, ne otetaan talteen ja suoritetaan uutto esimerkeissä 11 ja 12 kuvatulla tavalla. Solu-uutteiden TPA-aktiivisuus määritetään esimerkissä 12 kuvatulla tavalla. Saadut tulokset on esitetty taulukossa 3.
Taulukko 3: Eri plasmideilla transformoituneiden
Saccharomyces cerevisiae GRF18-kantojen TPA-aktiivi-suus, kun määritys on suoritettu päälle kytketyissä olosuhteissa (matala-P^): TPA-aktiivinuus (yksikköä/1 plasiridi hiivaviljelmää/OD^QQ) pJDB207/PH05-TPA18 750 pJDB207/PH05-TPA42 700 PJDB207R/PH05-SS-TPAA 2 600 pJDB207R/PH05-SS-TPAA 3 650 pJDB207/PH05 595C-TPA 900
Esimerkki 17: Kromosomin PH05-geenin korvaaminen TPA- geenillä (ks. kuva 25) TPA-proteiinia koodittava alue sijoitetaan hiivan kromosomiin II PH05-proteiinia koodittavaan kohtaan. Kokeellisesti tämä saavutetaan seuraavalla tavalla.
Saccharomyces cerevisiae GRF18 sekatransformoidaan 25 Mg:11a plasmidia p31/PH05-TPA18, joka on linearisoitu katkaisemalla BamHI:llä ja HindIII:lla, ja 3 yg:lla hiivaplasmidia Yep13 (51). Saaduista 24 Leu+-pesäkkees-tä yksi on PH05 ja samalla tuottaa 35 yksikköä TPA:ta/ litra soluviljelmää/OD60Q. Kun transformanttia kasvatetaan leusiinia sisältävässä alustassa (YPD, 10 g/1 Bacto Yeast Extract, 20 g/1 Bacto Peptone, 20 g/1 glu- 83 86746 koosia) 10 sukupolven ajan, saadaan Leu -segregantteja 10 - 20 % taajuudella, jotka segregantit oletettavasti ovat menettäneet Yep13-plasmidin. Kun suoritettiin Sout-herinin analyysi Leu -segreganteista saadulle hiivan kokonais-DNA:lie (52), voitiin todeta DNA-tasolla, että TPA-proteiinia koodittavat sekvenssit ovat korvanneet PH05-proteiinia koodittavat sekvenssit jättäen kromosomin II reunasekvenssit muuttumattomiksi, ja että kannoissa ei ole Yep13-plasmidi-DNA:ta. Valitaan yksi kanta, jolle annetaan nimeksi Saccharomyces cerevisiae GRF18(pho5-TPA).
Esimerkki 18: Kannan parantaminen mutatoinnilla
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-TPA(1 A)-kantaa kehitetään eteenpäin TPA:n tuottajaksi suorittamalla mutatointia ja valintaa matalan happofosfataasi-aktiivisuuden suhteen.
Saccharomyces cerevisiae H243/pJDB207/PHO5-TPA(1A),
joka on Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-TPA
(1A):n lämpöherkkä mutantti, saadaan UV-säteilytyksellä -2 (0,08 uWcm , 15 sekuntia, kuolee 99,2 %). Pesäkkeitä kasvatetaan 1,2 M sorbitolilla osmoottisesti stabiloidussa YPD-alustassa (10 g/1 Bacto Yeast Extract, 20 g/1 Bacto Peptone, 20 g/1 glukoosia, 20 g/1 Bacto agar) ja toisinnot kasvatetaan levyillä YPD-alustassa, jossa ei ole sorbitolia. Saccharomyces cerevisiae H243 eristetään hitaasti kasvavana pesäkkeenä.
5
Noin 10 Saccharomyces cerevisiae H243/pJDB207/ PH05—TPA(1A) kasvatetaan levyillä YNB-agarissa ( 6,8 1 Yeast Nitrogen Basea, jossa ei ole aminohappoja/ 20 g/1 glukoosia, 20 g/1 Bacto Agaria, täydennettynä histi-diinillä (20 mg/1)) ja säteilytetään suoraan UV-sätei-lyllä (0,08 |iWcm 12 sekuntia). Soluja kuolee 98%. Eloonjääneistä soluista saadut pesäkkeet kasvatetaan toisintoina levyillä matala-P^-alustassa ja 2 vuorokauden kuluttua ne värjätään happofosfataasiaktiivisuutta varten 84 86746 suorittamalla päällystys pehmeäliivatteella (48). Hap- pofosfataasin suhteen negatiivisen tuloksen antavia mu- -4 tantteja saadaan mutaatiotaajuudella 3,2 x 10 . Va litaan kanta, jolla on suurin TPA-tiitteri, ja sille annetaan nimeksi Saccharomyces cerevisiae H423/pJDB207/ PH05-TPA(1A).
Kolmen eri pJDB207/PHO5-TPA(lA):llä transfor moituneen hiivakannan TPA-aktiivisuudet on esitetty taulukossa 4.
Taulukko 4: Transformoituneiden Saccharomyces cerevisiae-kantojen TPA-aktiivisuus päälle kytketyissä olosuhteissa (matala-P^) TPA-aktiivisuus (yksikköä/1 hiivasoluviljelmää/ODgoo) GRF18/pJDB207/PH05-TPA(IA) 625 H243/pJDB207/PH05-TPA(IA) 1560 H423/pJDB207/PH05-TPA(IA) 7200
Esimerkki 19: TPA:n tuottaminen Saccharomyces cerevisi- aen yhdistelmäkannalla 30 l:n mittakaavassa
Saccharomyces cerevisiae-kanta GRF18/pJDB207/PHO5-TPA(1A) kantaa plasmidia, jossa on leusiinimerkki, joka mahdollistaa plasmidin selektiivisen ylläpidon isäntä-organismissa, ihmisen TPA:n rakennegeenin ja happo-fosfataasin PH05-promoottorin, joka mahdollistaa TPA-geenin ilmentymisen elatusaineissa, jotka sisältävät rajoittavan määrän epäorgaanista fosfaattia (päälle kytkevät olosuhteet).
