HU201115B - Process for producing fibrinolitic materials with yeast - Google Patents
Process for producing fibrinolitic materials with yeast Download PDFInfo
- Publication number
- HU201115B HU201115B HU844309A HU430984A HU201115B HU 201115 B HU201115 B HU 201115B HU 844309 A HU844309 A HU 844309A HU 430984 A HU430984 A HU 430984A HU 201115 B HU201115 B HU 201115B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- tpa
- dna
- yeast
- transformed
- promoter
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
- C12N9/60—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from yeast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel, a rekombináns DNS technológia felhasználásával. Pontosabban a találmány tárgya eljárás olyan szöveti plazminogén aktivátort kódoló DNS 5 szakaszt tartalmazó élesztő hibrid-vektor előállítására, melyben a kódoló szakasz a kifejeződését befolyásoló promoter-rendszerhez kapcsolódik, az említett hibrid vektorral transzformált, vagy a szöveti plazminogén 10 aktivétől' génjét kromoszómába integrált formában tartalmazó élesztösejtek előállítására, valamint új szöveti plazminogén aktivátorok előállítására.
A fejlett országokban a megbetegedések 15 és halálozások fő okozói a vérrögök. A vérrögök fibrinböl állnak, mely a trombin enzim hatására keletkezik oldódó prekurzorából, a fibrinogénból. Számos enzim és egyéb anyag biztosítja, hogy a vérrögök normális körül- 20 menyek között csak akkor és ott keletkeznek, ahol a vérveszteség megakadályozása céljából szükség van rájuk.
Az emlősök vérplazmája olyan enzimrendszert tartalmaz, mely képes feloldani a 25 fibrint a vérrögökben. A fibrinolitikus rendszer egyik komponense egy enzimcsoport, a plazminogén aktivátorok, melyek a plazrainogént (a plazmin inaktiv proenzim formáját) a proteolitikus enzimmé, plazminná alakítják. A 30 plazmin ezután oldható termékek keletkezése közben lebontja a rögök fibrin-vázát. Azokban az esetekben, mikor a szervezet trombolitikus aktivitása nem elegendő a keletkezett intravaszkuláris trombuszok eltávolítására, 35 például Lrombo-embolizniusban vagy operáció utáni komplikációban szenvedő betegeknél, elkerüIheLetlen külső trombolitikus anyagok alkalmazása.
Trombolitikus terápia céljaira a humán 40 piazminogén két aktivátora kapható kereskedelmi forgalomban az urokináz, emberi vizeletből vagy tenyésztett vesesejtekből izolált szerin-protáz, és a sztreptokináz, egy sztreptokokkuszokból előállítható baktérium- 45 fehérje. Mivel egyik enzimnek sincs specifikus affinitása a fibrinhez, az ezekkel az anyagokkal végzett trombolizis együtt jár a plazminogén általános aktiválásával, melynek eredménye a koagulációs fehérjék megkülön- 50 böztel.és nélküli emésztése, ezáltal lényegesen megnő a belsó vérzés veszélye a kezelés során. Továbbá a sztreptokináz az emberi szervezet számára idegen fehérje, ennélfogva indukálja a működését leállító, semlegesítő 55 antitestek képződését és ártalmas, potenciálisan halálos allergiás reakciókhoz vezet.
A plazminogén aktivátorok másik csoportja, a szöveti plazminogén aktivátorok (ezentúl ,ΤΡΑ'-ként hivatkozunk rójuk) is 60 ismertek a legtöbb emberi szövetben. A különböző szövetekből származó TPA-k molekuláris tulajdonságaikat tekintve valószínűleg különböznek egymástól, de immunolögiailag hasonlók. Különböznek az urokináztól kémiai 65 és immunológiai tulajdonságaik alapján, a fibrin jelenlétében nagymértékben megnövekedett fibrinolitikus hatásuk alapján, valamint a fibrinhez való nagy affinitásuk alapján [(1), (2)1. A fibrinhez való nagy affinitásuk miatt a TPA-k csak a vérrög szomszédságában működnek, ezáltal lényegesen csökken az ellenőrizetlen vérzés veszélye.
A TPA két molekuláris formában létezik: az aktív kétláncos formában (TPA) valamint az inaktív egyláncos formában [TPA-prekurzor vagy .pro-TPA ezentúl, lásd (2), (3), (4)]. A pro-TPA-t aktív TPA-vá alakíthatjuk katalitikus mennyiségű plazminnal inkubálva, előnyösen fibrin jelenlétében. A plazmin tehát saját szintézisét indítja be.
A humán TPA forrása például a különböző emberi szövetek extraktuma (nem használhatók kereskedelmi célokra) valamint különböző olyan emberi daganatsejtek, melyekről kimutatták, hogy különböző mennyiségben TPA-kat termelnek [(5), (6)).
Egy újabban benyújtott szabadalmi bejelentésben (EP 41766, feltatlálók D. Collen, D.C. Rijken és 0. Matsuo) egy 72 000 Dalton molekulasúlyú TPA-t írnak le, melyet tenyésztett humán melanómn sejtvonalból (Rowes) izoláltak.
Azonban a transzformált, rákos sejtvonalak (mint a melanoinasejtek) használata szükségszerűen korlátozza az innen izolált TPA-k alkalmazását a gyógyászatban. Továbbá bebizonyosodott, hogy nehéz emlőssejteket nagy térfogatban tenyészteni, ami pedig előfeltétele annak, hogy az ilyen sejtek által kiválasztott fehérjéket olcsón és gazdaságosan állítsuk elő. Az emlőssejtek generációs ideje lényegesen magasabb, mint a mikroroganizinusoké, ezért megfelelő nagy sejtsűrüség elérése hosszabb fermentációs időt igényel. Viszont az emlőssejtek növesztésével elérhető sejtsürűség lényegesen alacsonyabb annál, mint amit mikroorganizmusok nagy térfogatban való tenyésztése során általában elérnek. Ezenkívül a mikroorganizmusokhoz viszonyítva a törzsfejlesztés is nehéz.
Ennélfogva előnyösnek tűnik a TPA előállítása mikroorganizmusokkal, felhasználva az ipari mikrobiológia jólfejlett technológiáját és az újabb fejlődést rekombináns DNS technológiában.
Éppen mostanában, humán melanóma sejtvonalból származó, humán szöveti típusú plazminogén aktivátort kódoló cDNS-t klónoztak és fejeztek ki Eschericia coli-ban [(7), (8)1. Egy estben (7), a keletkezett polipeptidről kimutatták, hogy az autentikus humán TPA-ra jellemző fibrinolitikus aktivitással rendelkezik.
Azonban szenyezésként gyakran endotoxinokat találnak E, coli-bó] származó fehérjekészítményekben. Egy hasznos gyógyászati termékből ezeket drága tisztítási lépésekkel kell eltávolítani.
HU 201115 Β
Mivel az összes eukariótában közös a genetikai információ kifejeződésének mechanizmusa, ezért az eukarióta gének kifejeződése nagyobb hatásfokkal mehet végbe, egy eukarióta gazdaszervezetben mint E. coliban. Az alkalmazható eukarióta szervezetek közül az élesztőt legkönnyebb kezelni. Az élesztő kiválasztási módja hasonlít a magasabb állati sejtekére és ismert, hogy az élesztösejtek képesek megváltoztatni a fehérjéket a szignál-szekvencia (egy fehérje töltetlen N-terminális része, általában lehasad a kiválasztási transzport során) lehasításával (9). Ráadásul ügy látszik, hogy egy eukarióta gazdaszervezet kiválasztási bioszintézis útjába belépő és azon átjutó fehérjék hajlamosak a citoplazmában szintetizált fehérjékhez viszonyítva nagyobb mértékű harmadlagos szerkezetet létrehozni. Érdekes megjegyezni, hogy úgy látszik, prokariótákban, mint például E. coli-ban nincsenek magasabb fokú rendezettségű nagy fehérjék.
A glikozilezó rendszer kapcsolatban áll a kiválasztó bioszintézis úttal. A glikozilezett fehérjékhez vezető alap lépések hasonlóak minden eukarióta szervezetben és várható, hogy az élesztösejtek, az E. coli-szerű prokarióta sejtekkel szemben, képesek glikozilezett fehérjék előállítására (jóllehet az élesztő glikozilezési bioszintézis útjában néhány utolsó lépés különbözik az emlős sejtekétől és ezért esetleg módosítani kell élesztőben).
Mivel az élesztő egy mikroorganizmus, az élesztősejteket könnyű tenyészteni. Az egységnyi térfogatú tenyészléból nyerhető sejttömeg lényegesen magasabb élesztőnél mint E. coü-nál. Ezenkívül az élesztő viselkedése fermentáció közben jól ismert, és a nagytérfogatú fermentációs eljárások körülményeit is meghatározták. Sőt az élesztőseitek mentesek az endotoxinoktól.
Számos módszer ismert szöveti plazminogén aktivátorok előállítására, szővettenyésztési eljárással vagy rekombináns DNS technológiával, E. coli-t használva gazdaszervezetként. TPA élesztővel való előállításának módszerét, mely egyesíti a könnyen kezelhető és tenyészthető mikroorganizmus, valamint egy eukarióta szervezet jelenléte előnyeit, még nem írták le. A találmány célja tehát ilyen eljárás biztosítása. A jelen találmány tárgya továbbá egy beépített TPA kódoló-szakaszt hatásosan kifejező élesztó-vektorrendszer előállítása.
1. TPA kódoló-szakaszt tartalmazó hibrid-vektorok
A jelen találmány tárgya eljárás egy élesztőpromotert, és a promoterrel szabályozott TPA kódoló szakaszt tartalmazó élesztő hibrid-vektorok előállítására. A TPA DNS, mely a jelen találmány szerint, részét képezi az élesztő hibrid-vektoroknak, humán erede4 tű, és bármely TPA előállítására képes sejtből származhat. Ezek a sejtek lehetnek rákos és nem rákos eredetűek, és előnyösen egy elfogadott sejtvonalból származnak.
A megfelelő sejtre példa lehet a melanómasejt, úgymint Bowes vagy Maime-sejt, fib— roszarkómasejt, epidermális karcinóma, hólyag karcinóma, hipernefróma vagy liposzarkómasejt, Hela-sejt, fibroblasztok, limfociták, keratociták vagy mell epitéliális vagy embrionális vesesejtek. A jelen találmány előnyös kiviteli formájában Hela-sejteket használunk.
A TPA DNS lehet kromoszómális DNS vagy i cDNS. A kromoszómális TPA DNS-t a TPA gént j tartalmazó génkönyvtárból izolálhatjuk, a j
TPA cDNS-t az mRNS úton állíthatjuk eló, a j szakterületen ismert módszerekkel lehetséges ?
a TPA-t kódoló szakasz egy részének, vagy } a gén egy elmutált variánsának használata, j mely azonos, vagy megváltozott proteolitikus hatást és/vagy aktiválási tulajdonságot mutat a pro-TPA-nak aktív TPA-vá való konverziója során. Ezen géntermékek közül néhány mutathat új, értékes tulajdonságokat.
A jelen találmány szerinti élesztő promoterek az élesztő, pontosabban a Saccharomyces cerevisiae kromoszómális DNS-éből származnak. A TPA kifejezéséhez előnyösen nagyon jól kifejeződő élesztögén promoterét használjuk. így a TRP1 gén, az ADRI vagy ADHII gén, a savas foszfatáz (PH03 vagy PH05) gén, az izocitokróm gén promotere, vagy a glikolitikus enzimeket kódoló gének egy promotere, például az enoláz, gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogénáz (GADPH), 3-foszfoglicerát-kináz (PGK), hexokináz, piruvát dekarboxiláz, foszfo-fruktokinéz, glükóz-6-foszfát-izomeréz, 3-foszfoglicerát mutáz, piruvát-kínáz, triózfoszfát-izomeráz, foszfoglükóz-izomeráz és glükokináz gének promotere, vagy az a illetve alfa-faktort, az élesztő szexuális feromonjait kódoló gének promotere használható. A jelen találmány szerinti előnyös tulajdonságú vektorok transzkripciós kontroll alatt álló promotert tartalmaznak. Az ilyen típusú prometereket, például a PHO5 és CAPDH gének promotereit ki- és bekapcsol- j hatjuk a növekedés körülményeinek változta- í tásával. A PH05 promoter például a kísérlete- I zó tetszése szerint lehet represszálva vagy j derepresszálva, csupán a tápkőzegben levő !
szervetlen foszfát koncentrációjának növelé- j sével vagy csökkentésével. így a promoter i az élesztő exponenciális növekedési szakaszában represszálva lehet, és csak a korai stacioner fázisban, maximális sejtsűrűségnél kapcsoljuk be (depreszáljuk), lehetővé téve a PH05 promoter által kontrollált gén kifejeződését. Ez a tulajdonság, meg a transzkripció magas szintje együtt teszik a PH05 promotert a jelen találmány szerinti előnyös, promoterré.
A jelen találmány szerinti hibrid-vektorokban az élesztőpromotert működőképesen kapcsoljuk a TPA kódoló szakaszhoz, hogy
-3HU 201115 Β biztosítsuk a TPA hatékony kifejeződését. A jelen találmány egy előnyös kiviteli alakjában az élesztópromotert közvetlenül kapcsoljuk az érett TPA kódoló szakaszához, a kapcsolódásnál egy transzlációs startjelet beépítve. 5 Az élesztő promoter és a TPA kódoló szakasza összekapcsolására alkalmas előnyös szakasz a fő mRNS start és az említett promoterhez természetesen kapcsolódó ATG triplett között van. 10
A jelen találmánynak egy másik előnyös kiviteli formájában szignálszakasz is található a konstrukcióban. Azok a megfelelő szignálszakaszok, melyek természetesen kapcsolódnak a használt promoterhez, főleg a PHO5 15 szignálszakasz vagy TPA szignálszakasz. Más szignálszakaszok, például az élesztő invertáz vagy alfa-faktor géneké is használható. Egy változat szerint fuzionált szignálszakaszokat állíthatunk elő, a használt promoterhez tér- 20 mészetesen kapcsolódó gén szignálszakaszának egy részét a TPA szignálszakaszának egy részével összekötve. Azok az előnyös kombinációk, melyek lehetővé teszik a szignálszakasz és az érett TPA aminosav-kódoló 25 szakasz közötti pontos hasítást. További szakaszokat, például pro- vagy spacerszakaszokat, melyek vagy hordoznak, vagy nem, speciális feldolgozási jeleket, is tartalmazhat a konstrukció, hogy megkönnyítsék a prekur- 30 zor molekulák pontos megváltoztatását. Más megoldás szerint olyan fúziós fehérjék állíthatók eló, melyek a helyes in vivő vagy in vitro érést lehetővé tevő belső feldolgozó jelet tartalmaznak. A feldolgozó jelek előnyösen 35 Lys-Arg csoportot tartalmaznak, melyet felismer egy, a Golgi-membránban található élesztő-endopeptidáz.
A TPA kifejeződése során a géntermék bejut a kiválasztási útba és periplazmatikus 40 térbe kerül. Ha a sejtfalon keresztül további kiválasztást tudunk elérni a tenyészlébe, ezáltal nagymértékben fokozható a termelőképesség. A kinyerési eljárás is egyszerűsíthető, ha nem kell a sejteket feltárni. A TPA-t 45 ezenkívül az N-terminális véghez hozzáadott metionin nélkül nyerhetjük ki, mivel az érett kódoló szakasz előtt nincs szükség egy ATG triplettre, mint transzlációs startjelre. A glikozilezett TPA-nak számos tulajdonsága van, 50 mely a glikozilezetlen TPA-val szemben előnyössé teszi. A glikozilezett TPA jobban hasonlít az emlős sejtekből kinyert eredeti TPA-ra mint a glikozilezetlen. A TPA szerű fehérjék harmadlagos szerkezete valószínűleg 55 bizonyos fokig függ a glikozilmaradékok jelenlététől. Várható, hogy a TPA molekulához kapcsolósó szénhidrát molekulának előnyös hatásuk van a kémiai stabilitásra és a farmakológiai hatásra. 60
Az élesztópromoter és a TPA-t kódoló szakasz mellett a találmány szerinti vektorok további, a promoter működése, azaz a TPA-t kódoló szakasz kifejeződése szempontjából lényegtelen, vagy kevésbé fontos további 65
DNS szakasz(oka)t tartalmaznak, de ezeknek fontos funkciójuk lehet, például az említett hibrid vektorokkal transzformált élesztösejtek szaporításában. A további DNS szakaszok) származhatnak a prokarióta és/vagy eukarióta sejtekből, és kromoszómális és/vagy extrakromoszómális DNS szakaszokat tartalmazhatnak. A további DNS szakaszok származhatnak (vagy tartalmazhatnak) plazmid DNS-ból, úgymint bakteriális vagy eukarióta, plazmid DNS-ból, virális DNS-ból és/vagy kromoszómális DNS-ból, úgymint baktérium, élesztő vagy magasabb rendű eukarióta kromoszómális DNS-ból. Az előnyös tulajdonságú hibrid vektorok baktérium-plazmidokból, főleg az Escherichia coli PBR322 vagy rokon plazmidokból, a lambda fágból, az élesztő 2 mikronos plazmidjából és/vagy élesztő kromoszómális DNS-ból származó további DNS szakaszokat tartalmaznak.
A kiegészítő DNS szakaszok előnyösen élesztő replikációs origót és egy élesztőben működő, szelektív markert tartalmaznak. Az élesztő replikációs origót, például egy kromoszómális, autonóm replikálódó szakaszt (ars) tartalmazó hibrid-vektorok transzformálás után autonóm módon extrakromoszómálisan fennmaradnak az élesztösejtben és autonóm módon replikálódnak a mitózis során. Az élesztő 2 mikronos plazmid-DNS-ével homológ szakaszokat tartalmazó hibrid vektorok is használhatók. Ezek a hibrid-vektorok rekombinációval integrálódnak a sejtben már jelenlévő 2 mikronos plazmidokba vagy autonóm replikálódnak. A 2 mikronos szakaszok különösen alkalmasak nagy frekvenciával transzformáló plazmidokhoz, és nagy kópiaszámot eredményeznek.
A találmány szerinti hibrid-vektorok ezenkívül a gazdaélesztó kromoszómáján levő gén egy részét tartalmazó DNS szakaszt tartalmaznak (például a PHO5 gént vagy promoterét, a TPA-t kódoló szakaszhoz kötve). A homológ szakasz révén, mely 20-100 dezoxinukleotid hosszúságú lehet, az egész vektor, vagy annak lineáris fragmentje stabilan beépülhet a gazdakromoszómába rekombináció útján, igy a szaporítás során az utódsejtek megtartják, szelekciós nyomás nélkül is, a bevitt genetikai anyagot. Például ha a TPA gén két végére egy élesztő kromoszómális génben természetesen előforduló szakaszokat kötünk, például egy élesztő kromoszómális gén promoter szakaszát az 5’ végre és az említett gén 3’ végének egy részét a 3’ végre, akkor a TPA-t kódoló gén stabilan beépülhet az említett kromoszómális gén helyére. A jelen találmány egy előnyös kiviteli formájában a PHO5 promotert, a TPA-t kódoló szakaszt és a PHO5 3' végét tartalmazó lineáris DNS szakaszt használjuk arra, hogy a TPA gént beépítsük a megfelelő élesztókromoszómába, azaz a II élesztőkromoszómába, a PHO5 gén helyére.
HU 201115 Β
Ami az élesztőben használható szelektív markergéneket illeti, bármely olyan marker -gént használhatunk, mely a marker fenotípusos kifejeződése révén megkönnyíti a transzformánsok szelekcióját. Az élesztőben használható gének közül különösen az antibiotikum-rezisztencia gének megfelelőek, vagy élesztóauxotróf mutánsok esetében a gazdaszervezet hibáit javító gének.
Az említett gének pédául rezisztenssé teszik az élesztósejteket cikloheximidre, vagy prototróffá tesznek egy auxotrót élesztőmutánst, például egy URA3, LEU2, HIS3 vagy TRPi gént hordozó sejtet.
Az is lehetséges, hogy markerként olyan struktúrgéneket használjunk, melyek egy autonóm replikálódó szakaszhoz vannak kötve, azzal a feltétellel, hogy a transzformálandó gazdaszervezet auxotróf legyen a marker -génről kifejeződő termékre.
A találmány szerinti hibrid-vektorok előnyösen olyan további DNS-szakaszokat is tartalmaznak, melyek egy bakteriális gazda, főleg Escherichia coli, replikációs origóját és egy szelektív genetikai markerét is hordozzák. Az Escerichia coli replikációs origo és egy Escerichia coli marker jelenléte egy élesztő hibrid-vektorban előnyös tulajdonságokat kölcsönöz annak. Először, nagy menynyiségű hibrid-vektor DNS állítható elő Escherichia coli növesztésével és aniplifikálásával, és másodszor a hibrid-vektorok összeillesztését kényelmesen megtehetjük Escherichia co/f-ban felhasználva az Escerichia colP -ra alapozott klónozási technológia teljes repertoárját. Az Escherichia coli plazmidok, úgymint a pBR322 és hasonlók, mind Escherichia coli replikációs origót, mind Eschrichia coli-ban megnyilvánuló antibiotikum rezisztenciát, hordoznak, ezáltal előnyösen használhatók élesztő hibrid-vektorok részeként.
A jelen találmány szerinti hibrid-vektorok előnyösen egy élesztógén 3’ végét is tartalmazzák, melyekben a helyes transzkripciós terminációs jel és a poliadenilezés van kódolva. Megfelelő 3’ szakasz például az, amely a használt promoter génjéhez természetesen kapcsolódik, főleg a PH05 gén 3’ szakasza.
Azt a DNS-szakaszt, amely például az élesztő- és baktérium-gazda replikációs origóját és genetikai markerét tartalmazza, a továbbiakban .vektor DNS'-ként említjük mely az élesztőpromoterrel és a TPA kódoló szakasszal együtt a találmány szerinti hibrid-vektort képezi.
A jelen találmány tárgya olyan hibrid-vektorok, melyek az élesztő gazdasejtben képesek szaporodni és fenotipusos szelekciót biztosítani, élesztópromotert és a szöveti plazminogén aktivátort kódoló DNS szakaszt tartalmazzák olyan pozícióban, hogy az említett DNS-szakaszhoz a transzkripciós start és stop-jelek valamint a transzlációs start és stop-jelek kapcsolódnak a hibrid-vektorban az említett promoter kontrollja alatt olyan módon, hogy egy transzformált élesztótőrzsben az említett DNS szakasz kifejeződik és szöveti plazminogén aktivátor keletkezik.
A hibrid-vektorokat a szakterületeken ismert módon állítjuk eló, például úgy, hogy a vektor DNS-be egy élesztópromotert és az említett promoterrel kontrollált TPA-t kódoló szakaszt építünk be.
Egy megfelelően feltérképezett lineáris vagy előnyösen cirkuláris, például baktérium plazmid DNS-t vagy hasonlót (lásd előzőekben) használhatunk, mely legalább egy restrikciós hellyel, előnyösen kettő vagy több restrikciós hellyel rendelkezik. A vektor DNS előnyösen már tartalmazza az élesztőés/vagy baktériumgazda replikációs origóját és genetikai markereit.
A vektor DNS-t megfelelő restrikciós endonukleázzal hasítjuk. A hasított DNS-t az élesztópromotert és a TPA-t kódoló szakaszt tartalmazó DNS-fragmenthez kötjük. A promoter és a TPA-t kódoló szakasz bekötése előtt vagy után (vagy lehet egyidejűleg is) lehetséges az élesztő- vagy baktériumgazda replikációs origójának és/vagy genetikai jelzógénjének beépítése is. Minden esetben úgy kell megválasztani a hasítási és összekapcsolási körülményeket, hogy ne keletkezzen zavar a vektor DNS és a promoter lényeges funkciójában. A hibrid vektort összerakhatjuk lépésenként, vagy két, az összes érdekes szakaszt tartalmazó szakasz összekötésével.
Különböző technikákat használhatunk DNS szakaszok in vitro összekapcsolására. Tompavégű (végig bázispárokat tartalmazó DNS duplex), bizonyos restrikciós enzimekkel előállított DNS szakaszokat közvetlenül T4 DNS-ligázzal kapcsolhatjuk. Szokásosabb, ha a DNS szakaszokat egyszálú, tapadós végeken keresztül kötjük . össze, a kovalens kötést DNS-ligázzal, például T4 DNS-ligázzal hozva létre. Az ilyen egyszálas .tapadós vég'-eket a DNS-t egy másfajta, lépcsős végeket képező endonukleázokkal hasítva állítjuk elő (a DNS duplex két szálát különböző, egymástól néhány nukleotid távolságra levő pontokon hasítja az ilyen enzim).
Egyes szálakat úgy is előállíthatunk, hogy tompa vagy lépcsőzetes végekhez terminális transzferáz enzimmel építünk hozzá nukleotidokat (homopolimer toldás), vagy egy tompavégű DNS-szakasz egyik szálát megfelelő exonukleázzal, például lambda-exonukleázzal visszaemésztjük. A lépcsős végek előállításának másik megközelítési módja, ha a tompavégü DNS-szakaszokhoz olyan, kémiailag szintetizált linker (kötő) DNS-t kötünk, mely egy lépcsős véget képező restrikciós endonukleáz felismerési helyét tartalmazza, és a kapott DNS-t a megfelelő endonukleázzal emésztjük. Hogy megfelelően kifejeződjön, a TPA gént a transzkripciós (élesztő promoter) és transzlációs (riboszómális kötőhely) funk-59
HU 201115 Β ciókat hordozó szakaszokhoz megfelelően illeszteni kell. Először a promotert tartalmazó DNS-szakaszt és a TPA-t kódoló szakaszt a helyes orientációban kell összekapcsolni. Ha két orientáció lehetséges, akkor a helyeket szokásos restrikciós elemzéssel választjuk ki. Helytelenül orientált TPA gént tartalmazó hibrid-vektorokat újra orientálhatunk, ha a beépített gént megfelelő restrikciós endonukleázzal kihasítjuk, és a gént újra összekötjük a hibrid vektor fragmettel. A helytelen orientációt elkerülhetjük, ha két olyan DNS-szakaszt kötünk össze, melyek mindegyike a két végén különböző restrikciós enzimmel van emésztve. A hibrid-vektort továbbá úgy kell elkészíteni, hogy az lehetővé tegye a helyes transzkripció iniciációt és terminációt. Ami az utóbbi pontot illeti, a traszkripció előnyösen az élesztő kromoszómális DNS-éból vagy az élesztő 2 mikronos plazmidból származó DNS szakaszban végződik. A transzkripció előnyösen egy élesztőgén, például a PH05 vagy TRP1, transzkripciós terminációs jelét tartalmazó DNS szakasznál áll le. Másodszor, megfelelő leolvasási fázist kell létrehozni. A promoterszakasz és TPA-t kódoló szakasz nukleotid sorrendje rendszerint ismert az összekapcsolás előtt, vagy egyszerűen meghatározható [lásd (10)], úgy hogy nem okoz gondot a helyes leolvasási fázis létrehozása.
Ha az érett TPA direkt kifejeződésére van szükség, akkor az adott estben a promoterszakaszt követő és/vagy adott estben az érett TPA-t kódoló szakaszt megelőző szignálszakaszokat el kell távolítani, például egy exonukleázzal, mondjuk Bal31-gyel való emésztéssel. Az élesztő promoter és a TPA-t kódoló szakasz közvetlen összekötésére előnyös szakasz a fő mRNS startjel és az élesztő promoterhez természetben kapcsolódó gén kódoló szakaszának ATG-triplettje között van. Az ebben a régióban való összekapcsolásnál a TPA-t kódoló szakasznak saját ATG-triplettel kell rendelkeznie a transzlációs iniciálásához, vagy ezt egy további szintetikus oligonukleotid hozzáadásával kell létrehozni. Az élesztőpromotert egy szintetikus oligodezoxinukleotid, mint összekötő molekula felhasználásával is hozzákapcsolhatjuk a TPA-t kódoló szakaszhoz, igy a promoter régiót, ha lehetséges, leszűkíthetjük, a 3’-végénél úgy, hogy hiányozzon egy előre meghatározott számú bázispár belőle. Analóg módon, a TPA-t kódoló szakaszt is emészthetjük az 5’ vége közelében. Ezután egy olyan szintetikus oligodezoxinukleotidot állíthatunk elő, melyet ha az élesztőpromoter és a TPA-t kódoló szakasz összekapcsolására használunk, akkor visszavesszük a hiányzó bázispárokat, beleértve egy ATG transzlációs iniciációs jelet, és a TPA-t kódoló szakasz a promoterhez képest a helyes leolvasási fázisba kerül.
