PT86162B - Expressao de proteina recombinante - Google Patents

Expressao de proteina recombinante Download PDF

Info

Publication number
PT86162B
PT86162B PT8616287A PT8616287A PT86162B PT 86162 B PT86162 B PT 86162B PT 8616287 A PT8616287 A PT 8616287A PT 8616287 A PT8616287 A PT 8616287A PT 86162 B PT86162 B PT 86162B
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
tpa
gene
hak
cell
expression unit
Prior art date
Application number
PT8616287A
Other languages
English (en)
Other versions
PT86162A (en
Inventor
Mitchell Elliot Reff
Original Assignee
Smithkline Beecham Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Smithkline Beecham Corp filed Critical Smithkline Beecham Corp
Publication of PT86162A publication Critical patent/PT86162A/pt
Publication of PT86162B publication Critical patent/PT86162B/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/20043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA
CAMPO DA INVENÇÃO
Esta invenção refere-se à expressão de produtos genéticos, por técnicas de ADN recombinante, num hospedeiro mamífero.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Activador de Plasminogénio de tecido humano (tPA) é uma glicoproteína de cerca de 70.000 daltons e 527 aminoácidos. E segregada por vários tecidos humanos e está presente naturalmente no soro. 0 tPA actua na lise do coágulo por conversão do plasminogéneo em plasmina. 0 tPA tem uma afinidade para e é mais activo na presença de fibrina. Deste modo, o tPA é eficaz no tratamento de perturbações associadas com formação de trombos tal como na trombose das veias profundas, enfarte agudo do miocárdio e embolia pulmonar. Ver, principalmente, Rijken et al., Biochem. Biophys, Acta 580:140 (1979), Vetterlein et al., J. Biol. Chem, 254:575 (1979), Rijken et al., <T. Biol. Chem, 256:7035 (1981) e Matsuo et al., Nature 291:590 (1981).
tPA é produzido em excesso por certas linhas celulares, incluindo a linha celular do melanoma de Bowes. Ver, por exem pio, Wilson et al., Canc. Res. 40:933 (198). Collen et al., European Patent Application (EP-A)-41.766, descreve a purifica ção de tPA derivado do melanoma de Bowes. Wilson, BP-A-113.319, descreve a produção e purificação de tPA utilizando uma linha celular de melanoma de Bowes independente do soro. Brouty-Boye, Bio/Technology, Dezembro 1984, pag. 1058, descreve a produção de tPA por meio de células embrionárias do pulmão humano. Schleuning et al., Sixth Int’l. Conf. Fibrinolysis, lausanne, Switzerland, Abstract, July 22-23, 1982 descreve a produção de tPA por células de Hela.
tPA pode ser também preparado por técnicas de ADN recom binante. 0 isolamento de mARN para tPA é descrito, por exemplo, por Opdenakker et al., Eur. J. Biochem. 121:269 (1982). 0 iso lamento de cADN para parte de tPA é descrito por Edlund et al.,
866
SKB CASE 14317 ; * fc, *
-3Proc, Natl. Acad. Sei. USA 80:349 (1985). A clonagem de cADN, para tPA, em E. coli é descrita por Pennica et al., Nature 301:214 (1985). A clonagem de cADN para tPA em E. coli e em células dos ovários dos cricetos da China por aplicação de pro cedimentos de ADN recombinante convencionais é descrita por Goe ddel et al., EP-A-93.619 e por Levinson et al., EP-A-117.059. Goldberg et al., pedido de patente do PCT WO85-O3949, descreve a expressão de tPA em Ξ. coli., Meyhack et al., EP-A-143.081, descreve a expressão de tPA em leveduras. Robinson, W084-01786 descreve um tPA modificado que carece de todos ou de uma parte dos radicais de hidrato de carbono presentes no tPA selvagem.
Howley et al., Patente Americana 4.419.446, descreve a uti lização de ADN de BPV incluindo a respectiva região 69T, como um vector de clonação em células de mamíferos. Ricciardi et al., Patente Americana 4.562.155 descreve o plasmídeo pML BK, o qual tem funções de conservação na E. coli e em mamíferos (virus BK).
HAK ou HáK é uma linha celular de rim de criceto que foi isolada pela primeira vez em 1959 por I.M.Spense a partir de rins de dois cricetos da Síria machos, adultos, jovens e normais. A origem e as características da linha celular de HAK estão descritas em Catalogue of Bactéria, Phages e rDNA Vectors, 16^ Edição,1985, American Type Gulture Collection, Rockville,
Maryland, sob o número de acesso CCL-15. A linha celular de HAK não foi até agora descrita como um hospedeiro para transfecção com ADN estranho.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção consiste numa célula HAK que compreende uma uni dade de expressão do gene de tPA.
de de do
A invenção consiste também num processo para a preparação uma cultura de células para a produção de tPA que compreen(fe a transfecção de uma celula/HAK com uma unidade de expressão gene de tPA e a selecção e propagação dos transfectantes que produzem tPA.
866
SKB CASE 14517 ,4. v.
-4A invenção consiste também no tPA produzido por uma célula de HAK recombinante e numa composição farmacêutica que compreende uma quantidade trombolítica, não tóxica de tal tPA.
A invenção consiste também num vector de clonação de ADN recombinante que pode ser utilizado no processo para a prepara ção da célula de HAK da invenção e a uma célula de HAK transfectada com esse vector.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Fig. 1 é uma ilustração de BPVneo, um vector BPV-pM12 híbrido que possui uma cassete resistência à neomicina.
A Fig. 2 é uma ilustração do vector Mbaneo.ltPA, que possui uma cassete da unidade de expressão do gene de tPA e uma cassete de resistência à neomicina.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Verificou-se agora que após a introdução de uma unidade de expressão do gene de tPA numa célula de HAK por técnicas de transfecção, essa célula de HAK transfectada produz uma quanti dade inesperadamente grande de tPA relativamente ao número de cópias da unidade de expressão do gene de tPA. Por exemplo, o clone de HAK 2,8, descrito a seguir produziu cerca de 3-5 pg de tPA por cópia de gene de tPA simples, quantidade que é cerca de 20 vezes maior do que a quantidade de tPA por cópia de gene de tPA produzida por células dos ovários de cricetos da China (CHO).
A unidade de expressão do gene de tPA que pode ser utilizada para preparar a célula de HAK recombinante da invenção com preende uma sequência de ADN de codificação para tPA ou para uma sua variante activa e, uma região de regulação, necessária ou desejável para transcrição da sequência de codificação de tPA e para tradução subsequente. A sequência de codificação de tPA ou uma sua variante pode ser conseguida em várias empresas ou pode ser obtida a partir de células ou linhas celu66 866
SKB CASE 14317 '
-5lares humanas, tais como a linha celular do melanoma de Bowes ou a linha celular de HeLa. Utilizam-se técnicas padrão de en genharia genética para se obter uma sequência de codificação de tPA a partir do ADN genómico de uma célula humana. As suas variantes podem também ser preparadas por técnicas padrão de ADN recombinante e/ou técnicas sintéticas. As referências citadas no capítulo dos antecedentes, são ilustrativas.