Kantaa pidetään yllä vinopintaviljelmissä, joissa on määritelty leusiiniton alusta, jotta voidaan olla varmoja plasmidin säylimisestä. Vastaympättyjä vino-pintoja viljellään 24 tuntia 30°C:ssa. Yhden vinopin- es 86746 nan pinnassa oleva kasvusto suspendoidaan uudestaan 3 ml:aan esikasvatusalustaa, joka sitten siirretään ensimmäiseen esikasvatusravistelupulloon. 500 ml:n pullossa on yksisuuntalevy ja se sisältää 100 ml esi kasvatusalustaa I, jonka koostumut on seuraava (määrät g/1): L-asparagiini 2,0; L-histidiini 0,02; glukoosi 10; KH2P04 1,0; MgS04.7H20 0,5; NaCl 0,1; CaCl2-2H20 0,1; vitamiiniliuos 5ml/l; ja hivenaineliuos 5 ml/1. Kasvualustan pH säädetään ennen sterilointia arvoon 7,2 lisäämällä natriumhydroksidia. Glukoosi, vitamiinit ja hivenaineet steriloidaan erikseen ja lisätään kasvualustaan. Vitamiinien ja hivanaineiden varastoliuos-ten koostumus on seuraava (g/1): Vitamiinit: biotiini 0,0002; kalsium-D-pantotenaatti 0,04; foolihappo 0,0002; nikotiinihappo 0,04; p-aminobentsoehappo 0,02; pyrid-oksiinihydrokloridi 0,04; riboflaviini 0,02; tiamiini-hydrokloridi 0,04; ja inositoli 0,2; deionoidussa vedessä; hivenaineet: boorihappo 0,05; CuSC>4.5H20 0,004; KI 0,01; FeCl... 6H„0 0,02; MnS0..4H_0 0,04; NaoMo0..2H~0 32 42 242 0,02; ja ZnSC>4.7H20 0,04, deionoidussa vedessä. Alusta valmistetaan käyttämällä deionoitua vettä.
Ensimmäistä esiviljelmää inkuboidaan 24 tuntia 30°C:ssa orbitaaliravistelijassa, jossa on 5 cm:n heitto, nopeudella 250 1/min.
Ensimmäisestä esiviljelmästä saadaan siirroste toisiin esiviljelmäpulloihin. Pullot saavat siirrostetta 1 tilavuus-%:n. Ne sisältävät 100 ml esikasvatusalustaa II, jonka koostumus on seuraava (g/1): Hiivauute (Difco) 10,0; L-asparagiini 6,6; KH2P04 1,0; MgSC>4.
7H20 1,0; L-histidiini 0,02; ja D-glukoosi (monohydraat-ti) 33,0.
Alusta valmistettiin käyttämällä deionoitua vettä ja sen pH on noin 6,0. Glukoosi steriloidaan erikseen. Inkubointiolosuhteet ovat samat kuin ensimmäisessä esivil jelmässä. 3 tällaisen pullon kasvusto yhdistetään niin, että saadaan 1 tilavuus-% siirrostetta päätuo-tantofermentoriin.
86 8 6 7 4 6
Tuotantofermentorin kokonaistilavuus on noin 45 litraa ja siinä on 4 suuntavelyä ja kuusilapainen levyturbiinisekoitin, jonka halkaisija on 115 cm. Sekoittimen nopeus on 600 1/min, ylipaine on 0,3 bar ja ilmastusnopeus 0,5 tilav./tilav./min. Fermentori sisältää 30 litraa kasvualustaa, jonka koostumus on seuraava (g/1): L-asparagiini 2,0; L-histidiini 0,02; KH2P04 0,03; MgS04.7H20 0,5; NaCl 0,1; CaCl2.2H20 0,1; KCl 1,0; D-glukoosi (monohydraatti) 2 0,0; vitamiini liuos 5 ml/1 ja hivenaineliuos 5 ml/1. Alustan pH säädetään natriumhydroksidilla arvoon 7,2 ennen sterilointia. Glukoosi, vitamiinit ja hivenaineet steriloidaan erikseen ja lisätään alustaan. Vitamiini- ja hivenaineliuoksen koostumus on sama kuin esikasvatusalustan I kohdalla on selostettu.
Fermentointilämpötila on 30°C. pH laskee arvoon 5,0, jossa sitä pidetään lisäämällä natriumhydroksidia. Maksimaalinen TPA-pitoisuus saavutetaan fermentoimalla noin 20 tuntia. Optinen tiheys, joka saavuttaa 2-3 yksikköä, ja happofosfataasiaktiivisuus ovat hyödyllisiä indikaattoreita fermentoinnin etenemiselle. Fermen-tointiliuos jäähdytetään 10°C:een ennen hiivasolujen talteenottoa .
Esimerkki 20: TPA:n ja Pro-TPA:n talteenotto ja puhdis tus monoklonaalisella anti-TPA-vasta-ainekromatografial-la a) Solujen uutto 30 litran fermentoinnin kasvusto (pH 4) (ks. esimerkki 19) jäähdytetään 10°C:een ja sentrifugoidaan Alfa-Laval BRPX-207 lietteenpoistosentrifugilla. Erottuneet solut suspendoidaan uudestaan 2 litraan lyysipus-kuria A (20 mM NaH2P04, 80 mM K2HP04, 150 mM NaCl, 0,01 % Tween, 10 mM bentsamidiinia ja 10 mM EDTA). Liuos jäähdytetään 5°C:een ja lasketaan Dync^-myllyn läpi (KDL- 87 B6746
Pilot) syöttönopeudella 10 1/h. Mylly on varustettu 500 ml:lla lasihelmiä, joiden halkaisija on 0,5 - 0,75 mm, ja mylly toimii nopeudella 3000 1/min. Ennen solu-suspension lisäämistä lasihelmet pestään 300 ml:11a lyysipuskuria A, jossa on 30 mg NSA:ta. Rikkoutuneiden solujen suspensio sentrifugoidaan (Sorvali rotor 653, 40 minuuttia, 9000 1/min) ja pelletti heitetään pois.