A közbenső termékeket, például azokat a vektorokat, melyekből még egy vagy több lényeges funkció hiányzik, valamint a találmány szerinti végső hibrid-vektorokat adott esetben egy baktérium gazdába, főleg Escherichia co/i-ba transzformáljuk a fenti okok miatt (például a közbenső termékek és hibrid-plazmidok előállítása nagy mennyiségben). Ezért a bakteriális replikációs origót és genetikai marker(eke)t tartalmazó bakteriális vektorok, úgymint az Escherichia coli pBR322 plazmid, vagy ennek a fenti alkotókat tartalmazó fragmentjei a legelőnyösebb tulajdonságú vektorok. Ilyen bakteriális vektor használata esetén az élesztő hibrid-vektorok előállításának végső lépései közé tartozik előnyösen az élesztő genetikai marker és replikációs origó beépítése.
2. Az élesztő transzformálása TPA-t kódoló szakaszt tartalmazó hibrid-vektorokkal
A jelen találmány tárgya továbbá eljárás szöveti plazminogén aktivátor termelésére képes transzformált élesztösejtek előállítására, azzal jellemeve, hogy az 1. pontban leírt hibrid-vektorok bármelyikével transzformálunk élesztósejteket, vagy a szöveti plazminogén aktivátor génjét integráljuk egy élesztőkromoszómaba.
A használható élesztők közé tartoznak a Saccharomyces, Schiosaccharomyces, Torulopsis és rokon nemzetségekbe tartozó élesztőfajok [lásd (11)] főleg a
Saccharomyces cevevisiae törzsei.
Az élesztő hibrid-vektorokkal való transzformálását a szakterületen ismert eljárásokkal hajthatjuk végre, például a Hinnen és munkatársai által leírt [lásd (12)] módszer, szerint. Ez a módszer három lépésre bontható.
1) Az élesztő sejtfal eltávolítása.
2) A .csupasz' élesztősejtek (szferoplasztok) kezelése a transzformáló DNS-sel PEG (polietilénglikol) és Ca2* ionok jelenlétében.
3) A sejtfal regenerálása és a transzformáit sejtek szelekciója szilárd agarrétegben.
Előnyős módszerek:
ad 1) Az élesztő sejtfalát enzimatikusan távolítjuk el különböző glükozidáz készítmények, például csiga bélnedv (például GlusulaseR vagy HelicaseR) vagy mikroorganizmusokból nyert enzim-keverékek (például ZymolyaseR) felhasználásával, ozmotikusán stabilizált oldatokban (például 1 M szorbitol). ad 2) Az élesztő szferoplasztok PEG jelenlétében aggregálódnak és a citoplazma-membránok lokális fúziója indukálódik. A .fúzió-szerű ’ állapot nagyon fontos, és számos transzformált élesztősejt diploid vagy éppen tripolid lesz a transzformációs eljárás során. A fuzionált szferoplasztok szelekcióját lehetővé tevő eljárásokat használhatunk a transzformánsok dúsítására, azaz könnyebben
-611
HU 201115 Β kiválaszthatók a transzformált sejtek az előre szelektált fúziós termékek között, ad 3) Mivel a sejtfal nélküli élesztősejtek nem osztódnak, a sejtfalat regenerálni kell. A regenerálást kényelmesen végrehajthatjuk a 5 szferoplasztokat agarba ágyazva. Például olvasztott agart (körülbelül 50 °C) keverünk el a szferoplasztokkal. Az oldatot az élesztő növekedési hőmérsékletére hűtve (körülbelül 30 Cl szilárd réteget kapunk. Ez az agarré- 10 teg megakadályozza, hogy a szferoplasztoktól gyorsan eldiffundáljanak és ezáltal elvesszenek a fontos makromolekulák, így megkönynyíti a sejtfal regenerálódást. A sejtfal-regenerálódását azonban elérhetjük úgy is (jólle— 15 hét alacsonyabb hatékonysággal), ha a szferoplasztokat előre elkészített agarrétegre szélesztjük.
A regeneráló agart előnyösen úgy készítjük el, hogy a transzformált sejtek rege- 20 nerálását és szelekcióját is lehetővé tegye egyidejűleg. Mivel szelektív markerekként általában az aminosavak bioszintézisében résztvevő enzimeket kódoló géneket használunk (lásd 1. fejezet), a regenerálást elönyö- 25 sen élesztő minimális agartáptalajon végezzük. Ha nagyon magas hatékonyságú regenerálásra van szükség, előnyős a következő kétlépéses eljárás: 1) a sejtfal regenerálása gazdag, komplett táptalajban és 2) a transz- 30 formált sejtek szelekciója a sejtréteg szelektív agarlemezekre való replikázásával.
Ha a hibrid-vektor nem tartalmaz marker gént, a transzformált sejteket más módszerek felhasználásával is azonosítani lehet. 35 Ilyen módszer például az in situ hibridizálás a hibrid-vektor egyes szakaszával homológ, jelzett DNS fragmenttel [például Hinnen és munkatársai módszere szerint, lásd (12)], in situ immunassay, ha a bevezetett gén terme- 40 kével szembeni antitest elérhető, vagy más, a transzformáló plazmid(ok) által kódolt gének termékeit mérő módszerek.
Más módszer szerint, az élesztőt ko-transzformálhatjuk egy, a találmány szerinti 45 hibrid-vektorral, valamint egy második, élesztő genetikai markert tartalmazó vektorral. Ha a két különböző vektornak van közös DNS szakasza (ezek lehetnek a vektorokban levő bakteriális eredetű szakaszok), rekombi- 50 náció játszódik le, mely egy fuzionált, szelektálható hibrid-molekulához vezet.
Az élesztőt ko-transzformálhatjuk még olyan lineáris DNS szakasszal, mely a két végén az élesztő kromoszómájával homológ sza- 55 kaszokhoz kapcsolódó TPA gént tartalmaz, valamint egy élesztő szelektív markert tartalmazó vektorral. A ko-transzformació lehetővé teszi az olyan DNS-t felvett sejtek dúsítását, melyekre nem lehet közvetlenül sze- θθ lektálni. Mivel a kompetens sejtek bármilyen típusú DNS-t felvesznek, a szelektív vektorral transzformált sejtek nagy százaléka tartalmaz bármely, még hozzáadott DNS-t (azaz a TPA gént a homológ 3', 5' szakaszokkal 55 tartalmazó DNS szakaszt (50). Elegendő hoszszú homológ szakaszok segítségével (például körülbelül 20-100 dezoxinukleotid hosszúságú) a TPA gén stabilan beépül a gazda-kromoszómába. Kiemelve az az eset, ha a lineáris DNS szakasz a TPA gént szabályozó PHO5 promotert és a PUO5 terminátor szakaszt tartalmazza. Ez a konstrukció vezet a TPA génnek a PH05 gén helyére való stabil beépüléséhez az élesztő II. kromoszómába.
A jelen találmány tárgya továbbá egy élesztópromotert, az említett promoterrel kontrollált szöveti plazminogén aktivátor gént és egy élesztő géntranszkrípciós terminációs jelét tartalmazó DNS-szakaszt tartalmazó lineáris DNS-darab.
A kapott, a találmány szerinti hibrid plazmidokat tartalmazó élesztötörzsek TPA-termelő képességét a szakterületen ismert módszerekkel, mutációval és szelekcióval növelhetjük. A mutagén kezelést végezhetjük például ultraibolya fénnyel való besugárzással, vagy megfelelő kémiai reagensekkel.
A találmány tárgyai továbbá azok az élesztó-gazdasejtek, melyeket élesztőpromotert és az említett promoterrel kontrollált TPA-t kódoló szakaszt tartalmazó hibrid-vektorokkal transzformált élesztó-gazdsejtek közül szelektálunk, valamint azok az élesztógazdasejtek, melyekben a szöveti plazminogén aktivátor stabilan integrálódott egy élesztőkromoszómába, és a gén egy élesztőpromoter kontrollja alatt áll, valamint ezek mutánsai.
3. A transzformált élesztósejtek növesztése és a keletkezett TPA izolálása
A jelen találmány szerint a TPA gén élesztőben való kifejeződésének elsődleges terméke a TPA egyláncú prekurzor fehérje (.pro-TPA.). Ha azonban proteázok vannak jelen akár az élesztő-gazdasejtben, a periplazmatikus térben vagy a tenyészlében, az elsődlegesen keletkezett pro-TPA, legalábbis részlegesen kétiáncú TPA-vá alakulhat. A ténylegesen izolált termék ennélfogva lehet TPA, pro-TPA vagy ezek keveréke. Ha a TPA-t kódoló szakaszt a jelen találmány szerinti hibrid-vektorban szignálszakasz előzi meg, a kiválasztás összekapcsolódik legalább részlegesen, glikolizeléssel. A kapott termék tehát tartalmazhat glikozilezett és glikozilezetlen fehérjéket.
A találmány tárgya továbbá eljárás TPA pro-TPA vagy ezek olyan keverékeinek előállítására, melyekben a TPA és a pro-TPA glikozilezett vagy glikozilezetlen formában, vagy ezen formák keverékének alakjában van jelen, azzal jellemzve, hogy élesztőpromotert, és az említett promoterrel kontrollált TPA-t kódoló szakaszt tartalmazó hibrid-vektorral transzformált élesztótórzset, vagy olyan élesztótórzset, melyben a szöveti plaz-713
HU 201115 Β minogén aktivátor génje stabilan integrálódott egy élesztőkromoszómába és egy kromoszómáiig élesztópromoter kontrollja alatt áll, vagy ilyen élesztótörzsek mutánsait megfelelő körülmények között tenyésztjük, a fenti fehérjéket izoláljuk és tisztítjuk és ha szükséges, a kapott TPA-pro-TPA keveréket szétválasztjuk komponenseire, pro-TPA mentes TPA előállítása céljából átalakítjuk a keletkezett pro-TPA-t, TPA-vá, és ha szükséges, a glikozilezett és glikozilezetlen termékek keverékéből elkülönítjük az egyes komponenseket, a glikozilezett fehérjétől mentes glikozilezetlen fehérje előállítása céljából a kapott fehérjékről eltávolítjuk a glikozil-csoportokat.
a) A transzformált élesztősejtek növesztése
A jelen találmány szerinti transzformált élesztősejteket emészthető szén- és nitrogénforrást valamint szervetlen sókat tartamazó tápfolyadékban növesztjük.
Különböző szénforrásokat használhatunk. Az előnyös szénforrások emészthető szénhidrátok, például glükóz, maltóz, mannit vagy laktóz, vagy valamilyen acetát, melyet egyedül vagy megfelelő keverékekben használhatunk. A megfelelő nitrogénforrások közé tartoznak például az aminosavak, úgymint a kazaminosavak, peptidek és fehérjék valamint ezek lebomlási termékei, úgymint a Lripton, pepton vagy húskivonatok, továbbá az élesztőkivonat, malátakivonat, kukoricalekvár, valamint az ammóniumsók, úgymint az ammónium-klorid-szulfét vagy -nitrát, melyeket egyedül vagy megfelelő keverékekben használhatunk. A használható szervetlen sók közé tartoznak például a nátrium-, kálium-, magnézium-, és kalcium-ionok szulfát-, klorid-, foszfát- és karbonát-sói. A tápközeg ezenkívül tartalmazhat növekedésgyorsító anyagokat is. A növekedésgyorsító anyagok közé tartoznak például a nyomelemek, úgymint a vas, cink, mangán és hasonlók, vagy egyes aminosavak.
Az autonóm replikálódó plazmidokkal, például élesztő 2 mikronos DNS-t tartalmazó plazmidokkal transzformált élesztősejtek bizonyos mértékig hajlamosak arra, hogy elveszítsék a bevitt hibrid plazmidot [lásd (13)]. Ezért ezeket az élesztósejteket szelektív körülmények között kell növeszteni, azaz olyan körülmények között, mikor a növekedéshez szükség van a plazmidon kódolt gén kifejeződésére. A jelenleg használt legtöbb szelektív marker aminosav vagy purin bioszintézisben résztvevő enzimet kódoló gén. Ez szükségessé teszi, hogy a megfelelő aminosavat vagy purinbázist nem tartalmazó, szitetikus minimál táptalajt használjunk. Néhány olyan gén is használható, mely egy megfelelő mérgező anyaggal szembeni rezisztenciát hordoz (például a cikloheximid, a G418 aminoglikozid (14), nehézfémek vagy hasonlókkal szembeni rezisztenciát hordozó gének]. Az antibiotikum rezisztenciát tartalmazó vektorokkal transzformáit élesztósejteket a megfelelő antibiotikumot tartalmazó komplex táptalajban növesztjük, így nagyobb növekedési-sebességet és nagyobb sejtsűrűséget kapunk.
A kromoszómába integrálódó DNS-sel transzformált élesztósejtek növesztéséhez nincs szükség szelektív nővesztési körülményekre. Ezek a transzformált sejtek elég stabilak ahhoz, hogy szelektívnyomás nélkül is növeszthetők legyenek. A fenti okból ezeket a sejteket előnyösen koplex táptalajban növesztjük.
Konstitutív promoterrel (például PH03 vagy ADUI] rendelkező hibrid-plazmidot tartalmazó élesztősejtekben az említett promoterhez kapcsolt TPA gén indukció nélkül kifejeződik. Ha azonban a TPA gén szabályozott promoter (például GAPDH, PGK vagy PH05) kontrollja alatt van, a növesztő táptalaj összetételét úgy kell megválasztani, hogy a mRNS maximális szintjét kapjuk, például PHO5 promoter használata esetén, a promoter derepressziója érdekében a növesztő táptalaj csak alacsony koncetráciöban tartalmazhat szervetlen foszfátot.
A tenyésztést szokásos technikával végezzük. A tenyésztési körülményeket, úgymint a hőmérsékletet, a táptalaj pH-ját és a fermentációs időt úgy határozzuk meg, hogy maximális mennyiségű TPA keletkezzen. A választott élesztótörzs előnyösen aerob körülmények között, süllyesztett tenyészetben rázatva vagy kevertetve 25-35 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen körülbelül 30 °C-on, 4-8 pH között, például körülbelül 7-es pH-n, körülbelül 4-20 óráig, előnyösen a maximális mennyiségű fehérje keletkezéséig.
b) A keletkezett TPA izolálása és tisztítása
Miután a traszformált élesztősejtek kielégítő sűrűségig nőttek, a keletkezett fehérje kinyerésének első lépése a fehérje kiszabadítása a sejt belsejéből. A legtöbb eljárásban először a sejtfalat távolitják el glükozidáz enzimes emésztéssel (lásd 2. pont). Ezt követően a kapott szferoplasztokat felületaktív anyagokkal, például Tritonnal kezelik. Másik módszer szerint a sejtek feltárására mechanikai erőket, nyíróeröket (például X-press, French-press) vagy üveggyöngyökkel való rázatást alkalmaznak. A kapott fehérje keverékben szokásos módszerekkel dúsítjuk a TPA-t, úgymint a nem-fehérjeszerű anyagok eltávolítása polietiléniniines kezeléssel, a fehérjék kicsapása triklórecetsavval vagy az oldat ammóniumszulfátos telítésével, gél-elektroforézissel, dialízissel, kromatográfiával, például ioncserélös kromatográfiával, méret-kizárásos kromatográfiával, HPLC-vel vagy reverz fázisú HPLC-vel, molekulaszúréssel 9
-8HU 201115 Β megfelelő Sephadex® oszlopon vagy hasonlókkal. Az előtisztított termék végső tisztítását például affinitáskromatográfiával végezzük, antitest affinitáskromatográfiával, főleg monoklonális antitest affinitáskromatográfiával, a szakterületen ismert módszerekkel oldhatatlan hordozóhoz kötött monoklonális anti-TPA antitestekkel.
A TPA-nak tenyészléból való izoláláséra további előnyös módszer a TPA szelektív adszorpciója specifikus affinitású hordozóra, mely vagy oldhatatlan alapra, például dextránra [például (15)1 kovalensen kötött oldható fibrilláris fragmentekböl áll, vagy főleg Sepharose oszlopra kötött DE-3-ból. A DE-3 tripszin inhibitor, mely az Erythrina latissima (16) magjaiban található. Úgy találták, hogy a DE-3 képes a TPA aktivitását is gátolni. igy a tisztított DE-3 inhibitort oldhatatlan hordozóhoz, például BrCN-nal aktivált Sepharoséí'hoz lehet kapcsolni ismert módszerekkel. A TPA adszorbeálódik az inhibitor hordozóra, és kaotróp anyagot tartalmazó pufferral oldható le.
A jelen találmány egy előnyös kiviteli formájában a tenyészlevet, miután szükség esetén a fent említett tisztítási lépések közül eggyen vagy többön átment, szobahőmérsékleten olyan BrCN-nal aktivált Sepharos^Ü) oszlopon bocsátjuk keresztül, melyhez a DE-3 inhibitor van kapcsolva. Miután átmostuk az oszlopot, az adszorbeált szöveti plazminogén aktivátort eluáljuk, az oszlopot pufferoldattal, például olyan foszfáttal pufferolt sóoldattal mossuk, melynek pH-ja körülbelül 5,5— -6,0 és kaotróp anyagot, például KSCN-t tartalmaz körülbelül 1,4-2,0 mól, előnyösen 1,6 mól koncentrációban. Más módszer szerint benzamidint vagy arginint használhatunk leszorító anyagként. Előnyösen egy felületaktív anyagot, főleg nera-ionos detergenst, úgymint Triton X-10CJ®-t vagy Tween 8C®-t adunk az összes, a tisztítási lépésekben alkalmazott pufferoldatokhoz, hogy megakadályozzuk a szöveti plazminogén aktivátornak az edény falára való adszorpcióját, és megnöveljük stabilitását. A detergenst 0,01-0,1% végkoncentrációban alkalmazhatjuk.
Abban az estben, ha a szöveti plazminogén aktivátor kiválasztódik az élesztösejt periplazmatikus terébe, egyszerűsített módszert alkalmazhatunk. A fehérjét a sejt feltárása nélkül nyerhetjük ki, a sejtfalat enzimatikusan eltávolitva vagy olyan kémiai anyagokkal, például tiol reagensekkel vagy EDTA-val kezelve, melyek megrongálják a sejtfalat és lehetővé teszik, hogy a keletkezett TPA kiszabaduljon. Abban az esetben, ha a TPA a tenyészlébe választódik ki, közvetlenül onnan nyerhetjük ki.
Kromoszómálisan integrálódott TPA gént tartalmazó élesztősejtek tenyésztését, valamint a keletkezett TPA izolálását és tisztítását a fentiekkel azonos módon végezzük.
Olyan TPA előállítása céljából, amely lényegében nem tartalmaz pro-TPA-t, a pro-TPA-t enzimatikusan TPA-vá alakítjuk, például plazminnal, vagy a pro-TPA-ra azonos hatással rendelkező enzimmel.
Olyan pro-TPA előállítása céljából, mely lényegében nem tartalmaz TPA-t, a tisztítási eljárás során vágig előnyösen proteáz inhibitort, úgymint aprotinint (TrasyloíS) vagy bázlkus pankreatikus tripszin inhibitort használunk, hogy gátoljuk az esetleg nyomokban jelenlévő proteázokat, melyek a pro-TPA-nak részleges TPA-vá alakulását okozhatják. A végső tisztítást olyan oszlopon kromatografálva végezzük, mely szelektív affinitású reagenst, például DE-3-at tartalmaz, olyan inhibitor jelenlétében, mely szelektíven csak a TPA-t köti, a pro-TPA-t nem, ilyen pélául a diizopropil-fluor-foszfát (DFP) vagy a nitrofenil-guanidinobenzoát. Ezek a reagensek megakadályozzák, hogy a TPA az affinitásoszlopra adszorbeálódjon. Ennek következtében a TPA keresztülfolyik a DE-3 oszlopon, míg a pro-TPA adszorbeálódik az oszlopra, és a fentiek szerint leoldható onnan.
A glikozilezett és glikozilezetlen fehérjék keverékét például konkanavalin-A Sepharose® oszlopon kromatografálva választhatjuk szét. A glikozilezetlen fehérjék átfolynak az oszlopon, míg a glikozilezett fehérjék szelektíven adszorbeálódnak és ismert módszerekkel, például kaotróp anyaggal (KSCN) kombonált alfa-metil-mannoziddal eluálhatók.
A glikozil-csoportokat enzimatikus módszerekkel, például endoglikozidáz II-val is eltávolíthatjuk. Ezzel a módszerrel lehetséges a glikozilezetlen termék előállítása tiszta formában.
A jelen találmány szerint előállított TPA-k és pro-TPA-k értékes farmakológiai tulajdonságokkal rendelkeznek. így ezeket a fehérjéket az ismert plazminogén aktivátorokkal azonos módon használhatjuk emberek kezelésére, trombózis vagy más olyan állapot megelőzésére vagy kezelésére, ahol a plazminogén aktiválás mechanizmusa útján létrejövő helyi fibrinolítikus vagy proteolítikus aktivitásra van szükség, például arterioszklerózis, miokardiális és cerebrális infarktus értrombózis, trombo-embólia, operáció utáni trombózis, tromboflebitisz és diabetikus vaszkulopátia esetén.
A találmány vonatkozik továbbá élesztö-specifikusan glikozilezett TPA-ra és pro-TPA-ra valamint ezek keverékére, pontosabban a Saccharomyces nemzetségbe tartozó élesztőre, főleg a Saccharomyces cerevisiae-re specifikus glikozilezésre.
A találmány tárgya továbbá a TPA, pro-TPA, ezek keveréke, ha a jelen találmány szerinti eljárással állítjuk eló.
A találmány vonatkozik továbbá a feltalált eljárással előállított TPA-ra, pro-TPA-ra és ezek keverékére.
-917
HU 201115 Β
A találmány fö tárgyai a hibrid-vektorok, a transzformált élesztő törzsek, az előállítási eljárásuk, valamint a TPA, pro-TPA vagy keverékük előállításának módja, amint azt a példákban ismertetjük.
mezve, hogy a jelen találmány szerinti biológiailag aktív fehérjét gyógyászatilag megfelelő hordozóval keverjük el.
Az új fehérjék alkalmazása az emberi 5 test megelőző és terápiás kezelésében is tárgyát képezi a jelen találmánynak.
Gyógyászati készitmények
A jelen találmány szerint előállítható üj 10 fehérjék, főleg a TPA és pro-TPA értékes gyógyászati tulajdonságokkal rendelkeznek, így a TPA-t és pro-TPA-t az ismert plazminogén aktivátorokkal azonos módon használhatjuk emberek kezelésére, trombózis vagy 15 más olyan állapot megelőzésére vagy kezelésére, ahol a plazminogén aktiválás mechanizmusa útján létrejövő helyi fibrinolítikus vagy proteolitikus aktivitásra van szükség, például arterioszklerózis, miokardiális és ce- 20 rebrális infarktus, értrorabózis, tromba-embólia, operáció utáni trombózis, tromboflebitisz és diabetikus vaszkulopátia esetén.
A találmány vonatkozik továbbá az aktív adalékanyagból (főleg TPA, pro-TPA vagy 25 ezek keveréke, hatásos mennyiséget tartalmazó gyógyászati készítményekre, melyek olyan szerves vagy szervetlen szilárd vagy folyékony, gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagokat tartalmaznak, melyek alkalmasak 30 parenterális, intramuszkuláris, szubkután vagy intraperitonális adagolásra, és nem okoznak kárt az aktív adalékanyagokban.
Vannak megfelelő, főleg infúziós oldatok, előnyösen vizes oldatok vagy szuszpenziók, 35 ezek felhasználás előtt készíthetők el, például az aktiv adalékanyagot egyedül vagy hordozóval, úgymint mannit, laktóz, glükóz, albumin és hasonlók, liofilezett készítményekből. A gyógyászati készítményt sterilezhetjük 40 és szükség esetén segédanyagokkal, például tartósítószerekkel, stabilizálószerekkel emulgeátorokkal, oldódást elősegítő anyagokkal, pufferokkal és/vagy az ozmózis-nyomást szabályozó sókkal keverhetjük össze. A sterilé- 45 zést kis pórusméretű (0,45 mikrométer átmérőjű vagy kisebb) szűrön való szűréssel hajtjuk végre, majd szükség esetén a készítményt liofilezzük. Antibiotikumokat is adhatunk hozzá, ez is segit megőrizni a sterili- 50 tást.
A jelen találmány szerinti gyógyászati készítményeket egységdózisokba osztjuk szét, például dózisonként 1-2 000 mg gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot és 55 körülbelül 1-20 mg, előnyösen 3-15 mg aktiv adalékanyagot (TPA, pro-TPA vagy ezek keveréke) tartalmazó ampullákba.
A betegség fajtájától, valamint a beteg korától és állapotától függően egy körülbelül 60 70 kg súlyú páciensnek kezelés céljából naponta 3-15 mg-os, előnyösen 5-10 mg-os dózist adunk.
A találmány tárgya továbbá eljárás gyógyászati készítmény előállítására, azzal jelle- 65
Az ábrák rövid leírása
A kővetkező kísérleti részben a jelen találmány különböző részeit közöljük, a függelékben mellékelt rajzokra hivatkozva, melyekben:
Az 1. ábra a PH05 gén nukleotid-sorrendjének megállapításában a PH05 gén forrásaként használt pJDB207/ PHQ5, PH03 és pBR322/PH05 Bam-Sal plazmidok részleges restrikciós térképét mutatja.
A 2. ábrán a PH05 és PH03 savas foszfatáz gének lokalizációját mutatja az élesztő génbankból izolált 5,1 kb méretű fragmenten.
A 3a. és 3b. ábrán a PH05 és PH03 gének promoter-szakaszainak nukleotid-sorrendjét látjuk.
A 4. ábrán a p30 hibrid plazmid készítésének sematikus ábráját látjuk.
Az 5. ábra a PHO5 terminációs fragmentet tartalmazó p31 plazmid konstruálásának sematikus vázlata.
A 6. ébrén a PH05 Sau3A-PstX transzkripciós terminációs fragmentjének nukleotid-sorrendjét látjuk.
A 7. ábra a PHO5 szignálszakasznak a p31 expressziós plazniidból való kivágását mutatja, pontosabban a p31/R plazmid készítését.
A 8. ábrán a 7. ábrán vázolt eljárással kapott kiónokat látjuk.
A 9. és 10. ébrén a PH05/R és PHO5/Y promoterszakaszokat tartalmazó BamHI-EcoRI restrikciós fragmentek nukleotid-sorrendjét látjuk.
A 11. ábrán a Hela sejtekből izolált TPA cDNS klón nukleotid és a megfelelő aminosavsorrendjét látjuk.
A 12. ábrán az M13mp9/PH05- TPA klónozó vektor konstruálásának sematikus vázlatát látjuk.
A 13. ábrán a PH05 szignálszakaszt tartalmazó pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) plazmid konstruálását látjuk.
A 14. ábrán a rövidített PH05 transzkripciós terminációs fragmentet tartalmazó pJDB207/P/fO5-TPAa plazmid konstruálását látjuk.
A 15. ábrán a rövidített PH05 transzkripciós terminációs fragment nukleotid-sorrendjét látjuk.
A 16. ábrán a szignálszakasz nélküli p31RL/TPA (12-2) hibrid-plazmid készítését· látjuk. Az érett TPA-t kódoló szakaszt a PH05 promoterhez kötjük.
A 17. ábrán a pJDB307R/ÍWO5-TPA (12-2) plazmid készítésének sematikus vázlatát látjuk.
-1019
HU 201115 Β
A 18. ábrán a p31/PHO5-TPA18 plazmid készítését látjuk.
A 19. ábrán a PHO5 szignálszakasz és az érett TPA-t kódoló szakasz összekapcsolódását látjuk a p31/PHO5-TPA18 plazmidban.