A região reguladora pode ser uma região que seja usualmente utilizada na construção de vectores de expressão de células de mamíferos ou uma região que tem funções semelhantes. Essa região compreende, tipicamente, uma região promotora, isto é, uma região que actua na ligação da ARN polimerase e na iniciação de transcrição de ARN a montante da sequência de codificação de tPA. Os promotores que são geralmente utilizados nos vectores de expressão de células de mamíferos e que por consequência, são úteis na presente invenção incluem o promotor da metalotioneína, especialmente o promotor da metalotioneína do macaco, do rato e do homem; os promotores virais tais como o promotor anterior do vírus Símio 40 (SV40) ou o promotor posterior de SV40; os LTR virais tais como o LTR do vírus do tumor mamário do rato (MMTV), o LTR dos vírus linfotrépicos das células -T humanas, I, II ou III ou o LTR do vírus de sarcoma de Rous. Estes promotores podem ser derivados de genes ou cé lulas onde existam naturalmente. Estes promotores podem também ser modificados para alterar as respectivas sequências.
A jusante da sequência de codificação do tPA há tipicamente uma região de poliadenilação (poli A), isto é, uma regi ão que actua na poliadenilação de transcritos de ARN. Esta re gião poli A desempenha, aparentemente, uma função de estabilização da transcrição. As regiões de poliadenilação que são nor malmente utilizadas em vectores de expressão das células dos mamíferos e que, por consequência, são uteis na presente inven ção, incluem as regiões de poliadenilação da região anterior do SV40, hormona de crescimento bovina e colagénio humano pro-alfa 2 (I). Estas regiões podem ser derivadas de genes onde
866
SKB CASE 14517 ' ;'*^**m»
„..
-6estão presentes naturalmente. Estas regiões podem também ser modificadas para alterar as suas sequências, desde que as funções de poliadenilação e de estabilização da transcrição não sejam afectadas adversamente de forma significativa.
A unidade de expressão do gene ou qualquer outra parte da molécula de ADN que inclua a unidade de expressão do gene pode compreender outras funções reguladoras incluindo sítios de com binação, activadores e melhoradores de transcrição.
de
Uma célula/HAK é transfectada com a unidade de expressão do gene de tPA por qualquer técnica que permita a introdução de ADN estranho numa célula hospedeira sem afectar adversamente de modo significativo o ADN estranho ou a célula hospedeira. Estas técnicas incluem precipitação do cálcio, electroporação, fusão do protoplasto, a micro-injecção e a transfecção virai.
A unidade de expressão do gene de tPA é incorporada numa molécula de ADN maior, de preferência, antes da transfecção. Esta molécula de ADN maior compreende, de preferência, pelo menos um marcador de selecção genética em adição às funções de tPA. 0 marcador de selecção pode ser qualquer um ou mais genes que provoquem uma alteração fenotípica facilmente detectável numa célula hospedeira transfectada. Esta alteração fenotípica pode ser, por exemplo, formação de focos tal como pode ocorrer quando se utiliza um vector do vírus do papiloma bovino (BPV); resistência a drogas, tais como genes para resistência a G418 ou à higromicina B; ou outros marcadores de selecção tais como xantina-guanina-fosforibosil-transferase (xgprt), timidina-quinase (TK) e galactoquinase (galK). Pode-se utilizar um marcador de selecção que proporciona funções de amplificação para aumentar o número de cópias, quer por aumento da eficácia da transfecção, quer por replicação intra-celular aumentada do marcador e da unidade de expressão do gene de tPA. Estes marc adores/fervem também para amplificar o número de cópias do ge> ne incluem genes para di-hidrofolato-redutase (resistência a metotrexato), CAD (resistência a N-fosfon-acetil-Ir-aspartato) e adenosina-desaminase (resistência a 2-desoxicorfomicina).
866
SKB CASE 14317
f.' .
z
-7A molécula de ADN maior, que compreende a unidade de expressão do gene de tPA pode ser um plasmídeo que pode ou não ser capaz de manutenção episomal num transfectante de HAK. Este plasmídeo que é capaz de manutenção episomal estável com preenderá, alem da unidade de expressão do gene de tPA, uma função de manutenção isto é, uma região que leva o ADN a repli cação independentemente da replicação cromossómica mitótica, numa célula de HAK. Estas funções de manutenção são tipicamen te de origem virai, incluindo, por exemplo, vírus de animais tais como vírus do papiloma bovino (BPV), Vírus Simio 40 (SV40), Vírus BK (BKV), adenovirus, Vírus de Epstein Barr (EBV), vírus de papiloma e vírus de herpes simplex (HSV). Estas funções de manutenção podem ser facilmente preparadas e testadas para manu tenção episomal estável numa célula de HAK. 0 número de cópias do plasmídeo, e portanto de genes de tPA, está compreendido tipica mente, na gama de 1 - 1000, de preferência de 1 - 200.
Os plasmídeos nos quais se pode incorporar uma unidade de expressão do gene de tPA estão disponíveis a partir de muitas fontes ou podem ser construídos por técnicas bem conhecidas na arte, de expressão de genes em hospedeiros mamíferos, por técnicas de ADN recombinante. Entre as fontes estão os depositários públicos, incluindo o American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, que incluem no seu catálogo vários plasmídeos úteis.
A unidade de expressão do gene de tPA pode ser co-transfectada com outras funções de ADN, tal como um gene para uma função de amplificação como se descreveu antes. Esta outra função de ADN pode ser ligada directa ou indirectamente à unidade de expressão do gene de tPA ou pode estar separada, isto é, numa molécula diferente. Veja-se, por exemplo, a patente Americana 4.399.216 de Axel.
A seguir à transfecção, uma célula que tem a unidade de expressão do gene é cultivada num meio nutriente sob condições tais, que se produzam quantidades de tPA recuperáveis. Pode-se utilizar um meio de cultura de células de mamíferos, padrão,
866
SKB CASE 14517
-8por exemplo, o meio 199 de Morgan, Morton e Parker mais 10$ de soro bovino; BSS de Earle (87%), 2,5% de lactalbumina (0,5%) θ 10% de soro de cavalo; meio basal de Eagle e 5% de soro de vitela; e meio basal de Eagle com BSS de Hahks e 10% de soro de vitela. As células de HAK crescem bem num meio simples isento de soro. As culturas de células são mantidas à pressão ambien te entre 50 e 45°C, de preferência entre 55 e 42°C, sendo preferível a temperatura de 57°0.
Um protocolo padrão inclui a transformação, com ADN plasmídico que compreende uma unidade de expressão do gene de tPA, utilizando a técnica da precipitação do cálcio seguida, apés cerca de 6 a 8 horas de incubação, de um tratamento choque de resulta , glicerol. A transformação/numa célula hospedeira que possui até cerca de 20 cópias da unidade de expressão do gene de tPA. As técnicas de amplificação podem ser utilizadas para aumentar esse número de cópias até cerca de 1000 e tipicamente até cerca de 200. Cerca de 24 horas após a transformação, as células são colocadas em meio selectivo e cultivadas durante cerca de em duas semanas. As colónias sobreviventes são colocadas/placas de micro-titulação com 24 cavidades e incubadas até confluência, isto é, durante cerca de 1/2 a 1 semana. As cavidades são depois testadas em relação à produção de tPA. As colónias altamente produtivas são depois aumentadas por incubações sucessivas, cada uma durante cerca de 1 semana, em frascos T25, fras cos T75, garrafas cilíndricas e, finalmente, unidades de produção. Nas unidades de produção, o meio condicionado é obrigado a circular ou removido periodicamente e substituído, de modo que o tPA pode ser recolhido continuamente ou periodicamente. As unidades de produção são de preferência qualquer sistema de cultura apropriado para células aderentes, unidades de cultura de células que utilizam fibras, microveículos ou microcápsulas e fábricas de células.