b) DNA:n hajotus ja ammoniumsulfaatti fraktiointi 5 mg DNAasia lisätään 2 litraan kirkastettua suspensiota ja saatua seosta sekoitetaan 30 minuuttia 4°C:ssa. Sitten liuos kyllästetään airmoniumsulfaatilla 35 ?: sesti (paino/tilav) ja sekoitetaan 1 tunti 4°C:ssa. Liuos sentrifugoidaan edelläkuvatulla tavalla ja koko TPA-aktiivisuuden sisältävä pelletti suspendoidaan uudestaan 1 litraan A-puskuria, jossa on 1 % Tween ja 0,1 % SDS. Suspensiota sekoitetaan ainakin 1 tunti 4°C:ssa.
c) Immunoaffiniteettikromatografia I) Anti-TPA-vasta-aineen puhdistaminen 5 ml kanin anti-TPA-vastaseerumia (saatu tri E. Reichilta, Friedrich-Miescher-Institut, Basel) lasketaan lysiini-sefaroosipylvään läpi, jotta saadaan poistetuksi plasminogeeni seerumista.
Pylväs pestään 1-2 tilavuudella PBS:ää, pH 7,4, jossa on 100 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 8,1 mM Na2HPO^ ja 1,5 mM ΚΗ2?0^. Läpi virrannut liuos ja pesuliuos yhdistetään. Plasminogeenista vapautettu vastaseerumi saoste-taan lisäämällä kiinteätä ammoniumsulfaattila lopulliseen väkevyyteen 50 % (paino/tilavuus). Liuosta pidetään yön yli 4°C:ssa ja sen jälkeen se sentrifugoidaan (Sorvali GSA roottori, 1200 1/min, 20 minuuttia). Sakka liuotetaan pieneen tilavuuteen PBS:ää ja dialysoidaan PBS:ää vasten, jossa on 0,1 % NaN^. Tästä dialysoidusta liuoksesta saatu IgG puhdistetaan proteiini A sefaroosi- 88 8 6 7 46 pylväässä (55) .
II) Anti-TPA-vasta-ainepylvään valmistus 13 mg puhdistettua anti-TPA-vasta-ainetta dialy-soidaan 0,1 M MOPS-liuosta pH 7,0 vasten. Vasta-aine liitetään 5 ml:aan aktivoitua Affigel 10:tä (Biorad) valmistajan ohjeiden mukaan. Geelimatriisi tasapainotetaan PBSrllä, jossa on 1 % Tween 80, 0,1 % SDS, 0,2 M NaCl, 10 mM bentsamidiinia ja 0,1 % NaN^. Matriisi pakataan 5 ml:n pylvääseen.
III) TPA:n puhdistus immunoaffiniteettikromatografiällä
Ammoniumsulfaattifraktioinnissa saatu uudelleenliuo-tettu pelletti sentrifugoidaan hiukkasmateriaalin poistamiseksi (Sorvali GSA-roottori, 30 minuuttia, 12 000 1/min) ja sen jälkeen se tuodaan affiniteettipylvääseen virtausnopeudella noin 10 ml/h 4°C:ssa. Kun koko tilavuus on mennyt läpi, pylväs pestään 10 pylvästilavuudel-la PBS:ää, jossa on 0,05 % Tween 80. Pylväs eluoidaan liuoksella, jossa on 0,1 M glysiini.HCl pH 2,5 ja 0,1 % Tween 80. Otetaan 2 ml:n jakeet ja niistä analysoidaan TPA-aktiivisuus Ränbyn menetelmällä (49). Käytetty substraatti on D-Val-Leu-Lys-pNA (Kabi S-2251). Suurimman aktiivisuuden sisältävät jakeet yhdistetään, neutraloidaan 1 M Tris:llä ja väkevöidään ultrasentifugoi-malla käyttämällä Amicon flat bed-kalvoa YM10. Näin saadun TPA:n puhtausaste on noin 90 % ja se on pääasiassa yksisäikeistä muotoa (pro-TPA), kun analysoidaan SDS-PAGE: llä pelkistävissä olosuhteissa. Näennäinen molekyylipai-no ei-pelkistävissä olosuhteissa on noin 60 000 SDS-PAGE:llä (ks. kuva A).
Kuvat A ja B: Hiivan TPA-geenituotteen SDS-poly- akryyliamidigeelielektroforeesi (kuva A) ja sen entsy-maattinen aktiivisuus aktiivisuusgeelillä (kaseiinilevyt) (kuva B).
89 86746 A: SDS-geeli B:aktiivisuusgeeli 1 2 3 4 5 6 1 2 ——T—n ••rjT , , : ; f.;::< £_·!H m *f* 92.5 K - ' ./,:1.. ; [y :%·:Χφ. <. •W·· 67 κ “ <u« es» f* m L, . |w| .· ’ ä
95 K - * [ P P
_ . . 1 &iM? ’ |·,,' 21.5 K - , ^ '‘i " ' : ^ΜΖΜ&β-Α s 14.4 K — '· ·. ··: ; ..^ .· :rv: -. : .'l - ' ' '.
^ '*> O . j - . *
Kuva A (SDS-PAGE):
Kaistat 1 ja 4: standardiproteiinit (kokomerkit)
Kaistat 2 ja 5: melanooma-TPA
Kaistat 3 ja 6: hiivan TPA
Kaistat 1-3 pelkistävissä olosuhteissa
Kaistat 4-6 ei-pelkistävissä olosuhteissa Näytteiden ajot suoritettiin 12,5 %:sessa geelissä ja proteiini värjättiin Coomassie brilliant-sinisellä.
Kuva B (aktiivisuusgeeli, ks. esimerkki 23):
Kaista 1: melanooma-TPA Kaista 2: hiivan TPA
Kaseiini-agar-plasminogeenipäällyste (viite 56).