A 20. ábrán a prepro-TPA szakasz részeit tartalmazó DNS fragmentek izolálásának sematikus vázlatát látjuk.
A 21. ábrán a p31R/SS-TPAú 2 plazmid készítését látjuk.
A 22. ábrán a pBR322/PHO5 Bam-Rsa637 közbenső plazmid készítését látjuk.
A 23. ábrán olyan plazmidok készítését látjuk, melyekben a PH05 szignálszakasz belenyúlik a PH05 kódoló szakaszba.
A 24. ábrán a PH05 promotereknek és a PH05 kódoló szakasz egy részének az érett TPA-t kódoló szakaszhoz való kapcsolódását látjuk az A, B vagy C linkeren keresztül.
A 25. ábrán a PHO5 génnek a TPA gén -nel való kromoszöniális helyettesítését mutatja.
A 26. ábra:
az A ábrához (SDS-PAGE):
1. és 4. csík: standard fehérjék (molekulatömeg-markerek)
2. és 5. esik: melanoma TPA
3. és 6. csík: élesztő TPA az 1-3. csíkok redukáló körülmények között a 4-6 csíkok nem-redukáló körülmények közöLt
A mintákat 12,5%-os gélen futtatjuk, a fehérjét Coomassie Brillant Blue-val festjük; a B ábrához (aktivitás-gél, lásd 23. példa):
1. csík: melanoma TPA
2. csík; élesztő TPA
Kazein-agai—plazminogén felülrétegzés (56).
A következő példák a jelen találmány illusztrálását szolgálják, nem tekinthetők a találmány korlátozásának.
Kísérleti rész
A példákban a következő rövidítéseket használjuk:
BSA: szarvasmarha szérum-albumin
DTT: 1,4-ditiotreitol (1,4-dimerkapto-2,3-butándiol)
EDTA: etiléndiamin-tetraecetsav
SDS: nátrium-dodecil-szulfát
TNE: 100 mM nátrium-kloridot, mM TRIS-HCl-t (pH 7,5) és 1 mM EDTA-t tartalmazó oldat
TE: 10 mM TRIS-HCl-t (pH 7,5) és 1 mM EDTA-t tartalmazó oldat
TRIS-HC1: tris-(hidroximetil)-amino-metán, pH állítás sósavval
MOPS 3-morfolin-propán-l-szulfonsav.
1. Példa
Élesztő génbank előállítása
Saccharomyces cerevisiae S288C törzsből származó nagy molekulasúlyú DNS-ből (17) 30 mikrogrammot 30 percig 37 °C-on inkubálunk, 2 egység EcoRI metilázzal (New England Biolabs) 250 pl, a szállító által javasolt EcoRI metilezéssel pufferban. A DNS-t kicsapjuk etanollal, 500 mikroliter 25 mM-os TRIS.HC1 (pH 8,5), 2 mM MgClz oldatban (EcoRi* puffer) (18) szuszpendáljuk, majd addig emésztjük EcoRi enzimmel (Boehringer), mig a DNS fragmentek méreteloszlásának maximuma a 30-50 kb tartományban lesz (a lambda DNS-t Xhol-gyel emésztve a fragmentek mérete 33 kb és 17 kb). Az EcoRi* körülmények között emésztett élesztő DNS-t szacharóz gradiensen (5-20%-os szacharóz 10 mM TRIS.HC1 pH 7,5, 1 mM EDTA oldatban) frakcionáljuk, 6 órán át 38000/perc fordulatszámmal centrifugálva SW40 rotorban. A gradiens tetejéről 30 0,4 ml-es frakciót szedünk. A 16-os frakció tartalmazza a 30-40 kb méretű DNS fragmenteket. Az ebben a frakcióban levő DNS-t (3 jug) etanollal kicsapjuk, majd 16 órán át 15 °C-on, 15 ul össztérfogatban 1 ug, EcoRI-gyel linearizált pYcl kozmid-vektorba (19) ligáljuk. A llgálast 300 egység T4DNS ligázzal (New England Biolabs) hajtjuk végre, a szállító által leirt pufferrendszerben. A DNS-t in vitro lambda fágba pakoljuk (20) és a kapott fágokat használjuk Escherichia coli HB101 törzs (rn, πτκ, leír, prer, recA~) transzdukálására. A transzkdukálés hatásfoka körülbelül 5000 ampicillin rezisztens telep per mikrogramm pYcl vektor. 3000 ami® telepet izolálunk és növesztünk külön-külön mikrotiter lemezek lukaiban olyan LB táptalajban /10 g Bacto-Tryptone (Difco), 5 g Bacto Yeast Extráét (Difco), NaCl/, mely 100 pg/ml ampicillint tartalmaz.
2. Példa
A szabályozott savas foszfatázgén, PH05 izolálása
A génbank telepeit 100 ug/ml ampicillint tartalmazó LB agarlemezekre (LB táptalaj plusz 15 g/1 agar) replikázva növesztjük. 500 telepből származó sejttöraeget összemosunk. Az egyes sejtkeverékekből a következő módszerrel izoláljuk a DNS-t.
A sejteket centrifugálással ülepítjük (Sorvall, GSA rotor, 10 perc, 6000/perc fordulatszám, 4 °C), 100 ml TE-ben (10 mM
TRIS.HC1, 1 mM EDTA, pH 8,0) szuszpendáljuk, majd a fenti körülmények között újra centrifugáljuk. A sejtmasszát 3 ml Tsuc oldatban /50 mM TRIS.HC1, pH 7,5 25 v% szacharóz/ szuszpendáljuk majd SS-34 polipropilén Sorvall csövekbe tesszük. Az összes
-1121
HU 20111 következő lépést jégen végezzük: 0,3 ml lizozim oldatot (10 mg/ml, 11000 U/mg, Worthington) adunk hozzá, 5 perc múlva 1,2 ml EDTA-t (500 mM, pH 8,0), majd újabb 5 perc elteltével 4,8 ml detergenst /0,1% Triton X- 5 -100 (Merck), 50 mM EDTA, 50 mM TRIS.11C1 pH 8.0/ adunk hozzá. 5 perc elteltével a lizátumot előhűtött SS 34 rotorban centrifugáljuk 40 percig 4 °C-on. A felülúszót óvatosan eltávolítjuk és szilárd CsCl-t adunk 10 hozzá (8,3 g CsCl-t 8,7 ml felülúszóhoz).
mg/ml felülúszó végkoncentrációjú etidium-bromid (Sigma) hozzáadása utón az oldatot
13,5 ml-es Quick Seal poliallomer csövekbe (Beckman) tesszük és Beckman Ti50 rotorban 15 40 órán át 40 000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk. Hosszúhullámú UV fény (366 nm) hatására két fluoreszcens esik látható. Az alsó esik tartalmazza a natív (supercoiled) plazmid DNS-t, és oldalról, a csövet 18 G-S 20 tűvel megszúrva, 2 ml-es fecskendővel tóvolitjuk el. Az etidium-bromidot úgy távolítjuk el, hogy az oldatot ötször extraháljuk CsCl-dal telített izopropanollal, majd a kapott színtelen oldatot 30 ml-es Corex csövekbe 25 tesszük. 2,5 térfogat TE puffért adunk hozzá és a DNS-t etanollal kicsapjuk. Az oldatot ezután 12-15 órán át -20 °C-on tartjuk. A kicsapott DNS-t Sorvall ΗΒ-4-es rotorban 30 percig 12 000/perc fordulatszámmal 0 °C-on 30 centrifugáljuk, majd 200 jul TE-ben oldjuk. 50-100 pg hibrid DNS-t nyerünk ki 100 mi tenyészetből.
A fenti sejtkeverékből izolált plazmid DNS-sel Saccharomyces cerevisiae AH216 tör- 35 zset (a, Kist, Ieu2, ph03 ph05) transzformálunk a Hinnen és munkatársai által közölt módszerrel (12). A transzformált élesztősejteket alacsony szervetlen foszfát tartalmú táptalajra replikázzuk (azaz „Difco élesztő mini- 40 mái táptalaj aminosavak nélkül', kiegészítve 20 g/1 glükózzal, de a Difco recept alapján (Difco Mannal, Difco Laboratories, Detroit USA) komponensekből összeállitva, azzal a különbséggel, hogy 1 g/1 kálium-dihidro- 45 gén-foszfát helyett 0,03 g/1 kálium-dihidrogén-foszfétot ós 1 g/1 kélium-kloridot hasz-i nálunk), a savas foszfatóz aktivitás meghatározása céljából megfestjük, színezék agarral (1% Difco agar 100 mM, pH 4,0 acetát puffer- 50 bán, 2 mg/ml Fást Blue B salt (Serva) és 0,2 mg/ml alfa-naftil-foszfát (Serva) rétegezve a sejteket. Működőképes PH05 génnel rendelkező telepek megvörösödnek a gén alacsony Pi-tartaimú táptalajon való derepresz- 55 sziója miatt. A génbank ismételt csoportokra bontásával 3, egymástól független represzszálható savas foszfatóz aktivitással rendelkező kiónt kaptunk.
Az egyik ilyen kiónt (pG7) alaposabban 60 megvizsgáltuk. A hibrid-plazmid mérete 42 kb. A pG7 EcoRI és BamHI fragmenteit pBR322/HIS3-ban (13) és pJDB207-ben (22) szubklónozzuk. A restrikciós emésztéseket az enzimek előállítója (New England Biolabs) ál- 65
B 22 tál javasolt körülmények között végezzük, a ligálást 20 μΐ össztérfogatban 150 egység T4 DNS-ligázzal (New England Biolabs) és az emésztett plazmiddal 20 μΙ/ml koncentrációban végezzük a (New England Biolabs által ajánlott körülmények között.) A 8 kb méretű EcoRI fragment 5,1 kb méretű BamHI fragmentjét pJDB207 élesztővektorban szubklónozzuk, majd ΛΗ216 élesztőtörzsbe transzformálva ez a hibrid-plazmid (pJDB207/P/ÍÖ5, PII03, lásd 1. ábra) derepresszáló körülmények között (alacsony szervetlen foszfát koncentráció) nagy foszfatóz aktivitást mutat {pHO5 gén), normál élesztő táptalajon alacsony aktivitást mutat (a PHO3 gén megnyilvánulása).
3. Példa
A PIIO5 és PIIO3 gének lokalizálása és DNS szekvencia-analízise
a) A PH05 gén
A PHO3 és PHO5 géneknek a BamHI fragmenten való lokalizálásánál kihasználjuk a Sau3A restrikciós helyeket és az egyetlen PstI helyet. A BamHI fragmentet Sau3A restrikciós endonukleázzal emésztve (New England Biolabs) 6 fragmentet kapunk (A-F, 2. ábra). A részleges Sau3A emésztéssel kapott fragmenteket az önállóan replikálódó pJDB207 élesztővektor BamHI helyére szubklónozva a Sau3a fragmentek különböző kombinációit tartalmazó plazmidokat kapunk. Ezeket a plazmidokat használjuk a Saccharomyces cerevisiae AI1216 élesztő pho3, pho5 mutánsainak transzformálására. A transzformánsok savas foszfatóz aktivitását alacsony foszfét-tarlalmú vagy normálminimál táptalajon való növesztés utón vizsgáljuk. A Sau3A fragmentek közül a legalább A-t és B-t tartalmazó kiónok (2. ábra, 1-4.) ugyanolyan mennyiségben termelnek savas foszfatézt (kvalitatív becslés alapján, savas foszfatóz festó-agarral felülrétegezve, a 2. példában leírt módon) mint az egész 5,1 kb méretű BamHI fragment. A kifejeződést normális körülmények között a táptalajban lévó szervetlen foszfát-koncentrációja szabályozza. A csak az A Sau3A fragmentet tartalmazó kiónok [(2. ábra), 5., 6.] alacsony szinten termelik a savas foszfatázt, és ezt nem befolyásolja a táptalajban levő szervetlen foszfát koncentrációja. Ez azt mutatja, hogy az A Sau3A fragmenten lévő információ a konstitutív savas foszfatóz (PH03) kifejeződéséhez elegendő. A Sau3A B fragmentről egyedül (2. ábra, 7.) nem fejeződik ki savas foszfatóz sem represszált, sem derepresszált körülmények között. Azonban a BamHI és PstI hasítási helyek közötti teljes szakaszt tartalmazó szubklón (2. ábra, 10.) szabályozott, nem konstitutív savas foszfatóz szintézist, mutat. Tellát ez a szubklón tartalmazza az élesztő PHO5 gént (13).
-1223
HU 201115 Η
A PHO5 gén pontos helyet DNS szekvenálással, Maxam és Gilbert módszerét (10) alkalmazva határozzuk meg. Egy 623 bázispár méretű BamHI-Sall restrikciós fragmentet klónozunk a pBR322 plazmidba (lásd 1. ábra), a 375-650. bázisok közötti BamlII-Sall fragmentet (pBR322 nomenklatúra) helyettesítve vele a fentiekben leírt emésztési és ligálási körülmények között (minden enzim a New England Biolabs-tól van)
A BamHI-Sall DNS-szakasz fragmentjeil a következő helyeken: BamHI (-541), Sau3A (-200) és Sáli (+82) (a számozáshoz lásd a 3a, ábrát) aszimmetrikusan jelöljük az 5' végeken. A 623 bp méretű BamHI-Sall DNS-szakasz nukleotid-sorrendjét a 3a. ábrán mutatjuk be. Ez azt mutatja, hogy a beépített DNS-szakasz a PI1O5 promoter-régiót és a PÍIO5 foszfatáz fehérjét kódoló régió egy részét tartalmazza.
b) A PH03 gén
A PH03 gén pontos helyét DNS bázissorrend-analízissel határozzuk meg a New England Biolabs által kiadott „M13 cloning and DNA sequencing system című kiadvány alapján. Egy 415 bp méretű (5’) Pstl-Rsal (3') fragmentet szubklónozunk az M13 mp8 M13 mp9 vektorban, az egyedülálló Pst.1 és SamI restrikciós helyek felhasználásával. A 416 bp méretű Pstl-Rsal DNS-szakasz nukleotid-sorrendje a 3b. ábrán látható.
Ez azt mutatja, hogy a szakasz tartalmazza a PHO3 promoter-régiót és PHO3 savas foszfatáz fehérje kódoló szakaszának egy részét.
4. Példa
A p30 plazmid készítése (lásd 4. ábra)
a) A Ball restrikciós hasítási hely eliminálása a pBR322 plazmidból pg pBR322 plazmidot teljesen megemésztünk a Ball (BRL) és PvuII (Biolabs) restrikciós enzimekkel, az előállítók előírásai szerint. A pBR322 plazmid Ball/Pvull kettős emésztésével két, 3738 bp és 622 bp méretű restrikciós fragmentet kapunk. A két fragmentet 1%-os, alacsony olvadáspontű agaróz gélen választjuk el (Sigma) TBE (90 mM Tris.HCl, pll8,3, 2,5 mM EDTA, 90 mM bórsav) pufferben. A DNS sávokat etidium-bromiddal festjük, majd hosszú hullámhosszú (366 nm) UV fénnyel láthatóvá tesszük. A 3738 bp méretű fragmentet tartalmazó agaróz-darabokat kivágjuk a gélből, 65 °C-on megolvasztjuk, a nátrium-klorid koncentrációt 500 mM-ra állítjuk és 20 percig 65 °C-on tartjuk. Egy térfogat fenolt (10 mM TR1S.HC1 pH7,5, 1 mM EDTA, 500 nM nátrium-klorid összetételű pufferral telítjük előtte) adunk hozzá. A vizes fázist kétszer extraháljuk fenollal, egyszer 14 kloroformmal. A DNS-t 2,5 térfogat hideg abszolút etanollal kicsapjuk, majd centrifugálással kinyerjük. A DNS üledéket hideg 80%-os etanollal mossuk, majd vákuumban szárítjuk. A DNS-t TE pufferban oldjuk 0,15 mg/ml koncentrációban.
Az izolált 3738 bp méretű DNS fragmentnek a Ball és PvuII kettős emÓBzLés miatt két tompa vége van. A DNS-t tompa-vég ligálással körré zárjuk. 0,6 pg DNS-t inkubálunk éjszakán át szobahőmérsékleten 30 pl 60 mM Tris.HCl pH7,5, 10 mM magnézium-klorid 10 mM ATP összetételű pufferban 900 egység T4 DNS ligázzal (Biolabs). A ligáló elegyből 5 mikroliteres részeket adunk 50 mikroliter, kalciummal kezelt, transzformációra alkalmas Escherichia coli HB 101 sejtekhez, melyeket Mandel és munkatársai (24) módszerével állítottunk elő. A keveréket 5 percig jégen tartjuk, majd 2 percig 37 °C-on inkubáljuk, és 10 percig szobahőmérsékleten hagyjuk mielőtt 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB agarleniezekre szélesztjük. Hat ampR telepet izolálunk és külön növesztünk 100 ml LB (összetétel ugyanaz mint az előbbiekben, agar nélkül) táptalajon. A sejtekből a 2. példában leírt módon izolálunk plazmid DNS-t. A HaelII (szállító Biolabs, emésztési körülmények az előállító szerint), PvuII és Ball restrikciós enzimekkel való emésztés után kapott fragmenteket 1,5%-os agaróz gélen, TBE pufferban elemezzük. Az újonnan összekapcsolt fragmentek restrikciós mintázata és előre megadott mérete azt mutatja, hogy a plazmidok azonosak és a BalI-PvuII fragment kivételével azonosak a pBR322 plazmiddal. Ezekből a plazmidokból hiányzik a Ball restrikciós hely, jelölésűk pBK322a Ball.
b) Λ PH03 és PH05 géneket tartalmazó élesztő 5,1 kb méretű Bamíll restrikciós fragment klónozása pBR322a Ball plazmid bán
A pJDB 207/PHO5, PHO3 plazmid tartalmazza (lásd 1. ábra) a szabályozott és konstitutív élesztő savas foszfatáz (PIIO5 és PHO3) géneket hordozó élesztő 5,1 kb Bamlll fragmentet. Λ pJDB 207/PIIO5, PIÍO3 valamint a pBR322a Ball plazmidot BamHI restrikciós enzimmel emésztjük. A teljes emésztés lejátszódása után az enzimet 2 percig 65 °C-on tartva inaktiváljuk. Mindkét DNS-t kicsapjuk etanollal, majd mindegyiket 0,2 mg/ml koncentrációban 10 mM TRiS.HCl pH 8,0 pufferban oldjuk. Mindegyik Bamlll-gyel emésztett DNS-böl 0,5 pg-ot 20 pl össztérfogatú ligáló pufferban elkeverünk (a New England Biolabs előírásai szerint) és 300 egység T4 DNS ligázzal inkubáljuk 20 órán át 15 °C-on. A ligáló elegyből 5 pl-es alikvot részeket adunk 50 pl kalciummal kezelt Escherichia coli sejtekhez, és a transzformációt a 4a példában leírt módon hajtjuk végre. A transzformált sejteknek megvizsgáljuk ampicillin
-1325
HU 201115 1) és tetraciklin rezisztenciáját. Nyolc amp8, tets telepet izolálunk és 100 ml, 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptaljon növesztjük. A plazmid DNS-t izoláljuk a sejtekből (lásd 2. példa). A BamHI enzimmel végzett restrikciós emésztés azt mutatja, hogy a 3,7 kb vektor fragment mellett (pBR322 Δ Ball) 4 plazmid tartalmaz egy 5,1 kb méretű DNS-darabot. A Sáli enzimmel (New England Biolabs) végzett restrikciós emésztéssel meghatározva a beépített 5,1 kb méretű BamHI fragment orientációját, megállapítottuk, hogy két plazmidban a beépített DNS darab a 4. ábrán bemutatott orientációjú. Ezek közül az egyiket p30-nak nevezzük. Az 5,1 kb méretű darabon a PHO5, PHO3 gének transzkripciójának iránya a 4. ábrán bemutatott módon az óramutató járásával ellentétes.
5. Példa
A PH05 promotert és a PH05 transzkripciós terminációs jelet tartalmazó expressziós plazmid készítése
a) Az EcoRI restrikciós hasítási hely eliminálása a p30 plazmidból pg p30 DNS-t (lásd 4. példa) EcoRI restrikciós endonukleázzal (Boehringer) teljesen megemésztünk. A kapott tapadós végek feltöltése céljából 1 pg EcoRI-gyel emésztett p30 plazmidot 50 pl, 50 mM nátrium-klorid, mM TRIS.HC1 pH7,5, 10 mM magnózium-klorid, 1 mM DTT, 0,25 mM dATP 03 0,25 mM dTTP összetételű pufferban 30 percig 37 °C-on 1 egység DNS polimerázzal (Klenow nagy fragment, BRL) inkubálunk. Az etanolos kicsapás után kinyert DNS-t a szokásos módon ligáljuk és a 4. példában leirt módon kompetens Escherichia coli HB1O1 sejteket transzformálunk vele. Az EcoRI-es emésztésnek ellenálló kiónokat p30 (EcoRI) jelzéssel látjuk, el.
b) A 0,37 kb méretű Sau3A-PstI PHO5 transzkripciós termináció fragment izolálása .
A PH05 mRNS-eket SÍ nukleázos emésztéssel térképezzük (25). A transzkripciós-terminéciós jeleket a PHO5 gén 0,37 kb méretű Sau3A-PstI fragmenten találjuk. A Sau3A-PstI fragment nukleotid-sorrendjét a 6. ábrán adjuk meg.
Öt pg pJDB 207/PHO5, PHO3 DNS-t (lásd 2. példa) teljesen megemésztünk Sau3A és PstI restrikciós endonukleázokkal. A restrikciós fragmenteket 1,5%-os alacsony olvadáspontú vertikális gélen, TBE pufferben választjuk szét. A 0,37 kb méretű Sau3A-PstI fragmentet etidium-broniidos festéssel teszszük láthatóvá és a lehető legkisebb agarózdarabbal vágjuk ki a gélből.
c) A PHO5 Sau3A-PstI fragmeljének klónozása
M13/mp 9-ben
Az M13 mp 9 fág DNS-e igen hasznos, egymáshoz közel egyedi restrikciós helyeket tartalmazó klónozó vektor. 5 pg M13 mp 9 DNS-t teljesen megemésztünk BamHI és PStI restrikciós endonukleázokkal. A nagyobb, 7,1 kb méretű DNS-fragmentet 0,8%-os, alacsony olvadáspontú gélen választjuk el egy igen kicsi (8 bp méretű) fragmenttől. A gélből kivágjuk a nagy DNS fragmentet tartalmazó géldarabot. A pJDB207/PHO5, PÍIO3 plazmid (lásd 5b. példa, 0,37 kb méretű Sau3A-Pst.1 fragmentjét és az M13 mp 9 7,2 kb méretű BaniHI-PstI fragmentjét tartalmazó géldarabokat 65 °C-on megolvasztjuk, ekvimoláris mennyiségben összekeverjük és vízzel annyira hígítjuk, hogy az agaróz-koncentráció 0,3%-ra csökkenjen. A ligálást 200 pl, 60 mM TRIS.HC1 pH7,5 10 mM MgCL2, 10 mM DTT, 1 mM ATP összetételű pufferban, 600 egység T4 DNS ligázzal (Biolabs) végezzük. Az Escherichia coli JM 101 (Ca2*) törzs kompetens sejtjeinek transzdukcióját a New England Biolabs által kiadott .M13 cloning and DNA Sequencing system című kézikönyvben leírtak alapján végezzük. A fehér tarfoltokból izolált fágokat növesztjük, majd a beépített DNS-szakasz méretét EcoRI és PstI restrikciós endonukleázzal való hasítás után analizáljuk. A PIIO5 Sau3A-PstI transzkripciós terminációs fragmentet tartalmazó
M13 mp 9 klóul izoláljuk és M13 mp 9/PH05 (Sau3A-PstI)-nek nevezzük.
d) A PHO5 transzkripciós terminációs fragmentjének klónozása p30 (EcoRI)-ben
Az M13 mp9 fágban klónozott eredeti PH05 traszkripciós terminációs fragmentet (M13 mp9/P//O5 (Sau3A-PstI, újra klónozzuk HaellI-HindlII fragmentként Ball és Hindin enzimekkel hasított p3Ü(EcoRI) plazmidban: az M13 mp9/PHO5 (Sau3A-PsLI) DNS-ét teljesen megemésztjük HaelII és Hindlll restrikciós endonukleázokkal. A kapott két DNS-fragmentet 1,5%-os alacsony olvadáspontű vertikális agaróz gélen, TBE pufferban választjuk szét. A 0,39 kb méretű fragmentet a gélből kivágott géldarab formájában izoláljuk. A p30 (EcoRI) DNS-t Ball és Hindlll enzimekkel emésztjük. A nagy, 3,98 kb méretű fragmentet 0,8%-os alacsony olvadáspontú agaróz gélen, TBE pufferrel elválasztjuk, majd a DNS fragmentet tartalmazó géldarab formájában izoláljuk.
A 0,39 kb méretű ΓΙΙΟ5 HaellI-HindlII transzkripciós terminációs fragmentet és a p30 (EcoRI) 3,98 kb méretű Ball-HindlH fragmentjél tartalmazó góldarabokat 65 °C~on megolvasztjuk és körülbelül ekvimorális mennyiségben összekeverjük. A ligálást és a kompetens Escherichia coli 11B101 sejtek transzformálását a 4. példában leírt módon
-1427
HU 201115 Η végezzük. A transzformált sejtek DNS-ét megvizsgáljuk, p31 névvel látjuk el (lásd 5. ábra).
A p31 expressziós plazmid tartalmazza a PHO5 promoter régióját a szignálszakasz egy részével, és mellette a P11O5 transzkripciós terminációs jeleket tartalmazó DNS szakaszt. Az ebben a plazmidban kifejezendő idegen kódoló szakaszokat kényelmesen beépíthejük a promoter és a transzkripciós terminációs szakasz közé.
6. Példa
A PHO5 szignálszakaszának deléciója a p31 expressziós plazmidböl (lásd 7. ábra)
A p31 expressziós plazmid tartalmazza a PHO5 promoterszakaszt, ideértve a mRNS start-helyet, a savas foszfatáz ATG transzlációs start-kodon ját, és további 40, a savas foszfatáz szignálszakasz egy részét kódoló nukleotidot. Ebben a konstrukcióban a szignálszakasz nukleotidjait és az ATG tripletet Bal31 emésztéssel elimínáljuk. EcoRI linkereket építünk be, melyek lehetővé teszik a PHO5 promoter és az érett TPA-t kódoló szakasz összekapcsolását.
a) A Ball-gyel hasított p30 plazmid emésztése Bal31-gyel pg p30 DNS-t (lásd 4b példa) emésztünk a Ball restrikciós endonukleázzal, ennek eredményeképpen két, 3,7 és 5,1 kb méretű, fragmentet kapunk.
Fenol-kloroformos extrakció után a DNS-t etanollal kicsapjuk. A DNS-L 0,5 wg/ml koncentrációban oldjuk 10 mM TRlS(pH8,0) pufferban. 9 pg Ball-gyel emésztett p30 DNS-t emésztünk 100 μΐ 20 mM TRIS pH 8,0 199 mM nátrium-klorid, és 1 mM EDTA összetételű oldatban, 2 egység Bal31 exonukleázzal (BHU).