A seguir à cultura de células o tPA é isolado a partir do meio condicionado por técnicas padrão de isolamento de proteínas. Estas técnicas envolvem, tipicamente, uma série de procedimentos
866
SKB CASE 14317
-9cromatográficos incluindo, por exemplo, procedimentos de permuta iónica, fase inversa e cromatografia de afinidade. A seguir à purificação o tPA é formulado numa composição farmacêutica de forma que cada unidade de dosagem compreenda uma quantidade de tPA que seja não tóxica, isto é, isenta de efeitos secundários adversos significativos e que é eficaz na produção de trombolise após administração a um animal, particularmente ao homem. Esta composição farmacêutica para tratamento de enfarte de miocárdio está, tipicamente, numa forma apropriada para injecção ou infusão intravenosa e compreende 0,1 a 10 mg/ml de tPA num veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Um tratamento típico para uma pessoa adulta que sofre de enfarte agudo do miocárdio compreende a infusão intravenosa de 80-150 mg de tPA durante um período de 1/4-6 horas. Os diluentes e veículos apropriados são bem conhecidos de um químico farmacêutico bem como o são as técnicas para a preparação da composição farmacêutica.
EXEMPLOS
Os exemplos que se seguem são ilustrativos e não limitativos da invenção.
Inseriu-se em estrutura uma sequência de codificação de ADNc que tinha sido preparada por transcrição inversa de ARNm a partir de células HeLa (Schleuning et al., Sixth Int’l. Conf. Fibrinolysis, Lausanne, Switzerland, July 22-23, 1982) entre o promotor de proteína anterior de SV40 e um sítio de poliadenilação BGH (Woychik et al., Biochem. 81:3944 (1984); Goodwin et al., EP-A-I73.552) para preparar uma unidade de expressão do gene de tPA. A unidade de expressão do gene de tPA foi ligada em ambas as extremidades a um sítio de clivagem de endonuclease de restrição Sal I.
A cassete Sal I que compreendia a unidade de expressão do
866
SKB CASE 14317
-10sítio BamHI, (ii) funções de replicação pBR322 e no gene de (3-lactamase ambos obtidos a partir de pKD2 (Melon et al., Oell 2^:279-288 (1981) por delecção de uma região Sal Ι-BamHI não essencial e (iii) num marcador de selecção de resistência à neo micina (neo) preparado por fusão do promotor da^S-globina, da sequência de codificação da neomicina-fosfotransferase e da região de poliadenilação da região anterior de SV40. A unidade de expressão do gene de tPA foi inserida num sítio Sal I entre o ADN de BPV e o ADN de pMD2.
As células HB101 de Ξ. coli adequadas foram transformadas com o vector, referido como BPV^globina-neotPA ”A° ou ”B” depen dendo da orientação da cassete de tPA e seleccionaram-se em seguida os clones resistentes à ampicilina. Os clones que possuem o plasmídeo circular (A) que é ilustrado como se segue
.........—
BPV neo pML2
Sal I
BamHI BamHI tPÁ
1---------------------1
Sal I Sal I foram cultivados e o ADN plasmídeo isolado. (As setas indicam a direcção de transcrição.). Ver Fig. 1.
de
As células/HAK foram transfectadas com BPV^globina-neotPAB através da precipitação por fosfato de cálcio seguida 6 horas mais tarde do tratamento/choque com glicerol, como descreve substancialmente Wigler et al., Proc. Natl. Acad, Sei. USA 76:1375-1376 (1979). As células foram incubadas a 37°G durante a noite e depois tratadas com aproximadamente 300 jug/ml de G418. As colónias sobreviventes foram seleccionadas e desen volvidas num prato de microtitulação com 24 cavidades durante dias a 37°C. Verificou-se que o sobrenadante das células con fluentes continha tPA activo que tinha sido introduzido no meio pelo teste S-2251. A quantidade deste tPA extraído foi cerca de 0,5 pg/célula/dia. 0 teste de S-2251 é descrito por Weinberg et al., J. Immunol. Meth. 75:289 (1984). Baseado na anã
866
SKB CASE 14317 lise da mancha de Southern parece que 0 plasmídeo está presente numa cópia simples. 0 plasmídeo não foi integrado como se evidenciou pela ausência dos fragmentos de junção seguindo-se 0 tratamento com várias endonucleases de restrição e a Análise Southern Blot. As células de HAK transfectadas com o vector plasmídeo são referidas como HAK (BPV/3globina-neotPAB).
Este exemplo demonstra assim a produção de cerca de 0,5 pg/dia de tPA por cada cépia da unidade de expressão do gene de tPA num vector plasmídeo que possui funções de manutenção, derivado de BPV.
EXEMPLO 2. Mbaneo.ltPA vector BPVZy3globina-neo foi cortado com HindIII, prenchido e depois cortado com Scal para isolar um fragmento com 432 pares de bases contendo a sequência*· de manutenção de pias mídeo (PMS1).
Este fragmento foi inserido num sítio BamHI preenchido, do Bglobina-neo atrás da cassete neo. /3globina-neo é um vector que contém (i) um marcador de selecção de resistência a neomicina (neo) preparado por fusão do promotor de/3-globina, uma sequência de codificação da neomicina fosfotransferase e a região anterior de poliadenilação de SV40 e (ii) funções de repli cação pBR3222 e 0 gene da /3-lactamase. 0 vector resultante foi J3globina-neoPMSl.
Este vector foi cortado com BamHI e Sall para isolar um fragmento contendo a função neo e PMS1. Um segundo fragmento (BamHI a Sall) consistindo em ADN de pML2 foi isolado a partir de BPV globina-neo. Estes fragmentos foram ligados na presença de um terceiro fragmento que consiste numa unidade de expressão do gene da proteína EI com 2608 pares de bases que possui extre midades Sall. A unidade de expressão do gene Ξ1 foi preparada previamente através da ligação de um fragmento Nrul-Ncol que com preende a sequência de codificações EI com 0 promotor anterior de SV40 e a região de poliadenilação de SV40. Os transformantes HB101 de E. coli foram seleccionados em relação a plasmídeos
866
SKB CASE 14317 * -12possuindo os três fragmentos. Este plasmídeo foi designado por Mbaneo.l.
Inseriu-se no sítio Sall do Mbaneo.l, uma unidade de expres são do gene de tPA para preparar Kbaneo.ltPA. A unidade de expressão do gene estava contida num fragmento Sall com 3046 pares de bases. Continha o promotor anterior de SV40 e a região de po liadenilação BGH. Seleccionaram-se os transformantes HB101 de E. coli que possuem o plasmídeo Mbaneo.ltPA (Ver Fig. 2).
As células de HAK foram transfectadas com Mbaneo.ltPA substancialmente como se descreveu acima. A partir de uma primeira transfecção, 6 em 15 das colónias que eram resistentes a G418 produziram tPA. Uma destas colónias produziu quantidades relativamente grandes de tPA. Um seu sub-clone, identificado aqui como HAK 2,8, produziu 3-5 pg de tPA por célula por dia. Depositou-se uma amostra de HAK 2,8 no American Type Culture Collection, Rockville, Maryland sob o número de acesso CRI 9182, Este clone contém uma cópia integrada simples da unidade de expres são do gene de tPA e, por conseguinte, produz 3-5 pg de tPA por unidade de expressão do gene de tPA, por célula por dia.
De uma segunda transfecção 10 em 10 das eolónias produziram 500 ng/ml de tPA. Uma produziu cerca de 3000 ng/ml. Um sub-clone do clone de alta produção, identificado aqui como | HAK 1, produziu cerca de 1-2 pg de tPA por célula por dia e con tinha cerca de 10-15 eópias da unidade de expressão do gene de tPA, integradas.
De uma terceira transfecção, 39 em 40 das colónias expressaram baixos níveis de tPA. Uma delas, a HAK 21, produziu cerca de 500 ng/ml. Isto é equivalente a cerca de 0,5 pg de tPA por célula por dia. A HAK 21 também contém cerca de 10-15 cópias da unidade de expressão do gene de tPA, integradas.