90 867 46
Esimerkki 21: TPA:n ja pro-TPA:n talteenotto ja puh distus DE-3-affiniteettikromatografiällä (g) a. DE-3 Sepharose^pylvään valmistus 26 mg Erythrina latissiman puhdistettua DE-3-inhibiittoria (16) liitetään 5 ml:aan syanogeenibromidilla aktivoitua Sepharose 4b®: ää (Pharmacia) valmistajan ohjeiden mukaan. Matriisi tasapainotetaan fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella ("PBS") pH 7,4, jossa on 0,4 M NaCl, 0,1 % Triton Χ-10(β* ja 0,02 % natriumatsidia. Sitten matriisi pakataan 5 ml:n pylvääseen.
b. TPA:n ja pro-TPA:n kromatografinen puhdistus DE-3-Sepharose 4b^:llä
Solu-uutteet (ks. esimerkki 20a) säädetään pitoisuuteen 0,4 M NaCl ja 0,1% Triton X-10(f® ja suodatetaan 0.45 pm:n kalvon (Millipore) läpi. Sitten liuos tuo-daan DE-l-Sepharose^-pylvääseen (ks. edellä) virtausnopeudella 45 ml/h huoneenlämpötilassa ja effluentti heitetään pois. Kun solu-uute on kokonaan kulkenut läpi, pylväs pestään noin 50 ml:lla PBS:ää, jossa on 0,4 M NaCl ja 0,1 % Triton X-10cf®, ja kerätään 2 ml:n jakeet 4°C:ssa. Jokaisen jakeen proteiinipitoisuus määritetään UV-absorbanssilla 280 nm:ssä. Adsorboituneet proteiinin havaitaan eluoituvan terävänä piikkinä. Jakeet, joissa on korkein UV:n absorbanssi ja korkein fibrino- 125 lyyttinen aktiivisuus I-fibriinimäärityksellä mitattuna (47), yhdistetään, jolloin saadaan 8 ml liuosta, jota säilytetään -20°C:ssa. Tämä edustaa noin 70 - 80% pylvääseen tuodusta alkuperäisestä aktiivisuudesta. Pienemmän aktiivisuuden sisältävät jakeet yhdistetään erikseen. Kummankin keräyksen avulla saatu kokonaissaanto on tavallisesti 90 - 100 %.
c. Pro-TPA:n kromatografinen puhdistus DE-3-Sepharose (§) 4b .llä proteinaasien inhibiittorin läsnäollessa 91 86746
Hiivasolu-uutteiden kromatografia suoritetaan esimerkissä 21b kuvatulla tavalla, mutta emäksien haiman trypsiinin inhibiittori (BPTI) on mukana pitoisuutena 0,1 KIU/ml. Puhdistetun liuoksen TPA-ja pro-TPA-pitoisuus määritetään fluorimetrisella menetelmällä käyttämällä substraattina Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC: tä. 90 % TPArsta on proentsyymimuodossa ja 10 % on aktiivisessa muodossa. Näin ollen BPTI estää pro-TPA:n muuttumisen TPA:ksi puhdistuksen aikana.
Esimerkki 22: Pro-TPA:n erottaminen TPA:sta
Esimerkissä 21c saatu TPA:n ja pro-TPA:n liuoksen pH säädetään arvoon 8,0 liuoksella, jossa on 0,1 M Tris-HCl ja 0,1 % Triton X-100 , ja näin saadun liuoksen di-isopropyylifluorifosfaattipitoisuudeksi säädetään 1 mM. Kun on inkuboitu 4 tuntia 37°C:ssa, seos lasketaan 5 ml:n DE-S-Sepharose^-pylvään läpi (ks. esimerkki 21a). Effluentti, joka sisältää irre-versiibelisti inhiboituneen TPA:n, heitetään pois.
Pylväs pestään 6 pylvästilavuudella PBS:ää, jossa on 0,4 M NaCl ja 0,1 % Triton X-100®1, ja sen jälkeen eluoidaan PBS:llä, jossa on 1,6 M KSCN, 0,4 M NaCl ja (K) 0,1 % Triton X-100 , kuten esimerkissä 21 b on selostettu. Jakeet, joilla on suurin UV:n absorbanssi, yhdistetään. Kerätty liuos sisältää pro-TPA:n oleellisesti ottaen puhtaassa muodossa, koska amidolyyttistä aktiivisuutta ei havaita fluorimetrisessä määrityksessä käyttämällä substraattina Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC: tä (37) . Amidolyyttinen ja fibrinolyyttinen aktiivisuus voidaan palauttaa plasmiinikäsittelyllä, joka muuntaa pro-TPA:n aktiiviseksi entsyymiksi.
Esimerkki 23: Hiivan TPA-geenituotteen ominaisuudet a. Entsymaattiset ominaisuudet
Esimerkin 19 mukaisesti aikaansaatu ja DE-3-affi- 92 86746 niteettikromatografiällä (ks. esimerkki 21b) puhdistettu hiivan TPA-geenituote on entsymaattisesti aktiivinen, koska se pilkkoo tsymogeenisen plasminogeenin plasmiiniksi fibriinin läsnäollessa tai ilman fibrii-nin läsnäoloa. Entsymaattinen aktiivisuus voidaan osoittaa kolorimetrisillä menetelmillä (Ränby (49) (ks. esimerkki 12); Verheijen et ai. (60)), kaseiini- 125 ja fibriinilevyillä (56) ja J-fibrinogeeni-kiinteä- faasimenetelmällä (47). Etnsymaattinen aktiivisuus ka-seiinilevyillä on esitetty kuvassa B (ks. esimerkki 20clII).