2-2 ng DNS-t 15-30-45-00 másodperces 30 °C-os inkubálás után kiveszünk és rögtön összekeverjük 60 μΐ fenollal és 60 μΐ TNE-vel. Fenol-kloroformos extrakció és etanolos kicsapás után a DNS-t 100 ng/inl koncentrációban oldjuk 10 mM TRIS (pH 8,0) oldatban. A Bal31-es exonukleázos emésztés mértékének megállapításéra mindegyik időpontból kivett 0,5 pg DNS-t BamHI endonukleázzal emésztünk és 1,5%-os agaróz-gélen, pH 8,3 Tris-borát pufferban vizsgáljuk. 45 másodperces Bal31-es emésztés után átlagban 70 bázispár hiányzik a fragment mindkét végéről. A további kísérletek céljaira a 45 másodperces emésztés után kapott DNS-t használjuk.
b) EcoRI linkerek hozzákötése a Bal 31-gyel emésztett ÜNS-hez
Két Azeo egység EcoRI linkért (5’-GG AA TT CC-3’, BR1) oldunk 250 μΐ 10 mM TRIS 16 (plI8), 1 mM EDTA oldatban. Két ng EcoRI linkért 75 μΐ 60 mM TRIS (pH 7,5), 10 mM magnézium-klorid, 15 mM DTT, 10 μΜ ATP összetételű oldatban 33 egység T4 polinukleotid-kinázzal (Boehringer) kezelünk. Egy órás, 37 °C-os inkubálás után ez elegyet hagyjuk szobuhömérsékletre hűlni, majd -20 °C-on tartjuk,
A kezelt kétszálú EcoRI linkereket tompa végükkel a Bal31-gyel kezelt DNS fragmeritekhez kapcsoljuk. Fél míkrogramm Bal31-gyel kezelt DNS-t (lásd 6a. Példa) 16 órán ét, szobahőmérsékleten 50-szeres feleslegben lévő, kinéz enzimmel kezelt EcoRI linkerrel együtt inkubálunk 20 »il 60 mM TRIS (pH7,5) 10 mM magnézium-klorid, 10 ntM DTT, 4 mM ATP összetételű oldatban, 600 egység T4 DNS-ligázzal (Biolabs). Miután a T4 DNS ligázt inaktiváltuk, az EcoRI línkerek feleslegét 50 egység EcoRI enzimmel (Boehringer) 50 μΐ térfogatban lehasitjuk. A DNS-t fenol-kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk és 10 mM TRIS, l niM EDTA összetételű oldatban oldjuk.
Az EcoRI restrikciós endonukleáz nemcsak a két (3,7 kb és 5,1 kb) Ball fragment végéhez hozzáadott EcoRI linkereket hasítja le, hanem az 5,1 kb fragment belsejében levő EcoRI helyen is hasít, igy kapunk egy, 3,9 kb és egy 1,2 kb méretű fragmentet. A 3,7 kb és 3,9 kb méretű fragmenteket 0,8%-os alacsony olvadáspontú agarózon (Sigma), 90 mM Tris-HCl (pH 8,3) 90 mM bórsav és
2,5 mM EDTA összetételű pufferben választjuk el az 1,2 kb méretű fragmenttől. A DNS sávokat etidium-bromiddal festjük és hosszú hullámú (366 nM), UV-fénnyel tesszük láthatóvá. A két nugy 3,7 kb és 3,9 kb méretű fragmentet nem választjuk el. Ezeket egyetlen géldarabban kivágjuk u gélből és a 4a. példában leírL módon extraháljuk.
Az EcoRI tapadó végű lineáris fragmenteket Hgálással körbe-zárjuk. A fragmentekből kb 0,25 pg-ot ligálunk 100 μΐ 60 mM Tris (pH 7,5), 10 mM magnézium-klorid, 10 mM
DTT 1 mM ATP összetételű oldatban 600 egység T4 DNS ligázzal, 4 órán át 15 °C-on ínkubálva az elegyet.
A ligáló elegyből 10 μΐ-es alikvotokat adunk 100 μΐ kalciummal kezelt transzformációra kompetens E. coli HB 101 sejthez (lásd 4a. példa). 35 transzformált ampR telepet növesztünk külön-külön 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajon. A plazmid DNS-t Holmes és munkatársai (26) módszerével állítjuk e]ö, majd EeoRI/BauiHI kettős emésztéssel elemezzük.
c) Nukleotid-sorrend meghatározás az EcoRI linker hozzáadása helyének meghatározására
A 35 klón legtöbbje különbözik egymástól abban, hogy az EcoRI linker hol kapcsolódik a Ρ11Ο5 promoter régióhoz, attól függő-1529
HU 201115 U en, hogy mennyire emésztettük meg Bal31-gyel az egyes DNS molekulákat. A nukleotid-sorrend meghatározása céljából a plazmid DNS-t EcoRI-gyel emésztjük. Fenol-klorofoi— mos kizárás után az emésztett DNS-t etanollal kicsapjuk. A DNS-t defoszforilezzük és az 5’ végén megjelöljük. A jelölt DNS fragmenteket egy második restrikciós endonukleázzal, BamHI-gyel emésztjük. A termékeket 8,0%-os, alacsony olvadáspontú agaróz gélen választjuk el. A 0,5-0,6 kb méretű, 5’-jelzett EcoRI-BamHI fragmentet a 4a példában leírt módon izoláljuk az alacsony olvadáspontú agar óz ból. Az EcoRl linker melletti szakasz nukleotid-sorrendjének meghatározása céljából a különböző DNS-fragmenteket kémiailag lebontjuk és a termékeket poliakrilamid gél— elektroforézissel választjuk el a Maxam és Gilbert által leirt módszerrel (10).
A különböző kiónokat és a PHO5 szakasz utolsó nukleotidjának helyét (ezután egy EcoRl linker következik) az 1. Táblázatban soroljuk fel (lásd a 8. ábrát is.)
1. Táblázat
| Klón | PHO5 szakasz utolsó nukleotidjának helye |
| PE | + 25 |
| pG | + 16 |
| pe | + 15 |
| Pd | + 12 |
| PY | -4 |
| pR | -10 |
| pp | -16 |
| pv | -18 |
| pL | -21 |
| pN | -22 |
| PC | -24 |
| PH | -27 |
| pS | -28 |
| pk | -29 |
| Pl | -38 |
| pM | -50 |
| pO | -53 |
| pF | -59 |
| pm | -67 |
| pK | -73 |
| pi | -81 |
| ph | -137 |
d) A PHU5R promotert tartalmazó 0,53 kb méretű Bamlll-EcoRI fragment izolálása
A pR plazmid egy 534 bp méretű Bamlll-EcoRI fragmenten tartalmazza a PBO5R promotert. A 3a ábra számozása szerint a fragment a -541-es nukleotidtól (Bamlil hely) - a -10 nukleotidig terjedő P/IO5 promoter-szakaszt tartalmazza. A -10 nukleotidhoz kötött
EcoRl linker két G-csoportot ad hozzá EcoRI-gyel való emésztés után.
A píí plazmidot BuinllI és EcoRl restrikciós endonukleázokknl emésztjük. A 0,53 kb méretű Bamlll-EcoKl fragmentet. 0,7%-os alacsony olvadáspontú agarózon választjuk el, majd a 4a példában leírt, módon izoláljuk. A nukleotid-sorrend a 9. ábrán látható.
Hasonló módon, a pY plazmidot is megemésztjük és a 0,53 kb méretű, a PHO5Y promotert tartalmazó Bamill-EcoRl fragmentet izoláljuk. A nukleotid-sorrend a 10, ábrán látható.
e) A p3J plazmid Sall-EcoRI fragmenljének helyettesítése az új konstrukciók Sall-EcoRI fragmentjével pg p31 plazmidot (lásd 5d példa) emészLünk Sáli restrikciós endonukleázzal. Az emésztett DNS-t etanollal kicsapjuk, majd 50 μΐ, 100 mM TRIS (pH7,5) 50 mM nátríum-klorid, 5 mM magnézium-klorid összetételű pufferben oldjuk. A DNS-t EcoRI-gyel teljesen megemésztjük. A restrikciós fragmenteket 0,8%-os alcsony olvadáspontú agaróz-gélen választjuk el. TRIS-borát EDTA (pH8,3) pufferban. Egy 3,5 kb méretű DNS fragmentet izolálunk egy, a DNS-sávot tartalmazó géldarabban.
A pR és pY kiónokból (lásd 1. táblázat 8. ábra) 5-5 pg-ot Sall-gyel és EcoRI-gyel emésztünk a fentiekben leirt módon. A 0,8 kb méretű fragmenteket az alacsony-olvadáspotú agaróz kis géldarabjában izoláljuk.
A p31 vektor 3,5 kb méretű Sall-EcoRI frngmentjéből 0,67 A»g-ot a pR illetve pY plazmidok megfelelő, 0,8 kb méretű Sall-EcoRI fragmentjéhez (0,34 pg) ligálunk. A DNS fragmenteket tartalmazó megfelelő géldarabokat összekeverjük és 65 °C-ori megolvasztjuk. Az elfolyósítotl gélt háromszorosra hígítjuk. A ligálást 240 pl össztérfogatban, 60 mM TRIS (pII7,5) 10 mM nagnézium-klorid, 10 mM OTT 1 mM ATP összetételű pufferban végezzük 750 egység T4 DNS ligázzal (Biolabs) éjszakán át, 15 °C-on inkubálva. A ligáid elegyekből 2-2 pl alikvot részeket 100 pl, kalciummal kezelt transzformációra kompetens E. coli HB 101 sejtekhez adunk (lásd 4a példa).
transzformált amp* telepet növesztünk külön-külön, 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban. A plazmid-DNS-t restrikciós elemzéssel vizsgáljuk. Mindkét csoportban levő kiónok azonosak. Mindegyik kiónból egyet használunk tovább és p31R, illetve p31Y jelöléssel látjuk el. (lásd 7. ábra).
-1631
HU 201115 Β
7. Példa
A TPA gén előállítása
a) Az mRNS előállítása
175 cm2-es Falcon sejttenyésztő-lombikokat oltunk 10x10® Hela sejttel, majd 25 ml Dulbecco féle módosított Eagle táptalajban (DME) tartjuk, melyet 5% borjúmagzat-szérummal egészítünk ki. A táptalajt három naponként cseréljük, mig a sejtek egybefüggő réteget nem képeznek.
Az összefolyó egyrétegű sejttenyészetet kétszer mossuk PBS-sel (foszfáttal pufferolt sóoldat: 80 g nátrium-klorid, 2 g kálíum-klorid, 14,4 g dinátrium-hidrogén-foszfát és 2 g kólium-dihidrogén-foszfát egy liter oldatban), majd ezt követően 16 órán át 100 ng/ml TPA-val kiegészített DME oldatban tartjuk. Az össz-RNS-t extraháljuk (27) közvetlenül az egysejtes rétegre vitt feltáró pufferrel. Az össz-RNS-böl a poli (A)-ban gazdag szakaszokat Nagamine és munkatársai (28) módszerével izoláljuk.
A szacharóz-gradiens ultracentrifugálást SW-41 rotorral, Beckman ultracentrifugában végezzük. 100 ng poli (A) RNS 200 pl vizes oldatát 15-30%-os szacharóz gradiensen centrifugáljuk. 0,02 M TR1S.HC1 (pH7.4) 0,1% SDS, 0,01 M EDTA, 0,04 M nátrium-klorid összetételű oldatban 30 000/perc fordulatszámmal, 18 °C-on 12 órán át. A gradienst az aljától kezdve 36 frakcióban vesszük le, az RNS-t 0,2 M nátrium-kloriddal és 2,5 térfogat etanollal csapjuk ki. Éjszakán át -20 “C-on tartjuk, majd az RNS-t centrifugálással kinyerjük és 20 jul vízben oldjuk.
Vizuális megfigyelés alapján hatodik fázisban lévő oocytákat választunk ki, módosított Barth féle táptalajban tartjuk és a szacharóz-gradiens frakciókból származó RNS-el oltjuk be, lényegében a (29)-ben leírt módon. Az injekciózott oocyták plazminogén-aktivátor kiválasztását a Nagamine és munkatársai (28) által leírt radiális kazeinolízissel mutatjuk ki. Maximális TPA kiválasztást a 21-23S frakciókkal injekciózott oocytáknál látható,
b) cDNS szintézis és molekuláris klónozás
A TPA mRNS-ben dúsított Hela Poli (A) RNS-ről cDNS másolatot készítünk. 8 pg 50 mM TRIS.HC1 (pH8,3) 75 mM kálium-klorid, 8 mM magnézium-klorid, 1 tf% etanol, 0,2 mM EDTA, 25 Mg/ml oligo dT12-18, 0,5 mM mindegyik dNTP-ből és 12 pCi (oC32P) dCTP (New England Nuclear). Az oldatot 0 °C-ra hűtjük és 3 mM nátrium-pirofoszfáLot, 1 mM DTT-t és 144 egység reverz transzkriptázt (Life Sciences Ltd) adunk hozzá. 60 percig 39 °C-on tartjuk, majd újabb 32 egység reverz transzkriptázt adunk hozzá. 100 perc inkubálás után a reakciót 0,2% SDS és 15 mM 18
EDTA (végkoncentráció) hozzáadásával állítjuk be. Az (oC32P) dCTP beépülését a cDNS-be a reakció-elegy alikvot részének triklór-ecetsavus kicsapáséval vizsgáljuk. 1,15 Mg cDNS színtetizálódik 8 Mg RNS-ről (14,4% másolat). Kloroform-izoaniil-alkohol eleggyel (24:1 v/v) való kétszeri extrahálás után a vizes fázist sónientesitjük, 4 ml (5x0,5 cm) Sephadex G50 (finom) oszlopon való átcentrifugálással 20 mM TR1S.HC1 (pll9), 100 mM
NaCl, 1 mM EDTA oldatban. Az üres térfogat frakcióit egyesitjük, és nátrium-hidroxidot adunk hozzá, 0,3 N végkoncentrációban. 1,2 órán át 20 °C-on tartjuk, utána 0,3 N végkoncentrációban sósavat adunk hozzá és a nukleinsavat 3 térfogat etanol hozzáadásával kicsapjuk. A második lánc szintézisét 200 pl, 200 MM N-(2-hidroxietil)-piperazin-N’-etán-2-szulfonsav (Hepes) (pH6,9), 30 mM kálium-klorid, 10 mM DTT, 10 mM magnézium-klorid, 0,5 mM dATP, dCTP, HTTP és mikrogramm cDNS-enkénl 25 egység Klenow-fragment őszszetételű oldatban végezzük. Két óra 25 °C-os inkubálás után a reakciót az SDS koncentrációjának 0,1%-ra állításával leállítjuk, majd az oldaLot sómentesítjük 4 ml-es Sephadex G50 (finom) oszlopon való átcentrifugélással, 30 mM nátrium-ecetét (pH4,5), 0,2 mNaCl, 3 mM Z11CI2, 0,1% SDS összetételű oldatban, Az üres-térfogat frakciókhoz
2,5 egység/ml SÍ nukleázt adunk és az oldatot 30 percig inkubáljuk 37 °C-on, Az oldatot fenol-kloroform-izoamilalkohol (24:24:1 v/v) eleggyel extraháljuk, majd a vizes fázisban lévő nukleinsavat 0,3 M végkoncentrációjú nátrium-kloriddal és 3 térfogat etanollal kicsapjuk. Az első szálba beépült (uC 32P) dCTP 76%-a triklórecetsavval kicsapható marad az Sl-es emésztés után és alkalikus agaróz-gélen (30) való futtatással 500-3000 bp méretű kétszálú cDNS molkulakat látunk. A ds cDNS minLát inéiet szerint frakcionáljuk 5-20%-os szacharóz Gradiensen, 10 mM TRIS.HC1 (pH7,4), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1%-os SDS oldatban. 10 órán át centrifugáljuk 12 °C-on SW 41 rotorban 39 000/perc fordulatszámmal, majd a legnagyobb méretű cDNS-t tartalmazó frakciókat (az összminta 43%-a) egyesítjük és 0,3 M végkoncetréciójú nátrium-klorid, 5 Mg/ml BSA és 3 térfogat etanol hozzáadásával kicsapjuk. 25 /ig méret szerint szétválasztott cDNS végére dC egységeket kötünk (.31) szerint 85 pl, 450 egység/ml terminális transzferázt, 0,1 M kálium-kakodilátot (pH7,5), 2 mM kobalt-kloridot, 1 mM EDTA-t, 0,1 mM DTT-t és 5 pM (cf32P) CTP-t (20 mCí) tartalmazó reakcióelegyben. 3 percig tartjuk az elegyet 30 °C-on, majd a reakciót 10 mM EDTA 0,2% SDS és 100 pg/ml IRNS (mindhárom végkoncentráció) hozzáadásával leállítjuk. Az oldatot kétszer extraháljuk kloroform-izoamilakohol eleggyel, majd 5 ml-es Sephadex G50 (finom) oszlopon sómentesitjük 20 mM Tris.HCl (pH9), 100 111M NaCl, 1 mM
EDTA oldatban. Az üres térfogat frakcióit
-1733
HU 201115 Β egyesitjük és a nukleinsavakat 0,3 M végkoncentrációjú NaCl és 25 Mg/ml végkoncentrációjú tRNS valamint 3 térfogat entanol hozzáadásával kicsapjuk. 20 pg dCTP-vel meghosszabbított ds cDNS-t összekötjük 60 ng, a 5 PsTI helyen dG-vel meghosszabbított pBR 322-vel, 20 m1 0,4 M nátrium-klorid, 10 mM TRIS.HC1 (pH7,5) 1 mM EDTA összetételű oldatban 10 pei’cig 65 C-on 2 órán ót 45 C-on, 2 órán át 22 C-on tartva, majd lassan, 10 éjszakán át 4 °C-ra hűtve a reakcióelegyet.
Az össszekapcsolt cDNS-t 0 C-on 100 pl kompetens E. coli HB1OL/LM1O35 (33) szuszpenzióval keverjük össze.
A baktérium-szuszpenziót 15 percig 15
C-on, majd 5 percig 37 C-on inkubáljuk, majd 1,9 ,ml LB táptalajt adunk hozzá és az inkubálást további két órán folytatjuk 37 C-on. A selejteket 10 Mg/ml tetraciklint tartalmazó LB agarlemezekre szélesztjük. Egy 20 nanogramm vektorból 100 transzformánst kapunk, 13% újra összezáródott vektorral, mint háttérrel. 5400 transzformánst izolálunk steril fogpiszkálóval 96 lukas mikrotiter-lemezekben levő, 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó 25 200 pl LB táptalajba, éjszakán át növesztjük 37 C-on, majd 5 tórfX glicerin hozzáadása után -80 C-on tároljuk.
c) TPA-DNS szakaszok keresése 30
A humán szöveti plazminogén aktivátor cDNS két szintetikus oligonukleotidjál d5’-GGCAAAGATGGCAGCCTGCAAG-3’ és d5’-GCTGTACTGTCTCAGGCCGCAG-3’ 35 a módosított triészter módszerrel (35) állítjuk elő, majd reverz fázisú HPLC-vel és preparatív poliakrilamid elektroforézissel tisztítjuk.
Az oligonukleotidokat az 5’ végükön T4 kinázzal, (ot32P/ATP-vel (New England Nuclear) 40 .jelöljük, így 1x10® cpm (Cserenkov) pmól (10) specifikus aktivitást kapunk.
A mikrotiter lemezeket megolvasztjuk, és a transzformált tenyészeteket 6x8-as rácsozattal beosztott 82 mm-es HATF nitrocellulóz 45 szűrőkre visszük. 18 órán át 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó LB agarleniezen növesztjük, majd a plazmidokat 12 órán át 10 pg/ml Letraciklint és 10 pg/ml kloramfenikolt tartalmazó LB agarlemezeken amplifikóljuk. A DNS-t 50 rögzítjük a szűrőkhöz oly módon, hogy 3 percre 10%-os SDS-el telített Whatman 3 M papírra tesszük a szűrőket, majd ezt követően 0,5 N nátrium-hideroxiddal és 1,5 M nátrium-kloriddal telített szűrőpapírra 5 percig, 55 0,5 M TRis.HCl (pH8), 1,5 M nátrium-kloriddal telített szűrőpapírra 5 percig, végül x SSPE oldattal (SSPE: 0,15 M nátriuin-klorid, 10 mM nátrium-dihidrogén-foszfát, pH7,4 1 mM EDTA) telített szűrőpapírra 5 go percig (42). A szűrőket levegőn megszárítjuk, vákuumban 2 órán át 80 C-on, .sütjük'. Az igy kezelt szűrőket 2 órán át,
C-on mossuk 50 mM TRIS.HC1 (pH7,5), mM EDTA, 1M nátrium-klorid és 1% SDS 35 összetételű oldattal a bakteriális törmelék eltávolítására. A hibridizálást és mosást Wallace és munkatársai (1981) által leírt módszerrel végezzük, felhasználva a nukleotid-hossz, aG+C tartalom és a Tm közötti tapasztalati összefüggést, melyet Suggs és munkatársai (45) valamint Smilh (46) határozott meg. A szűrőket kéL órán át pre-hibridizáljuk majd 12 órán át hibridizáljuk 60 C-on 1,6 ml 900 mM nátrium-klorid 60 mM nátrium-dihidrogén-foszfát (pll7,4), 7,2 mM EDTA (6xSSPE) összetételű oldatban, mely 0,1.0,1% BSA-t, polivinilpirrolidonl, Ficoll 400-at (5x Denhardt oldat). 200 pg/ml LRNS-L és 0,1% SDS-t tartalmaz. A két 32P-vel jelölt oligonukleotidból álló keveréket 0,3 pmol/ml koncentrációban a pre-hibridizáló oldathoz adjuk. A hibridizálást követően a szűrőket 6xSSC oldattal mossuk (SSC: 0,15 mM nátrium-klorid, 15 mM trinátrium-citrát), 3x10 percig 4 C-on majd 3x10 percig 60 °C-on. A szárított szűrőket Kodak XB5 röntgenfilmre exponáljuk Dupont intenzitás-növelő betéttel („sőréén) 36 órán át -70 °C-on. A hibridizálást mutató inikroliter lukakat azonosítjuk, és az ezekből a tenyészetekből származó egyedi telepeket a fenti módon átvizsgáljuk, duplikát szűrőket külön-külön hibridizálva az egyes próbákhoz. A szűrők hibridizálásút és mosását 63 °C-on végezzük. Mindkét próbával külön-külön hibridizáló telepeket izoláljuk az anyalemezről és éjszakán át 37 C-on növesztjük 10 pg/ml tetraciklint tartalmazó LB táptalajban. Ezek közül a telepek közül az egyiket a pW349F-nek nevezzük. A plazmid DNS előállítására a módosított alkalikus lízis módszerét (36) használjuk, majd cézium-klorid gradiens-centrifugálást.
A pW349F plazmid DNS-ét PstI és BglII restrikciós endonukleazokkal emésztve vizsgáljuk. A restrikciós fragmentek mérete azonos a várttal. Ebből arra következtetünk, hogy a pW349F plazmid (7,1 kb) a humán szöveti plazminogén aktivátor teljes strukturgénjél tartalmazza.
d) A TPA cDNS klón nukleoLid-sorrendje (lásd 11, ábra
Maxam és Gílbert (10) és Sanger módszerének (53) kombinációját használva szekvenóljuk a TPA cDNS kiónt. Az eredmények a
11. ábrán láLhatók. A nukleotid sorrendet összehasonlítva a Pennica és munkatársai által közölttel (7), csalt egy változás figyelhető meg a 113-as nukleotidnál, mely a TPA pre-szakaszában egy aminosav csendes pozíciójában eredményez változást (CTG-GTA).
-1835
HU 201115 Β
8. Példa
A pJDB207/PHO5-TPA(lA) és pJDB207/PII05ΤΡΑδ plazmidok konstruálása 12-15. ábrák
A PHO5 promotert és a PH05 szignálszakaszt leolvasási fázisban az érett TPA-t kódoló szakaszhoz kapcsoljuk. P11O5 transzkripciós terminációs jel is található a konstrukcióban.
a) Az M13 mp 9/PIIO5 Bam-Sal molekula konstrukciója (lásd 12. Abra)
Mg pBR322/PWO5 BamSal plazmidot (lásd 1. ábra) hasítunk BamHI és Sáli restrikciós endonukleázokkal (mindkettő Biolabs) a szállító által előírt körülmények között. így kapjuk a PÍIO5 promotert tartalmazó (3a. példa, 3a. ábra) 623 bp méretű Bamlll-Sall fragmentet. Az M13 mp 9 egyszélú fágvektor (23) replikatív formájából (RF) 2 pg-ot emésztünk ugyanezekkel az enzimekkel. Mindkét DNS-készltményt 0,6%-os lágy agaróz gélre viszszük az 5. példában leírt módon. A pBR322/PHO5 BamSal plazmidból származó 623 bp méretű fragmentet és az M13 mp 9-ből származó 7,2 kb méretű fragmentet az 5c. példában leírt módon extraháljuk a gélből. Mind a 623 bp méretű fragmentböl, mind a 7,2 kb méretű M13 mp 9 DNS fragmentböl 150-150 ng-ot ligálunk 200 egység T4 DNS ligázzal (Biolabs) 4 órán át 15 °C-on 60 mM TRIS-HC1 (pH7,5) 10 mM magnézium-klorid, mM DTT és 1 mM ATP összetételű oldatban. A JM 101 E. coli törzset Messing módszerével (23) transzformáljuk, majd 12 fehér plakkot izolálunk és az RF plazmid (38) restrikciós elemzésével vizsgáljuk. Az összes vizsgált klón tartalmazza a 623 bp méretű fragmentet az M13 mp 9 Bam-Sal helyére beépítve. Egy izolátuniot kiválasztunk és ezt M13 mp 9/PHO5 Bam-Sal jelzéssel látjuk el. (lásd 12. ábra).
b) A TPA fehérjét kódoló szakasz hozzákapcsolása a PHO5 szignál-szakaszhoz (lásd 12. ábra) pg pW349 F plazmidot (lásd 7. péda) BglII endonukleázzal emésztünk (New England Biolabs) a szállító által megadott körülmények között. A DNS-t etanollal kicsapjuk, majd 6 mM Tris-HCl (pH 7,5) 50 mM nátrium-klorid, 6 mM magnézium-klorid összetételű pufferban szuszpendáljuk. A DNS 3’ beugró végét az E. coli DNS-polimeráz Klenow fragmentjével feltöltjük. A reakciót 50 pl össztérfogatban 2 egység enzimmel hajtjuk végre 80 pM dATP, dGTP, dCTP és dTTP jelenlétében 37 °C-on, 30 percig. Az inkubálást fenol-extrakcióval állítjuk le, majd a DNS-t etanollal kicsapjuk.
pg M13 ηιρ9/PHO5 Bam-Sal RF plazmidot KprI (Biolabs) restrikciós endonukleázzal 20 emésztünk a szállító álLal megadott módon. A DNS-t etanollal kicsapjuk, majd 10 pl, 200 mM nátrium-klorid, 1 mM cink-szulfát és 60 inM Na-acetát (pil-1,6) összetételű pufferban oldjuk. Egy egység Sí exonukleázt aduk hozzá, és az elegyet 60 percig 37 °C-on inkubáljuk. A reakciót fenolos extrakcióval állítjuk le, a DNS-t etanollal kicsapjuk és 50 pl, 50 mM Tris-HCl (pll7,5), 1 mM magnézium-klorid öszszetételű pufferban oldjuk. 10 egység borjú-bél alkalikus foszufatázt (Boehringer) adunk hozzá és a reakcióelegyet 60 percig 37 °C-on inkubáljuk, majd 65 “C-on újabb 60 percig. A DNS-t DE52 (Whatman) ioncserélő kromaLográfiával (lásd 9a. példa) tisztítjuk, majd etanollal kicsapjuk.
1,5 pg BglII-vel emésztett pW349F plazmidot a fentiek szerint Klenow DNS polimerázzal kezeljük, és 0,5 pg KprI-gyel hasított, Si-gyel emésztett és foszfatázzal kezelt M13 mp9/PHO5 Bam-Sai fragmenttal ligáljuk 10 pl össztérfogatba 900 egység T4 DNS ligázzal a fentiekben leírt pufferban azzal a különbséggel, hogy 4 niM ATP-t használunk és az inkubálást 18 órán át szobahőmérsékleten végezzük. E. coli JM 101 sejteket transzformálunk, 6 fehér plakkot kiválasztunk és az egyszálú fág-templátot a leírás szerint (38, izoláljuk. A kapcsolódási hely nukleotid sorrendjét (a 2,0 kb méretű BglII fragment és az M13 mp 9 vektor kapcsolódása) a didezoxi lánc-terminációs módszerrel (39) határozzuk meg. A következő oligo-dezoxinukleotid prímért használjuk.
