PT86162B

PT86162B - Expressao de proteina recombinante

Info

Publication number: PT86162B
Application number: PT8616287A
Authority: PT
Inventors: Mitchell Elliot Reff
Original assignee: Smithkline Beecham Corp
Priority date: 1986-11-21
Filing date: 1987-11-18
Publication date: 1990-11-20
Also published as: EP0269382A1; PT86162A

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se à expressão de produtos genéticos, por técnicas de ADN recombinante, num hospedeiro mamífero.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Activador de Plasminogénio de tecido humano (tPA) é uma glicoproteína de cerca de 70.000 daltons e 527 aminoácidos. E segregada por vários tecidos humanos e está presente naturalmente no soro. 0 tPA actua na lise do coágulo por conversão do plasminogéneo em plasmina. 0 tPA tem uma afinidade para e é mais activo na presença de fibrina. Deste modo, o tPA é eficaz no tratamento de perturbações associadas com formação de trombos tal como na trombose das veias profundas, enfarte agudo do miocárdio e embolia pulmonar. Ver, principalmente, Rijken et al., Biochem. Biophys, Acta 580:140 (1979), Vetterlein et al., J. Biol. Chem, 254:575 (1979), Rijken et al., <T. Biol. Chem, 256:7035 (1981) e Matsuo et al., Nature 291:590 (1981).

tPA é produzido em excesso por certas linhas celulares, incluindo a linha celular do melanoma de Bowes. Ver, por exem pio, Wilson et al., Canc. Res. 40:933 (198). Collen et al., European Patent Application (EP-A)-41.766, descreve a purifica ção de tPA derivado do melanoma de Bowes. Wilson, BP-A-113.319, descreve a produção e purificação de tPA utilizando uma linha celular de melanoma de Bowes independente do soro. Brouty-Boye, Bio/Technology, Dezembro 1984, pag. 1058, descreve a produção de tPA por meio de células embrionárias do pulmão humano. Schleuning et al., Sixth Int’l. Conf. Fibrinolysis, lausanne, Switzerland, Abstract, July 22-23, 1982 descreve a produção de tPA por células de Hela.

tPA pode ser também preparado por técnicas de ADN recom binante. 0 isolamento de mARN para tPA é descrito, por exemplo, por Opdenakker et al., Eur. J. Biochem. 121:269 (1982). 0 iso lamento de cADN para parte de tPA é descrito por Edlund et al.,

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-3Proc, Natl. Acad. Sei. USA 80:349 (1985). A clonagem de cADN, para tPA, em E. coli é descrita por Pennica et al., Nature 301:214 (1985). A clonagem de cADN para tPA em E. coli e em células dos ovários dos cricetos da China por aplicação de pro cedimentos de ADN recombinante convencionais é descrita por Goe ddel et al., EP-A-93.619 e por Levinson et al., EP-A-117.059. Goldberg et al., pedido de patente do PCT WO85-O3949, descreve a expressão de tPA em Ξ. coli., Meyhack et al., EP-A-143.081, descreve a expressão de tPA em leveduras. Robinson, W084-01786 descreve um tPA modificado que carece de todos ou de uma parte dos radicais de hidrato de carbono presentes no tPA selvagem.

Howley et al., Patente Americana 4.419.446, descreve a uti lização de ADN de BPV incluindo a respectiva região 69T, como um vector de clonação em células de mamíferos. Ricciardi et al., Patente Americana 4.562.155 descreve o plasmídeo pML BK, o qual tem funções de conservação na E. coli e em mamíferos (virus BK).