Fibriini stimuloi suuresti saadun TPA:n entsymaattista aktiivisuutta. DE-3-affiniteettikromatografiällä osittain puhdistettu TPA analysoidaan parabolisella nopeusanalyysillä (Ks. Ränby (49)). Kun ote- 2 taan reaktionopeus Δε :n suhteen 3-5 minuutin välillä entsyymiaktiivisuuden mitaksi, on optimaalisten fibriinipitoisuuksien (noin 100 ug/ml) aikaansaama stimulaatio 10- - 20-kertainen. Vaikutus voidaan havaita CNBr-hajotuksella saaduilla fibriinifragmenteilla (57) tai b^roksobiinilla käsitellyllä fibrinogeenil-la (58). Kun tutkitaan urokinaasia samoissa olosuhteissa, ei ilmene fibriinifragmenttien aikaansaamaa aktiivisuuden stimuloitumista.
b. TPArn sitoutuminen fibriinilevyihin
Kun suoritetaan Rijken et alin (2) fibriiniinsi-toutumiskoe saadulle TPA:lie, joka on puhdistettu DE-3-affiniteettikromatografiällä, havaitaan sen sitoutuvan suuressa määrin fibriinipaakkuihin. Sen sijaan uroki-naasi ei sitoudu merkittävässä määrin fibriiniin. Näin ollen saadun hiivan TPA-geenituotteen ja urokinaasin välillä on se silmiinpistävä ero, että ensinmainittu absorboituu fibriiniin, mistä seuraa plasminogeenin aktivoitumisen tehostuminen (59).
93 86746
Esimerkki 24: Hiivan TPA-geenituotteen glykosyloitu- misaste
Jotta saataisiin selville, onko hiivan tuottama TPA glykosyloitunut, sen käyttäytyminen konkanava-liini A-SepharosJ^-pylväässä (2) analysoidaan.
Käytetään DE-3 Sepharose -pylväässä osittain af-finiteettikromatografisesti puhdistettua TPA-jaetta (ks. esimerkki 21b). Tämän jakeen aktiivisuus on 11,5 FU/ml, joka vastaa 2,1 yg/ml TPA-proteiinia.
Aktiivinen jae (3 ml) sijoitetaan konkanavaliini A Sepharose^-pylvääseen (pakatun kolonnin tilavuus 0,5 ml), joka on tasapainotettu liuoksella, jossa on 0,1 M Tris.HCl pH 7,5, 1 M NaCl ja 0,01 tilavuus-% Tween 80R.
Läpivirtauksen sisältämät proteiinit kerätään vain yhtenä jakeena (n. 3 ml). Pylväs pestään 6 ml:lla tasa-painotuspuskuria ja matriisiin sitoutuneet proteiinit eluoidaan 4 vaiheessa tasapainotuspuskuriin lisätyllä α-metyylimannosidilla ja KSCN:llä. Nämä neljä vaihetta suoritetaan peräkkäisesti käyttämällä 0,5 ml seuraa-via liuoksia: 1. 50 mM oi-metyylimannosidia + 0,25 M KSCN tasapainotus-puskurissa 2. 100 mM ot-metyylimannosidia + 0,50 M KSCN tasapaino-tuspuskurissa 3. 200 mM α-metyylimannosidia + 1 M KSCN tasapainotus-puskurissa 4. 300 mM ^-metyylimannosidia + 2 M KSCN tasapainotus-puskurissa
Huomattava määrä TPA-aktiivisuutta saadaan talteen vaiheissa 2 ja 3, mutta mitään aktiivisuutta ei vapaudu pienillä suolan ja sokerin pitoisuuksilla (vaihe 1 ) .
Läpivirtausjakeesta (ks. edellä) löydetään myös hieman TPA-aktiivisuutta.
Nämä tulokset osoittavat, että TPA on hiivassa 94 8 6 7 4 6 glykosyloituneena. Kuitenkin myös läpivirtausjakeesta löytyy aktiivisuutta, mikä merkitsee, ettei kaikki hiivassa syntetisoitunut TPA ole täysin glykosy- loitunutta, mikä saattaa johtua liikatuotantoti- lanteesta matala-P.-alustassa-
Esimerkki 25: Farmaseuttinen valmiste parenteraalises- ti annettavaksi TPA:ta ja/tai pro-TPA:ta sisältävä liuos, joka on saatu esimerkeissä 20 - 22 kuvatulla tavalla, dia-lysoidaan sellaista liuosta vasten, jossa on 0,3 M natriumkloridia ja 0,01 % Tween 8Cr*% ja säilytetään -80°C:ssa. Ennen antamista pitoisuudeksi säädetään 75 yg/ml kokonais-TPA:ta (so. TPA tai pro-TPA tai TPA plus pro-TPA) ja 0,3 M NaCl. Liuos steriloidaan suodattamalla 0,22 ym:n kalvosuodattimen läpi.
Tämä menetelmä sopii TPA-, pro-TPA- tai TPA+pro-TPA-liuosten valmistamiseen parenteraalista antoa, kuten intravenoosista antoa varten.
95 86746
Kirjallisuusviitteet; 1. S. Thorsen et ai., Thromb. Diath. Haemorrh. 28, 65(1972) 2. D.C. Rijken and D. Collen, J. Biol. Chern. 256, 7035 (1981) 3. D.C. Rijken et ai., J. Biol. Chem. 257_, 2920 ( 1982) 4. P. Hallin et ai., Progr. Fibrin. 2» 16 (1982) 5. E.L. Wilson et ai., Cancer Res. 40, 933 (1980) 6. E.L. Wilson et ai., Blood 61., 568 (1983) 7. D. Pennica et ai., Nature 301, 214 (1983) 8. T. Edlund et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 349 (1983) 9. Perlman et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 22. 781 (1982) 10. A.M. Maxara et ai., in "Methods in Enzymology", voi. 65, p. 499, New York 1980 11. J. Lodder, "The Yeasts", Amsterdam 1971 12. A. Hinnen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA _75, 1929 (1978) 13. A. Hinnen et ai., Curr. Top. Microbiol. Immun. j)6, 101 (1982) 14. A. Jimenez et ai., Nature 2%]_t 869 (1980) 15. European Patent Application No. 23860 16. F.J. Joubert et ai., Hoppe-Seyler1 s Zeitschr. Physiol. Chem. 302, 531 (1981) 17. M.V. Olson et ai., J. Mol. Biol. Π2, 387 (1979) 18. H. Meyer, FEBS Lett. 90, 341 (1978) 19. B. Hohn et ai. in "Genetic Engineering, voi. 2, p. 169,
New York 1980 20. B. Hohn in "Methods in Enzymology", voi. 68, p. 299,
New York 1979 21. A. Hinnen et ai. in "Eukaryotic Gene Regulation", voi. 14, p. 43, New York 1979 22. J.D. Beggs in "Genetic Engineering, vol. 2, p. 175,
New York 1981 23. J. Messing, In the 3rd Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DNA (ed. A. Walton), Elsevier, Amsterdam 1981, p. 143 24. M. Mandel et ai., J. Mol. Biol. 21» 159 (1970) 25. A. J. Berk et al., Cell _12, 721 (1977) 96 86 7 46 26. D.S. Holmes et al., Anal. Biochem. 144, 193 (1981) 27. P.M. Lizardi et al., Anal, Biochem. j)6, 116 (1979) 28. Y. Nagamine et al., Cell 32, 1181 (1983) 29. J.B. Gurdon et al., J. Embryol. Exp. Morphol. ^6, 523 (1976) 30. M.W. McDonnel et al., J. Mol. Biol. _Π0, 119 (1977) 31. G. Deng et al., Nucl. Acids Res. _9, 4173 (1981) 32. L. Vi 1la-Komaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3727 (1978) 33. D.A. Morrison in "Methods in Enzymology", vol. 6(5, 326 ( 1979) 34. T. Edlund et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA J50, 349 (1983) 35. H. Ito et al., Nucl. Acids Res. K), 1755 (1982) 36. H.C. Birnboim et al., Nucl. Acids Res. _7, 1513 (1979) 37. M. Zimmerman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA J75, 750 (1978) 38. J. Messing in "M13 cloning/Dideoxy Sequencing" (EMBO-course manual), 1981 39. in manual "M13 cloning and DNA sequencing system", New England Biolabs 40. K. Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. _97_, 7327 (1975) 41. J.F.M. de Rooij et al., Reel. Trav. Chim. Pays-Bas 98, 537 (1979) 42. Molecular cloning. A laboratory Manual (eds. T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook), Cold Spring Harbor Lab. 1982, p. 177 43. G.F. Hong, Bioscience Reports _1^ 243 ( 1981) 44. A. Toh-e et al., J. Bacteriol. 113, 727 (1973) 45. S.V. Suggs et al., in "Developmental biology using purified genes", ICN-UCLA symposium on molecular and cellular biology, vol. 23 (ed. D.D. Brown and D.F. Fox), p. 683 (1981) 46. M Smith, in "Methods of RNA and DNA sequencing" (ed. S.M. Weissmann), Praeger Scientific, New York 1983 47. E.L. Wilson et al., int . J. Cancer 22^, 390 (1978) 48. B. Meyhack et al., EMBO Journal J_, 675 (1982) 49. M. Ranby, Biochim. Biophys. Acta 704, 461 (1982) 50. Hicks et al., Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, Voi. XLIII, p. 1305 (1979) 51. Broach et al., Gene 8, 121 (1979) 52. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1035 (1979) 97 8 6 7 4 6 53. F. Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA _74, 5463 (1977) 54. J. Kurjan et ai., Cell 30, 933 (1982) 55. P.L. Ey et ai., Immunochem. J_5, 429 (1978) 56. J. Jespersen et ai., Haemostasis 18, 301 (1983) 57. C. Zamarrron et ai., J. Biol. Chem. 259, 2080 (1984) 58. J. Chmielewska et ai., Thrombosis Research 427 ( 1983) 59. P. Vallan, Progr. Chem. Fibrinolysis Thrombolysis, 3, 167 (1978) 60. J.H. Verheijen et ai., Thromb. Haemost. ^8, 266 ( 1982)

Claims (7)

98 86 7 46
1. Saccharomyces cerevislae -yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se sisältää Saccharomyces cerevi-siaen PH05-promoottorin ja ihmisen kudos-plasminogeeni-aktivaattoria (TPA) koodittavan alueen, joka koodittaa po-lypeptidiä, jolla on aminohapposekvenssi Ser Tyr Gin Vai Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gin Met Ile Tyr Gin Gin His Gin Ser Trp Leu Arg Pro Vai Leu Arg Ser Asn Arg Vai Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gin Cys His Ser Vai Pro Vai Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gin Gin Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Vai Cys Gin Cys Pro Glu Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gin Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gin Lys Pro Tyr Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Vai Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Vai Tyr Thr Ala Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Vai Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Vai Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Vai Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Vai Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys Phe Glu Vai Glu Lys Tyr Ile Vai His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gin Glu Ser Ser Vai Vai Arg li 99 867 46 Thr Vai Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gin His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gin Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly lie lie Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp lie Arg Asp Asn Met Arg Pro ja jota aluetta edeltää signaalisekvenssi ja joka on mainitun promoottorin ohjauksessa.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että TPArta koodittavaa aluetta edeltää PHQ5-signaallsekvenssi tai TPA:n prepro-sekvenssi.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että PH05-promoottori ulottuu vastaavan PH05-geenin koodittavalle alueelle ja on liittynyt TPA:ta koodittavaan alueeseen synteettisen kytkijän kautta, joka kytkijä sisältää Saccharomyces cerevisiaen endo-peptidaasin vaikutuskohtia.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että TPA-transkriptit päättyvät DNA-sekvenssissä, joka sisältää Saccharomyces cerevisiae-geenin transkription lopetussignaalit.