Os níveis de expressão por cópia de gene, conseguidos no caso da HAK 2,8 foram inesperadamente altos em relação à experiência com outras células de mamíferos transfectadas com unidades de expressão do gene de tPA, tais como transfectantes CHO.
866
SKB CASE 14317
.....,$’·'
-13Deste modo, este exemplo demonstra a expressão de tPA em células de HAK a partir de uma unidade de expressão do gene de tPA integrada num número de cépias pequeno, mas capaz de níveis ele vados de produção de tPA relativamente ao número de cópias do gene. Obtém-se um aumento nos níveis de expressão de tPA pela amplificação do número de cópias da unidade de expressão do gene de tPA.
Os exemplos e a descrição anteriores descrevem totalmente a invenção incluindo as suas formas de realização preferidas. A invenção, porém, não se limita, precisamente, às construções descritas, mas em vez disso inclui todas as suas modificações que possam resultar do âmbito das reivindicações que se seguem.

Claims (23)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1 - Célula de HAK caracterizada por possuir uma unidade de expressão do gene activador de plasminogéneo de tecido (tPA).
  2. 2 - Célula de HAK de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a unidade de expressão do gene tPA ser epissomal e estar presente em 1-1000 cópias.
  3. 3 - Célula de HAK, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o ADN epissomal ser um plasmídeo que possui funções de manutenção virai.
  4. 4 - Célula de HAK, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por as funções de manutenção do plasmídeo serem derivadas de um vírus animal seleccionado do grupo que consiste em vírus de papiloma bovino (BPV), vírus simio 40 (SV40), vírus do herpes simplex (HSV), adenovírus, vírus de Epstein Barr (EBV), vírus de polioma e vírus BK (BKV).
  5. 5 - Célula de HAK, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por o plasmídeo compreender funções de manutenção deri vadas do BPV.
  6. 6 - Célula de HAK, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por o promotor na unidade de expressão do gene tPA ser derivado de um gene para metalotioneína, do LTR do vírus do tumor mamário do rato (MMTV), do promotor anterior ou posterior de SV40, do LTR dos vírus HTLV ou do LTR de vírus do sarcoma de Rous.
  7. 7 - Célula de HAK, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por a unidade de expressão do gene tPA compreender o promotor anterior de SV40 e a hormona bovina de crescimento (BGH) ou a região anterior de poliadenilação de SV40.
  8. 8 - Célula de HAK, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a unidade de expressão do gene tPA estar integrada e estar presente entre 1-1000 cópias.
  9. 9 - Célula de HAK, de acordo com a reivindicação 8, carac66 866
    SKB CASE 14517
    -15terizada por o promotor na unidade de expressão do gene tPA ser derivado de um gene para metalotioneína, do LTR de MMTV, do pro motor anterior ou posterior de SV4O, do 1TR dos vírus HTIiV ou do IiTR. do vírus do sarcoma Rous.
  10. 10 - Célula de HAK, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por a unidade de expressão do gene tPA compreender o promotor anterior de SV40 e a região de poliadenilação anterior de SV40 ou de BGH.
  11. 11 - Célula de HAK, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser uma célula de HAK 2,8.
  12. 12 - Processo para a preparação de uma cultura de células para a produção de tPA, caracterizado por compreender a transfecção de uma célula de HAK com uma unidade de expressão do gene tPA, e a selecção e a propagação dos transfectantes que produzem tPA.
  13. 13 - Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a célula de HAK ser transfectada com um plasmídeo ca paz de manutenção epissomal na célula hospedeira em 1 a 1000 cé pias.
  14. 14 - Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o plasmídeo compreender funções de manutenção virai.
  15. 15 - Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o promotor na unidade de expressão do gene ser derivado de um gene para metalotioneína, do LTR de MKJV, do promotor anterior ou posterior de SV40 ou do BTR dos vírus HTLV.
  16. 16 - Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por as funções de manutenção do plasmídeo serem derivadas de BPV.
  17. 17 - Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a unidade de expressão do gene tPA compreender o pro motor anterior de SV40 e a região de poliadenilação anterior de SV40 ou de BGH.
  18. 18 - Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracte66 866
    SKB CASE 14517
    -16rizado por compreender a transfecção da célula de HAK de tal mo do que a unidade de expressão do gene tPA seja integrada no genoma da célula hospedeira.
  19. 19 - Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por compreender a amplificação do número de cópias de expressão do gene tPA até cerca de 1000.
  20. 20 - Processo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o promotor na unidade de expressão do gene tPA ser derivado de um gene para metalotioneína, do LTR de NMTV, do pro motor anterior ou posterior de SV40 ou do LTR dos vírus HTLV.
  21. 21 - Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por a unidade de expressão do gene tPA compreender o pro motor anterior de SV40 e a região de poliadenilação anterior de SV40 ou de BGH.
  22. 22 - Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a célula de HAK resultante ser uma célula de HAK 2,8.
    25 - Processo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por compreender a amplificação da unidade de expressão do gene tPA pela sua co-transfecção com uma função amplificável.
  23. 24 - Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por a função amplificável ser um gene para di-hidrofolato redutase, CAD ou adenosina desaminase.
PT8616287A 1986-11-21 1987-11-18 Expressao de proteina recombinante PT86162B (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US91421586A 1986-11-21 1986-11-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PT86162A PT86162A (en) 1987-12-01
PT86162B true PT86162B (pt) 1990-11-20

Family

ID=25434053

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT8616287A PT86162B (pt) 1986-11-21 1987-11-18 Expressao de proteina recombinante

Country Status (2)

Country Link
EP (1) EP0269382A1 (pt)
PT (1) PT86162B (pt)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5108909A (en) * 1985-03-22 1992-04-28 Chiron Corporation Expression of TPA in mammalian cells
ES2031826T3 (es) * 1985-12-23 1993-01-01 Chiron Corporation Procedimiento para producir nuevos peptidos activadores del plasminogeno.