HAK ou HáK é uma linha celular de rim de criceto que foi isolada pela primeira vez em 1959 por I.M.Spense a partir de rins de dois cricetos da Síria machos, adultos, jovens e normais. A origem e as características da linha celular de HAK estão descritas em Catalogue of Bactéria, Phages e rDNA Vectors, 16^ Edição,1985, American Type Gulture Collection, Rockville,

Maryland, sob o número de acesso CCL-15. A linha celular de HAK não foi até agora descrita como um hospedeiro para transfecção com ADN estranho.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção consiste numa célula HAK que compreende uma uni dade de expressão do gene de tPA.

de de do

A invenção consiste também num processo para a preparação uma cultura de células para a produção de tPA que compreen(fe a transfecção de uma celula/HAK com uma unidade de expressão gene de tPA e a selecção e propagação dos transfectantes que produzem tPA.

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SKB CASE 14517 ,₄. _v.

-4A invenção consiste também no tPA produzido por uma célula de HAK recombinante e numa composição farmacêutica que compreende uma quantidade trombolítica, não tóxica de tal tPA.

A invenção consiste também num vector de clonação de ADN recombinante que pode ser utilizado no processo para a prepara ção da célula de HAK da invenção e a uma célula de HAK transfectada com esse vector.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Fig. 1 é uma ilustração de BPVneo, um vector BPV-pM12 híbrido que possui uma cassete resistência à neomicina.

A Fig. 2 é uma ilustração do vector Mbaneo.ltPA, que possui uma cassete da unidade de expressão do gene de tPA e uma cassete de resistência à neomicina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Verificou-se agora que após a introdução de uma unidade de expressão do gene de tPA numa célula de HAK por técnicas de transfecção, essa célula de HAK transfectada produz uma quanti dade inesperadamente grande de tPA relativamente ao número de cópias da unidade de expressão do gene de tPA. Por exemplo, o clone de HAK 2,8, descrito a seguir produziu cerca de 3-5 pg de tPA por cópia de gene de tPA simples, quantidade que é cerca de 20 vezes maior do que a quantidade de tPA por cópia de gene de tPA produzida por células dos ovários de cricetos da China (CHO).

A unidade de expressão do gene de tPA que pode ser utilizada para preparar a célula de HAK recombinante da invenção com preende uma sequência de ADN de codificação para tPA ou para uma sua variante activa e, uma região de regulação, necessária ou desejável para transcrição da sequência de codificação de tPA e para tradução subsequente. A sequência de codificação de tPA ou uma sua variante pode ser conseguida em várias empresas ou pode ser obtida a partir de células ou linhas celu66 866

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-5lares humanas, tais como a linha celular do melanoma de Bowes ou a linha celular de HeLa. Utilizam-se técnicas padrão de en genharia genética para se obter uma sequência de codificação de tPA a partir do ADN genómico de uma célula humana. As suas variantes podem também ser preparadas por técnicas padrão de ADN recombinante e/ou técnicas sintéticas. As referências citadas no capítulo dos antecedentes, são ilustrativas.

A região reguladora pode ser uma região que seja usualmente utilizada na construção de vectores de expressão de células de mamíferos ou uma região que tem funções semelhantes. Essa região compreende, tipicamente, uma região promotora, isto é, uma região que actua na ligação da ARN polimerase e na iniciação de transcrição de ARN a montante da sequência de codificação de tPA. Os promotores que são geralmente utilizados nos vectores de expressão de células de mamíferos e que por consequência, são úteis na presente invenção incluem o promotor da metalotioneína, especialmente o promotor da metalotioneína do macaco, do rato e do homem; os promotores virais tais como o promotor anterior do vírus Símio 40 (SV40) ou o promotor posterior de SV40; os LTR virais tais como o LTR do vírus do tumor mamário do rato (MMTV), o LTR dos vírus linfotrépicos das células -T humanas, I, II ou III ou o LTR do vírus de sarcoma de Rous. Estes promotores podem ser derivados de genes ou cé lulas onde existam naturalmente. Estes promotores podem também ser modificados para alterar as respectivas sequências.