5’AGTATGGCTTCATCTCTC 3’
Az oligo dezoxinukleotidot a foszfotriészter módszerrel (40,41) szintetizáljuk. Ez a PI1O5 promoteren belül hibridizálódik, és lehetővé teszi az elongációt a kívánt DNS kapcsolódási ponton keresztül az E. coli DNS polimeráz Klenow fragmentjével. Egy megfelelő izolátuniot kapunk, mely a kővetkező DNS nukleotid-sorrenddel rendelkezik (a PHO5 fehérjét kódoló szakasz ATG triplettjétöl indul):
ATG TTT ΑΛΑ Τ('Ί' θ'Ι’Τ CTT TAT TCA ATT ΤΤΛ C.CC GCT~ TC'Í’~' TTC _ Cl -I: ÁAT GCÁ~GGA TCT TAC_CAA.G.TG —----PHO5 fehérét kódoló szakasz
- TPA fehérjét kódoló szakasz Ezt a konstrukciót. M13 mp9/P//O5-TPA-nak nevezzük (lásd 12. ábra)
c) llövidített PIIO5 transzkripciós terminációs fragment elóállitása (lásd 13. ábra) pg p31R plazmid DNS-t (lásd 7. ábra, emésztünk Smal restrikciós enzimmel, a DNS-l fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. Λ DNS-t 0,5 mg/ml koncentrációban 10 mM Tris-HCl (pll8,0) pufferban oldjuk. 10 pg Saml-gyel hasított I)NS-t 2 egység Bal31 exonukleázzal (BRL) emésztünk 100 pl, 20 mM TR1S-HC1 (pH8,0) 100 mM nátrium-klo-1937
HU 201115 Β rid, 12 mM magnézium-klorid, 12 mM kalcium-klorid és 1 mM EDTA összetételű pufferban.
3-3 pg-os alikvot részeket kiveszünk 90, 120, 150 másodperces, 30 °C-os inkubálás után és azonnal összekeverjük 50 pl fenollal és 60 pl TNE-vel, Fenol-kloroformos extrakció és etanolos kicsapás után a DNS-t 100 ug/ml koncentrációban 10 mM Tris-HCl (PH8,0) pufferban oldjuk. A Bal31 exonukleázos emésztés mértékének meghatározása céljából minden egyes időpontból 0,7 pg DNS-t tartalmazó aT ikvot részeket kiveszünk, HindlII-mal emésztünk ée agaróz gélelektroforézissel analizálunk. A további analízis céljára a 90 másodpercig emésztett DNS-t használjuk. 2,2 pg plazmid DNS-t 1 órán át, 37 “C-on 2,8 egység Klenow DNS polimerázzal inkubálunk (a polimeráz I nagy fragmentje, BRL) 35 pl 60 mM Tris-HCl (pH7,5), 10 mM magnézium-klorid és mindegyik dNTP-böl 0,1 mM összetételű pufferban.
pg Xhol linkért (5’-CCTCGAGÜ-3’, Collaborative Research) 35 egység T4 polinukleotid kinéz enzimmel (Boehringer) kezelünk 30 percig 37 “C-on, 50 pl, 60 mM Tris-HC1 (pH7,5) 10 mM magnézium-klorid, 4 mM DTT és 0,5 mM ATP összetételű pufferban.
0,67 pg kinázzal kezelt Xhol linkért és 0,4 pg Bal31-gyel kezelt p31R Lompavégű plazmid DNS-t ligálunk éjszakén át szobahőmérsékleten 450 egység T4 DNS ligázzal 25 pl, 60 mM Tris (pH7,5) 10 mM magnézium-klorid, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP összetételű pufferban. A ligáit DNS-t a feleslegben lévő linkertől izopropanolos kicsapással választjuk el 10 m, EDTA, 0,3 M nátrium-acetát (pH6,0) jelenlétében, 0,54 térfogat izopropanollal. Miután 35 percig szobahőmérsékleten tartottuk a keveréket, a DNS-t centrifugálással ülepítjük. Az üledéket levegőn szárítjuk és 17 pl, 6 mM Tris (pH7,9) 150 mM nátrium-klorid, mM magnézium-klorid és 6 mM merkapto-etanol összetételű pufferban oldjuk. A DNS-hez kapcsolt Xhol linkereket Xhol enzimmel hasítjuk, a DNS-t iozopropanollal kicsapjuk a fentiek ezerint és ligálással körbezárjuk. 6 órán át 15 “C-on ligáljuk a DNS-t 50 pl, 60 mM Tris-HCl (pH7,5) 10 mM magnézium-klorid, 10 mM DTT, 1 mM ATP összetételű pufferban 600 egység T4 DNS ligázzal, majd 10 pl-t adunk a ligáló elegyekből 100 pl kalciummal kezelt, transzformációra kompetens E. coli HB 101 sejtekhez (lásd 4a. példa).
amp* rezisztens telepet növesztünk külön-külön 100 mg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban. A plazmid DNS-t [p31R (Xhol)] izoláljuk, és HaelII emésztéssel analizáljuk. Két plazmidot választunk és a terminátor fragmenten az Xhol hely melletti szakasz nukleotid-sorrendjót Maxam és Gilber módszerével (10) meghatározzuk. A nukleotid-sorrend a 15. ábrán látható.
d) A PHO-TPA hibrid gén átvitele ά pJDB207 élesztővektorokba (lásd 13. ábra)
Az M13 mp9/PHO5-TPA RF plazmidot a fentiekben leírt módon készítjük el. Ebből a DNS-ből 2 pg-ot BamHI (Biolabs) és Sáli (Biolabs) restrikciós endonukleázzal emésztünk, ós a 2,6 kb fragmentet alacsony olvadáspontű agaróz gélből izoláljuk (lásd 5c. példa). Hasonlóan állítjuk elő 100 ng-ot a PHO5 terminátort tartalmazó p31R (Xhol) plazmid 134 bp méretű HindlII-XhoI fragmentjéből. Ezenkívül 1 pg pJDB207 plazmidot (22) emésztünk BaniHI-gyel és HindlITmal, majd a
6,5 kb fragmentet alacsony olvadáspontú agaróz gélen való elektroforézis után izoláljuk.
Mindhárom fragmenből 0,5 pg-ot 200 egység T4 DNS-ligázzal (Biolabs) összeligázunk éjszakán át 15 “C-on, 20 pl 60 mM Tris-HCl (pH7,5), 10 mm magnézium-klorid, mM DTT, 1 mM ATP, összetételű pufferban. Az E. coli HB 101 törzs transzformálását a 4a példában leirt módon végezzük ampicillin, rezisztens telepeket szelektálva. Négy telepet izolálunk, plazmid DNS-t állítunk elő belőlük (a 2. pédában leirt módszerrel), és a DNS-t BamHI, Hindii! és BstEII restrikciós enzimekkel emésztve analizáljuk. Az egyik plazmidot pJDB207/P//O5-TPA/lA) jelzéssel látjuk el.
e) A pJDB207/PHO5-TPAa plazmid készítése (lásd 14. ábra)
Az M13 mg 9/PHO5-TPA kettős szálú DNS-ből 10 pg-ot SalI-gyel emésztünk. Fenolos extrahálás és etanolos kicsapás után a DNS-t 0,5 mg/ml koncentrációban oldjuk 10 mM TRIS-HCI (pH8,0) pufferben. A Bal31-es emésztéseket lényegében a 8c. példában leirt módon hajtjuk végre, majd Xhol linketeket adunk hozzá. E. coli JM1O1 törzsbe való transzformálás után RF DNS-t izolálunk, és az Xhol linker helyét a didezoxi szekvenáló módszerrel határozzuk meg, az 5’-GAACGGTAGGTATTGATTG-3’ oligodezoxinukleotid primer felhasználásával.
Az Xhol linkereket különböző helyen tartalmazó M13 származékokat következőképpen nevezzük:
M13mp9/P//O5-TPA (Xhol-l)
M13mp9/PZZO5-TPA (XhoX-2)
M13mp9/P//O5-TPA (XhoI-3)
M13mp9/P/fO5-TPA (XhoI-4)
Az Xhol linkerek 1-4 helyzetét mutatják az alábbiakban:
-2039
HU 201115 Β
CGACCG h'GAl CTCTTCTTCTTCA
CCAGGAACACCCGACTCCTCAAAAGCAAATGAGATCC » k
GAAGACACTG» CAAAGtí fCGCAGTC
CTTCTCT |tGa1 TPA transzlációs stop-kodon
1, 2, 3, 4 a linker (5’-CCTCGAGG-3’> helyzete
A fenti négy M13 származék [M13mp9/PHO5-TPA (Xhol 1-4)] mindegyikéből 2 pg RF DNS-t izolálunk, BamHI és Xhol enzimekkel emésztjük, és a 2,5 kb méretű fragmentet alacsony olvadáspontú agaróz gélektroforézissel izoláljuk (lásd 5c. példa). Hasonlóképpen 2 Mg p31R (Xhol) DNS-t emésztünk Xhol és HindlII enzimekkel és a 134 bp méretű fragmentet izoláljuk. A pJDB207 élesztőplazmidból 2 Mg-t BamHI és HindlII enzimekkel emésztünk, majd a 6,5 kb méretű fragmentet a fentiek szerint izoláljuk. A három fragmentet 15 °C-on 15 órán ét ligáljuk és E. coli HB1O1 sejteket transzformálunk velük, ampicillin rezisztenciára szelektálunk. A plazmid DNS-t tizenkettesével csoportosított telepekből izoláljuk, és a konstrukciókat HindlII, Xhol, és BamHI restrikciós endonukleázokkal végzett restrikciós elemzéssel vizsgáljuk. A négy klónozó kísérletből származó izolétumokat a következőképpen jelöljük: pjDB207/PH05-TPA Δ 1, pjDB207/PHO5-TPA Λ 2, pjDB207/PHO5-TPA δ 3, pjDB207/PHO5-TPA Δ 4,
9. Példa
A p31RL/TPA (12-2) plazmid készítése (16. ábra)
A PH05 promoter és az érett TPA-t kódoló szakasz összekapcsolását szintetikus oligodezoxínukleotiddal végezzük. Az ezt az öligodezoxinukleotid linkért a PIJO5 promoter 3’ végén tartamazó plazmidot használjuk akceptor DNS-ként az érett TPA-t kódoló szakusz klónozására.
A. A p31L akceptor plazmid készítése (16. ábra)
a) A p31R plazmid emésztése EcoRI enzimmel és alkalikus foszfatázzal
Mg p31 plazmid DNS-t (lásd 6e példa) 6 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal 60 percig 37 °C-on emésztünk a szállító (Boehringer) által előirt körülmények között. A teljes megemésztés után a mintát 10 percig 65 °C-on tartjuk, hogy inaktiváljuk az enzi22 met. 0,05 térfogat 1M Tris-HCl-t (pH8,0) és 2 egység borjúbél alkalikus foszfatázt (Boehringer) adunk hozzá. Az elegyet 60 percig 37 °C-on tartjuk, majd 1 órán a 65 °C-on, hogy a foszfatázt inaktiváljuk. A DNS-t DE52 (Whatman) ioncserés kromatográfiával tisztítjuk. A DNS-t a DE52-re (100 pl ágytérfogat szilikonozott Pasteur pipettában) alacsony sótartalmú pufferban (150 mM nátrium-klorid, 10 inM TRIS-HC1, pH8,0 mM EDTA) adszorbeál20 juk és nagy sótartalmú puffer-oldattal (1,5 M nátrium-klorid, 10 mM TRIS-HC1, 1 inM EDTA) eluáljuk. A leoldott DNS-t etanollal kicsapjuk és 0,15 mg/ml koncetráciöban 10 m Tris-HCl-ben (pH8,01) oldjuk.
b) A kémiailag szintetizált DNS linker ligálása az EcoRI-gyel és alkalikus foszfatázzal emésztett p31R plazmádhoz.
Az 5’-GAATTCCATGGTACCATGGAATTC-3’ képletű oligodezoxinukleotidot a foszfotriészter módszerrel [Itakura et al (40) de Rooy al (41)] szintetizáljuk, Az oligodezoxinukleotid nukleotid-sorrendje olyan, hogy az egyik fe35 le komplementer a másikkal. A kezelés során 24 bázispár méretű, kétszálú DNS linkért kapunk 5 pg szitetikus oligodezoxinukleotidot az 5’ végen foszforilezünk 7,5 pCi /χ-32ρ/-ATP-vel (5 000 ci/mmól, Amersham) 50 pl
60 mM TRISZ-HC1 (pH7,5), 10 mM magnózium-klorid, 4 mM DTT, 0,5 m ATP és 35 egység T4 polinukleotid kináz összetételű oldatban 30 percig, 37 °C-on. Az elegyet tovább inkubáljuk 5 percig 75 °C-on, hagyjuk szobahö45 mérsékletre hűlni, majd -20 °C-on tároljuk.
2,5 pg radioaktív foszorral jelzett őszszetapadt linker DNS-t önmagával lígálunk 50 pl, 60 mM Tris-HCl (pH7,5) 3,5 M ATP, mM DTT összetételű oldatban, 2 000 egység 'Γ4 DNS ligázzal (Biolabs), 6 °C-on éjszakán át inkubálva. A T4 DNS ligázt inaktiváljuk, az elegyet 10 percig 65 °C-on tartva. A kapott multimer linker DNS-t 55 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal emésztjük 60 pl,
100 mM TRIS-HC1 (pH7,5), 10 mM magnézium-klorid, 50 mM nátrium-klorid összetételű oldatban, 60 percen ét 37 °C-on tartva az elegyet. A reakciót a minta cseppfolyós nitrogénbe helyezésével állítjuk le. 0,5 pg foszfo60 rilezett, EcoRI-gyel hasított linker DNS-t 300 egység T4 DNS ligázzal (Biolabs) EcoRI-gyel és alkalikus foszfatázzal emésztett p31 DNS-sel kapcsolunk össze 10 pl, 60 mM TRIS-HCl (pH7,5), 10 mM magnézium-klorid, 1 mM ATP és 5 mM DTT összetételű pufferban, 3 órás
-2141
HU 201115 Β °C-08 inkubálás után. A ligaló elegyből 4 pl-es alikvot részeket adunk 100 pl kalciummal kezelt, transzformációra kompetens E. coli HB 101 sejtekhez (lásd 4a. példa).
Négy transzformált amp* telepet külön-külön felnövesztünk 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban. A plazmid DNS-t Holmes és munkatársai módszerével (26) izoláljuk, és KpnI valamint Smal/BamHI emésztéssel elemezzük.
Egy olyan, p31RL-lel jelölt kiónt választunk a további munkához, mely KpnI restrikciós endonukleázzal hasítható, és a Smal/BamHI kettős emésztés után a várt restrikciós fragmenteket kapjuk.
A p31R plazmidot helyettesíthetjük a p31Y vagy bármely következő, a 6c példában említett plazmiddal: p31P, p31V, p31L, p31N, p31C, p31H, p31S, p31k és p311. Az EcoRl-gyel hasított, defoszforilezett p31Y DNS-t a foszforilezett, EcoRI-gyel hasított linker DNS-sel kapcsoljuk össze. A transzformációt és az ampe telepek analízisét a fent leírt módon végezzük, A várt restrikciós mintázatot mutató kiónok közül egyet kiválasztunk és p31RL jelöléssel látjuk el.
B. A TPA DNS beépítése a p31RL plazmidba (16. ábra)
a) A p3lRL plazmid emésztése Ncol-gyel pg p31RL DNS-t a szállító (Biolabs) által előirt körülmények között Ncol restrikciós endonukleázzal emésztünk. Az oldatot a teljes emésztödés lejátszódása után fenol-kloroformos extrakcióval fehérje-mentesíjük, és a DNS-t etanolos kícsapással koncentráljuk. A DNS-t 10 mM TRIS-HC1 (pH8) pufferban oldjuk, 0,25 mg/ml koncentrációban.
b) A Klneow DNS polimeráz reakciója az Ncol-gyel hasított p31RL DNS-sel pg, Ncol-gyel hasított p31RL DNS-t 100 pl, 60 niM, TRIS-HC1 (pH7,5), 10 mM magnézium-klorid, 4 pM dATP 30 uCi[oC-32p]-dATP, 0,1 mM dTTP, 0,1 mM dCTP és 0,1 raM d GTP összetételű pufferban 8 egység Klenow DNS polimerázzal (nagy fragment, BRL) inkubálunk. 15 perces szobahőmérsékleten való inkubálás után a jelöletlen dATP koncentrációját 0,1 mM-ra növeljük. Az inkubálást újabb 45 percig folytatjuk szobahőmérsékleten. A reakciót fenol-kloroformos extrakcióval állítjuk le. A DNS-t etanolos kicsapással töményítjük és 0,25 mg/ml koncentrációban 10 mM TRIS-1IC1 (p!18) pufferban oldjuk.
Az a) és b) reakciók egy alternatívájaként a p31RL DNS-t KpnI restrikciós endonukleázzal, majd T4 DNS polimerázzal kezeljük, a c) és d) reakciók szerint:
c) A p31 RL plazmid emésztése Kpnl-gyel pg p31RL DNS-t emésztünk meg a szállító (Bikolabs) előírásai szerint. Az elegyet fenol-kloroformmal extraháljuk. A DNS-t etanollal kicsapjuk, majd 0,4 mg/ml koncentrációban 10 iiiM Tris-HCl (pI18) 0,1 mM EDTA összetételű pufferban oldjuk.
d) A T4 DNS- polimeráz reakciója Kpnl-gyel hasított p31RL DNS-sel pg KpnI enzimmel hasított p31RL DNS-t 2,5 percig 37 °C-on inkubálunk 10 egység T4 DNS polimerázzal (42) 100 pl 33 mM TRIS-acetát (pH7,9) 66 mM kálium-acetát, 10 mM magnézium-acetát és 0,5 mM DTT összetételű oldatban (trimmelési lépés). A trimmelt DNS-nél reszintézisét megnövelt 200 pl térfogatban végezzük 33 mM TRIS-acetát (8pH7,9) 66 mM kálium-acetát, 10 mm magnézium-ecetet, 0,5 mM DTT, 0,4 uM dATP, 30 pCi[oC-32p]~ -dATP, 0,1 mM dTTP és 0,1 mM dCTP és 0,1 mM dGTP jelenlétében. 18 órán át 37 °C-on inkubáljuk az elegyet, majd a jelöletlen dATP koncentrációját 0,1 mM-ra növeljük és az inkubálást további 35 percig folytatjuk 37 °C-on. A reakciót fenol-kloroformos extrakcióval állítjuk le. A DNS-t etanollal kicsapjuk és 0,4 mg/ml koncentrációban oldjuk 10 mM TRIS-IIC1 (pH8) pufferban.
e) A lineáris, DNS-polimerázzal kezelt p311íL plazmid DNS emésztése Smal-gyel
4,5 pg Ncol-gyel és Klenow DNS polimerázzal kezelt, p31RL DNS-t (9 Bp példa) vagy 4 pg KpnI-gyel és T4 DNS-polimerázzal ínkubélt p31RL DNS-t Smal restrikciós endonukleázzal teljesen megemésztünk. A DNS-t etanollal kicsapjuk és 100 pl 50 mM TRIS-HCL (pH 8,0) pufferban oldjuk.
f) A 4,3 kb méretű nagy DNS fragment izolálása és defoszforilezése
A nagy 4,3 kb méretű DNS fragmentet Tris-borát-EDTA pufferban (pH8,3) 0,8%-os preparatív agaróz gélből izoláljuk, a DNS-t tartalmazó agaróz-darabot kivágva a gélből. Mindegyik gél-blokkban levő DNS-t külön-külön elektro-eluáljuk 1,5 ml ötszörösre hígított TRIS-borát-EDTA (pH8,3) pufferral töltött dialízis hüvelyben. A lezárt hüvelyeket TRIS-borát-EDTA (pH8,3) pufferba merítjük. 30 percig 100 mA áramot engedünk át rajta, majd 45 másodpercre megváltoztatjuk az áram poliaritésát, hogy a DNS-t eltávolitsuk a dialízis-membrán faláról. A dialízis-hüvelyben levő géldarabot körülvevő puffért kivesszük a nátrium-klorid koncentrációját 150 mM-ra állítjuk és DE 52 (Whatman) ioncserélő oszlopon bocsátjuk keresztül. A DNS23
-2243
HU 201115 Β
-t magas sótartlmú pufferral (1,5 M nátrium-klorid, 10 mM Tris-HCl pH8,0 és 1,0 mM EDTA) oldjuk le etanollal kicsapjuk, majd 0,2 mg/ml koncentrációban 10 mM TRIS (pH8,0) pufferban oldjuk. A DNS fragment 5 jelölése p31RLa.
Az a)-f) reakciókat hasonló módon végezhetjük p31YL DNS-sel a p31RL DNS-helyett, így p31YLa DNS fraginentet kapunk.
g) A pW349F plazmid emésztése Dall-gyel
A pW349F plazmid a humán szövet-specifikus plazminogén aktivátor struktúrgénjét 15 tartalmazza a pBR322 plazmid PstI helyére klónozva (lásd 7c. példa)
A plazmid DNS előállítására a pW349-tel transzformált £'. coli HB101 törzs egy telepével 100 ml 10 mg/1 koncentrációban tetracik- 20 lint tartalmazó LB táptalajt oltunk. A tenyészetet éjszakén át 200/perc fordulatszámmal 37 “C-on rázatjuk. A plazmid előállítását a 2. példában leírt módon végezzük.
pg pW349 plazmid DNS-t 10 egység 25 Ball restrikciós endonukleézzal emésztünk 2 órán át 37 °C-on, 200 pl, 6 mM Tris-HCl (pH7,5), 6 mM nátrium-klorid, 6 111M magnézium-klorid, 6 mM 2-merkapto-etanol és 0,1 mg/ml borjú szórum-albumin összetételű 30 pufferban. A teljes emésztődés megtörténte után az oldatot fenol-kloroformos extrakcióval fehérje-mentesítjük. A DNS-t etanollal kicsapjuk, majd 0,2 mg/ml koncentrációban 10 mM Tris (pH8,0) pufferban oldjuk. 35
Adott esetben Xhol linkért ligáivá a Ball-gyel emésztett DNS tompa végéhez a további munkában kényelmesen használható klónozó helyet kapunk.
h) A Ball-gyel hasított pW349F DNS emésztése BglII-vel pg Ball-gyel hasított pW349F DNS-t BglII restrikciós endonukleézzal (Biolabs) 45 emésztünk a szállító előírásai szerint. Miután a teljes emésztés inegtörLént a fehérjéket fenolos-kloroformos extrakcióval eltávolítjuk. A DNS-t etanollal kicsapjuk és 0,2 mg/ml koncentrációban vízben oldjuk. 50
i) . A Klenow DNS polimeráz és Sí nukleáz limitált reakciója a Bgl II restrikciós helyen pg Ball-gyel és BglI-vel hasított pW349F DNS-t 30 percig szobahőmérsékleten inkubálunk 100 pl, 60 TRIS-HC1 (pII7,5), mM magnózium-klorid, 0,1 mM dATP,
0,1 mm dGTP, 8 egység Klenow DNS-polimerüz 60 összetételű oldatban. A reakciót EDTA-nak 10 mM végkoncentrációban való hozzáadásával állítjuk le. A fehérjét fenol-kloroformos kirázással távolltjuk el. A DNS-t etanollal kicsapjuk, majd 0,2 mg/ml koncentrációban 65 vízben oldjuk.
Sí nukleázzal való további emésztés céljából a DNS-t 30 percig 37 “C-on inkubáljuk
1,5 egység Sí nukleázzal 50 pl, 30 mM natriUin-acetát (plhl.G), 200 mM nátrium-klorid, 1 mM cink-szulfát oldatban. Fenol-kloroformos extrakció után a DNS-L etanollal kicsapjuk, majd újra oldjuk 45 pl 10 inM Tris-HCl (pH8,0) pufferban.
k) Az 1,86 kb méretű Bgllll-Ball restrikciós fragment izolálása
A BglII restrikciós helyen a fentiek szerint Klenow DNS polímerázzal és Sí nukleézzal tompa végűre alakított. 1,86 kb méretű BglII-Ball fragmentet 0,8%-os preparatív agaróz gélen TRIS-borát-EDTA (pH8,3) pufferban elválasztjuk és izoláljuk. A gél-blokkokból a 9Bf példában leírtak szerint elektro-elúcióval nyerjük ki a DNS-t.
l) Az 1,86 kb méretű DNS-fragment klónozása megfelelő akceptor DNS-be
Az 1,86 kb méretű, tompavégű DNS-fragmentból 0,3 pg-ot (lásd 9Bk példa) 0,6 pg p31RLa-bo (lásd 9Bf példát) ligálunk. A reakciót 20 órán át 15 “C-on folytatjuk 400 egység T4 DNS ligázzal (Biolabs) 10 pl 60 mM TRIS-HC1 (plI7,5), 10 mM magnézium-klorid, mM DTT, 3,5 mM ATP összetételű pufferban,
A ligáló elegyből 3 vagy 6 pl alikvot részeket adunk 100-100 pl kalciummal kezelt, transzformációra kompetens E. coli HB 101 sejthez (lásd 4a. példa) transzformált, ampR telepet növesztünk külön-külön 100 ng/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban. A plazmid DNS-t Holmes és munkatársai (26) módszerével állítjuk elő, majd EcoRl-gyes emésztéssel analizáljuk. 12 klón tartalmazza a megfelelő orientációban az 1,86 kb méretű DNS-fragmentet. Ezeket a kiónokat a P1IO5 promoter és a TPA strukturgén kapcsolódási helyét tartalmazó DNS-szakasz nukleotid-sorrendjének meghatározásával tovább elemezzük. Olyan szintetikus oligodezoxinukleotidot használunk, mely a PB(J5 promoter mRNS starthelyéhez közel hibridizálódik és lehetővé teszi a nukleotidsorrend meghatározását 3’ irányban. Az M13 reverz priming körülményeket (43) alkalmazzuk a kel.l.ősszálú plazmid DNS denaturálására és a szintetikus oligodezoxinukleotid hibridizálására. A DNS szekvenélást a leírás (39) szerint végezzük.
Két klón tartalmazza a kővetkező, korrekt kapcsolódási helyet:
-23HU 201115 B ·>· PH05mRNS
GAATA
AGAACAACAACAAATAGAGCAAGCAAATTCGGAATTCC ATGJ'CT TAC CAA.... Met Ser Tyr Gin......
PHO5 mRNS start
-PHO5 DNS 10
.............linker DNS
----TPA DNS
Ezek a kiónok azonosak és a p31RL (TPA (12-2) jelzést kapták.
10. Példa
A gén-konstrukciók szub-klónozésa a nagy kópia-számú pJDB207 élesztóvektoiban (lásd 20 17. ábra).
mennyiségben keverjük a pJDB2O7 6,2 kb méretű Hindlll-Sull fragmentjével. A ligálást 4 órán át 15 °C-on végezzük 100 pl őssztórfogatban. A ligáló elegyből 10 pl-t használunk kompetens E. coli IIB101 sejtek transzformálására a 4a. példában leírtak szerint. Számos amp telepet növesztünk külön-külön 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban. A plazmid DNS-t Hindin és Sáli restrikciós endonukleázzal emésztve vizsgáljuk a beépített szakasz méretét. A helyes beépített szakaszt tartalmazó klón a pJDB207/P/7O5-TPA (12-2) jelölést kapja.
11. Példa
A 9. példában leírt konstrukció a pBR322-ből származó vektorba egymás után beépítve tartalmazza PHO5 promotert a szignálszakasz nélkül a TPA-2 kódoló szakaszt és a P1IO5 transzkripciós terminációs szakaszt. Élesztőben való kifejeződés céljából az egész beillesztett szakaszt leucin protolrófíára való szelekciót lehetővé tevő pJDB207 (22) éleszLővektorban szubklónozzuk.
pg p3lRL/TPA (12-2) DNS-t emésztünk Sáli és Hindlll restrikciós endonukleázokkal. A restrikciós fragmenteket 0,8%-os preparatív alacsony olvadáspontéi agarózgélen választjuk el, és a kis 2,8 kb méretű fragmentet 0,8%-os preparatív alacsony olvadáspontú agarózgélből izoláljuk. A DNS fragmenteket tartalmazó géldarabokat 65%-on megolvasztjuk és az agaróz koncentráció 0,3%-ra csökkentése céljából vízzel hígítjuk.