AU2000268170A1 (en) * 2000-09-04 2002-03-22 Hunan Royal Biotech A cell line expressing mutant human tissue-type plasminogen activator, constructing strategy and method of expressed protein preparation

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GR79202B (pt) * 1982-05-05 1984-10-22 Genentech Inc
IE56716B1 (en) * 1983-01-19 1991-11-20 Genentech Inc Method for producing human tpa and expression vectors therefor
PT79518B (pt) * 1983-11-21 1986-12-12 Ciba Geigy Ag 54). 5 ^ig do plasmídeo pBR 322 /PHO5 Bam Rsa 637 são digeridos com a endonuclease de restrição Xbal. Apos digestão completa o DNA ê extraído com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol. 0 DNA ê redissolvido em Tris.HCl 50mM pH8,0 numa concentração de 50 p-g/nd. e ê digerido com 11 unidades de fosfatase alcalina do intestino de vitela (Boehringer), durante 1 hora a 379C. - 97 fORHjf y| A enzima ê inativada a 65 9C durante 1 hora. 0 DNA ê purificado por cromatografia de troca iõnica em DE 52 ( Whatman) e precipitação com etanol como descrito no Exemplo 9Aa. Dois oligodeoxinucleotídeos sintéticos com a formula 5’-CTAGAAGGGGTATCTTTGGATAAGA - 3' 3’- TTCCCCATAGAAACCTATTCTCTAG -5' são fosforilados individualmente nas suas extremidades 5' como descrito no Exemplo 9Ab. Os oligodeoxinacleotídeos fosforilados são misturados em quantidades equimolares . A mistura ê aquecida durante 10 min. a 759C, depois deixada arrefecer lentamente atê à temperatura ambiente e guardada a -209C. Este adaptador ê designado por adaptador C. 1 ^ig (120 pmoles) do adaptador C emparelhado e fosforilado e 5 pg (1,5 pmoles) de pBR322/ /PH05 Bam-Rsa 637 desfosforilado e cortado com Xba I são ligados em 40^1 de Tris.HCl 60mM pH 7,5, MgCl2 lOmM, DTT 5mM, ATP lmM, 1600 unidades da ligase de DNA do T4 a 159C durante 20 horas. A ligase de DNA ê inactivada durante 10 min. a 859C e o excesso de adaptadores ê removido por precipitação com isopropanol. 0 DNA ê redissolvido em H20 numa concentração de 0,25 mg/ml. Os múltiplos de adaptadores são removidos por digestão com a endonuclease de restrição BglII. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido e depois digerido com Bam HI. Os fragmentos de restrição são separados num gel de 0,6¾ de agarose de baixo ponto de fusão em Tris-borato-EDTA pH8,3. 0 fragmento Bam HI-BglII de 662 pb (derivado de fragmento Bam HI-Rsa I de 637 pb) ê localizado e removido do gel. c) Isolamento de um fragmento de vector contendo a sequência codificadora do TPA maduro ( fig. 23) 5 yig do plasmídeo p31R/SS-TPA /\ 2, são digeridos com as endonucleases de restrição Bam HI e BglII. Após digestão completo de DNA e precipitado com etanol e ressuspenso em Tris.HCl 50mM pH 8,0 numa concentração de 75 jxg /ml. Os fragmentos de DNA sao desforilados nas suas extremidades 5' por digestão com 1 unidade de fosfatase alcalina de intestino de vitela ( Boehringer) em 60 de Tris.HCl 50mM pH 8,0 durante 1 hora a 379 C. A fosfatase ê inactivada por incubação a 659C durante 1,5 horas. 0 DNA é purificado por cromatografia de troca iónica em DE-52 (Whatman) como descrito no Exemplo 9Aa. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido em Tris-HCl lOmM, pH8,0 e aplicada num gel de 0,6 °'o de agarose de ponto de fusão baixo. 0 fragmento maior Bam HI -BglII de 5,2 kb ê removido do gel. d) Ligação dos fragmentos de DNA isolados e transformação de E.coli HB 101 (cf. figs 23 e 24 ). Dois blocos de gel de agarose de ponto de fusão baixo contendo 0,1 pmoles do fragmento Bam HIBglII de 5,2 kb de p31R/SS-TPA/\ 2 e 0,2 pmoles do fragmen to BamHI -BglII de 662 pb de pBR322/PHO5 Bam-Rsa 637, respectivamente, são misturados, liquefeitos a 659C e diluídos para baixar a concentração de agarose para 0,3¾. A ligação ê feita em 150^1 de Tris.HCl 60mM, pH 7,5; MgCl^ lOmM, 99 jr £ DTT 5mM, ATP ImM e 800 unidades de ligase de DNA do T4 (Biolabs) a 159C durante 16 horas. Amostras de 10 ^il e 30 yjl são misturadas com 100 p.1 de células E.coliHB 101 competentes para a transformação como descrito no Exemplo 4a. - R 6 colonias transformadas amp são crescidas individualmente em meio LB contendo 100 ^g/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo ê analisado quanto ao tamanho e orientação da invenção por corte com a endonuclease de restrição Bam Hl. Um único clone com a orientação correcta da inserção é designado por p31/PHO5 637-TPA (cf. fig. 23). 0 plasmídeo pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 pode também ser substituído por pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 595, pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 811 e pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 1312 . Seguindo o processo descrito atras são isolados clones únicos com inserções do tamanho e orientação esperados e designados por p31/PHO5 595C-TPA, p51/PHO5 811C-TPA e p31/PHO5 1312 C-TPA. 0 adaptador C pode também ser substituído pelo adaptador B com a seguinte férmula 5' -CTAGATAAGAGATCTGC -3’ 3’ TATTCTCTAGACG -5' o qual codifica Lis -Arg na construção final (fig. 24). A fosforilação dos oligodeoxinucleotídeos sintéticos e emparelhamento são como descrito para o adaptador C. Para a adição do adaptador 5 de pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 cortado com Xba I são digeridos com 2 unidades de nuclease (Sigma) em 50 yjl de acetato de sédio 30mM pH 4,6, NaCI 200mM e ZnSO^ ImM durante 40 min. a 379C para criar extremidades cerses (ver fig.23). Apos extração com fenol clorofórmio o DNA ê precipitado com etanol e redissolvido em H^O numa concentração de 0,25 mg/ml. 0,4 ^g (120 pmoles) de adaptador A fosforilado e emparelhado e 5 ^ig (1,5 pmoles) de pBR 322/PHO5 Bam -Rsa 637 cortado com Xba I /S^ são ligados através das extremidades cerses como descrito para o adaptador C exceptuando a utilização de ATP 3,5 mM. As outras construções são como descrito atras. Os clones resultantes são identificado pela letra A e referidos como p31/PHO5 595A-TPA, p31/PHO5 637A-TPA, p31/PHO5 811A-TPA e p31/PHO5 1312 A-TPA. Exemplo 16: Subclonagem de construção genética no vector de levedura de elevado numero de copias pJDB2O7 e transformação de S. cerevisiae GRF18 As construções descritas nos Exemplos 13-19 contêm o promotor de PH05 com ou sem extensões para a região codificadora do gene de PH05 . A região codificadora do TPA com ou sem prepo-sequência e os sinais de terminação da transcrição de PH05 num arranjo tendem, tudo inserido num vector derivado do pBR 322. Os fragmentos Bam HI-HIND III contendo todo o arranjo são ligados ao fragmento Bam Hl -Hind III de 6,4 kb do pJDB 207 como descrito para uma reacção analoga no Exemplo 10. Células E.coli HB101 competentes são transformadas e vãrias colonias amp^ de cada experiência são crescidas individualmente em meio LB com 100 ^ig/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídio é analisado por corte com as endonucleases de restrição Hind III, Bam Hl e Pst I. Partindo dos plasmídeos p31/PHO5-TPA 18, ρ31 /PHO5-TPA 42, p31R/SS-TPA /\ 2, p31R/SS-TPA/\ 3, Ρ31/ΡΗΟ5 595C-TPA, p31/PHO5 637C-TPA,’ p31/PHO5 811C-TPA, P31/PHO5 1312C-TPA, p31/PHO5 595B-TPA, p31/PHO5 637-TPA, P31/PHO5 811 B-TPA, p31/PHO5 1312 B-TPA, p31/PHO5 595 A-TPA P31/PHO5 637-TPA, p31/PHO5 811-A-TPA e p31/PHO5 1312A-TPA obtem-se os clones que se seguem com as inserções correctas PJDB2O7/PHO5-TPA18 PJDB2O7/PHO5-TPA42 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 2 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 3 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA PJDB2O7/PHO5 637C-TPA PJDB2O7/PHO5 811C-TPA PJDB2O7/PHO5 1312C-TPA PJDB2O7/PHO5 595B-TPA PJDB207/PH05 637B-TPA pJDB2O7/PHO5 811B-TPA PJDB2O7/PHO5 1312B-TPA pJDB2O7/PHO5 595A-TPA PJDB2O7/PHO5 637A-TPA PJDB2O7/PHO5 811A-TPA PJDB2O7/PHO5 1312A-TPA . Estes plasmídeos são introduzidos individualmente em Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 como descrito no Exemplo 11. Uma única colónia de levedura de cada uma das transformações de levedura ê picked. Os clones obtidos são designados por . Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2Ò7/PHO5-TPA18 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA42 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7R/PHO5-SS-TPA/\ 2 Sacchãtúiuycea cerevisíae GRFi8/pJD32O7R/?HO5~SS-TPA /\ 3 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312B-TPA As células de levedura são crescidas colhidas e extraídas como descrito nos Exemplos 11 e 12. A actividade de TPA nos extractos celulares é testado como descrito no Exemplo 12. Os resultados estão apresen tados na tabela 3. Tabela 3: Actividade de TPA da estirpe de levedura Saccharomyces cerevisiae GRF18 transformada com diferentes plasmídeos e testada em condições de desrepressão (Pi baixo) : plasmídeo Actividade de TPA(unidades/l de cultura de células de levedura/ OD^qq) PJDB2O7/PHO5-TPA18 750 PJDB2O7/PHO5-TPA42 700 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA_A 2 600 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA 3 650 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA 900 Exemplo 17: Substituição cromossómica do gene de PHO5 pelo gene do TPA (ver fig.25) A região codificadora da proteína TPA ê colocada no cromossoma II de levedura na posição da região codificadora da proteína PH05 . Experimentálmente isto ê con seguido por cotransformação. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 ê cotransformada com 25 ^ig do plasmídeo p31/PHO5 -TPA 18, linearizado com BnmHI e Hind III, e 3 ^xg do plasmídeo de levedura Yepl3 (51). De 24 colónias Leu obtidas, uma ê Pho5 e ao mesmo tempo produz aproximadamente 35 unidades de TPA/1 de cultura de células de levedura /0D600. Por crescimento deste transformante num meio contendo leucina (YPD, 10g/l de Bacto Yeast Extract, 20g/l de Bacto Peptone, 20 g/l de glucose) durante 10 gerações, segregantes Leu~são obtidos com uma frequência de 10-20¾ os quais provavelmente perderam o plasmideo Yep31. Por análise ou Southern do DNA total de levedura isolado dos segregantes Leu (52) verifica-se que no nível de DNA que as sequências codificadoras da proteína TPA substituem as sequências codificadores da proteína PH05 deixando inal. teradas as sequências ladeantes do cromossoma II. Seleccionou-se uma estirpe que se designou por Saccharomyces cerevisiae GRF 18 (pho-5-ΤΡΑ)♦ Exemplo 18: Melhoramento de estirpe por mutação A estirpe Saccharomyces cerevisiae GRF18 /pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) é ainda desenvolvida para produção de TPA por mutação e selecção de baixa actividade de fosfatase ácida. Saccharomyces cerevisiae H2 4 3/pJDB 20 7/ /PH05 -TPA (IA) um mutante termo-sensível de Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5 TPA (IA) ê obtido por irra_2 diação com UV (0,08 yiWcm , 15 segundos, 99,2¾ de morte). As colónias são crescidas em meio YPD osmc ticamente estabilizado contendo sorbitol 1,2M (10 g/l de Bacto Yeast Extract, 20 g/l de Bacto Peptone, 20g/l de glucose, 20 g/l de agar Bacto) e transferidas para meio YPD sem sorbitol. Saccharomyces cerevisiae H243 ê isolada como colónia de crescimento lento. Cerca de 10$ células de Saccharomyces cerevisiae H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA (IA) são semeadas em agar YNB (6,8 1 de yeast Nitrogen Base sem aminoãcidos ; 20 g/1 de glucose, 20 g/1 de agar Bacto, suplementado com 20 mg/1 de histidina) e são irradiadas directamente com UV (0,08 -2 uWcm durante 12 segundos). A morte e de 98¾. As colonias obtidas a partir das células sobreviventes são transferidas para meio de Pi baixo e dois dias depois coradas para a actividade de fosfatase acida por um teste de sobrecamada de agar mole (48). Os mutantes negativos para a fosfatase _4 acida são obtidos com uma frequência de mutaçao de 3,2x10 . A estirpe com o título de TPA mais elevado é seleccionado e referido como Saccharomyces cerevisiae H423/pJDB2O7/PHO5-TPA (IA). As actividades de TPA de tres estirpes diferentes de levedura transformadas com pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) estão apresentadas na Tabela 4. Tabela 4: Actividade de TPA de diferentes estirpes de Saccharomyces cerevisiae transformadas em condi ções de desrepressão (Pi baixo) Actividade de TPA (unidades/1 de cultura de células de levedura /OD^qq) GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) 625 H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 1560 H423/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 7200 • 1 Exemplo 19 : Produção de TPA por uma estirpe recombinante da levedura Saccharomyces cerevisiae numa escala de 30 1. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) possui um plasmídeo que inclui uma marca para leucina permitindo manutenção selectiva do plasmídeo no organismo hospedeiro, um gene estrutural para o TPA humano e o promotor da fosfatase acida PH05 que permite a expressão do gene do TPA em meios com quantidades limitativas de fosfato inorgânico (condições de desrepressão). A estirpe ê mantida em culturas de agar inclinado preparadas com um meio definido sem o aminoãcido leucina para assegurar a retenção do plasmídeo. Agar recentemente inoculado e incubado durante 24 horas a 30?C. A cultura â superfície de um dos agares inclinados ê ressuspensa em 3ml de meio de pre-cultura o qual ê então transferido para o primeiro balão de pre-cultura com agitação. 0 balão de 500 ml tem uma unica saída e contem 100 ml de meio I de pre-cultura tendo o seguinte composição ( valoreq em g/1). L-asparagina, 2,0; L-histidina, 0,02 glucose, 10 ; Kt^PO^, 1,0 ; MgSO4· 7H2O, 0,5 ; NaCl 0,1 ; CaCl2~2H2O, 0,1 ; solução de vitaminas 5 jil/1 e solução de micronutriantes 5 ml/1. 0 meio e ajustado a pH7,2 usando NaOH antes da esterilização . A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados à parte e adicionados ao meio. As soluções &quot;stock” de vitaminas e micronutrientes têm as seguintes composições (em g/1): Vitaminas - biotina, 0,0002; D-pantotenato de cãlcio , 0,04 ; acido fõlico, 0,0002; acido micotínico, 0,04 ; acido p-aminobenzõico, 0,02 ; hidrocloreto de piridoxina, 0,04; riboflãvina, 0,02 ; hidrocloreto de tiamina, 0,04; e inositol 0,2 em 1 1 de agua desionizada ; micronutrientes - acido bórico 0,05 ; CuSO &quot;^H 0, 0,004 ; Kl, 0,01; FeCl^.