5. Menetelmä transformoituneen Saccharomyces cerevisiae-kannan valmistamiseksi, joka on Saccharomyces cerevisiae-kanta, joka on transformoitunut yhdistelmävektorilla, jossa on PH05-promoottori ja mainitun promoottorin ohjaukses- loo 86746 sa oleva ihmisen TPA:ta koodittava alue, joka koodittaa polypeptidiä, jolla on aminohapposekvenssi Ser Tyr Gin Vai Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gin Met Ile Tyr Gin Gin His Gin Ser Trp Leu Arg Pro Vai Leu Arg Ser Asn Arg Vai Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gin Cys His Ser Vai Pro Vai Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gin Gin Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Vai Cys Gin Cys Pro Glu Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gin Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gin Lys Pro Tyr Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Vai Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Vai Tyr Thr Ala Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Vai Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Vai Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Vai Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Vai Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys Phe Glu Vai Glu Lys Tyr Ile Vai His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gin Glu Ser Ser Vai Vai Arg Thr Vai Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Vai Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gin His Leu Leu Asn I: 101 86746 Arg Thr Vai Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gin Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly lie lie Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp lie Arg Asp Asn Met Arg Pro tai Saccharomyces cerevislae-kanta, jossa ihmisen ΤΡΑ-geeni, joka koodittaa polypeptidiä, jolla on edellä esitetty aminohapposekvenssi, on stabiilisti integroitunut Saccharomyces cerevislaen kromosomiin ja on kromosomaali-sen PH05-promoottorin ohjauksessa, tunnettu siitä, että transformoidaan Saccharomyces cerevlsiae-kanta mainitulla yhdistelmävektorilla tai integroidaan ihmisen TPA-geeni Saccharomyces cerevisiaen kromosomiin.
6. Menetelmä TPA:n, pro-TPA:n tai näiden seoksen tuottamiseksi, jossa TPA ja pro-TPA ovat läsnä glykosyloituneessa tai glykosyloitumattomassa muodossa tai näiden seoksena, tunnettu siitä, että viljellään sopivissa ravinto-olosuhteissa Saccharomyces cerevisiae-kantaa, joka on transformoitunut yhdistelmävektorilla, joka sisältää Saccharomyces cerevisiaen PH05-promoottorin ja mainitun promoottorin ohjauksessa olevan ihmisen TPA:ta koodittavan alueen, joka koodittaa polypeptidiä, jolla on aminohappo-sekvenssi Ser Tyr Gin Vai Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gin Met Ile Tyr Gin Gin His Gin Ser Trp Leu Arg Pro Vai Leu Arg Ser Asn Arg Vai Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gin - Cys His Ser Vai Pro Vai Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gin Gin Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Vai Cys Gin Cys Pro Glu Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gin Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu 102 86746 Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gin Lys Pro Tyr Ser Gly Arg Arg Pro Asp Ala lie Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met lie Leu lie Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin Phe Arg lie Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp lie Ala Ser His Pro Trp Gin Ala Ala lie Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly He Leu He Ser Ser Cys Trp He Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val He Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys Phe Glu Vai Glu Lys Tyr He Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp He Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gin Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gin His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gin Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly He He Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp He Arg Asp Asn Met Arg Pro tai Saccharomyces cerevisiae-kantaa, jossa ihmisen ΤΡΑ-geeni, joka koodittaa polypeptidiä, jolla on edellä esitetty aminohapposekvenssi, on stabiilisti integroitunut 103 86 7 46 Saccharomyces cerevlslaen kromosomiin ja on kromosomaali-sen PH05-promoottorin ohjauksessa, ja eristetään ja puhdistetaan mainitut proteiinit, ja haluttaessa erotetaan saatu TPA:n ja pro-TPA:n seos yksittäisiksi komponenteiksi, ja pro-TPA:sta vapaan TPA:n valmistamiseksi muunnetaan saatu pro-TPA TPArksi, ja haluttaessa erotetaan saadusta seoksesta glykosyloitunut muoto glykosyloitumattomasta, ja glykosyloituneesta proteiinista vapaan glykosyloitumatto-man proteiinin tuottamiseksi poistetaan saaduista proteiineista glykosyylitähteet.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdistusmenetelmään sisällytetään proteaasien inhibiittori ja kromatografia DE-3 Sepharose-pylväässä suoritetaan sellaisen inhibiittorin läsnäollessa, joka sitoo selektiivisesti vain TPA:n niin, että saadaan pro-TPA:ta, joka on käytännöllisesti katsoen vapaa TPA:sta. 104 86746
FI844544A 1983-11-21 1984-11-19 Foerfarande foer framstaellning av maensklig vaevnads-plasminogenaktivator (tpa) med hjaelp av saccharomyces cerevisiae -jaest och i foerfarandet anvaenda hybridvektorer FI86746C (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB8331045 1983-11-21
GB838331045A GB8331045D0 (en) 1983-11-21 1983-11-21 Synthesis of fibrinolytic agents by yeast
GB8423112 1984-09-13
GB848423112A GB8423112D0 (en) 1983-11-21 1984-09-13 Synthesis of fibrino lytic agents by yeast

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI844544A0 FI844544A0 (fi) 1984-11-19
FI844544L FI844544L (fi) 1985-05-22
FI86746B true FI86746B (fi) 1992-06-30
FI86746C FI86746C (fi) 1992-10-12

Family

ID=26287024

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI844544A FI86746C (fi) 1983-11-21 1984-11-19 Foerfarande foer framstaellning av maensklig vaevnads-plasminogenaktivator (tpa) med hjaelp av saccharomyces cerevisiae -jaest och i foerfarandet anvaenda hybridvektorer

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP0143081B1 (fi)
JP (1) JPS6119489A (fi)
KR (1) KR930002889B1 (fi)
AU (1) AU595478B2 (fi)
DD (1) DD229151A5 (fi)
DE (1) DE3479520D1 (fi)
DK (1) DK164941C (fi)
ES (1) ES8609471A1 (fi)
FI (1) FI86746C (fi)
GR (1) GR80966B (fi)
HU (1) HU201115B (fi)
IE (1) IE57699B1 (fi)
IL (1) IL73568A (fi)
NO (1) NO844618L (fi)
NZ (1) NZ210266A (fi)
PH (1) PH22337A (fi)
PT (1) PT79518B (fi)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI88932C (fi) * 1982-04-15 1993-07-26 Genentech Inc Framstaellning av funktionellt maenskligt urokinasprotein
US7138505B1 (en) 1984-01-12 2006-11-21 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Factor VIII:C nucleic acid molecules
JPS61502655A (ja) * 1984-07-09 1986-11-20 インテグレ−テッド・ジェネティックス・インコ−ポレ−テッド 酵母クロ−ニングビヒクル
NZ213647A (en) * 1984-10-01 1989-05-29 Integrated Genetics Inc Recombinant human tissue plasminogen activator (tpa) modified in n-linked glycosylation pattern
JPS624233A (ja) * 1985-07-01 1987-01-10 Toyobo Co Ltd 組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製造法
JPS6229975A (ja) * 1985-08-01 1987-02-07 Mitsui Toatsu Chem Inc 粗ｔＰＡの精製法
GB8521496D0 (en) * 1985-08-29 1985-10-02 Ciba Geigy Ag Repressible yeast promoters
DE3675724D1 (de) * 1985-09-18 1991-01-03 Green Cross Corp Hefe-promotor und verfahren zur herstellung von heterologen proteinen.