A jusante da sequência de codificação do tPA há tipicamente uma região de poliadenilação (poli A), isto é, uma regi ão que actua na poliadenilação de transcritos de ARN. Esta re gião poli A desempenha, aparentemente, uma função de estabilização da transcrição. As regiões de poliadenilação que são nor malmente utilizadas em vectores de expressão das células dos mamíferos e que, por consequência, são uteis na presente inven ção, incluem as regiões de poliadenilação da região anterior do SV40, hormona de crescimento bovina e colagénio humano pro-alfa 2 (I). Estas regiões podem ser derivadas de genes onde

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„..

-6estão presentes naturalmente. Estas regiões podem também ser modificadas para alterar as suas sequências, desde que as funções de poliadenilação e de estabilização da transcrição não sejam afectadas adversamente de forma significativa.

A unidade de expressão do gene ou qualquer outra parte da molécula de ADN que inclua a unidade de expressão do gene pode compreender outras funções reguladoras incluindo sítios de com binação, activadores e melhoradores de transcrição.

de

Uma célula/HAK é transfectada com a unidade de expressão do gene de tPA por qualquer técnica que permita a introdução de ADN estranho numa célula hospedeira sem afectar adversamente de modo significativo o ADN estranho ou a célula hospedeira. Estas técnicas incluem precipitação do cálcio, electroporação, fusão do protoplasto, a micro-injecção e a transfecção virai.

A unidade de expressão do gene de tPA é incorporada numa molécula de ADN maior, de preferência, antes da transfecção. Esta molécula de ADN maior compreende, de preferência, pelo menos um marcador de selecção genética em adição às funções de tPA. 0 marcador de selecção pode ser qualquer um ou mais genes que provoquem uma alteração fenotípica facilmente detectável numa célula hospedeira transfectada. Esta alteração fenotípica pode ser, por exemplo, formação de focos tal como pode ocorrer quando se utiliza um vector do vírus do papiloma bovino (BPV); resistência a drogas, tais como genes para resistência a G418 ou à higromicina B; ou outros marcadores de selecção tais como xantina-guanina-fosforibosil-transferase (xgprt), timidina-quinase (TK) e galactoquinase (galK). Pode-se utilizar um marcador de selecção que proporciona funções de amplificação para aumentar o número de cópias, quer por aumento da eficácia da transfecção, quer por replicação intra-celular aumentada do marcador e da unidade de expressão do gene de tPA. Estes marc adores/fervem também para amplificar o número de cópias do ge> ne incluem genes para di-hidrofolato-redutase (resistência a metotrexato), CAD (resistência a N-fosfon-acetil-Ir-aspartato) e adenosina-desaminase (resistência a 2-desoxicorfomicina).

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-7A molécula de ADN maior, que compreende a unidade de expressão do gene de tPA pode ser um plasmídeo que pode ou não ser capaz de manutenção episomal num transfectante de HAK. Este plasmídeo que é capaz de manutenção episomal estável com preenderá, alem da unidade de expressão do gene de tPA, uma função de manutenção isto é, uma região que leva o ADN a repli cação independentemente da replicação cromossómica mitótica, numa célula de HAK. Estas funções de manutenção são tipicamen te de origem virai, incluindo, por exemplo, vírus de animais tais como vírus do papiloma bovino (BPV), Vírus Simio 40 (SV40), Vírus BK (BKV), adenovirus, Vírus de Epstein Barr (EBV), vírus de papiloma e vírus de herpes simplex (HSV). Estas funções de manutenção podem ser facilmente preparadas e testadas para manu tenção episomal estável numa célula de HAK. 0 número de cópias do plasmídeo, e portanto de genes de tPA, está compreendido tipica mente, na gama de 1 - 1000, de preferência de 1 - 200.

Os plasmídeos nos quais se pode incorporar uma unidade de expressão do gene de tPA estão disponíveis a partir de muitas fontes ou podem ser construídos por técnicas bem conhecidas na arte, de expressão de genes em hospedeiros mamíferos, por técnicas de ADN recombinante. Entre as fontes estão os depositários públicos, incluindo o American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, que incluem no seu catálogo vários plasmídeos úteis.