A p31RL/TPA (12-2) plazmid 2,8 kb méretű Sall-HindlII fragmentjét ekvimoláris
A Saccharomyces cevevisiae GRF18 transzformálása
A pJDB207/r//O5-TPA(lA), pJDB207/PH05-ΤΡΑδ 1, pJDB20/Ρ//Ο5-ΤΡΑΔ 2, pJDB207/PllO5-TPAa 3, pJDB207/PH05-TPAA 4 és pJDB207R//’//O5-TPA( 12-2) plazmidokat a Hinnen és munkatársai által leirt eljárás (12) alkalmazásával külön-külön bevlsszük a Saccharomyces cevevisiae GRF18 (alfa, his3-11, his3-15, leu2-3, leu2-112, can”) törzsbe. Mindegyik plazmid DNS-ből 1 pg-ot adunk egy szferoplaszt szuszpenzióhoz és a keveréket polietilén glikollal kezeljük. A szferoplasztokat 10 ml regeneráló agarba keverjük és leucint nem tartalmazó élesztő minimál agarlemezre szélesztjük. 3 napig 30 °C-on inkubálva kb. 200 transzformált sejtet kapunk.
Mindegyik élesztő-transzformálásból egy élesztőtelepet izolálunk. A különböző izolátumok a következő jelzéseket kapják.
Saccharomyces cevevisiae GRF18/pJDB207/P//O5-TPA( 1 A), Saccharomyces cevevisiae GRF18/pJDB207/P//G5-TPA δ 1, Saccharomyces cevevisiae GRF18/pJDB207/W/O5-TPA Δ 2, Saccharomyces cevevisiae GRF18/pJDB207/P//üó-TPA δ 3, Saccharomyces cevevisiae GRFl8/pJDB207/P//O5-TPA λ 4 és Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/P//(75-TPA (12-2).
Az élesztősejteket 30 “C-on 100 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő élesztőtáptalajban 55 24 órán át rázatva növesztjük, míg a 2-3x10’ sejt/ml sűrűséget el nem érjük. A sejteket egyszer mossuk alacsony foszfát-koncentrációjú minimál táptalajjal. A felszuszpendált sejtekből 3 ml-t használunk 1000 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő 300 ml alacsony foszfát-koncentrációjú minimál táptalaj és
300 ml normál minimál táptalaj beoltására. A tenyészeteket 30 “C-on 160/perc fordulatszámmal rázatjuk. A P11O5 promoter indukcióját a savas foszfatáz aktivitás sejtekben való megjelenésének mérésével követjük. Tho-e és munkatársai módszerével (44). A sejteket 2660 -30 órás inkubálással körülbelül 1-2x10’ sejt/ml sűrűségig növesztjük.
-2447
HU 201115 Β
12. Példa
Élesztő sejtkivonatok készítése és a TPA aktivitás meghatározása
Alacsony foszfáttartalmú tenyészlében (48) l-2xl07/ml sűrűségre növő sejteket centrifugálunk Sorvall SS34 rotorban 10 percig 3000/perc fordulatszámmal. A kiülepltett sejteket a tenyészlé sókomponenseit tártál- 10 mazó pufferral (azaz aminosavak vitaminok, nyomelemek nélkül) mossuk. A sejteket szobahőmérsékleten 5 percig 3000/perc fordulatszómmal centrifugáljuk. A kiülepített sejteket 4 ml össztérfogatban szuszpendáljuk hideg, 15 66 mM nátrium-foszfát puffer (pH7,4) és 0,1% (v/v) Triton X-100 összetételű oldatban. A sejtszuszpenziót átvisszük egy 30 ml-es Corex-csőbe, 8 g 0,5 mm átmérőjű üveggyöngyöt adunk hozzá és a szuszpenziót 4 percig teljes sebességgel rázatjuk egy Vortex Mixeren (Scientific Instruments Inc., USA), majd jégfürdőben lehűtjük. Ezzel az eljárással a sejteknek több mint 90%-a felrázódik. A sejttörmeléket és az üveggyöngyöket Sorvall HB-4-es rotorban 10 percig 4 °C-on 8000/perc fordulatszámmal centrifugálva ülepítjük. A felülúszót Eppendorf csövekbe tesszük, cseppfolyós nitogéuben lefagyasztjuk és -60 °C-on tároljuk. A TPA-aktivitást Ranby (49) módszerének csekély módosításával határozzuk meg. D-Val-Leu-Lys, pNA-t (Kábái S-2251) használunk szubsztrátként. A 405 nm-es abszorpciót nem-specifikus hasításra korrigáljuk és urokináz standardhoz viszonyítjuk. Az eredmények a 2. táblázatban láthatók.
2. Táblázat
TPA aktivitás különböző rekombináns plazmidokkal transzformált S. cerevisiae GRF18 törzsben
| Plazmid | TPA aktivitás (egység/1 élesztó-sejttenyészet OD/6üo) | |
| Represszáll (magas Pl) | derepresszált (alcsony Pi) | |
| pJDB207/P//O5-TPA( 12-2) | - | 60 |
| p JDB207/P//O5-TPA( 1A) | 20 | 625 |
| PJDB207/ΡΡΟ5-ΤΡΑΛ 1 | - | 600 |
| PJDB207/PPO5-TPAa 2 | - | 700 |
| pJDB207/P//ü5~TPAa 3 | - | 650 |
| pJDB207/PH05-TPAá 4 | 625 |
13, Példa
A P11O5 szignálszakasz és az érett TPA-t kódoló szakasz közötti pontos összekapcsolódást tartalmazó plazmid konstrukciója (18. ábra)
Ez a konstrukció egy szintetikus oligodezoxinukleotid felhasználósóval korrekt kapcsolódást hoz létre a PHO5 szignálszakasz és az érett TPA-t kódoló szakasz között. Az egyszerűség kedvéért a pJDB207/P//O5-TPAA 2 plazmid (lásd 8e. példa) megfelelő szakaszát a p31 plazmldban (lásd 5. példa) szubklónozzuk.
a) A p31/PHO5-TPAü 2 plazmid izolálása
Mind a pJDB207/P//O5-TPAA 2 (lásd 8e. példa) mind a p31 plazmidból 2 pg-ot HindllI és Sáli restrikciós endonukleázzal emésztünk. A teljes megemésztődés után DNS-fragmenteket, 0,6%-os alacsony olvadáspontú agaróz-gélen, TRIS-borát-EDTA (p!18,3) pufferban választjuk szét. A pJDB207/P//05-TPAa 2 plazmid 2,6 kb méretű HindiiI—Sáli fragment26 jét, valamint a p31 plazmid 3,1 kb méretű HindlII-SalI fragmentjét kivágjuk a gélből. A góldarabokat 65 °C-on megolvasztjuk és az agaróz-koncentráció 0,3%-ra csökkentése céljából vízzel hígítjuk. Mindkét fragmentból ekvimorális mennyiséget keverünk össze és 100 pl térfogatban 4 órán át 15 °C-on ligái— juk. A ligáló elegyből 10 pl-t használunk kompetens é. coli ΗΒ101 sejtek transzformálására. Néhány ampH telepet analizálunk. A korrekt DNS-darabot tartalmazó kiónt ρ31/Ρ//Ο5-ΤΡΑΔ 2 jelöléssel látjuk el.
Ugyanezt a konstrukciót állítjuk elő a pJDB207/PW(95-TPAá 1, pJDB207-TPA λ 3 és pJDB207/PH05-TPAó 4 plazmidokkal is (lásd 8e. példa). A kapott plazmidok jelölése Ρ31/ΡΗΟ5-ΤΡΛΔ 1, p31/Ρ//Ο5-ΤΡΑδ3 és
Ρ31/ΡΗΟ5-ΤΡΑΔ 4.
b) A p31/PHO5-TPA18 plazmid készítése (18. ábra) pg ρ31/Ρ//Ο5-ΤΡΑΔ 2 DNS-t Xhol restrikciós endonukleázzal emésztünk. A linearizált DNS-t fenol-kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk és 0,5 mg/ml koncentrácl-2549
HU 201115 Β óban 10 mM Tris-HCI (pH8) pufferban oldjuk (p31/ΡΗ05-ΤΡΑΔ 2. Xhol).
Az Xhol-gyel hasított DNS-ből 5 pg-ot tovább emésztünk Ball-gyel. A teljes megemésztődés után a DNS-t egyszer extraháljuk fenol-kloroformmal, 2,5 térfogat etanollal kicsapjuk és 10 mM TRIS-HCI (pH8) pufferban oldjuk. A restrikciós fragmenteket 1,2%-os agaróz gélen Tris-borát-EDTA (pH8,3) pufferban választjuk szét. A nagy 3,9 kb méretű Xhol-Ball fragmentet kis géldarabban kivágjuk a gélből. A DNS fragmentet (A fragment lásd 18. ábra) a géldarabból elektroelúcióval ós DE 52 ioncserélő kromatográfiával nyerjük ki a 9Bf példában leírtak alapján. A DNS-L etanolos kicsapással koncentráljuk ós 0,2 mg/ml koncentrációban 10 mM TRIS-HCI (pH8) pufferban oldjuk.
pg ρ31/ΡΗΟ5-ΤΡΑΔ 2. Xhol DNS-t (lásd fenti) 37 °C-on 45 percig részlegesen emésztünk PstI restrikciós endonukleázzal (0,75 egység/pg DNS) 200 pl 10 mM Tris-HCI (pH7,5) 6 mM magnézium-klorid, 50 mM nátrium-klorid, 6 mM merkapto-entanol és 0,01 mg/ml etidium-bronűd összetételű oldatban. A reakciót fenol-kloroformos extrakcióval állítjuk le. A DNS-t etanollal kicsapjuk és 10 mM TRIS-HCL (pH8) pufferban oldjuk. A restrikciós fragmenteket 1,2%-os agaróz gélen, TRIS-borát-EDTA (pH8,3) pufferban választjuk szét. Egy 1,6 kb méretű az érett TPA-t kódoló szakasz legnagyobb részét tartalmazó XhoI-PstI fragmentet (B fragment, lásd 18. ábra) a géldarabból a fentiekben leirt módon elektroelúcióval kinyerjük. A DNS-t etanollal kicsapjuk és 40 pg/ml koncentrációban 10 mM TRIS-HCI (p!18) pufferban oldjuk.
A PHO5 szignálszakasz és az érett TPA-t kódoló szakasz közötti helyes kapcsolódást a (C) 5’-CCAATGCATCTTACCAAGTGATCTGCA-3’ (D) 3’-GGTTACGTAGAATGGTTCACTAG -5’ képletű szintetikus linkerrel hozzuk létre. A linker 5’ végén lévó nyolc nukleotid (5*— -CCAATGCA...) a PHO5 szignálszakasznak a Ball hasitási helytől a szakasz végéig terjedő darab egy részének felel meg, és 19 nukleotid az érett TPA-t kódoló szakasz 5’ végétől az első PstI helyig terjedő darabnak felel meg (lásd 19. ábra). A C és D oligonukleotidokat a foszfatriészter módszerrel szintetizáljuk. Külön-külön foszforilezzük 5’ végeiken és a 9Ab példában leírt módon egymáshoz illesztjük őket.
ng (4 pmól) foszforilezett kétszálú linker DNS-t 0,4 g pg (0,4 pmól) 1,6 kb méretű XhoI-PstI fragmenthez (B frgament, lásd fent) ligálunk 15 °C-on 16 órán át 600 egység T4 DNS ligázzal, 15 pl 60 mM Tris-HCI (pH7,5), 10 mM magnézium-klorid, 1 mM ATP, 5 mM DTT összetételű pufferban. Az elegyet 10 percig 85 °C-on tartva inaktiváljuk a ligázt. A liker feleslegét a DNS-nek 10 mM EDTA, 300 mM nátrium-acetát (pH6,0) jelenlétében 0,54 térfogat izopropanollal való kicsapáséval távolítjuk el. A többszörös linker-DNS-t és a DNS fragmentet Ball és Xhol enzimmel való emésztéssel távolitjuk el. A linker PstI helyen való hozzáadásának következtében az 1,6 kb méretű XhoI-PstI fragmentet Xhol-Ball fragmentté alakítjuk.
Ebből az 1,6 kb méretű Xhol-Ball DNS-fragmentből 0,4 pg-ot 1 pg 3,9 kb méretű Xhol-Ball fragmenthez (A fragment lásd fent) ligálunk, 400 egység T4 DNS ligázzal szobahőmérsékleten 16 órán át 10 pl 60 mM TRIS-HC1 (pH 7,5) 10 mM magnézium-klorid,
3,5 mM ATP, 5 mM DTT összetételű pufferben. A ligáló elegyböl 3 ós 7 pl-es alikvot adunk
100 pl transzformációra kompetens E. coli HB
101 sejtekhez (lásd 4a. példa). 10 transzformáit, ampR telepet növesztünk fel külön 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban. A plazmid DNS-t Holmes és munkatársai (26) módszerével állítjuk elő. A kiónokat a linker-régión átmenő szekvenálással analizáljuk.
Egy, a PIIO5 szignálszakasz és az érett TPA-t kódoló szakasz között leolvasási fázisban lévő kapcsolódással rendelkező kiónt (lásd 19. ábra) p31/P//Oó-TPA18 jelöléssel látunk el.
A p31/Ρ//Ο5-ΤΡΑΔ 2 plazmidot a Ρ31/Ρ//Ο5-ΤΡΑΔ 1, a p31/Ρ//Ο5-ΤΡΑΔ 3 vagy p31/PHO5-TPA& 4 plazmiddal helyettesíthetjük. A p31/ΡΙΙΟ5-ΎΡΑ& 3 plazmidból származó egyik kiónt például p31/P7ÍO5-TPA42 jelöléssel látunk el.
14. Példa
Plazmid-készilés a prepro-TPA-t kódoló DNSsel (20, 21 ábra)
A PH05 promotert a prepro-TPA-t kódoló DNS szakaszhoz kötjük. A prepro-régió 35 aminosavát kódoló nukleotid-szakaszt az érett TPA-t kódoló szakasz követi.
a) A TPA-t kódoló szakaszt, ideértve, a TPA szignálszakaszt, izolálása (20. ábra) pg pW349E plazmidot BglI restrikciós endonukleázzal hasítunk. Fenol-kloroformos extrakció és etanolos kicsapás utána DNS-t tovább emésztjük EcoRI-gyel és BamHI-gyel. A restrikciós fragmenteket 1%-os agaróz-gélen TRIS-borat EDTA (pH8,3) pufferban választjuk szét. A 0,9 kb méretű BglI-EcoRI fragmentet lokalizáljuk a gélen és kivágjuk, a gélből. A DNS-t a 9Bf példában leírt módon, elektro-elúcióval nyerjük ki.
A 0,9 kb méretű BglI-EcoRI fraginentből
3,5 pg-ot Hgal restrikciós enzimmel teljesen megemésztve 3 fragmentet kapunk. Az elegyet fenol-kloroformmal extraháljuk és a DNS-fragmentekct etanollal kicsapjuk. A
-2651
HU 201115 Β fragmenteken Hgal enzimmel való emésztés során keletkező tapadós végeket Klenow DNS-polimerázzal (1 egység X/pg DNS) feltöltjük, 60 mM TRIS-HC1 (pH7,5) 10 mM magnézium-klorid 0,1 mM TTP, 0,1 mM dCTP és 0,1 mM dGTP pufferban. Az elegyet 60 percig 20 °C-on tartjuk, majd a reakciót etanolos kicsapással leállítjuk. A tompa végű DNS-fragmenteket 40-szere feleslegben foszforilezett és párosított EcoRi- linkerrel (Biolabs) keverjük össze. A llgálást 2000 egység T4 DNS ligázzal végezzük, 16 órán át 15 °C-on, 56 ul 60 mM TRIS-HC1 (piI7,5) 10 mM magnézium-klorid, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP összetételű pufferban. A linker-inolekulák feleslegét a DNS-nek 10 mM EDTA (pH7,5) és 300 mM nátrium-acetát (pH6,0) jelenlétében 0,54 térfogat izopropanolos kicsapásával, Lávolítjuk el. A DNS-fragmentek keverékét a többszörös linkerek eltávolítására EcoRI-gyel emésztjük, majd NarX-gyel. A teljes megeniésztódés után a restrikciós fragmenteket 1%-os agaróz gélen, TRIS-borát-EDTA (pH8,3) pufferban választjuk szét. A 446 bp méretű EcoRI/(HgaI)-NarI fragmentet kivágjuk a gélből és a DNS-t elektroelücióval izoláljuk (lásd 9Bf példa).
b) A TPA-t kódoló szakasz 3' végének egy részét és az élesztő transzkripciós terminéciós jeleket tartalmazó DNS-fragment izolálása (lásd 20. ábra) pg ρ31/ΡΗΟ5-ΤΡΑΔ 2 plazmidot HindlII enzimmel emésztünk. Fenol-kloroformos extrakciós és etanolos kicsapás után a DNS-t vízben oldjuk, 0,1 mg/ml koncentrációban és NarI enzimmel emésztjük. A restrikciós fragmenteket 1% agaróz-gélen, TRIS-borát-EDTA (pH8,3) pufferban választjuk szét. Az 1,4 kb Narl-HindllI fragmentet izoláljuk és elektroelücióval kinyerjük az agaróz géldarabból (lásd 9Bf példa).
c) A vektorszakaszokat és a PH05 promotert tartalmazó DNS-fragment izolálása (lásd 21. ábra) pg p311I plazmidot HindlII és Ecoid restrikciós endonukleázzal emésztünk. A restrikciós fragmenteket 1%-os agaróz gélen, TRIS-borát-EDTA (plI8,3) pufferban választjuk szét. A 3,9 kb méretű Hindlil-EcoRI DNS-t tartalmazó géldarabot kivágjuk és a DNS-t elektroelücióval izoláljuk.
dl A fragmentek ligálása (lásd 21. ábra)
0,3ápmól 3,9 kb méretű HindlII-E'coKl fragmentet 0,3 pmól 1,4 kb méretű NarJ-HindlII fragmentet és 0,6 pmól 446 bp méretű EcoRI-NarI fragmentet ligálunk 480 egység T4 DNS-ligázzal 15 °C-on 6,5 órán át 12 pl 60 inM Tris-HCl (pH7,5) 10 mM magnézi28 um-klorid, 1 mM ATP és 5 inM DTT összetételű pufferban. A ligáló elegyből 5 és 7 pl-es alkivot részeket adunk 100 pl, kalciummal kezelt transzformációra kompetens E. coli HB 101 sejtekhez (lásd 4a. példa).
traszfonnált, ampB telepet növesztünk külön-külön 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajon. A különböző klónokból származó plazmid DNS-eket PstI enzimmel emésztve analizáljuk. Az egyik, várt restrikciós mintázattal rendelkező klórit p31R/SS-ΤΡΑδ 2 jelzéssel látjuk el. A ρ31/ΡΗ05-ΤΡΑΔ 2 plazmidot helyet-tesíthejük a p31/PHO5-ΤΡΑδ 3 plazmiddal, vagy a 13a. példában szereplő egyik klónnal. A plazmidok készítését a feniek szerint végezzük. A p31/PHO5-ΤΡΛδ 3 plazmidból származó egyik kiónt p31R/SS-TPAa 3 jelzéssel látjuk el.
15. Példa
A PHO5 kódoló szakaszba benyúló PH05 szignálszakasszal rendelkező plazmid készítése (lásd 22-24. á)
Ha idegen DNS-t kapcsolunk a P11O5 szignálszakaszhoz, akkor a szignálpeptid hasítási helye melletti aminosavak különböznek az eredeti P1IO5 fehérje aminosavaitól. Az aminosav-sorrend változása befolyásolhatja a fehérje szignálpeptidázzal való hasításának hatásfokát. Ezért a következő DNS-konstrukciókban olyan P1105 szignélszakaszt használunk, mely az éreti savas foszfatézt kódoló szakasz egy részét is tartalmazza. Csak a szignálszakasz után különböző távolságban kapcsoljuk az élesztő endopeptidéz hasítási helyét tartalmazó oligodezoxinukleotidon keresztül leolvasási fázisban, az érett TPA-t kódoló szakaszt. Az endopeptidáz hasítási hely jelenléte megakadályozza fúziós fehérjék létrejöttét.
a) Az érett savas-foszfatázt kódoló szakasz egy részét tartalmazó Ρ1ΙΟ5 szakasz szubklónozása
Olyan DNS fragmenteket izolálunk, melyek a PIIO5 promol.ert, PI1O5 szignálszakaszt és az érett savas-fosztatázt kódoló szakasz különböző hosszúságú részeit tartalmazzák. A BamHI hasítási helytől 5’ irányban 595, 637, 811 és 1312 nukleotid távolságra Hsai restrikciós helyek találhatók. (48). Mivel a P1105 szignálszakasz a 592. sorszámú nukleotidig terjed, a különböző Rsal hasítási helyek az érett savas foszfatázt kódoló szakaszban a 3, 45, 219 és 720 sorszámú bázisoknál találhatók. A Bamlll-Rsal fragmenteket az Rsal hasítási helyet Xbal hasítási hellyé átalakító szintetikus oligonukleolidon keresztül szubklónozzuk.
A p./DH207/ZJ//05, pH03 plazmid-DNS-t (lásd 2. példa) BamHI és Hpal restrikciós en-2753
HU 201115 Β donukleázokkal hasítjuk, majd a P11O5 és PH03 géneket tartalmazó 3,9 kb méretű fragmentet preparatív gólelek troforézissel izoláljuk. A 3,9 kb méretű BamHI-IIpal fragmentet BamHI és PvuII restrikciós endonukleázokkal hasított pBR322 vektorban klónozzuk. Az igy kapott, a PHO5 és PH03 géneket tartalmazó plazmidot p29 jelzéssel látjuk el.
A p29 plazmidból 30 pg-ot BamHI és EcoRII restrikciós endonukleázzokkal emésztünk. Teljes megemésztödés után a DNS-t fenol-kloroformmal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. A DNS-t 0,5 mg/ml koncentrációban 10 mM Tris-HCL (pli8) pufferban oldjuk.
pg BamHI és EcoRI restrikciós endonukleázokkal hasított p29 plazmidot részlegesen emésztünk Rsal restrikciós endonukleázzal (0,9 egység/pg DNS) 37 “C-on 45 percig inkubálva 300 pl 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) 6 mM magnézium-klorid 50 mM nátrium-klorid, 6 mM merkapto-etanol és 5 pg/ml etidium-bromid összetételű pufferban. Az emésztést fenolos extrakcióval állítjuk le. A DNS-t etanollal kicsapjuk, majd 1 mg/inl koncentrációban vízben oldjuk.
A 5’-CTAGATCTAG-3' képletű oligodezoxinukleotidot az 5' végén foszforilezzük, majd önmagával párosítjuk a 9Ab példában leírtak szerint. 4 pg (1400 pmol) foszforilezett és kótszálúvá tett linker DNS-t 14 pg (140 pmol) emésztett p29 DNS-sel (lásd fent) ligálunk, 16 órán át 20 “C-on 3200 egység T4 DNS ligázzal inkubálva 80 pl 60 mM Tris-HCl (pH 7,5) 10 mM magnézium-klorid, 3,5 mM
ATP, 5 mM DTT összetételű pufferban. A T4 DNS ligázt 10 percig 65 “C-on tartva inaktiváljuk. A linker feleslegét 10 mM EDTA és 300 mM nátrium-acetát (pH 6,0) jelenlétében 0,54 térfogat izopropil-alkohollal kicsapjuk. A DNS-t BamHI és Xbal restrikciós endonukleázokkal emésztve (4 egység/pg DNS) eltávolítjuk a többszörös linker molekulákat és Xbal tapadós végeket kapunk. A tompa végű RasI hasítási helyekhez való linker hozzáadásával majd ezt követően a linker Xbal restrikciós endonukleázzal való hasításával az összes p29 BamHI-Rsal restrikciós fragmentet BamHI-Xbal fragmentté alakítjuk, majd 1%-os alacsony olvadáspontú gélen, Tris-borát EDTA (pH 8,3) pufferban szétválasztjuk. Az 595 bp 637 bp, 811 bp vagy 1312 bp méretű BamHI-Xbal fragmenteket tartalmazó géldarabokat kivágjuk a gélből.
A pBR322/PHO5 Eco-Bam plazmid a pG7 plazmidból származik (2. példa). A pG7-et EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázzal hasítjuk. A kapott DNS-fragmenteket preparativ gél-eletroforézissel választjuk el. A 2,1 kb méretű EcoRI-BaniHI fragmentet izoláljuk, mely a PHO5 BamHI hasítási helyétől 5’ irányban található szakaszt tartalmazza. A 2,1 kb méretű fragmentet a pBR322 vektor 4 kb méretű EcoRI-BamllI fragmentjével ligáljuk. A kapott plazmid jelzése pBR322/P//üő Eco-Bam.
A pBR322/PH05 plazmid bán található a PHO5 BamHI hasítási helyétől 5’ irányban terjedő DNS-szakaszt tartalmazó 2,1 kb méretű EcoRI-BamllI fragment, 15 pg plazmid DNS-t emésztünk BamHI és Xbal restrikciós endonukleázokkal. A restrikciós fragmenteket 0,6%-os alacsony olvadáspontú gélen TRIS-borát-EDTA (pH 8,3) pufferban választjuk el. A 4,25 kb méretű BamHI-Xbal fragmentet kivágjuk a gélből.
A DNS fragmenteket tartalmazó géldarabokut 65 °C-on megolvasztjuk, majd az agaróz-koncentráció 0,3%-ra csökkentése céljából vízzel hígítjuk. A 637 bp méretű BamHI-Xbal fragment és a 4,25 kb méretű BamHI-Xbal vektor-fragment ekvimoláris mennyiségét összekeverjük és 600 egység T4 DNS-ligázzal 16 órán át 15 °C-on inkubáljuk 125 pl 60 mM TR1S-HC1 (ph 7,5) 10 mM magnézium-klorid, 5 mM DTT, 1 mM ATP összetételű pufferban.
A ligáló elegyből 10 pl-t 100 pl transzformácóra kompetens E. coli HB101 sejtekhez adunk, a 4a. példában leírtak szerint. 5 ainpR telepet növesztünk külön-külön 100 pg/ml ampcicillint tartalmazó LB táptalajban. A plazmid DNS-be beépített DNS-szakasz méretét EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázokkal végzett emésztéssel vizsgáljuk. A kívánt DNS-darabot tartalmazó kiónt pBR322/PHO5 Bam-Rsa637 jelöléssel látjuk el.