USH2055H1 (en) * 1985-09-20 2002-12-03 Zymogenetics, Inc. Expression of tissue-type plasminogen activator in bacteria
MY101203A (en) * 1985-12-12 1991-08-17 Ucp Gen Pharma Ag Production of thrombin iinhibitors.
GB8530631D0 (en) 1985-12-12 1986-01-22 Ciba Geigy Ag Thrombin inhibitors
US5106741A (en) * 1985-12-20 1992-04-21 The Upjohn Company Tissue plasminogen activator (TPA) analogs
US4898825A (en) * 1986-05-07 1990-02-06 Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated Methods for purification of single-chain and double-chain tissue plasminogen activator
ZA872534B (en) * 1986-05-08 1987-11-25 Phillips Petroleum Co Yeast production of streptokinase
IL82746A (en) * 1986-06-06 1994-10-07 Genentech Inc A process for producing a biologically active tissue plasminogen activator
JPS6463378A (en) * 1986-08-11 1989-03-09 Mitsui Toatsu Chemicals Separation of single stranded tpa and double standard tpa
GB8621118D0 (en) * 1986-09-01 1986-10-08 Whitbread & Co Plc Stabilised polypeptides
EP0263072B1 (en) 1986-10-03 1994-03-23 Ciba-Geigy Ag Novel lymphokine related peptides
PT86162B (pt) * 1986-11-21 1990-11-20 Smithkline Beecham Corp Expressao de proteina recombinante
ZA879286B (en) 1986-12-16 1988-10-26 Smith Kline Rit New plasminogen activators
US5149533A (en) * 1987-06-04 1992-09-22 Zymogenetics, Inc. Modified t-PA with kringle-/replaced by another kringle
US5089409A (en) * 1989-09-28 1992-02-18 Monsanto Company Method of increasing specific activity of t-pa
US5326700A (en) * 1990-11-06 1994-07-05 Eli Lilly And Company DNA sequences encoding t-PA derivatives with cleavable sites
EP0663009A1 (en) * 1993-08-04 1995-07-19 Novartis AG High molecular weight desulphatohirudin
DK0801682T3 (da) 1995-02-09 2002-02-18 Aventis Pharma Gmbh Fremgangsmåde til fremstilling af proteiner

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4775622A (en) * 1982-03-08 1988-10-04 Genentech, Inc. Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast
AR241654A1 (es) * 1982-05-05 1992-10-30 Genentech Inc Procedimiento para producir activador de plasminogeno de tejido humano.
GB2125047B (en) * 1982-08-09 1986-02-19 Ciba Geigy Ag Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides
EP0174835A1 (en) * 1984-09-11 1986-03-19 The Upjohn Company Human tissue plasminogen activator and recombinant DNA compounds
NZ213647A (en) * 1984-10-01 1989-05-29 Integrated Genetics Inc Recombinant human tissue plasminogen activator (tpa) modified in n-linked glycosylation pattern

Also Published As

Publication number Publication date
NZ210266A (en) 1988-11-29
AU3571984A (en) 1986-03-20
FI844544A0 (fi) 1984-11-19
KR930002889B1 (ko) 1993-04-12
ES537828A0 (es) 1986-07-16
ES8609471A1 (es) 1986-07-16
DK551084A (da) 1985-05-22
DE3479520D1 (en) 1989-09-28
IL73568A (en) 1992-07-15
NO844618L (no) 1985-05-22
DK164941C (da) 1993-02-01
AU595478B2 (en) 1990-04-05
EP0143081B1 (en) 1989-08-23
KR850003733A (ko) 1985-06-26
HUT36185A (en) 1985-08-28
PT79518B (pt) 1986-12-12
EP0143081A3 (en) 1987-01-07
IE842965L (en) 1985-05-21
GR80966B (en) 1985-03-15
DK164941B (da) 1992-09-14
JPS6119489A (ja) 1986-01-28
DK551084D0 (da) 1984-11-20
FI86746C (fi) 1992-10-12
FI844544L (fi) 1985-05-22
PT79518A (en) 1984-12-01
DD229151A5 (de) 1985-10-30
IE57699B1 (en) 1993-03-10
IL73568A0 (en) 1985-02-28
HU201115B (en) 1990-09-28
PH22337A (en) 1988-08-12
EP0143081A2 (en) 1985-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI86746B (fi) Foerfarande foer framstaellning av maensklig vaevnads-plasminogenaktivator (tpa) med hjaelp av saccharomyces cerevisiae -jaest och i foerfarandet anvaenda hybridvektorer.
EP0225286B1 (en) Modified fibrinolytic agents
AU614121B2 (en) Improvements in the production of polypeptides
JPH0829086B2 (ja) ポリクリングルプラスミノ−ゲン活性化因子
EP0292009A1 (en) Fibrinolytic proteins
JP2641875B2 (ja) ハイブリッドタンパク質
FI98219C (fi) Menetelmä urokinaasityyppisen plasminogeenin aktivaattorin tuottamiseksi
US6103515A (en) Production of polypeptides by use of novel protease deficient yeast strains
JP2518832B2 (ja) 変形された組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−
IE61775B1 (en) Process for the production of proteins
KR970001564B1 (ko) 우로키나제-형 플라스미노겐 활성체
SI8810195A (sl) Hibridni proteini

Legal Events

Date Code Title Description
MM Patent lapsed
MM Patent lapsed

Owner name: CIBA-GEIGY AG