A unidade de expressão do gene de tPA pode ser co-transfectada com outras funções de ADN, tal como um gene para uma função de amplificação como se descreveu antes. Esta outra função de ADN pode ser ligada directa ou indirectamente à unidade de expressão do gene de tPA ou pode estar separada, isto é, numa molécula diferente. Veja-se, por exemplo, a patente Americana 4.399.216 de Axel.

A seguir à transfecção, uma célula que tem a unidade de expressão do gene é cultivada num meio nutriente sob condições tais, que se produzam quantidades de tPA recuperáveis. Pode-se utilizar um meio de cultura de células de mamíferos, padrão,

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-8por exemplo, o meio 199 de Morgan, Morton e Parker mais 10$ de soro bovino; BSS de Earle (87%), 2,5% de lactalbumina (0,5%) θ 10% de soro de cavalo; meio basal de Eagle e 5% de soro de vitela; e meio basal de Eagle com BSS de Hahks e 10% de soro de vitela. As células de HAK crescem bem num meio simples isento de soro. As culturas de células são mantidas à pressão ambien te entre 50 e 45°C, de preferência entre 55 e 42°C, sendo preferível a temperatura de 57°0.

Um protocolo padrão inclui a transformação, com ADN plasmídico que compreende uma unidade de expressão do gene de tPA, utilizando a técnica da precipitação do cálcio seguida, apés cerca de 6 a 8 horas de incubação, de um tratamento choque de resulta , glicerol. A transformação/numa célula hospedeira que possui até cerca de 20 cópias da unidade de expressão do gene de tPA. As técnicas de amplificação podem ser utilizadas para aumentar esse número de cópias até cerca de 1000 e tipicamente até cerca de 200. Cerca de 24 horas após a transformação, as células são colocadas em meio selectivo e cultivadas durante cerca de em duas semanas. As colónias sobreviventes são colocadas/placas de micro-titulação com 24 cavidades e incubadas até confluência, isto é, durante cerca de 1/2 a 1 semana. As cavidades são depois testadas em relação à produção de tPA. As colónias altamente produtivas são depois aumentadas por incubações sucessivas, cada uma durante cerca de 1 semana, em frascos T25, fras cos T75, garrafas cilíndricas e, finalmente, unidades de produção. Nas unidades de produção, o meio condicionado é obrigado a circular ou removido periodicamente e substituído, de modo que o tPA pode ser recolhido continuamente ou periodicamente. As unidades de produção são de preferência qualquer sistema de cultura apropriado para células aderentes, unidades de cultura de células que utilizam fibras, microveículos ou microcápsulas e fábricas de células.

A seguir à cultura de células o tPA é isolado a partir do meio condicionado por técnicas padrão de isolamento de proteínas. Estas técnicas envolvem, tipicamente, uma série de procedimentos

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-9cromatográficos incluindo, por exemplo, procedimentos de permuta iónica, fase inversa e cromatografia de afinidade. A seguir à purificação o tPA é formulado numa composição farmacêutica de forma que cada unidade de dosagem compreenda uma quantidade de tPA que seja não tóxica, isto é, isenta de efeitos secundários adversos significativos e que é eficaz na produção de trombolise após administração a um animal, particularmente ao homem. Esta composição farmacêutica para tratamento de enfarte de miocárdio está, tipicamente, numa forma apropriada para injecção ou infusão intravenosa e compreende 0,1 a 10 mg/ml de tPA num veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Um tratamento típico para uma pessoa adulta que sofre de enfarte agudo do miocárdio compreende a infusão intravenosa de 80-150 mg de tPA durante um período de 1/4-6 horas. Os diluentes e veículos apropriados são bem conhecidos de um químico farmacêutico bem como o são as técnicas para a preparação da composição farmacêutica.

EXEMPLOS

Os exemplos que se seguem são ilustrativos e não limitativos da invenção.

Inseriu-se em estrutura uma sequência de codificação de ADNc que tinha sido preparada por transcrição inversa de ARNm a partir de células HeLa (Schleuning et al., Sixth Int’l. Conf. Fibrinolysis, Lausanne, Switzerland, July 22-23, 1982) entre o promotor de proteína anterior de SV40 e um sítio de poliadenilação BGH (Woychik et al., Biochem. 81:3944 (1984); Goodwin et al., EP-A-I73.552) para preparar uma unidade de expressão do gene de tPA. A unidade de expressão do gene de tPA foi ligada em ambas as extremidades a um sítio de clivagem de endonuclease de restrição Sal I.

A cassete Sal I que compreendia a unidade de expressão do

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-10sítio BamHI, (ii) funções de replicação pBR322 e no gene de (3-lactamase ambos obtidos a partir de pKD2 (Melon et al., Oell 2^:279-288 (1981) por delecção de uma região Sal Ι-BamHI não essencial e (iii) num marcador de selecção de resistência à neo micina (neo) preparado por fusão do promotor da^S-globina, da sequência de codificação da neomicina-fosfotransferase e da região de poliadenilação da região anterior de SV40. A unidade de expressão do gene de tPA foi inserida num sítio Sal I entre o ADN de BPV e o ADN de pMD2.

As células HB101 de Ξ. coli adequadas foram transformadas com o vector, referido como BPV^globina-neotPA ”A° ou ”B” depen dendo da orientação da cassete de tPA e seleccionaram-se em seguida os clones resistentes à ampicilina. Os clones que possuem o plasmídeo circular (A) que é ilustrado como se segue

.........—

BPV neo pML2

Sal I

BamHI BamHI tPÁ

1---------------------1

Sal I Sal I foram cultivados e o ADN plasmídeo isolado. (As setas indicam a direcção de transcrição.). Ver Fig. 1.

de

As células/HAK foram transfectadas com BPV^globina-neotPAB através da precipitação por fosfato de cálcio seguida 6 horas mais tarde do tratamento/choque com glicerol, como descreve substancialmente Wigler et al., Proc. Natl. Acad, Sei. USA 76:1375-1376 (1979). As células foram incubadas a 37°G durante a noite e depois tratadas com aproximadamente 300 jug/ml de G418. As colónias sobreviventes foram seleccionadas e desen volvidas num prato de microtitulação com 24 cavidades durante dias a 37°C. Verificou-se que o sobrenadante das células con fluentes continha tPA activo que tinha sido introduzido no meio pelo teste S-2251. A quantidade deste tPA extraído foi cerca de 0,5 pg/célula/dia. 0 teste de S-2251 é descrito por Weinberg et al., J. Immunol. Meth. 75:289 (1984). Baseado na anã

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SKB CASE 14317 lise da mancha de Southern parece que 0 plasmídeo está presente numa cópia simples. 0 plasmídeo não foi integrado como se evidenciou pela ausência dos fragmentos de junção seguindo-se 0 tratamento com várias endonucleases de restrição e a Análise Southern Blot. As células de HAK transfectadas com o vector plasmídeo são referidas como HAK (BPV/3globina-neotPAB).

Este exemplo demonstra assim a produção de cerca de 0,5 pg/dia de tPA por cada cépia da unidade de expressão do gene de tPA num vector plasmídeo que possui funções de manutenção, derivado de BPV.

EXEMPLO 2. Mbaneo.ltPA vector BPVZy3globina-neo foi cortado com HindIII, prenchido e depois cortado com Scal para isolar um fragmento com 432 pares de bases contendo a sequência*· de manutenção de pias mídeo (PMS1).

Este fragmento foi inserido num sítio BamHI preenchido, do Bglobina-neo atrás da cassete neo. /3globina-neo é um vector que contém (i) um marcador de selecção de resistência a neomicina (neo) preparado por fusão do promotor de/3-globina, uma sequência de codificação da neomicina fosfotransferase e a região anterior de poliadenilação de SV40 e (ii) funções de repli cação pBR3222 e 0 gene da /3-lactamase. 0 vector resultante foi J3globina-neoPMSl.

Este vector foi cortado com BamHI e Sall para isolar um fragmento contendo a função neo e PMS1. Um segundo fragmento (BamHI a Sall) consistindo em ADN de pML2 foi isolado a partir de BPV globina-neo. Estes fragmentos foram ligados na presença de um terceiro fragmento que consiste numa unidade de expressão do gene da proteína EI com 2608 pares de bases que possui extre midades Sall. A unidade de expressão do gene Ξ1 foi preparada previamente através da ligação de um fragmento Nrul-Ncol que com preende a sequência de codificações EI com 0 promotor anterior de SV40 e a região de poliadenilação de SV40. Os transformantes HB101 de E. coli foram seleccionados em relação a plasmídeos

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SKB CASE 14317 * -12possuindo os três fragmentos. Este plasmídeo foi designado por Mbaneo.l.

Inseriu-se no sítio Sall do Mbaneo.l, uma unidade de expres são do gene de tPA para preparar Kbaneo.ltPA. A unidade de expressão do gene estava contida num fragmento Sall com 3046 pares de bases. Continha o promotor anterior de SV40 e a região de po liadenilação BGH. Seleccionaram-se os transformantes HB101 de E. coli que possuem o plasmídeo Mbaneo.ltPA (Ver Fig. 2).

As células de HAK foram transfectadas com Mbaneo.ltPA substancialmente como se descreveu acima. A partir de uma primeira transfecção, 6 em 15 das colónias que eram resistentes a G418 produziram tPA. Uma destas colónias produziu quantidades relativamente grandes de tPA. Um seu sub-clone, identificado aqui como HAK 2,8, produziu 3-5 pg de tPA por célula por dia. Depositou-se uma amostra de HAK 2,8 no American Type Culture Collection, Rockville, Maryland sob o número de acesso CRI 9182, Este clone contém uma cópia integrada simples da unidade de expres são do gene de tPA e, por conseguinte, produz 3-5 pg de tPA por unidade de expressão do gene de tPA, por célula por dia.

De uma segunda transfecção 10 em 10 das eolónias produziram 500 ng/ml de tPA. Uma produziu cerca de 3000 ng/ml. Um sub-clone do clone de alta produção, identificado aqui como | HAK 1, produziu cerca de 1-2 pg de tPA por célula por dia e con tinha cerca de 10-15 eópias da unidade de expressão do gene de tPA, integradas.

De uma terceira transfecção, 39 em 40 das colónias expressaram baixos níveis de tPA. Uma delas, a HAK 21, produziu cerca de 500 ng/ml. Isto é equivalente a cerca de 0,5 pg de tPA por célula por dia. A HAK 21 também contém cerca de 10-15 cópias da unidade de expressão do gene de tPA, integradas.

Os níveis de expressão por cópia de gene, conseguidos no caso da HAK 2,8 foram inesperadamente altos em relação à experiência com outras células de mamíferos transfectadas com unidades de expressão do gene de tPA, tais como transfectantes CHO.

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-13Deste modo, este exemplo demonstra a expressão de tPA em células de HAK a partir de uma unidade de expressão do gene de tPA integrada num número de cépias pequeno, mas capaz de níveis ele vados de produção de tPA relativamente ao número de cópias do gene. Obtém-se um aumento nos níveis de expressão de tPA pela amplificação do número de cópias da unidade de expressão do gene de tPA.

Os exemplos e a descrição anteriores descrevem totalmente a invenção incluindo as suas formas de realização preferidas. A invenção, porém, não se limita, precisamente, às construções descritas, mas em vez disso inclui todas as suas modificações que possam resultar do âmbito das reivindicações que se seguem.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1 - Célula de HAK caracterizada por possuir uma unidade de expressão do gene activador de plasminogéneo de tecido (tPA).
2 - Célula de HAK de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a unidade de expressão do gene tPA ser epissomal e estar presente em 1-1000 cópias.
3 - Célula de HAK, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o ADN epissomal ser um plasmídeo que possui funções de manutenção virai.
4 - Célula de HAK, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por as funções de manutenção do plasmídeo serem derivadas de um vírus animal seleccionado do grupo que consiste em vírus de papiloma bovino (BPV), vírus simio 40 (SV40), vírus do herpes simplex (HSV), adenovírus, vírus de Epstein Barr (EBV), vírus de polioma e vírus BK (BKV).
5 - Célula de HAK, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por o plasmídeo compreender funções de manutenção deri vadas do BPV.
6 - Célula de HAK, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por o promotor na unidade de expressão do gene tPA ser derivado de um gene para metalotioneína, do LTR do vírus do tumor mamário do rato (MMTV), do promotor anterior ou posterior de SV40, do LTR dos vírus HTLV ou do LTR de vírus do sarcoma de Rous.
7 - Célula de HAK, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por a unidade de expressão do gene tPA compreender o promotor anterior de SV40 e a hormona bovina de crescimento (BGH) ou a região anterior de poliadenilação de SV40.
8 - Célula de HAK, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a unidade de expressão do gene tPA estar integrada e estar presente entre 1-1000 cópias.
9 - Célula de HAK, de acordo com a reivindicação 8, carac66 866

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-15terizada por o promotor na unidade de expressão do gene tPA ser derivado de um gene para metalotioneína, do LTR de MMTV, do pro motor anterior ou posterior de SV4O, do 1TR dos vírus HTIiV ou do IiTR. do vírus do sarcoma Rous.
10 - Célula de HAK, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por a unidade de expressão do gene tPA compreender o promotor anterior de SV40 e a região de poliadenilação anterior de SV40 ou de BGH.
11 - Célula de HAK, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser uma célula de HAK 2,8.
12 - Processo para a preparação de uma cultura de células para a produção de tPA, caracterizado por compreender a transfecção de uma célula de HAK com uma unidade de expressão do gene tPA, e a selecção e a propagação dos transfectantes que produzem tPA.
13 - Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a célula de HAK ser transfectada com um plasmídeo ca paz de manutenção epissomal na célula hospedeira em 1 a 1000 cé pias.
14 - Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o plasmídeo compreender funções de manutenção virai.
15 - Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o promotor na unidade de expressão do gene ser derivado de um gene para metalotioneína, do LTR de MKJV, do promotor anterior ou posterior de SV40 ou do BTR dos vírus HTLV.
16 - Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por as funções de manutenção do plasmídeo serem derivadas de BPV.
17 - Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a unidade de expressão do gene tPA compreender o pro motor anterior de SV40 e a região de poliadenilação anterior de SV40 ou de BGH.
18 - Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracte66 866

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-16rizado por compreender a transfecção da célula de HAK de tal mo do que a unidade de expressão do gene tPA seja integrada no genoma da célula hospedeira.
19 - Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por compreender a amplificação do número de cópias de expressão do gene tPA até cerca de 1000.
20 - Processo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o promotor na unidade de expressão do gene tPA ser derivado de um gene para metalotioneína, do LTR de NMTV, do pro motor anterior ou posterior de SV40 ou do LTR dos vírus HTLV.
21 - Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por a unidade de expressão do gene tPA compreender o pro motor anterior de SV40 e a região de poliadenilação anterior de SV40 ou de BGH.
22 - Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a célula de HAK resultante ser uma célula de HAK 2,8.

25 - Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por compreender a amplificação da unidade de expressão do gene tPA pela sua co-transfecção com uma função amplificável.
24 - Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por a função amplificável ser um gene para di-hidrofolato redutase, CAD ou adenosina desaminase.