A 637 bp méretű BamHI-Xbal fragmentet helyettesíthetjük az 595 bp, 811 bp vagy 1312 bp méretű BamHI-Xbal fragmenttel. A kívánt méretű beépített DNS-szakaszt tartalmazó kiónok közül egyet-egyet pBR322/PIIO5 Bam-Rsa595, pBR322/PHO5 Bam-Rsa811 és pBR322/PHO5 Bam-lísa 1312 jelölésssel látunk el.
b) Szintetikus oligodezoxinukleotidok hozzáadása:
A 637 bp méretű BamHI-Xbal fragment tartalmazza a PIIO5 proniotert, valamint az érett savas foszfatázt kódoló szakasz 637 nukleolidjánál levő Hasi hasítási helyig terjedő szakasszal meghosszabbított PHO5 szignál-szakaszt. A DNS-fragmentet leolvasási fázisban kapcsoljuk az érett TPA-t kódoló szakaszhoz a Leu-Geu-Gly-Val-Ser-Leu-Asp-Lys-Arg oligopeptidet kódoló oligodezoxinukleotid linkeren keresztül. Ez a szakasz megtalálható még az élesztő alfa-faktort kódoló szakasztól (54) 5’ irányban.
pg pBR322/PHO5 Bam-Rsa plazmidot Xbal restrikciós endonukleázzal emésztünk. Teljes megemésztés után a DNS-L fenol-kloroformmal extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. A DNS-f 50 pg/ml koncentrációban 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) pufferban oldjuk, majd 11 egység borjúból alkalikus foszfutázzal (Boehringer) egy órán át 37 “C-on emésztjük. Az enzimet 1 órán át 65 C-on tartva inakfiváljuk. A I)NS-t DE52 (Whatman) ioncserélő kromatográfia val tisztítjuk, majd a
-2855
HU 201115 Β
9Aa példában leírt módon etanollal kicsapjuk. A ö’-CTAGAAGGGGTATCTTTGGATAAGA -3’
3’- TTCCCCATAGAAACCTATTCTCTAG -5’ képietú két szintetikus oligonukleotidot külön-külön foszforilezük az 5' végükön a 9Ab példában leirt módon. A foszforilezelt oligodezoxinukleotidokat ekvimoláris mennyiségben összekeverjük. Az elegyet 10 percig 75 °C-on tartjuk, majd hagyjuk lassan szobahőmérsékletre hűlni, és -20 C-on tároljuk. Ezt a linkért nevezzük C linkernek.
pg (120 pmól) foszforilezett, kettősszálú C linkért és 5 pg (1,5 pmol) Xba I-gyel hasított, defoszforilezett pllil322/PHO5 Bams-Rsa 637 plazmidot 1600 egység T4 ONS-ligázzal 15 °C-on 20 órán át ligálunk 40 pl 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM magnézium-klorid, 5 inM DTT és 1 mM ATP összetételű pufferban. A DNS ligázt 10 percig 85 C-on tartva Ínaktiváljuk, majd a linker feleslegét, izopropanolos kicsapással eltávolítjuk. A DNS-t 0,25 mg/ml koncentrációban vízben oldjuk. A többszörös linkereket BglII restrikciós endonukleázzal való emésztéssel eltávolítjuk. A DNS-t etanollal kicsapjuk újra oldjuk és Bamill-gyel tovább emésztjük. A restrikciós fragmenteket 0,6%-os alacsony olvadáspontú agaróz gélen, Tris-borát-EDTA (pH 8,3) pufferban válasz.tuk el. A 662 bp méretű BamHI-BglII fragmentet (a 637 méretű BamHI-Rsal fragmentből származik) lokalizáljuk és kivágjuk a gélből.
c) Az érett TPA-t kódoló szakaszt tartalmazó vektor-fragment izolálása (23. ábra) pg p31R/SS-TPAó 2, plazmidot BamHI és BglII i'estrikciós endonuklázokkal emésztünk. Teljes megemésztödés után a DNS-t etanollal kicsapjuk és 75 pg/ml koncentrációban 50 mM TRIS-HCL (pH 8,0) pufferban oldjuk. A DNS-fragmenteket 5’ végeiken defoszforilezzük 1 egység borjúból alkalikus foszfatázzal (Boehringer) 1 órán át 37 °C-on emésztve 60 pl 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) pufferban. A foszfatázt 1,5 órán át 65 C-on inkubálva inaktiváljuk. A DNS-t a 9Aa példában leirt módon DE52 (Whatman) ioncserélő kromatográval tisztítjuk. A DNS-t etanollal kicsapjuk, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) pufferban oldjuk, majd 0,6%-os alacsony olvadáspontú gélre visszük. Az 5,2 kb méretű BamHI-BglII fragmentet kivágjuk a gélből.
d) Az izolált DNS-fragment ligálása és transzformálása E. coli HBlOl-be (lásd 23. és 24. példa,
A p31R/SS-TPAó-25,2 kb méretű Bamlll—BglII fragmentjéből 0,1 pmólt és a pBR322/PHO5 Bam-Rsa 637 622 bp méretű BamHI-BglII fragmentjéből 0,2 pmólt tartalmazó alacsony olvadáspontú agaróz gélblokkot megolvasztunk 65 °C-on összekeverünk és az agaróz-koncentráció 0,3%-ra csökkentése érdekében vízzel hígítunk. A ligálást 800 egy30 ség T4 DNS ligázzal (Biolabs) 16 órán át 15 C-on végezzük 150 pl 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 inM magnézium-klorid, 5 mM DTT és 1 mM ATP összetételű oldatban, 10 pl és 30 pl-es alikvot részeket keverünk 100-100 pl transzformációra kompetens E. coli HB101 sejttel a 4a példában leírt módon. 6 anipR transzformált telepet növesztünk külön-külön 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban. A plazmid DNS-L a beépített DNS-szakasz mérete és orientációja szempontjából vizsgáljuk BamHI restrikciós endonukleázos emésztéssel. A beépített DNS-t a korrekt orientációbn tartalmaz!) egyik kiónt p31/PHO5 637 C-TPA jelöléssel látjuk el (lásd 23. ábra)
A pBR322/ΓΊΙΟ5 Bain-Rsa 637 plazmidot helyettesíthetjük a pBR322/P//(?5 Bam-Rsa595, ΡΒΚ322/Ρ//Ο5 Bam-Rsa 811 és pBR322/P1ÍO5 Bam-Rsal312 plazmidokkal. A fent leírt eljárást követve a várt méretű és orientációjú DNS-szakaszt tartalmazó kiónokat izoláljuk és a p3í/PHO5 595 C-TPA, p31/PHO5 811 C-TPA és p3i/PHO5 1312 C-TPA jelöléssel látjuk el.
A C linkért is helyettesíthejtük a
5’- CTAGATAAGAGATCTGC -3’ TATTCTCTAGACG -5’ képletű B linkénél.
A szintetikus oligodezoxinukleotidok foszforilezését, párosítását és a megfelelő DNS fragmentbez való kötését a C linkerre leírt módon végezzük. A kapott kiónokat B betűvel jelöljük, és p3l/PIIO5 595B-TPA, P31/PHO5 637Β-ΤΡΑ p31/PH05 811-ΤΙΆ és p31/PIIO5 1312B-TPA jelöléssel látjuk el. Ezekben a konstrukciókban a B linker a Leu-Asp-Lys-Arg aminosavakat kódolja.
Λ C linkért a
5’- AAGAGATCTGC -3’
3’- TTCTCTAGACG -5’ képletü A linkerrel is belyettesíthejük, mely a végső konstrukcióban (24. ábra) a Lys-Arg aminosavakat kódolja. A szintetikus oligodezoxinukleotidok foszforilezését és párosításét a C linkerre leírt módon végezzük.
A linker hozzáadás céljából 5 pg Xbal restrikciós endonukleázzal hasított
PBR322/PHO5 Bam-Rsa637 DNS-t 2 egység Sí nukleázzal (Sigma) emésztünk (tompa végű DNS-t állítunk elő) 50 pl 30 inM nátriuin-acetát (pH 4,6) 200 mM nátrium-klorid és 1 mM cink-szulfát összetételű oldatban, 40 perces 37 °C-os inkubálássai (lásd 23. ábra). Fenol-kloroformos extrakció után a DNS-t eLanollal kicsapjuk, majd 0,25 mg/ml koncentrációban vízben oldjuk. 0,4 pg (120 pmól, foszforllezett, párosított A linkért, és 5 pg (1,5 pmól) Xbal/Si-gyel hasított pBR322/P/füő Bam-Rsu637 DNS-t kötünk össze tompa végű ligálással a C linkerre leírt módon, azzal a különbséggel, hogy 3,5 mM ATP-t használunk. A további konstrukciókat a fentiek szerint készítjük. Λ kapott kiónokat A betűvel azonosítjuk és p31/P//C)5 595A-TPA P31 /P1IO5 637Λ-ΤΡΑ, p31 /PHO5 811Λ-ΤΡΑ és p3J/OHO5 13Γ2Α-ΤΡΑ jelöléssel látjuk el.
-2957
1IU 201115 Β
16. Példa
A fenti gén-konstrukciók szubklónozása a nagy kópia-számú pJDB 207 élesztóvektorban és transzformálása S.Cercvisiae GRF18-ba 5
A 13-15. példákban leírt konstrukciók tartalmazzák a PH05 promotert a PHO5 gén kódoló szakaszával vagy anélkül, a TPA-t kódoló szakaszt a prepro-szakasszal vagy 10 anélkül, valamint a PH05 transzkripciós términációs jeleket egymás utáni sorrendben elrendezve, és az egészet egy pBR322-böl származó vektorba beépítve. Az egész tömböt tartalmazó Bamlll-Hindlll fragmentet a pJDB 15 6,4 kb méretű BamHI-HindlII fragmentjéhez ligáljuk, a 10. példában leírt reakcióval analóg módon. Kompetens E. coli HB101 sejteket transzformálunk, és mindegyik kísérletből néhány ampR telepet növesztünk fel külön- 20 -külön 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban. A plazmid DNS-t HindlII, BamHI és Pstl restrikciós endonukleázokkal hasítva analizáljuk.
A Ρ31/ΡΖΖΟ5-ΤΡΛ18, p31/PZZO5-TPA42, 25 p31R/SS-TPAa 2, P31R/SS-TPAa 3, p3í/PHO5 595C-TPA, p3í/PHO5 637C-TPA, p31/PHO5 811C-TPA, p31/PZZO5 1312C-TPA, p31/PZZO5 595B-TPA, p31/PHO5 637B-TPA, p31/PHO5
811B-TPA, P31/PHO5 1312B-TPA, p31/PHO530
595-TPA, p31//’ZZO5 637A-TPA, p31/PI105 811A-TPA- és p31/PHO5 1312A-TPA plazmidokból a következő, korrekt beépített
DNS-szakaszt tartalmazó kiónokat kapjuk:
p JD B 207 / P1IO5- T PA 18
PJDB207/PZZO5-TPA42 pJDB207R/RZZO5-SS-TPAa 2 pJDB207R/Z’ZZO5-SS-TPAÁ 3 pJDB207/PZZO5 595C-TPA pjDB207/PIIO5 637C-TPA
PJDB207/PHO5 811C-TPA pJDB2()7 / PI1O5 1312C-TPA
PJDB207/PI1O5 595B-TPA
PJDB207/PHO5 637B-TPA
PJDB207/P1IO5 811B-TPA
PJDB207/PZZO5 1312-TPA
PJDB207/PHO5 595A-TPA
PJDB207/PZZZJ5 637A-TPA
PJDB2O7/PHO5 811A-TPA
PJDB207 / PIIO5 1312A-TPA.
Ezeket a plazmidokat Saccharomyces cerevisiae GRF18 törzsbe transzformáljuk a ll. példában leírt módon.
Minden egyes élesztő-transzformációs kísérletből egy telepet izolálunk. A kapott kiónokat
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PZZO5-TPA18 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PZZO5-TPA42 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PZZO5-SS-TPAa 2 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PZZO5-SS-TPAa 3 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/Z7ZO5-595C-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/ZJZZO5-637-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PZZO5 811C-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/Z’ZZO5 1312C-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PZZO5 595B-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PZZÜ5 637B-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PZZO5 811B-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PZZO5 1312-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PZZO5 595A-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PZZO5 637A-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PZZO5 811A-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PZZO5 1312A-TPA jelöléssel látjuk el. 50
Az élesztősejteket a 11. és 12. példában leírt módon növesztjük, gyűjtjük össze és extraháljuk. A sejt-extraktumokban mérhető TPA-aktivitást a 12. példában leírt módon vizsgáljuk. Az eredményeket a 3. táblázatban 55 mutatjuk be.
3, táblázat
Különböző plazmidok kai transzformált és derepresszált körülmények között, (alacsony Pi) vizsgált Saccharomyces cerevisiae GRF18 élesztő törzs TPA-ak ti vitása
| Plazmid | TPA aktivitás egys/1 élesztőseit tenyészet/OD60o) |
| pJDB207/Z’ZZÖ.5-TPAJ8 | 750 |
| pJDB207/Z’ZZ(?5-TPA42 | 700 |
| pJI)B207R/P/ZG5-SS-TPAa 2 | 600 |
| pJL>B207R/PZZO5-SS-TPAa 3 | 650 |
| P.JDB207/Z7ZO5 595C-TPA | 900 |
-3059
HU 201115 Β
17. Példa
A PHO5 gén kicserélése a kromoszómán a TPA génnel (lásd 25. ábra)
A TPA fehérjét kódoló szakaszt a II élesztőkromoszómába építjük be a PH05 fehérjét kódoló szakasz helyébe. Kísérletileg ezt ko-transzformálással visszük véghez.
A Saccharomyces cerevisiae GRF18 törzset ko-transzformáljuk 25 pg p31//’//O5TPA18 plazmiddal, melyet BamHI- és Hindii! restrikciós endonukleázzal linearizálunk, valamint 3 pg Yepl3 élesztóplaziniddal (51.). A kapott 24 Leu’ telep közül egy PH05- és ugyanakkor körülbelül 35 egység/liter élesztősejt tenyészet/OÜGOo-at termel. Ezt a transzformánst 10 generáción keresztül leucin-tartalma táptalajon növesztve (YPD, 10 g/1 Bacto Yest Extract, 20 g/1 Bacto Peptone, 20 g/1 glükóz, 10-20%-ban Beír szegregánst kapunk, melyek valószínűleg elvesztették az Yepl3 plazmidot. A Beír szegregánsokból (52) izolált össz-élesztő DNS SouLhern analízisével DNS-szinten igazolni lehet, hogy a TPA fehérjét kódoló szakasz helyettesíti a PHO5 fehérjét kódoló szakaszt, változatlanul hagyva a II kromoszómán a kísérő DNS-szakaszokat, és a törzsek nem tartalmazzák az Yepl3 plazmid DNS-t. Egy törzset kiválasztunk és Saccharomyces cerevisiae GRF18 (pho5-TPA) jelöléssel látjuk el.
18. Példa
Tőrzsjavítás mutációval
A Saccharomyces cerevisiae
GRF18/pJDB207/PH05-TPA (1Λ, törzs TPA-termelő képességét továbbfejlesztjük mutációval és alacsony foszfatáz aktivitásra szelektálva.
A Saccharomyces cerevisiae
H243/pJDB207/P//O5-TPA (IA) törzs a
Saccharomyces cerevisiae
GRF18/pJDB207/PPÜ5-TPA (IA) törzs hőmérséklel-érzékeny mutánsa, melyet UV-besugérzással (0,08 pW cm'2, 15 másodperc, pusztulás 99,2%) állítunk elő. A telepeket 1,2 M szorbittal ozmotikusán stabilizált YPD táptalajon (10 g/1 Bacto Yeast Extract, 20 g/1 Bacto Peptone, 20 g/1 glükóz, 20 g/1 Bacto agar) növesztjük és szorbiol nélküli YPD táptalajra replikázzuk.
A Saccharomyces cerevisiae 11243-at egy lassan növő telep formájában izoláljuk.
Körülbelül 105 Saccharomyces cerevisiae H243/pJDB207/P//O5-TPA (IA) sejtet szélesztünk YNB agarra (6,8 1 Yeast Nitrogén Base aminosavak nélkül: 20 g/1 glükóz, 20 g/1, Bacto Agar, 20 mg/1 hisztidinnel kiegészítve) és közvetlenül besugározzuk UV fénnyel (0,08 pW cm2 12 másodperc). A pusztulás 98%-os. A túlélő sejtekből izolált telepeket alacsony Pi-tarLalmü táptalajra replikázzuk és 2 nap elteltével a savas foszfatáz aktivitás vizsgálata céljából a lágyagar-felülrétegezési vizsgálat (48, alapján megfestjük. Savas foszfatáz-negatív mutánsokat 3,2 x 10'4 mutációs frekvenciával kapunk. A legmagasabb TPA-titerü törzset kiválasztjuk és Saccharomyces cerevisiae II433/pJDB207/ /ΡΙΙΟ5-ΎΡΑ (IA) jelöléssel látjuk el.
A PJDB207/PWO5-TPA (IA) plazmiddal transzformált három különböző élesztótörzs TPA-aktivitását mutatjuk be a 4. táblázatban.
4. Táblázat
Különböző transzformált Saccharomyces cerevisiae törzsek TPA aktivitása derepresszált körülmények (alacsony Pi) között
TPA aktivitás (egység/1 élesztő sejt-tenyészet/OD60o)
GRF18/pJDB207/P//ü5-TPA( 1A) 625
H243/pJDB207/P/K?5-TPA( 1A) 1560
H423/pJDB207/P//O5-TPA(lA) 7200
19. Példa
TPA előállítása 30 literes térfogatban egy Saccharomyces cerevisiae rekombináns törzszsel
A Saccharomyces cerevisiae
GRF18/pJDH207/ZW5-TPA (IA) törzs olyan plazmidot tartalmaz, melyben a plazmidnak a gazdaszervezetben való szelektív fennmaradását lehetővé tevő leucin-marker, a humán TPA struktúr-génje, valamint a PHO5 savas foszfatáz promotere található. Az utóbbi teszi lehetővé a TPA gén kifejeződését korlátozott mennyiségű szervetlen foszfátot tartalmazó táptalajon (depresszált körülmények).
A törzset ferde-agar tenyészet formájában tartjuk fenn, a plazmid megmaradását biztosító leucin-mentes táptalajon. A frissen oltott ferdéket 24 órán át 30 °C-on inkubáljuk. Egy ferde-agar felületén kinőtt tenyészetet 3 ml előtenyésztó táptalajban szuszpendálunk, majd az első előtenyésztő rázott lombikba visszük. Az 500 ml-es lombikban egy torló található és 100 ml, következő öszszetételű I jelű táptalujt teszünk bele (az értékek g/l-ben értendők):
L-aszparagin, 2,0; L-hisztidin, 0,02; glükóz, 10; kálium-dihidrogén-foszfát, 1,0; magnézium-szulfát két kristályvízzel, 0,5; nátrium-klorid, 0,1; kalcium-klorid két kristályvízzel 0,1; vitatmin-oldat 5 nil/1 és riyomelemoldat, 5 ml/1.
-3161
HU 201115 Β
A táptalaj pH-ját sterilezés előtt nátrium-hidroxiddal 7,2-re állítjuk. A glükózt, vitaminokat és nyomelemeket külön sterilezzük, majd a táptalajhoz adjuk. A vitamin- és nyomelem-törzsoldatok összetétele a következő (g/l-ben): Vitaminok-biotin, 0,0002; kalcium D-pantotenát, 0,04; fólsav, 0,0002; nikotinsav, 0,04; p-amino-benzoesav, 0,02; piridoxin-hidroklorid 0,04; és inozit, 0,21 liter ionmentes vízben, nyomelemek- bórsav, 0,05; rézszulfát öt kristályvízzel, 0,004; kálium-jodid, 0,01; vas(III)-klorid hat kristályvízzel, 0,02; mangán!II)-szulfát négy kristályvízzel, 0,04; nátrium-molibdenát két kristályvízzel, 0,02 és cink-szulfát hét kristályvízzel, 0,04, egy liter ionmentes vízben. A táptalajt ionmentes viz felhasználáséval készítjük.
Az első elö-tenyészetet 24 órán át 30 °C-on inkubáljuk 5 cm kitérésű körkörös rázógépen, 250/perc fordulatszámmal.
Az első előtenyészetet használjuk a második előtenyésztő lombikok oltáséra. Ezeket a lombikokat 1 térfogatszázaléknyi oltóanyaggal oltjuk. A lombikok 100 ml II jelű, következő összetételű elótenyésztó táptalajt tartalmaznak (g/l-ben: Élesztőkivonat, (Difco),10,0; b-aszparagin, 6,6; kálium-dihidrogén-foszfát, 1,0; magnézium-szulfát hét kristályvízzel 1,0; L-hisztidin, 0,02; és D-glukóz (monohidrát), 33,0;
Az ionmentes vízzel készült táptalaj pll-ja körülbelül 6,0; A glükózt külön sterilezzük. Az inkubálás körülményei ugyanazok mint az első elótenyésztésnél. Három ilyen lombikból származó tenyészlevet egyesítünk, és ezt használjuk a fő, termelő fermentor 1 térfogatszázalékos oltóanyagaként.
A termelő fermentor össztórfogata körülbelül 45 1, 4 torlólemezt tartalmaz, valamint egy 115 mm átmérőjű, hat lapátos lemez turbinakeverőt. A keverő fordulatszáma 600/perc, a túlnyomás 0,03 MPa és a levegőztetés 0,5 v/v/perc. A fermentor 30 litert tartalmaz a következő összetételű táptalajból (g/l-ben). L-aszparagin 2,0; L-hisztidin 0,02; kálium-dihidrogén-foszfát 0,03, magnézium-szulfát hét kristályvízzel 0,5; kalcium-klorid két kristályvízzel 0,1; kálium-klorid 1,0; glükóz (monohidrát) 20,0; vitamin-oldat 5 ml/1 és nyomelem-oldat 5 ml/1. A táptalaj pH-jét sterilezés előtt 7,2-re állítjuk nétrium-hidroxiddal. A glükózt, vitaminokat és nyomelemeket külön sterilezzük és adjuk a táptalajhoz. A vitamin- és nyomelem-törzsoldat összetétele ugyanaz, mint az I jelű előtenyésztő táptalajnál használté.
A fermenciós folyamatot 30 °C-on vezetjük. A pH-érték 5,0-re esik és ezen az értéken tartjuk nátrium-hidroxiddal. Körülbelül 20 órás fermentálás után érjük el a maximális TPA-termelést. Az optikai sűrűség, mely körülbelül 2-3 egységet ér el, valamint a savas foszfatáz aktivitás jól jellemzi a fermentációs folyamat előrehaladását. Az élesztősejtek öszszegyűjtése előtt 10 °C-ra hűtjük a fermentlevet.
20. Példa
A TPA és pro-TPA kinyerése és tisztítása monoklonális anti-TPA antitest-kromatográfiával
a) Sejt-extrakció
A 30 liter pH 4-es fermentlevet (lásd 19. példa) 10 °C-ra hütjük és egy Alfa-baval BRPX-207 iszapmentesító centrifugával lecentrifugáljuk. Az elválasztott sejteket 2 liter A jelű feltáró pufferben szuszpendáljuk (20 mM nátrium-di-hidi'ogén-foszfét, 80 mM dikálium-hidrogén-foszfát 150 mM nátrium-klorid, 0,01% Tween 10 mM benzamidin és 10 mM EDTA). Az oldatot 5 °C-ra hűtjük majd 10 1/óra sebességgel KDL-Pilot típusú DynoR malmon bocsátjuk keresztül. A malomban 500 ml 0,5-0,75 mm átmérőjű üveggyöngy van és 3000/perc fordulatszémmal működik. Felhasználás előtt az üveggyöngyöket 300 ml olyan A feltáró pufferrel mossuk, melyben 30 mg BSA van. A feltárt sejtszuszpenziót lecentrifugáljuk (653-as Sorvall rotor, 40 perc, 9000/plerc fordulatszám), és az üledéket kidobjuk.
b) A DNS emésztése és ammónium-szulfátos frakcionálás mg DN-ézt adunk 2 liter felüluezóhoz és az elegyet 30 percig 4 °C-on tartjuk. Ezt kővetően az oldatot ammóniura-szulfátra nézve 35%-osan telítetté tesszük, majd egy órán 4 °C-on kevertetjük. Az oldatot lecentrifugéljuk a fentiek szerint, majd a teljes TPAaktivitást tartalmazó üledéket 1 liter 1%-os Tween-L és 0,1% SDS-t tartalmazó A pufferban szuszpendáljuk. A szuszpenziót legalább egy órán át 4 °C-on kevertetjük.
c) Immun-affinitás kromatográfia
I. Anti-TPA antitest tisztítása ml nyúl anti-TPA antiszérumot (Dr. E.Reich szívességéből, Friedric-Miescher-Institut, Basel) lizin-szefaróz oszlopon bocsátunk keresztül, hogy a plazminogént eltávolitsuk a szérumból.
Az oszlopot 1-2 térfogat pH 7,4-es PBS-sel mossuk, melynek összetétele: 100 mM nátrium-klorid, 2,7 mM kálium-klorid, 8,1 mM dÍnátrium-hidrogón-foszfát, és 1,5 mM kállum-dihidrogén-foszfát. Az átfolyó oldatot és a mosófolyadékot összegyűjtjük. A plazminogén-mentesitett anti-szérumot 50 v% végkoncentrációban hozzáadott ammónium-szulfáttal kicsapjuk. Az oldatot éjszakán át 4 °C-on tartjuk, majd lecentrifugáljuk (Sorvall GSA rotor 12000/perc, 20 perc). A csapadékot kislérfogatú PBS-ben, oldjuk, majd 0,1% nátrium-azidot tartalmazó PBS-sel szemben dializáljuk. Ebből a dialízált oldatból az IgG-t protein A szefaróz oszlopon tisztítjuk (55).
-3263
HU 201115 Β
II. Anti-TPA antitestoszlop készítése mg tisztított anti-TPA-t 0,1 M (pH 7,0) MOPS-pufferrel szemben dializálunk. Az antitestet 5 ml aktivált Affigel 10-hez (Biorad) kapcsolunk, az előállító előírása szerint. A gél-mátrixot 1% Tween 80-at 0,1% SDS-t, 0,2 M nátrium-kloridot, 10 mM benzamidint és 0,1% nátrium-azidot tartalmazó PBS-sel hozzuk egyensúlyba. A mátrixot 5 ml-es oszlopba töltjük.
III. A TPA tisztítása immun-affinitás kromatográfiá val
Az ammónium-szulfátos frakcionálás után kapott, beoldott üledéket a lebegő szemcsés anyagok eltávolítására lecentrifugáljuk (Sorvall GSA rotor, 12000/perc, 30 perc), majd ezt követően az affinitás-kromatográfiás oszlopra visszük, körülbelül 10 ml/óra táplálási sebességgel, 4 “C-on. Miután a teljes térfogatot átbocsátottuk, az oszlopot mossuk 10 térfogat 0,05% Tween 80-at tartalmazó PBS-oldattal. Az oszlopot 0,1% Tween tartalmazó 0,1 M glicin-HCl (PH 2,5) oldattal eluáljuk. 2 ml-es frakciókat szedünk és a TPA-aktivitást Ranby (49, módszerével mérjük. D-Val-Leu-Lys-pNA-t (Rabi S-2251) használunk szubsztrátként. A legnagyobb aktivitású frakciókat egyesijük, 1 M Tris-szel semlegesítjük és Amicon YM 10 membránt alkalmazva ultraszüréssel töményítjük. Az Így nyert TPA körülbelül 90% tisztaságú, és főleg az egyláncú formában (pro-TPA) fordul elő, a redukáló körülmények között SDS-PAGE eredményei alapján. Nem-redukáló körülmények között végzett SDS-PAGE alapján látszólagos molekulasúlya körülbelül 60 000 (lásd A ábra,.
A és B ábra: az élesztő TPA-géntermékének SDS-poliakrilamid gélelektroforézise (A ábra) és ennek aktivitása aktivitás-gélen (kazein-lemezek) (B ábra).
21. Példa
A TPA és pro-TPA kinyerése és tisztítása DE-3 affinitáskromatográfiá val
a) DE-3 Sepharose? oszlop készítése mg, Erythrina latissima-ból (16) kinyert, tisztított DE-3 inhibitort 5 ml, brómciánnal aktivált Sepharose 4bíeUhez (Pharmacia) kapcsolunk, az előállító előírásai szerint. A mátrixot pH 7,4-es, 0,4 M nátrium-kloridot, 0,1% Triton X-100R-t és 0,02% nátrium-azidot tartalmazó, foszfáttal pufferolt sóoldattal (.PBS) hozzuk egyensúlyba. A mátrixot ezután egy 5 ml-es oszlopba töltjük.
bf A TPA és pro-TPA kromatográfiás tisztítása DE-3 Sepharose 4t& oszlopon
A sejtkivonat (20a példa) nátrium-klorid koncentrációját 0,4 M-ra, a Triton X-10C® koncentrációját 0,1%-ra állítjuk, majd 0,45 nm pórusméretű Millipore membránon szűrjük ét. Az oldatot ezután 45 ml/óra táplálási sebességgel, szobahőmérsékleten a DE-3 Sepharose® oszlopra visszük: (lásd fent) majd az átfolyó oldatot kidobjuk. Miután az összes sejtkivonatot átbocsájtottuk az oszlopon, az oszlopot körülbelül 50 ml, 0,4 M nátrium-kloridot és 0,1% Triton X-100®-t tartalmazó PBS-sel mossuk, és 4 “C-on 2 ml-es frakciókat szedünk. Mindegyik frakció fehérjetartalmát a 280 nm-es UV-elnyelés alapján határozzuk meg. Az adszorbeált fehérje éles csúcs formájában eluálódik. A legmagasabb UV elnyelést és legmagassabb fibrinolitikus aktivitást /125I-fibrin-assay alapján (47) mutató frakciókat egyesítjük 8 ml térfogatban és -20 “C-on tároljuk. Ez az oszlopra vitt összes aktivitásnak körülbelül 70-80%-át jelenti. Az alacsonyabb aktivitású frakciókat külön gyűjtjük. A két külön gyűjtött frakció általában 90-100%-át tartalmazza az aktivitásnak.
c) A pro-TPA kromatográfiás tisztítása DE-3 Sepharose 4k?-n, proteinaz inhibitor jelenlétében
Az élesztősejt-kivonat kromatográfiáját a 21b példában leírthoz hasonló módon végezzük, azzal a különbséggel, hogy az eljárás során 0,1 KlU/ml koncentrációban bázikus pankreatikus tripszin-inhibitort (BPTI) használunk, A Cbz-Gly-Glu-Arg-AMC-t szubsztrátként alkalmazó fluorimetriás vizsgálattal (37, meghatározzuk a tisztított oldat TPA és pro-TPA tartalmát. A TPA 90%-a pro -enzim formájában van jelen, 10%-a van aktiv formában. Tehát a pro-TPA-nak TPA-vá alakulását a tisztitási eljárás során a BPTI gátolja.