óH^O, 0,02 ; MnSO^, 0,04 ; NaMoO^. 2^0, 0,02 e ZnSO^.71^0, 0,04 em 1 1 de agua desionizada. 0 meio ê preparado usando agua desionizada. A primeira pré-cultura é incubada durante 24 horas a 309C num agitador orbitol com 5cm de excentricidade a uma velocidade de 250 rev/min. Os balões com a primeira pré-cultura constituem o inoculo para os balões da segunda pré-cultura. Estes balões recebem um inoculo de 1¾ (v/v). Eles contem 100 ml de meio II de pré-cultura tendo a seguinte composição (mg/1): Extracto de levedura (Difco), 10,0 ; L-asparagina, 6,6; Κ^ΡΟ^ 1.0 ; MgSO^.7H2O, 1,0 ; L-histidina, 0,02 e D-glucose (mono-hidrato) , 33,0. 0 meio que ê preparado usando agua desionizada tem um pH de aproximadamente 6,0. A glucose é esterilizada separadamente. As condições de incubação são idênticas âs da primeira pré-cultura. 0 caldo de cultura de 3 balões ê combinado para dar um inoculo a 1¾ v/v para o fermentador principal de produção. 0 fermentador de produção tem um volume total de aproximadamente 45 1, contem 4 saliências e um agitador de turbina de disco de seis lâminas com um diâmetro de 115 mm. A velocidade de agitação é de 600 rev/min, a sobrepressão de 0,3 bar e uma velocidade de arejamento de 0,5 vol/vol/min. * ,· Η Ο fermentador contem 30 1 de um meio com as composições seguintes: (valores em g/1): L-asparagina, 2,0 ; L-histidina, 0,02 ; Kí^PO^, 0,03; MgSO^. 71^0, 0,5; NaCl, 0,1, CaCl2.2H2O, 0,1 ; KC1, ip ; D-glucose (mono -hidrato) , 20,0 ; solução de vitaminas 5 ml/1 e solução micronutrientes, 5ml/l. 0 meio ê ajustado pH 7,2 usando NaOH antes da esterilização. A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados separadamente e adicionados ao meio. As soluções &quot;stock&quot; de vitaminas e micronutrientes têm composição idêntica às descritas para o meio I de prê-cultura. A temperatura de fermentação ê de 309C. 0 pH desce para 5,0 onde ê controlado usando NaOH. Apos fermentação durante cerca de 20 horas atinge-se a produção máxima de TPA. A densidade óptica que atinge 2-3 unidades e a actividade de fosfatase ácida dão indicações uteis àcer ca do progresso da fermentação. 0 calor de fermentação ê arrefecido para 109C antes da colheita das células de levedura. Exemplo 20: Recuperação e purificação do TPA e pro-TPA por cromatografia com anticorpos monoclonais anti-TPA a) Preparação de extractos celulares 0 líquido de cultura (pH4) dos 30 1 de fermentação (cf.Exemplo 19) é arrefecido atê 109C e centrifugado usando uma centrífuga Alfa-Laval BRPX-207. As células separadas são ressuspensas em 21 de tampão de lise A ( NaH2P04 20mM, f^HPO^ 80mM, NaCl 150 mM, 0,01¾ de Tween, Benzamidina lOmM e EDTA lOmM). • 1 ί »» A solução é arrefecida atê 59C e passa da através de um moinho Dyno (tipo KDL-Pilot) com uma velocidade de alimentação de 101/h. 0 moinho estã equipado com 500 ml de pérolas de vidro de 0,5 -0,75 m de diâmetro e ê ligado a 3000 rev/min. Antes da adição das pérolas de vidro às células em suspensão aquelas são lavadas com 300 ml de tampão de lise A contendo 30 mg de BSA. A suspensão de células ê centrifugada ( rotor Sorvall 653, 40 min. 9000 rpm) e o sedimento rejeitado. b) Digestão do DNA^e fraccionamento com sulfato de amonio Adiciona-se 5 mg de DNAse a 2 1 da suspensão clarificada e a mistura ê agitada durante 30 min. a 49C. Subsequentemente a solução é levada a 35¾ de saturação com (NH^^SO^ (p/v) e ê agitada durante 1 hora a 49C. A solução ê centrifugada como descrito atrãs e o sedimento contendo toda a actividade de TPA ê ressuspensa em 1 1 de tampão H contendo 1¾ de Tween e 0,1¾ de SDS. A suspensão ê agitada durante pelo menos 1 hora a 49C. c) Cromatografia de imunoafinidade I) Purificação do anticorpo anti-TPA 5 ml de soro de coelho, anti -TPA (oferecido pelo Dr. E. Reich, Friedrich -Miescher-Institut Basel) são passados por uma coluna de sefarose com lisina para renovar o plasminogenio de soro. A coluna ê lavada com 1-2 volumes de PB5 pH 7,4 contendo NaCl 100 mM, KCI 2,7 mM, Na2HP04 8,lmM e KH2PO4 1,5 mM. $ rf* « « Ο líquido da coluna e de lavagens são juntos. 0 anti-soro sem plasminogênio é precipitado pela adição de (NH^)2SO^ sólido para uma concentração final de 50¾ (p/v). A solução ê mantida durante a noite a 4?C e em seguida centrifugada ( rotor Sorvall GSA,1200 rpm, 20 min.) . 0 precipitado e dissolvido num peque no volume de PB5 e dializado contra PBS contendo 0,1 ¾ de NaNj. A IgG desta solução dializada e purificada numa coluna de proteína A -sefarose (55). II) Preparação de uma coluna com anticorpo anti-TPA 13 mg de anticorpo anti-TPA purificado são dializados contra MOPS 0,1 M pH7,0. 0 anticorpo e ligado a 5 ml de Affigel 10 activado ( Biorad ) segundo as instruções do fabricante. A matrix do gel ó equilibrada com PBS contendo 1¾ de Tween 80, 0,1¾ de SDS, NaCl 0,2M, Benzamidin lOmM e 0,1¾ de NaN^. A matrix e aplicada numa coluna de 5 ml. III) Purificação de TPA por cromatografia de imunoafinidade. 0 sedimento redissolvido do fraccionamento com sulfato de amónio ê centrifugado para remover o material insolúvel ( rotor Sorvall GSA, 30 min. 12000rpm) e subsequentemente aplicado â coluna de afinidade a uma ve locidade de fluxo de cerca de lOml/hr a 49C. Depois de todo o volume ter passado através da coluna esta ê lavada com 10 volumes da coluna de PBS contendo 0,05¾. de Tween 80. A coluna ê eluída usando glicina-ΗΟΙΟ,ΙΜ pH2,5 contendo 0,1 ¾ de Tween. São colhidas fracções de 2 ml e testados para a actividade de TPA segundo o método de Rânby (49). Como substracto usa-se D-Val-Leu-Lis -pNA (Kabi -S-2251). As fracções com actividades mais elevadas são reunidas, neutralizadas usando Tris IM e concentradas por ultrafiltração usando uma membrana Amicon YM10. 0 TPA assim obtido apresenta cerca de 90¾ de pureza e estã predominantemente em forma de cadeia unica ( pro-TPA) como evidenciado por SDS-PAGE em condições de redução. 0 peso molecular aparente em condições não redutoras ê de cerca de 60 000 por SDS -PAGE (ver figura A). Figuras A e B : electroforese em gel de poliacrilamida-SDS do produto do gene TPA em levedura (Figura A) e a sua actividade enzimãtica num gel de actividade (placas com caseína) ( figura B). B:gel de actividade A:gel com SDS ad figura A (SDS-PAGE): Faixas 1 e 4 : proteínas padrão (marcadores de peso molecular) Faixas 2 e 5 : TPA de melanoma Faixas 3 e 6 : TPA de levedura Faixas 1 - 3 : em condições de redução Faixas 4 - 6 : em condições de não-redução As amostras correram num gel de 12,5¾ que se corou para proteínas usando azul Coomassie brilhante. ad. figura B (gel de actividade, cf. Exemplo 23): Faixa 1 : TPA de melanoma Faixa 2 : TPA de levedura Sobre-camada para plasminogénio de agar com caseira (referência 56) . Exemplo 21: Recuperação e purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia de afinidade com DE-3 a. Preparação de uma coluna de DE-3 Sepharosé 26 mg do inibidor DE-3 purificado a partir de Erythrina latíssima (16) são acoplados a 5 ml de Sepharose 4b ® activada com brometo de cianogênio (Pharmacia) segundo as instruções do fabricante. A matrix ê equilibrada com tampão fosfato salino (&quot;PBS&quot;) pH 7,4 contendo NaCl 0,4M, 0,1¾ de Triton X-100R e 0,02¾ de azida de sódio. A matrix ê então acamada numa coluna de 5 ml. b. Purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia em DE-3 R Sepharose 4b Os extractos celulares (cf. Exemplo 20a) são tornados 0,4 M relativamente a NaCl e 0,1¾ para Triton X-lOCr^ e filtrados através de uma membrana de 0,45 ^im (Millipore). A solução ê então aplicada à coluna de DE-3 Sepharose (ver atras) a uma velocidade de fluxo de 45ml/hr â temperatura ambiente e o efluente ê rejeitado. Depois do volume total do extracto ter passado através da coluna esta ê lavada com cerca de 50 ml de PB5 contendo NaCl 0,4 M e 0,1 ¾ de Triton X-lOO*' sendo colhidos fracções de 2 ml a 49C. 0 conteúdo protêico de cada fracção ê determinado por medição da absorvância de UV a 280nm. A proteína adsorvida verificou-se ser eluída como um pico bem definido. As fracções contendo os valores mais elevados de absorvância de UV e de activida125 de fibrinolítica determinada pelo teste da I fibrina (47) são reunidas dando 8 ml de solução que se guardou a -209 C. Isto representa aproximadamente 70-80¾ da actividade total aplicada à coluna. As fracções com as actividades »· mais baixas são reunidas separadamente. A recuperação total de actividade em ambos os conjuntos de fracções monta os 90-100¾. c). Purificação de pro-TPA por cromatografia em DE-3 Sepharose 4b® na presença de um inibidor de proteíases. A cromatografia dos extractos de células de levedura ê feita de modo semelhante ao descrito no Exemplo 21b exceptuando a inclusão neste caso do inibidor de tripsina pancreãtica bãsica (BPTI) a 0,1 KlU/ml usando o teste fluorimétrico como Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC como substracto (37) determinou-se o conteúdo em TPA e pro-TPA da solução purificada. 90¾ do TPA estã na forma de pro-enzima e 10¾ na forma activa. Assim, a conversão de pro-TPA em TPA durante o processo de purificação é inibido pelo BPTI. Exemplo 22: Separação de pro-TPA do TPA A solução de TPA e pro-TPA obtida como descrito no Exemplo 21c e ajustada a pH8,0 com Tris.HCl O,1M contendo 0,1¾ de Triton X-lOcP e tornado lmM relativamente ao diisopropilfluorofosfato. Apos incubação a 37?C durante 4 horas, a mistura ê passada através de uma coluna de 5 ml de DE-3 Sepharose® (cf. Exemplo 21a). 0 efluente contendo o TPA irreversivelmente inibido é rejeitado. A coluna e lavada com 6 volumes de coluna de PBS contendo NaCl 0,4 M e 0,1¾ de Triton X-IOC^ e subsequentemente eluída com PB5 contendo K SCN 1,6M, NaCl 0,4M e 0,1¾ de Triton X-10C^ como descrito no Exemplo 21b . As fracções apresentando as absorvân. 1 s· P0RWI « ? » ... Ή , - - - , __. «τ'. cias de UV mais elevadas são reunidas. 0 conjunto de fracções contem pro-TPA numa forma substancialmente pura uma vez que não se detecta actividade amidolítica no teste fluorimêtrico usando Cbz-Gli-Gli-Arg-AMC (37) como substrato. A actividade amidolítica assim como a fibrinolítica pode ser restabelecida por tratamento com plasmina a qual converte pro-TPA em enzima activa. Exemplo 23: Propriedades do produto do gene TPA em levedura a. Propriedades enzimãticas 0 produto do gene TPA em levedura obtido segundo o Exemplo 19 e purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 (cf. Exemplo 21b) ê enzimãticamente activo como se mostra por clivagem de plasminogênio zimogênio em plasmina na ausência e na presença de fibrina. A actividade enzimãtica pode ser verificada pelos testes colorimêtricos descritos por Ranby (49) (cf. Exemplo 12) e por Verheijen et al. (60) , em placas de caseína e de fibrina (56) e num teste de fase solida com 12 9 I - fibrinogenio ( 47). A actividade enzimãtica em placas de caseína ê mostrada na figura B ( cf. Exemplo 20 c III). A actividade enzimãtica do TPA obtido ê grandemente estimulada pela fibrina. 0 TPA parcialmente purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 ê testado num teste de velocidade parabólica (cf. Ranby (49)). Tomando a velocidade reacção Δ E versus Δ t^ entre e 5 minutos como uma medida da actividade enzimãtica a estimulação por concentração óptimas de fibrina ê de 10-20 vezes ( ca. 100 yig /ml) . 0 efeito pode ser observado com fragmentos de fibrina obtidos por digestão com CnBr
EP0173552B1 (en) * 1984-08-24 1991-10-09 The Upjohn Company Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa
AU593264B2 (en) * 1985-07-10 1990-02-08 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Chromosomal DNA sequence, expression vector for human tissue plasminogen activating factor, cultured cells transfected with same and method of producing said activating factor

Also Published As

Publication number Publication date
EP0269382A1 (en) 1988-06-01
PT86162A (en) 1987-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100496111B1 (ko) 단백질을 함유하지 않는 배지에서의 재조합 인자ⅷ의 제조방법
US5631237A (en) Method for producing in vivo delivery of therapeutic agents via liposomes
AU593538B2 (en) Vectors and method for expression of human protein c activity
US5990279A (en) Amino-terminally truncated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
US5686278A (en) Methods for enhanced retrovirus-mediated gene transfer
US5817492A (en) Recombinant DNA viral vector for transfecting animal cells
JPS63503275A (ja) ファクター８：ｃの製造方法
JP2000505288A (ja) チミジンキナーゼ変異体、対応する核酸配列および遺伝子治療におけるそれらの用途
CN101041819A (zh) 人红血球生成素基因在稳定转染的哺乳动物细胞中的高水平表达
ES2232950T3 (es) Vectores adenoviricos recombinantes que comprenden una secuencia de empalme.
US5422250A (en) Process for the preparation of human factor VIII and analogs of factor VIII
Watanabe et al. Change of DNA near the origin of replication enhances the transforming capacity of human papovavirus BK
JPH06343477A (ja) 医薬的および診断的使用のための組み換えフオーミーウイルスベクター、および組み換えフオーミーウイルスベクターの作製方法
PT86162B (pt) Expressao de proteina recombinante
JPH022376A (ja) 酵素前駆体型ヒトプロテインｃの発現のためのベクターおよび化合物
CN114941013A (zh) 重组间充质干细胞治疗糖尿病肺炎
JP2706260B2 (ja) ドロソフィラ細胞における外来性遺伝子の発現
PT981537E (pt) &#39;&#39;clone infeccioso para o vírus parainfluenza humano de tipo 3&#39;&#39;
PT86383B (pt) Processo de preparacao de um activador de plasminogenio e de composicoes farmaceuticas que os contem
AU754272B2 (en) Adenoviral transfer vector for the gene transport of a DNA sequence
RU2046827C1 (ru) Способ получения активатора плазминогена тканевого типа, штамм культивируемых клеток животных сно-продуцент активатора плазминогена тканевого типа
JP5851410B2 (ja) 組換えビタミンｋ依存性タンパク質の生成法
Yamaoka et al. Mammalian lectin as transforming growth factor
CN114941012A (zh) 重组间充质干细胞及其应用
JPS6232896A (ja) 有用たん白質の産生方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM3A Annulment or lapse

Free format text: LAPSE DUE TO NON-PAYMENT OF FEES

Effective date: 19911002