22. Példa
A pro-TPA elválasztása a TPA-tói
A 21c. példa szerint előállított TPA és pro-TPA oldat pH-ját 8,0-ra állítjuk 0,1% Triton X-10(@-t tartalmazó 0,1 M TRIS-HCl-lel, majd 1 mM végkoncentrációban di-izopropil-fluorofoszfátot adunk hozzá. 4 órán át inkubáljuk 37 °C-on, majd az elegyet 5 ml térfogatú DE-3 Sepharose8 oszlopon (lásd 21a példa) bocsátjuk át. Az irreverzibilisen gátolt TPA-t tartalmazó átfolyó oldatot eldobjuk. Az oszlopot 6 térfogat, 0,4 M nátrium-kloridot és 0,1% Triton X-lOd0-et tartalmazó PBS-sel mossuk, majd 1,6 M kálium-rodani34
-3365
HU 201115 Η dót, 0,4 M nátrium-kloridot és 0,1% Triton X-10Ö9-et tartalmazó PBS-sel a 21b példa szerint eluáljuk. A legnagyobb UV-elnyelóst mutató frakciókat egyesítjük. Az így kapott oldat lényegében a tiszta pro-TPA-t tartalmazza, mivel a fluorimetikus vizsgálattal nem mutatható ki amidolitikus aktivitás a Cbz-GLy-GLy-Arg-AMc (37) szubsztráton. Az amidolitikus valamint fibrinolitikus aktivitást helyreállíthatjuk plazminos kezeléssel, mely a pro-TPA-t aktív-enzimmé alakítja.
23. Példa
Az élesztő TPA-géntermék tulajdonságai
a) Enzimatikus tulajdonságok
A 19. példa szerint előállított és a 21.b példa szerint DE-3 affinitás-kromatográfiával tisztított élesztő TPA-géntermék enzimatikusan aktiv, melyet fibrin jelenlétében vagy anélkül az imogén plazminogén hasításával lehet kimutatni. Az enzimatikus aktivitást ki lehet mutatni a Ranby (49) és Verheinen et alt (69) által leirt kolorimetriás vizsgálattal (lásd 12. példa) kazein lemezeken valamint fibrin lemezeken (56), valamint a 125I-firbinogén szilárd fázisú vizsgálattal (47). A kazein-lemezeken mutatott enzimatikus aktivitás a B ábrán látható (lásd 20cIU példa).
A kapott TPA enzimatikus aktivitását nagymértékben fokozni lehet fibrinnel. A DE-3 affinitás-kromatográfiával részlegesen tisztított TPA-t parabolikus sebesség assayban vizsgáljuk, (lásd Ranby (49). A δΕ reakció-sebességet a At2 függvényében ábrázolva 3 és 5 perc között az enzimaktivitás mértékeként a fibrin optimális koncentrációja mellett (kb. 100 pg/ml) a stimulálás 10-20-szoros. A hatás megfigyelhető brómciános emésztés (57) után kapott fibrin-fragmentekkel, vagy bathroxobin-sal kezelt fibrínogénnel (58). Az urokinázt hasonló körülmények között vizsgálva, nem jelentkezik aktivitás-növekedés fibrin-fragmentekkel.
b) A TPA kötődés fibrin-lemezkékhez
A Tijken és munkatársai által leirt (2) fibrin-kötési tesztet alkalmazva a kapott, DE-3 affinitáskromatográfiával tisztított TPA-ról azt találták, hogy nagymértékben kötődik a fibrin-rögökhöz. Tehát egy lényeges különbség a kapott élesztő TPA-géntermék és az urokináz között, hogy az előző abszorbeálódik a fibrinhez és ennek eredménye a plazminogén aktiválásának jelentős megnövekedése (59).
24. Példa
Az élesztő TPA-gén termék glikozilezettségi állapota
Hogy lássuk, vajon az élesztő által előállított TPA glikozilezve van-e vagy sem, konkanavalin-A SepharosdS) oszlopon (2, való viselkedését vizsgáljuk.
A DE-3 Sepharose11 oszlopon affinitáskromatográfiával részlegesen tisztított TPA frakciót (lásd 21b példa) használjuk. Ennek a frakciónak az aktivitása 11,5 FU/ml, mely megfelel 2,1 pg/ml TPA fehérjének.
Az aktív frakciót (3 ml) visszük konkanavalin-A Sepharose1* oszlopra (ágytérfogat 0,5 ml) és 1 M nátrium-kloridot valamint 0,01 tf% Tween 8C^)-a tartalmazó 0,1 M Tris—HCl—lel (pH7,5) hozzuk egyensúlyba.
Az átfolyóban levó fehérjéket csak egy frakcióba gyűjtjük (* 3 ml). Miután az oszlopot 6 ml egyensúlyi pufferrel mostuk, a mátrixhoz kötött fehérjék eluálását négy lépésben hajtjuk végre, alfa-metil-mannozidot és kálium-rodanidet adva az egyesúlyi pufferhez. A négy lépést egymás után hajtjuk végre, a következő oldatok mindegyikéből 0,5 ml-rel.
1. 50 mM alfa-metil-mannozid + 0,25 M kálium-rodanid egyensúlyi pufferben
2. 100 mM alfa-metil-mannozid + 0,25 M kálium-rodanid egyensúlyi pufferben
3. 200 mM alfu-metil-mannozid + 1,0 M kálium-rodanid egyensúlyi pufferben
4. 300 mM alfa-metil-mannozid + 2,0 M kálium-rodanid egyensúlyi pufferben
Jelentős TPA aktivitást kapunk a 2. és 3. lépésben, de nem kapunk aktivitást alacsony cukor- és só-koncentrációnál (1. lépés).
Valamennyi TPA-aktivitás található az átfolyó frakcióban is (lásd fent).
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a TPA glikozilezve van élesztőben. Azonban található aktivitás az átfolyó frakcióban is, mely azt mutatja, hogy nem az összes élesztőben szintetizált TPA van glikozilezve, melynek valószínű oka az alacsony Pi tartalmú táptalajon való túltermelési helyzet.
-3467
HU 201115 Β
25. Példa
Gyógyászati készítmény parenterális adagolás céljára
A 20-22. példákban leírtak szerint előállított, TPA-t és/vagy pro-TPA-t tartalmazó oldatot 0,01% Tween 8ÖÖ-at tartalmazó 0,3 M nátrium-kloriddal szemben dializáljuk, majd 80 °C-on tároljuk. Beadás előtt az össz-TPA koncentrációt (azaz TPA vagy pro-TPA vagy TPA plusz pro-TPA) 75 pg/ml-re állítjuk a nátrium-klorid koncentrációját pedig 0,3 M-ra. Az odatot 0,22 μηι-es membránon átszűrve sterilezzük.
Ez az eljárás alkalmas TPA, pro-TPA vagy TPA plusz pro-TPA oldatok készítésére parenterális, például intravénás adagolás céljából.
Irodalomjegyzék
1. S. Thorsen et al., Thromb. Diath. ilaemorrh. 28, 65(1972)
2. D.C. Rijken and D. Collen, J. Bioi. Chem.
256, 7035 (1981)
3. D.C Rijken et al., J. Bioi. Chem. 257,
2920 (1982)
4. P. Wallén et al., Progr. Fibrin. 5, 16 (1982)
5. E.L. Wilson et al., Cancer Rés. 40, 933 (1980)
6. E.L. Wilson et al., Blood 61, 568 (1983)
7. D. Pennica et al., Natúré 301, 214 (1983)
8. T. Edlund et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 80, 349 (1983)
9. Perlman et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 79, 781 (1982)
10. A.M. Maxam et ah, in .Methodis in Enzymology', vol. 65, p. 499, New York 1980
11. J. Lodder, .The Yeasts, Amsterdam
1971
12. A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 75, 1929 (1978,
13. A. Hinnen et al., Curr. Top. Microbiol.
Immun. 96, 101 (1982,
14. A. Jimenez et al,, Natúré 287, 869 (1980)
15. European Patent Application No. 23860
16. F.J. Joubert et al., Hoppe-Seyler’s Zeitschr. Physiol. Chem. 302, 531 (1981)
17. M.V. Olson et al., J. Mól. Bioi. 132, 387 (1979)
18. H. Meyer, FEBS Lett. 90, 341 (1978)
19. B. Hohn et al. in „Genetic Engineering, vol. 2, p. 169, New York 1980
20. B.Hohn in .Methods in Enzymology, vol.
68, p. 299, New York 1979
21. A. Hinnen et al. in .Eukaryotic Gene
Regulation, vol. 14, p. 43, New York
1979
22. J.D. Beggs in .Genetic Engineering, vol, 2, p. 175, New York 1981
23. J. Messing, In the 3rd Cleveland Syniposium on Macromolecules: Recombinant
DNA (ed. A. Walton), Elsevier, Amsterdam 1981, p. 143
24. M. Mandel et al., J. Mól. Bioi. 53, 159 (1970)
25. A.J. Berk et al., Cell 12, 721 (1977)
26. D.S. Holmes et al., Anal. Biochem. 144, 193 (1981)
27. P.M. Lizardi et al., Anal. Biochem. 96, 116 (1979)
28. Y. Nagamine et al., Cell 32, 1181 (1983)
29. J.B. Gurdon et al., J. Embryol. Exp. Morphol. 36, 523 (1976,
30. M.W. McDonnel et ab, J. Mól. Bioi. 110, 119 (1977)
31. G. Deng et al., Nucl. Acids Rés. 9, 4173 (1981)
32. L. Villa-Komaroff et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 75, 3727 (1978,
33. D.A. Morrison in .Methods in Enzymology-, vol. 68, 326 (1979)
34. T. Edlund et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 349 (1983,
35. H. Ito et al., Nucl. Acids Rés. 10, 1755 (1982)
36. H.C. Bimbóim et al., Nucl. Acids Rés. 7, 1513 (1979)
37. M. Zimmerman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 750 (1978)
38. J. Messing in ,M13 cloning/Dideoxy Sequencing (EMBO-course manual), 1981
39. in manual .M13 cloning and DNA sequencing system, New England Biolabs
40. K. Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 97, 7327 (1975)
41. J.F.M. de Rooij et al., Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 98, 537 (1979)
42. Molecular cloning. A laboratory Manual (eds. T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook), Cold Spring Harbor Láb. 1982, p. 177
43. C.F. Hong, Bioscience Reports 1, 243 (1981)
44. A. Toh-e et al., J. Uacteriol. 113, 727 (1973)
45. S.V. Suggs et al., in .Developmental biology using purified genes, ICN-UCLA symposium on molecular and cellular biology, vol. 23 (ed. D.D. Brown and D.F. Fox), p. 683 (1981)
46. M Smith, in .Methods of RNA and DNA sequencing' (ed. S.M. Weissmann), Praeger Scientific, New York 1983
47. E.L. Wilson et al., Int. J. Cancer 22, 390 (1978)
48. B. Meyhack et al., EMBO Journal 1, 675 (1982)
49. M. Ranby, Biochim. Biophys. Acta 704, 461 (1982)
50. Hicks et al., Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology, Vol. XLIII, p. 1305 (1979,
51. Broach et al., Gene 8, 121 (1979,
52. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76’, 1035 (1979)
-3569
HU 201115 Β
53. F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 74, 5463 (1977)
54. J. Kurjan et al., Cell 30, 933 (1982)
55. P.L. Ey et al., Immunochem. 15, 429 (1978) 5
56. J. Jespersen et al., Haemostasis 18, 301 (1983)
57. C. Zamarron et al., J. Bioi. Chem. 259, 2080 (1984)
58. J. Chmielewska et al., Thrombosis Rese- 10 arch 31, 427 (1983)
59. P. Wallén, Progr. Chem. Eibrinolysis Thrombolysis, 3, 167 (1978,
60. J.H. Verheijen et ah, Thromb. Haemost.
48, 266 (1982) 15
A kísérő rajzok ábráin a használt szimbólumok jelentése a következő:
pBR 322 szakasz a PIIO3, PHO5 régióból származó 'élesztő kromoszómáiig DNS ////////' élesztő 2 μ-os plazmid DNS ;A LEU 2 régióból származó 'élesztő kromoszómáiig DNS ampR ampicillin rezisztencia gén tetR tetraciklin rezisztencia gén p promoter régió t transzkripció terminációs régió egy restrikciós hely deléciója
ITPA gén
y.. deléció pBR 322-ben restrikciós hely transzkripció iránya linker DNS
Claims (21)
1. Eljárás olyan TPA, vagy pro-TPA vagy ezek keverékei előállítására, ahol a TPA és/vagy pro-TPA glikozilezett vagy glikozilezetlen formában, illetve a kettő keverékének formájában van jelen, transzformált élesztőtörzs tenyésztésével és az említett fehérjék izolálásával és tisztításával, és kívánt esetben a kapott TPA/pro-TPA keverék kompotenseire való szétválasztásával, és pro-TPA-tól mentes TPA előállítására az előállított pro-TPA TPA-vá alakításával, és adott esetben a kapott keverékből a glikozilezetlen termék elválasztásával a glikozilezettől, és glikozilezett fehérjétől mentes glikozilezetlen fehérje előállítására a glikozil maradékok eltávolításával a kapott fehérjéktől, azzal jellemezve, hogy élesztőpromotert és az ezzel a promoterrel szabályozott, TPA-t kódoló szakaszt tartalmazó hibrid-vektorral transzformáit élesztőtörzset, vagy egy élesztőkromoszómába stabilan beépült és egy kromoszomális élesztópromoter által szabályozott szöveti plazminogén aktivátor gént tartalmazó élesztőtörzset, vagy ilyen törzs mutánsát alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1984. 09. 13.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy élesztőpromotert és az ezzel a promoterrel szabályozott, TPA-t kódoló szakaszt tartalmazó hibrid-vektorral transzformáit élesztőtörzset alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1983. 11. 21.)
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy HeLa-sejtból származó TPA-kódoló szakaszt tartalmazó hibrid-vektorral transzformált élesztőtörzset alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1983. 11. 21.)
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kívülről szabályozható élesztőpromotert tartalmazó hibrid vektorral transzformált élesztőtörzset alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1983. 11. 21.)
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy élesztő PHO5 promotert tartalmazó hibrid vektorral transzformált élesztőtörzset alkalmazunk, (Elsőbbsége:
1983. 11. 21.)
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az érett TPA kódoló szakaszához egy, a kapcsolódási helyhez beékelt ATG transzlációs start-jelen keresztül közvetlenül kapcsolt élesztőpromotert tartalmazó hibrid-vektorral transzformált élesztőtörzset alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1983. 11. 21.)
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy, a TPA-t kódoló szakasz elölt egy jelzőszekvenciát tartalmazó hibrid-veklorral transzformált élesztőtörzset alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1983. 11. 21.)
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy, a TPA-t kódoló szakasz előtt PII05 jelzőszekvenciát tartalmazó hibrid-vektorral transzformált élesztőtörzset alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1983. 11. 21.)
-3671
HU 201115 Β
9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy, a TPA-t kódoló szakasz előtt TPA prepro-szekvenciát tartalmazó hibrid-vektorral transzformált élesztőtőrzset alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1983. 11. 21.) 5
10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a promoter által a természetben szabályozott gén kódoló szakaszába benyúló endopeptidáz hasítási helyeket tartalmazó szintetikus kapcsolóval kapcsolódó 10 élesztópromotert tartalmazó hibrid-vektorral transzformált élesztőtőrzset alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1984. 09. 13.)
11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy PHO5-génből származó 15 élesztópromotert és megnyújtott jelzőszekvenciát tartalmazó hibrid vektorral transzformáit élesztőtőrzset alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1984. 09. 13.)
12. Az 1. igénypont szeinti eljárás, azzal 20 jellemezve, hogy a kódoló DNS után egy élesztógénből származó transzkripciós terminációs jelet tartalmazó hibrid vektorral transzformált élesztőtörzset alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1983. 11. 21.) 25
13. Az 1, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzformált Saccharomyces cerevisiae élesztőtőrzset alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1983. 11. 21.)
14. Az 1. igénypont szerinti eljárás, az- 30 zal jellemeve, hogy az élesztőtőrzset asszimilálható szén- és nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó folyékony tápközegben tenyésztjük. (Elsőbbsége: 1983. 11. 21.)
15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, az- 35 zal jellemezve, hogy a TPA-t, pro-TPA-t és ezek keverékét a Lenyészléből Sepharose oszlopra kötött DE-3-mal végzett szelektív adszorpcióval izoláljuk. (Elsőbbsége:
1983. 11. 21.) 40
16. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a TPA-t, pro-TPA-t és ezek keverékét a tenyészléből, monoklonális antitestek alkalmazásával végzett affinitáskromatográfiával izoláljuk. (Elsőbbsége: 45 1983. 11. 21.)
17. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapott pro-TPA-t enzimesen alakítjuk TPA-vá. (Elsőbbsége:
1983. 11. 21.) 50
18. Az 1. igénypont szerinti eljárás TPA-mentes pro-TPA előállítására, azzal jellemezve, hogy a tisztítási eljárás során proteáz-inhibitort is alkalmazunk, ós a Sepharose oszlopra kötött DE-3-mal végzett kromatográ- 55 fiat a TPA-t szelektíven megkötő inhibitor jelenlétében hajtjuk végre. (Elsőbbsége:
1983. 11. 21.)
19. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapott glikozilezett és glikozilezetlen termékeket konkanavalin-A Sepharose oszlopon végzett kromatográfiával választjuk szét. (Elsőbbsége: 1984. 09. 13.)
20. Az 1. igénypont szerinti eljárás TPA, pro-TPA és keverékeik előállítására, azzal jellemezve, hogy specifikusan glikozilező élesztőtörzset alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1983. 11.
21.)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB838331045A GB8331045D0 (en) | 1983-11-21 | 1983-11-21 | Synthesis of fibrinolytic agents by yeast |
| GB848423112A GB8423112D0 (en) | 1983-11-21 | 1984-09-13 | Synthesis of fibrino lytic agents by yeast |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT36185A HUT36185A (en) | 1985-08-28 |
| HU201115B true HU201115B (en) | 1990-09-28 |
Family
ID=26287024
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU844309A HU201115B (en) | 1983-11-21 | 1984-11-20 | Process for producing fibrinolitic materials with yeast |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0143081B1 (hu) |
| JP (1) | JPS6119489A (hu) |
| KR (1) | KR930002889B1 (hu) |
| AU (1) | AU595478B2 (hu) |
| DD (1) | DD229151A5 (hu) |
| DE (1) | DE3479520D1 (hu) |
| DK (1) | DK164941C (hu) |
| ES (1) | ES8609471A1 (hu) |
| FI (1) | FI86746C (hu) |
| GR (1) | GR80966B (hu) |
| HU (1) | HU201115B (hu) |
| IE (1) | IE57699B1 (hu) |
| IL (1) | IL73568A (hu) |
| NO (1) | NO844618L (hu) |
| NZ (1) | NZ210266A (hu) |
| PH (1) | PH22337A (hu) |
| PT (1) | PT79518B (hu) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR78180B (hu) * | 1982-04-15 | 1984-09-26 | Genentech Inc | |
| US7138505B1 (en) | 1984-01-12 | 2006-11-21 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Factor VIII:C nucleic acid molecules |
| JPS61502655A (ja) * | 1984-07-09 | 1986-11-20 | インテグレ−テッド・ジェネティックス・インコ−ポレ−テッド | 酵母クロ−ニングビヒクル |
| NZ213647A (en) * | 1984-10-01 | 1989-05-29 | Integrated Genetics Inc | Recombinant human tissue plasminogen activator (tpa) modified in n-linked glycosylation pattern |
| JPS624233A (ja) * | 1985-07-01 | 1987-01-10 | Toyobo Co Ltd | 組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製造法 |
| JPS6229975A (ja) * | 1985-08-01 | 1987-02-07 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 粗ｔＰＡの精製法 |
| GB8521496D0 (en) * | 1985-08-29 | 1985-10-02 | Ciba Geigy Ag | Repressible yeast promoters |
| EP0216573B1 (en) * | 1985-09-18 | 1990-11-22 | Green Cross Corporation | Yeast promoter and method of producing heterologous proteins |
| USH2055H1 (en) * | 1985-09-20 | 2002-12-03 | Zymogenetics, Inc. | Expression of tissue-type plasminogen activator in bacteria |
| GB8530631D0 (en) | 1985-12-12 | 1986-01-22 | Ciba Geigy Ag | Thrombin inhibitors |
| MY101203A (en) * | 1985-12-12 | 1991-08-17 | Ucp Gen Pharma Ag | Production of thrombin iinhibitors. |
| US5106741A (en) * | 1985-12-20 | 1992-04-21 | The Upjohn Company | Tissue plasminogen activator (TPA) analogs |
| US4898825A (en) * | 1986-05-07 | 1990-02-06 | Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporated | Methods for purification of single-chain and double-chain tissue plasminogen activator |
| ZA872534B (en) * | 1986-05-08 | 1987-11-25 | Phillips Petroleum Co | Yeast production of streptokinase |
| PT84991B (pt) * | 1986-06-06 | 1990-03-08 | Genentech Inc | Processo para a producao de actividador do plasminogenio biologicamente activo |
| JPS6463378A (en) * | 1986-08-11 | 1989-03-09 | Mitsui Toatsu Chemicals | Separation of single stranded tpa and double standard tpa |
| GB8621118D0 (en) * | 1986-09-01 | 1986-10-08 | Whitbread & Co Plc | Stabilised polypeptides |
| DE3789413T2 (de) | 1986-10-03 | 1994-07-28 | Ciba Geigy Ag | Lymphokin-ähnliche Peptide. |
| PT86162B (pt) * | 1986-11-21 | 1990-11-20 | Smithkline Beecham Corp | Expressao de proteina recombinante |
| ZA879286B (en) | 1986-12-16 | 1988-10-26 | Smith Kline Rit | New plasminogen activators |
| US5149533A (en) * | 1987-06-04 | 1992-09-22 | Zymogenetics, Inc. | Modified t-PA with kringle-/replaced by another kringle |
| US5089409A (en) * | 1989-09-28 | 1992-02-18 | Monsanto Company | Method of increasing specific activity of t-pa |
| US5326700A (en) * | 1990-11-06 | 1994-07-05 | Eli Lilly And Company | DNA sequences encoding t-PA derivatives with cleavable sites |
| NZ271088A (en) * | 1993-08-04 | 1996-10-28 | Ciba Geigy Ag | Desulphatohirudin muteins, their production, conjugates thereof and pharmaceutical compositions |
| ATE207538T1 (de) | 1995-02-09 | 2001-11-15 | Behringwerke Ag | Verfahren zur produktion von proteinen |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4775622A (en) * | 1982-03-08 | 1988-10-04 | Genentech, Inc. | Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast |
| GR79202B (hu) * | 1982-05-05 | 1984-10-22 | Genentech Inc | |
| GB2125047B (en) * | 1982-08-09 | 1986-02-19 | Ciba Geigy Ag | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides |
| EP0174835A1 (en) * | 1984-09-11 | 1986-03-19 | The Upjohn Company | Human tissue plasminogen activator and recombinant DNA compounds |
| NZ213647A (en) * | 1984-10-01 | 1989-05-29 | Integrated Genetics Inc | Recombinant human tissue plasminogen activator (tpa) modified in n-linked glycosylation pattern |
-
1984
- 1984-11-19 DE DE8484810564T patent/DE3479520D1/de not_active Expired
- 1984-11-19 PT PT79518A patent/PT79518B/pt not_active IP Right Cessation
- 1984-11-19 GR GR80966A patent/GR80966B/el unknown
- 1984-11-19 EP EP84810564A patent/EP0143081B1/en not_active Expired
- 1984-11-19 FI FI844544A patent/FI86746C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-11-19 PH PH31460A patent/PH22337A/en unknown
- 1984-11-19 DD DD84269628A patent/DD229151A5/de not_active IP Right Cessation
- 1984-11-20 NO NO844618A patent/NO844618L/no unknown
- 1984-11-20 IE IE2965/84A patent/IE57699B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-11-20 IL IL73568A patent/IL73568A/xx unknown
- 1984-11-20 NZ NZ210266A patent/NZ210266A/xx unknown
- 1984-11-20 HU HU844309A patent/HU201115B/hu not_active IP Right Cessation
- 1984-11-20 AU AU35719/84A patent/AU595478B2/en not_active Ceased
- 1984-11-20 DK DK551084A patent/DK164941C/da not_active IP Right Cessation
- 1984-11-20 JP JP59243529A patent/JPS6119489A/ja active Pending
- 1984-11-21 ES ES537828A patent/ES8609471A1/es not_active Expired
- 1984-11-21 KR KR1019840007284A patent/KR930002889B1/ko active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0143081A2 (en) | 1985-05-29 |
| DK551084D0 (da) | 1984-11-20 |
| NZ210266A (en) | 1988-11-29 |
| FI86746C (fi) | 1992-10-12 |
| IL73568A0 (en) | 1985-02-28 |
| FI86746B (fi) | 1992-06-30 |
| PH22337A (en) | 1988-08-12 |
| GR80966B (en) | 1985-03-15 |
| ES537828A0 (es) | 1986-07-16 |
| PT79518A (en) | 1984-12-01 |
| AU595478B2 (en) | 1990-04-05 |
| KR930002889B1 (ko) | 1993-04-12 |
| IE57699B1 (en) | 1993-03-10 |
| DK551084A (da) | 1985-05-22 |
| IL73568A (en) | 1992-07-15 |
| HUT36185A (en) | 1985-08-28 |
| JPS6119489A (ja) | 1986-01-28 |
| DE3479520D1 (en) | 1989-09-28 |
| FI844544A0 (fi) | 1984-11-19 |
| EP0143081B1 (en) | 1989-08-23 |
| ES8609471A1 (es) | 1986-07-16 |
| EP0143081A3 (en) | 1987-01-07 |
| DD229151A5 (de) | 1985-10-30 |
| DK164941B (da) | 1992-09-14 |
| AU3571984A (en) | 1986-03-20 |
| DK164941C (da) | 1993-02-01 |
| PT79518B (pt) | 1986-12-12 |
| KR850003733A (ko) | 1985-06-26 |
| IE842965L (en) | 1985-05-21 |
| NO844618L (no) | 1985-05-22 |
| FI844544L (fi) | 1985-05-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU201115B (en) | Process for producing fibrinolitic materials with yeast | |
| EP0225286B1 (en) | Modified fibrinolytic agents | |
| US4943529A (en) | Kluyveromyces as a host strain | |
| EP0301670B2 (en) | Kluyveromyces as a host strain | |
| IE55598B1 (en) | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides | |
| PL154427B1 (en) | Method for manufacturing and separating heterological protein through yarrow lipolytica culturing | |
| JP2645237B2 (ja) | ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータをコードする遺伝子 | |
| EP0288435B1 (en) | Process for the production of proteins | |
| US5580559A (en) | Hybrid plasminogen activator | |
| US5242819A (en) | DNA molecules encoding hybrid proteins of tissue plasminogen activator and urokinase | |
| JP2518832B2 (ja) | 変形された組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ− | |
| IE61775B1 (en) | Process for the production of proteins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |