JP2706260B2 - ドロソフィラ細胞における外来性遺伝子の発現 - Google Patents
ドロソフィラ細胞における外来性遺伝子の発現Info
- Publication number
- JP2706260B2 JP2706260B2 JP63111390A JP11139088A JP2706260B2 JP 2706260 B2 JP2706260 B2 JP 2706260B2 JP 63111390 A JP63111390 A JP 63111390A JP 11139088 A JP11139088 A JP 11139088A JP 2706260 B2 JP2706260 B2 JP 2706260B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tpa
- cells
- drosophila
- vector
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 title claims abstract description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 39
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 claims description 17
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 claims description 11
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical group C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 claims description 10
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 claims description 10
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 claims 2
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 claims 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 abstract description 82
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 abstract description 82
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 abstract description 79
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 101
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 38
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- 101150010939 tpa gene Proteins 0.000 description 16
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 15
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 9
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 8
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 101100507655 Canis lupus familiaris HSPA1 gene Proteins 0.000 description 5
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 5
- 108700023157 Galactokinases Proteins 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 4
- 108700020490 Drosophila S Proteins 0.000 description 3
- 101001091269 Escherichia coli Hygromycin-B 4-O-kinase Proteins 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 101001091268 Streptomyces hygroscopicus Hygromycin-B 7''-O-kinase Proteins 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 3
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 101000801481 Homo sapiens Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 2
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical group [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YKYOUMDCQGMQQO-UHFFFAOYSA-L cadmium dichloride Chemical compound Cl[Cd]Cl YKYOUMDCQGMQQO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- SPBDXSGPUHCETR-JFUDTMANSA-N 8883yp2r6d Chemical compound O1[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](OC)C[C@H](O[C@@H]2C(=C/C[C@@H]3C[C@@H](C[C@@]4(O[C@@H]([C@@H](C)CC4)C(C)C)O3)OC(=O)[C@@H]3C=C(C)[C@@H](O)[C@H]4OC\C([C@@]34O)=C/C=C/[C@@H]2C)/C)O[C@H]1C.C1C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@@]21O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]1O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C1)[C@@H](C)\C=C\C=C/1[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\1)O)C[C@H]4C2 SPBDXSGPUHCETR-JFUDTMANSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000048120 Galactokinases Human genes 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- -1 lymphokine Proteins 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N phenanthrene-3,4-diol Chemical compound C1=CC=C2C3=C(O)C(O)=CC=C3C=CC2=C1 RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
- C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
- C07K16/1063—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV env, e.g. gp41, gp110/120, gp160, V3, PND, CD4 binding site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/90—Vectors containing a transposable element
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/75—Vector systems having a special element relevant for transcription from invertebrates
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Oncology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、ドロソフィラ細胞における外来性遺伝子の
発現方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ドロソ
フィラ細胞における組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー（tPA）の高水準の発現についての方法および該発現
遺伝子産生物の精製に関する。
発現方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、ドロソ
フィラ細胞における組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー（tPA）の高水準の発現についての方法および該発現
遺伝子産生物の精製に関する。
発明の背景 ヒトtPAは、約70000ダルトンの糖タンパク質および52
7アミノ酸である。それは種々のヒト組織により分泌さ
れ、通常、血清中に存在する。tPAは、プラスミノーゲ
ンをプラスミンに変換することにより血餅溶解の作用を
する。tPAはフィブリンに対して親和性を有し、かつ、
フィブリンの存在下により活性である。したがって、tP
Aは、深静脈血栓、急性心筋梗塞および肺塞栓症のよう
な血栓形成に関連する疾患の治療に有用である。通常、
レイケンら、バイオヒミカ・エ・バイオフィジカ、アク
タ（Rijken et al.,Biochem.Biophys.Acta）．580,140
（1979）、ベタラインら、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（Vetterlein et al.,J.Biol.Che
m.），254,575（1979）、レイケンら、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー，256,7035（1981）
およびマツオら、ネイチャー（Matsuo et al.,Natur
e），291,590（1981）参照。
7アミノ酸である。それは種々のヒト組織により分泌さ
れ、通常、血清中に存在する。tPAは、プラスミノーゲ
ンをプラスミンに変換することにより血餅溶解の作用を
する。tPAはフィブリンに対して親和性を有し、かつ、
フィブリンの存在下により活性である。したがって、tP
Aは、深静脈血栓、急性心筋梗塞および肺塞栓症のよう
な血栓形成に関連する疾患の治療に有用である。通常、
レイケンら、バイオヒミカ・エ・バイオフィジカ、アク
タ（Rijken et al.,Biochem.Biophys.Acta）．580,140
（1979）、ベタラインら、ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（Vetterlein et al.,J.Biol.Che
m.），254,575（1979）、レイケンら、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー，256,7035（1981）
およびマツオら、ネイチャー（Matsuo et al.,Natur
e），291,590（1981）参照。
tPAは、ボウズ（Buwes）メラノーマ細胞株を含むある
種の細胞株により過剰生産される。例えば、ウイルソン
ら、キャンサー・リサーチ（Wilson et al.,Canc.Re
s.）40,933（1980）参照。コレンら、ヨーロッパ特許出
願（EP−Ａ）第41766号は、ボウズメラノーマ由来tPAの
精製を開示している。ウイルソン、ヨーロッパ特許出願
（EP−Ａ）第113319号は、血清独立ボウズメラノーマ細
胞株を用いたtPAの産生および精製を開示している。ブ
ルーティーボイエ，バイオ／テクノロジー（Brouty−Bo
ye,Bio/Technology）、1984年12月、1058頁は、ヒト胚
肺細胞によるtPAの産生を報告している。シュロイニン
グら（Schleuning et al.），スイス国ローザンヌの第
６回インターナショナル・カンファレンス・オブ・フィ
ブリノリシス（Sixth Int′l Conf.Fibrinolysis,Lausa
ne,Switzerland）、要約、1982年７月22〜23日は、ヒー
ラー細胞によるtPAの産生を報告している。
種の細胞株により過剰生産される。例えば、ウイルソン
ら、キャンサー・リサーチ（Wilson et al.,Canc.Re
s.）40,933（1980）参照。コレンら、ヨーロッパ特許出
願（EP−Ａ）第41766号は、ボウズメラノーマ由来tPAの
精製を開示している。ウイルソン、ヨーロッパ特許出願
（EP−Ａ）第113319号は、血清独立ボウズメラノーマ細
胞株を用いたtPAの産生および精製を開示している。ブ
ルーティーボイエ，バイオ／テクノロジー（Brouty−Bo
ye,Bio/Technology）、1984年12月、1058頁は、ヒト胚
肺細胞によるtPAの産生を報告している。シュロイニン
グら（Schleuning et al.），スイス国ローザンヌの第
６回インターナショナル・カンファレンス・オブ・フィ
ブリノリシス（Sixth Int′l Conf.Fibrinolysis,Lausa
ne,Switzerland）、要約、1982年７月22〜23日は、ヒー
ラー細胞によるtPAの産生を報告している。
tPAは、また、組換え体DNA法により調製できる。tPA
についてのmRNAの単離は、例えば、オプデナッカーら、
ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（Opdenakker et al.,Eur.J.Biochem.），121,269（198
2）により開示されている。tPAの一部についてのcDNAの
単離は、エドランドら、プロシーディングス．オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オ
ブ・ユー・エス・エー（Edlund et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA），80,349（1983）により開示されている。
イー・コリーにおけるtPAについてのcDNAのクローニン
グは、ペニカら（Pennica et al.），ネイチャー．301,
214（1983）により報告されている。通常の組換え体DNA
法の適用によるイー・コリおよびチャイニーズハムスタ
ー卵巣細胞におけるtPAについてのcDNAのクローニング
は、ゲデルら（Goeddel et al.）EP−Ａ−93619および
レビンソンら（Levinson et al.）、EP−Ａ−117059に
より開示されている。ゴールドベルグら（Goldberg et
al.）、PCT特許出願WO85−03949は、イー・コリにおけ
るtPAの発現を開示している。メイハックら（Mayhack e
t al.）、EP−Ａ−143081は、酵母におけるtPAの発現を
開示している。ロビンソン（Robinson）、WO84−01786
は、天然tPAに存在する炭水化物部の全部または一部を
欠失した修飾tPAを開示している。
についてのmRNAの単離は、例えば、オプデナッカーら、
ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（Opdenakker et al.,Eur.J.Biochem.），121,269（198
2）により開示されている。tPAの一部についてのcDNAの
単離は、エドランドら、プロシーディングス．オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オ
ブ・ユー・エス・エー（Edlund et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA），80,349（1983）により開示されている。
イー・コリーにおけるtPAについてのcDNAのクローニン
グは、ペニカら（Pennica et al.），ネイチャー．301,
214（1983）により報告されている。通常の組換え体DNA
法の適用によるイー・コリおよびチャイニーズハムスタ
ー卵巣細胞におけるtPAについてのcDNAのクローニング
は、ゲデルら（Goeddel et al.）EP−Ａ−93619および
レビンソンら（Levinson et al.）、EP−Ａ−117059に
より開示されている。ゴールドベルグら（Goldberg et
al.）、PCT特許出願WO85−03949は、イー・コリにおけ
るtPAの発現を開示している。メイハックら（Mayhack e
t al.）、EP−Ａ−143081は、酵母におけるtPAの発現を
開示している。ロビンソン（Robinson）、WO84−01786
は、天然tPAに存在する炭水化物部の全部または一部を
欠失した修飾tPAを開示している。
安定、かつ、実験室条件下にて増殖しうるドロソフィ
ラ細胞培養の開発が報告されている。シュナイダー，ジ
ャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペ
リメンタル・モルホロジー（Schneider,J.Embryol.Exp.
Morphol.），27,353（1972）参照。特定のコーディング
配列を含有する種々のベクター系を、ドロソフィラ熱衝
撃プロモーターまたはCOPIAプロモーターの調節下にド
ロソフィラ中に挿入した、ダイノセラら（DiNocera et
al.）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ユー・エス
・エー，80,7095（1983）。より最近、該熱衝撃プロモ
ーターをコードするmRNAが高い割合でドロソフィラ細胞
にて翻訳された。マックガリーら，セル（McGarry et a
l.,Cell），42,903（1985）。
ラ細胞培養の開発が報告されている。シュナイダー，ジ
ャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペ
リメンタル・モルホロジー（Schneider,J.Embryol.Exp.
Morphol.），27,353（1972）参照。特定のコーディング
配列を含有する種々のベクター系を、ドロソフィラ熱衝
撃プロモーターまたはCOPIAプロモーターの調節下にド
ロソフィラ中に挿入した、ダイノセラら（DiNocera et
al.）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ユー・エス
・エー，80,7095（1983）。より最近、該熱衝撃プロモ
ーターをコードするmRNAが高い割合でドロソフィラ細胞
にて翻訳された。マックガリーら，セル（McGarry et a
l.,Cell），42,903（1985）。
発明の要約 本発明の１つの態様は、ドロソフィラ細胞に外来性遺
伝子を共導入し、かつ、発現するための選択系の開発に
関する。この方法の使用により、tPA遺伝子発現ユニッ
トを用いてトランスフェクションしたドロソフィラ細胞
を培養してtPAを発現し、かつ、分泌し、および分泌し
たtPAを収集することによりtPAをドロソフィラ細胞にて
産生しうる。開発した選択系を用いて重要な他の遺伝子
を共導入し、かつ、過剰発現しうる。
伝子を共導入し、かつ、発現するための選択系の開発に
関する。この方法の使用により、tPA遺伝子発現ユニッ
トを用いてトランスフェクションしたドロソフィラ細胞
を培養してtPAを発現し、かつ、分泌し、および分泌し
たtPAを収集することによりtPAをドロソフィラ細胞にて
産生しうる。開発した選択系を用いて重要な他の遺伝子
を共導入し、かつ、過剰発現しうる。
本発明のもう１つの態様は、組換え体ドロソフィラ細
胞により産生されたtPAに関する。tPAについてのDNAコ
ーディング配列またはその活性変異体ならびにドロソフ
ィラ細胞内でのtPAコーディング配列の転写およびその
後の翻訳に必要な調節要素からなることを特徴とするtP
A遺伝子発現ユニットを記載する。かくして、tPA遺伝子
産生物を細胞培地中に分泌し、収集する。
胞により産生されたtPAに関する。tPAについてのDNAコ
ーディング配列またはその活性変異体ならびにドロソフ
ィラ細胞内でのtPAコーディング配列の転写およびその
後の翻訳に必要な調節要素からなることを特徴とするtP
A遺伝子発現ユニットを記載する。かくして、tPA遺伝子
産生物を細胞培地中に分泌し、収集する。
もう１つの態様において、本発明は、該遺伝子産生物
についての遺伝子発現ユニットを含有するベクターおよ
び組込みCOPIA成分からの５′LTRおよびハイグロマイシ
ンＢホスホトランスフェラーゼまたはメトトレキセイト
耐性選択マーカー含有ベクターにてドロソフィラ細胞を
共トランスフェクションし、該遺伝子産生物が発現する
ような条件下にトランスフェクションした細胞を培養
し、かつ、該遺伝子産生物を収集することを特徴とする
方法を提供する。
についての遺伝子発現ユニットを含有するベクターおよ
び組込みCOPIA成分からの５′LTRおよびハイグロマイシ
ンＢホスホトランスフェラーゼまたはメトトレキセイト
耐性選択マーカー含有ベクターにてドロソフィラ細胞を
共トランスフェクションし、該遺伝子産生物が発現する
ような条件下にトランスフェクションした細胞を培養
し、かつ、該遺伝子産生物を収集することを特徴とする
方法を提供する。
発明の詳説 此度、高水準のtPA産生がドロソフィラ細胞培養にお
いて得られうることを見出した。該ドロソフィラ細胞
を、外来性DNAまたは宿主細胞に悪影響を及ぼすことな
く宿主細胞中に外来性DNAの導入を許容する標準クロー
ニング法を用いることによりトランスフェクションす
る。そのように構築した組換え体ドロソフィラ細胞は、
高水準にてtPAを分泌する。
いて得られうることを見出した。該ドロソフィラ細胞
を、外来性DNAまたは宿主細胞に悪影響を及ぼすことな
く宿主細胞中に外来性DNAの導入を許容する標準クロー
ニング法を用いることによりトランスフェクションす
る。そのように構築した組換え体ドロソフィラ細胞は、
高水準にてtPAを分泌する。
いずれのドロソフィラ細胞も本発明の実施に用いう
る。好ましい細胞株は、S2株である。DNAトランスフェ
クション法によるドロソフィラS2細胞中へのtPAcDNAコ
ーディング配列の導入は、予期せぬほど大量のtPAを産
生する。該S2細胞（シュナイダー，ジャーナル・オブ・
エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モル
ホロジー，27,353（1972））は、多培数胚ドロソフィラ
細胞の安定細胞培養である。S2ドロソフィラ細胞の使用
は、室温にて高密度まで増殖するその能力を含むが、そ
れらに限定されない多くの利点を有する。該選択系の安
定な組込みは、1000コピーまでのトランスフェクション
した遺伝子発現ユニットを該細胞染色体中に産生した。
他の入手可能なドロソフィラ細胞株は、S1、S3、KC−Ｏ
およびハイダイ（hydei）である。
る。好ましい細胞株は、S2株である。DNAトランスフェ
クション法によるドロソフィラS2細胞中へのtPAcDNAコ
ーディング配列の導入は、予期せぬほど大量のtPAを産
生する。該S2細胞（シュナイダー，ジャーナル・オブ・
エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モル
ホロジー，27,353（1972））は、多培数胚ドロソフィラ
細胞の安定細胞培養である。S2ドロソフィラ細胞の使用
は、室温にて高密度まで増殖するその能力を含むが、そ
れらに限定されない多くの利点を有する。該選択系の安
定な組込みは、1000コピーまでのトランスフェクション
した遺伝子発現ユニットを該細胞染色体中に産生した。
他の入手可能なドロソフィラ細胞株は、S1、S3、KC−Ｏ
およびハイダイ（hydei）である。
ドロソフィラ細胞は、例えば、M3培地を含む種々の栄
養培地にて培養しうる。M3培地は、6.6のpHにおける平
衡塩数および必須アミノ酸の処方からなる。該培地の調
製は、実質的にリンドクイスト（Lindquist）,DIS,58,1
63（1982）に記載されているごとく行なう。
養培地にて培養しうる。M3培地は、6.6のpHにおける平
衡塩数および必須アミノ酸の処方からなる。該培地の調
製は、実質的にリンドクイスト（Lindquist）,DIS,58,1
63（1982）に記載されているごとく行なう。
組換え体DNA分子であり、かつ、本発明の組換え体ド
ロソフィラ細胞を調製するために用いうるtPA遺伝子発
現ユニットは、tPAについてのDNAコーディング配列また
はその活性変異体およびtPAコーディング配列の転写お
よびその後の翻訳に必要であるか望ましい調節領域から
なる。
ロソフィラ細胞を調製するために用いうるtPA遺伝子発
現ユニットは、tPAについてのDNAコーディング配列また
はその活性変異体およびtPAコーディング配列の転写お
よびその後の翻訳に必要であるか望ましい調節領域から
なる。
該tPAコーディング配列はいくつかの源から入手で
き、または、ヒト細胞またはボウズメラノーマ細胞株も
しくはヒーラー細胞株のような細胞株から得ることがで
きる。遺伝子工学の標準的方法を用いて、ヒト細胞のゲ
ノムDNAからtPAコーディング配列を誘導する。その変異
体も標準組換え体DNA法により調製できる。そのような
変異体は、血栓崩壊活性に顕著な悪影響を及ぼすことな
く１個または数個のアミノ酸が置換し、付加しまたは欠
失したtPA分子からなる。例えば、ロビンソン,WO84−01
786、ローザら（Rosa et al.）,WO−86−01538、ヘイネ
ッカーら（Heyneker et al.）,GB2173804A参照。
き、または、ヒト細胞またはボウズメラノーマ細胞株も
しくはヒーラー細胞株のような細胞株から得ることがで
きる。遺伝子工学の標準的方法を用いて、ヒト細胞のゲ
ノムDNAからtPAコーディング配列を誘導する。その変異
体も標準組換え体DNA法により調製できる。そのような
変異体は、血栓崩壊活性に顕著な悪影響を及ぼすことな
く１個または数個のアミノ酸が置換し、付加しまたは欠
失したtPA分子からなる。例えば、ロビンソン,WO84−01
786、ローザら（Rosa et al.）,WO−86−01538、ヘイネ
ッカーら（Heyneker et al.）,GB2173804A参照。
該調節領域は、代表的には、RNAポリメラーゼの結合
時およびRNA転写開始時に機能するプロモーター領域か
らなる。該プロモーター領域は、代表的には、該tPAコ
ーディング配列から上流に見出されている。例えば、ア
ビアンラウスサルコーマウイルスLTRおよびシミアンウ
イルス（SV40初期プロモーター）を含む哺乳動物細胞発
現ベクターに通常用いられるプロモーターは、ドロソフ
ィラ系において不充分な機能および発現しか示さない。
好ましいプロモーターは、ドロソフィラ起源のものであ
る。SV40初期プロモーターは、ドロソフィラメタロチオ
ネインプロモーターより低水準の発現を示す。他のドロ
ソフィラプロモーターの例としては、例えば、熱衝撃
（Hsp70）およびCOPIALTRプロモーターが挙げられる。
時およびRNA転写開始時に機能するプロモーター領域か
らなる。該プロモーター領域は、代表的には、該tPAコ
ーディング配列から上流に見出されている。例えば、ア
ビアンラウスサルコーマウイルスLTRおよびシミアンウ
イルス（SV40初期プロモーター）を含む哺乳動物細胞発
現ベクターに通常用いられるプロモーターは、ドロソフ
ィラ系において不充分な機能および発現しか示さない。
好ましいプロモーターは、ドロソフィラ起源のものであ
る。SV40初期プロモーターは、ドロソフィラメタロチオ
ネインプロモーターより低水準の発現を示す。他のドロ
ソフィラプロモーターの例としては、例えば、熱衝撃
（Hsp70）およびCOPIALTRプロモーターが挙げられる。
該tPAコーディング配列の後には、SV40初期ポリＡ領
域のようなtPA遺伝子発現ユニット内でのポリアデニル
化（ポリＡ）領域が続く。RNA転写物のポリアデニル化
の際に機能するポリＡ領域は、転写の安定化にある役割
を果たすと考えられる。該ポリＡ領域は、天然に存在す
る種々の遺伝子から誘導しうる。他の入手可能なポリＡ
領域としては、例えば、成長ホルモンおよびメタロチオ
ネイン遺伝子から誘導されるものがあげられる。そのよ
うな領域は、またポリアデニル化および転写物安定化機
能が顕著な悪影響を及ぼさないならば、修飾してその配
列を変更しうる。
域のようなtPA遺伝子発現ユニット内でのポリアデニル
化（ポリＡ）領域が続く。RNA転写物のポリアデニル化
の際に機能するポリＡ領域は、転写の安定化にある役割
を果たすと考えられる。該ポリＡ領域は、天然に存在す
る種々の遺伝子から誘導しうる。他の入手可能なポリＡ
領域としては、例えば、成長ホルモンおよびメタロチオ
ネイン遺伝子から誘導されるものがあげられる。そのよ
うな領域は、またポリアデニル化および転写物安定化機
能が顕著な悪影響を及ぼさないならば、修飾してその配
列を変更しうる。
ドロソフィラメタロチオネインプロモーターの使用
は、非常に高いコピー数においてさえ充分な調節を保持
するメタロチオネインベクター系を生じる。これは、該
金属の調節効果がコピー数の増加とともに減少する哺乳
動物メタロチオネインプロモーターを用いた哺乳動物細
胞における結果と全く対象的である。この保持した誘導
効果の結果、高いコピー数でドロソフィラ細胞における
該遺伝子産生物の発現が増加する。
は、非常に高いコピー数においてさえ充分な調節を保持
するメタロチオネインベクター系を生じる。これは、該
金属の調節効果がコピー数の増加とともに減少する哺乳
動物メタロチオネインプロモーターを用いた哺乳動物細
胞における結果と全く対象的である。この保持した誘導
効果の結果、高いコピー数でドロソフィラ細胞における
該遺伝子産生物の発現が増加する。
いったん、該tPA遺伝子発現ユニットを含有するベク
ター構築されたならば、標準トランスフェクション法を
用いてドロソフィラ細胞中にそれをトランスフェクショ
ンしうる。そのような方法としては、例えばリン酸カル
シウム共沈澱、細胞融合、エレクトロポレーション（el
ectroporation）微量注入およびウイルストランスフェ
クションが挙げられる。
ター構築されたならば、標準トランスフェクション法を
用いてドロソフィラ細胞中にそれをトランスフェクショ
ンしうる。そのような方法としては、例えばリン酸カル
シウム共沈澱、細胞融合、エレクトロポレーション（el
ectroporation）微量注入およびウイルストランスフェ
クションが挙げられる。
遺伝子クローニングを行なった場合、一般的には、ト
ランスフェクション前により大きな組換え体DNA分子中
に選択した遺伝子を取り込む。そのようなより大きなDN
A分子は、好ましくは、該tPA機能に加えて、少なくと
も、遺伝子選択マーカーからなる。該選択マーカーは、
トランスフェクションした宿主細胞において容易に検出
できる表現型変化を生じるいずれもの遺伝子または複数
遺伝子でありうる。そのような表現型変化は、例えば、
ハイグロマイシンＢ耐性についての遺伝子のような薬剤
耐性でありうる。
ランスフェクション前により大きな組換え体DNA分子中
に選択した遺伝子を取り込む。そのようなより大きなDN
A分子は、好ましくは、該tPA機能に加えて、少なくと
も、遺伝子選択マーカーからなる。該選択マーカーは、
トランスフェクションした宿主細胞において容易に検出
できる表現型変化を生じるいずれもの遺伝子または複数
遺伝子でありうる。そのような表現型変化は、例えば、
ハイグロマイシンＢ耐性についての遺伝子のような薬剤
耐性でありうる。
薬剤メトトレキセイトおよび原核生物のジヒドロホレ
ートリダクターゼ（DHFR）を用いた選択系をドロソフィ
ラ細胞とともに用いうる。該細胞の内因性真核生物DHFR
は、メトトレキセイトにより抑制される。したがって、
メトトレキセイトに対して非感受性である原核生物DHFR
含有プラスミドにて該細胞をトランスフェクションし、
かつ、メトトレキセイトにて選択することにより、該原
核生物DHFRにてトランスフェクションし、かつ、該原核
生物DHFRを発現する細胞のみが生存する。
ートリダクターゼ（DHFR）を用いた選択系をドロソフィ
ラ細胞とともに用いうる。該細胞の内因性真核生物DHFR
は、メトトレキセイトにより抑制される。したがって、
メトトレキセイトに対して非感受性である原核生物DHFR
含有プラスミドにて該細胞をトランスフェクションし、
かつ、メトトレキセイトにて選択することにより、該原
核生物DHFRにてトランスフェクションし、かつ、該原核
生物DHFRを発現する細胞のみが生存する。
形質転換した哺乳動物および細菌細胞のメトトレキセ
イト選択と異なり、ドロソフィラ系において、メトトレ
キセイトを用いて最初に高コピー数トランスフェクショ
ン物を選択しうる。保護原核生物DHFR遺伝子を取り込ん
だ細胞のみが生存する。付随して、これらの細胞は重要
な遺伝子発現ユニットを有する。
イト選択と異なり、ドロソフィラ系において、メトトレ
キセイトを用いて最初に高コピー数トランスフェクショ
ン物を選択しうる。保護原核生物DHFR遺伝子を取り込ん
だ細胞のみが生存する。付随して、これらの細胞は重要
な遺伝子発現ユニットを有する。
本発明において、２つのベクター系を用いてドロソフ
ィラ細胞中に問題の遺伝子産生物についての遺伝子発現
ユニットおよび用いる選択系についてのコーディング領
域を共トランスフェクションしうる。例えば、ベクター
pDM100およびpHGCOからなるpDM100発現系を用いてtPAに
ついての該DNAコーディング配列を含有する組換え体S2
細胞を調製しうる。該ベクターpDM100は、該プロモータ
ーがドロソフィラからのHsp70熱衝撃プロモーターであ
るtPA遺伝子発現ユニットからなる。Hsp70は、ドロソフ
ィラ細胞において遺伝子発現に対して都合がよいことが
判明しているドロソフィラ熱衝撃プロモーターである
（インゴリアら，セル（Ingolia et al.,Cell）、21,66
9（1980））。該pHGCOベクターは、DHFR遺伝子発現ユニ
ットからなり、pDM100ベクターとともに共トランスフェ
クションされ、それにより選択に必要なDHFR遺伝子を提
供する。本発明のこの具体例のより完全な記載は、実施
例１に見出される。
ィラ細胞中に問題の遺伝子産生物についての遺伝子発現
ユニットおよび用いる選択系についてのコーディング領
域を共トランスフェクションしうる。例えば、ベクター
pDM100およびpHGCOからなるpDM100発現系を用いてtPAに
ついての該DNAコーディング配列を含有する組換え体S2
細胞を調製しうる。該ベクターpDM100は、該プロモータ
ーがドロソフィラからのHsp70熱衝撃プロモーターであ
るtPA遺伝子発現ユニットからなる。Hsp70は、ドロソフ
ィラ細胞において遺伝子発現に対して都合がよいことが
判明しているドロソフィラ熱衝撃プロモーターである
（インゴリアら，セル（Ingolia et al.,Cell）、21,66
9（1980））。該pHGCOベクターは、DHFR遺伝子発現ユニ
ットからなり、pDM100ベクターとともに共トランスフェ
クションされ、それにより選択に必要なDHFR遺伝子を提
供する。本発明のこの具体例のより完全な記載は、実施
例１に見出される。
本発明の第２の代表的態様は、ベクターpCOHYGROおよ
びpDMtPAからなるpCOHYGROベクター系を用いるtPA遺伝
子発現ユニットを用いる以外２ベクター法を用いるtPA
の産生である。
びpDMtPAからなるpCOHYGROベクター系を用いるtPA遺伝
子発現ユニットを用いる以外２ベクター法を用いるtPA
の産生である。
pCOHYGROは、ハイグロマイシンＢ遺伝子発現ユニット
からなる。pDMtPAは、メタロチオネインプロモーターを
用いたtPA遺伝子発現ユニットを含む。pCOHYGROベクタ
ー系を用いるtPA遺伝子発現ユニットは、選択のための
ハイグロマイシンＢ耐性の利点を最大限に活用すること
によりS2ドロソフィラ細胞においてtPAを産生する。こ
の系と共に、抗生物質ハイグロマイシンＢを用いて、ト
ランスフェクションしたベクターを含有するそれらの細
胞を選択しうる。
からなる。pDMtPAは、メタロチオネインプロモーターを
用いたtPA遺伝子発現ユニットを含む。pCOHYGROベクタ
ー系を用いるtPA遺伝子発現ユニットは、選択のための
ハイグロマイシンＢ耐性の利点を最大限に活用すること
によりS2ドロソフィラ細胞においてtPAを産生する。こ
の系と共に、抗生物質ハイグロマイシンＢを用いて、ト
ランスフェクションしたベクターを含有するそれらの細
胞を選択しうる。
ウィグラーら（Wigler et al.），セル，16,777（197
9）により記載されているごとき方法を用いて、該２ベ
クターをS2ドロソフィラ細胞中に共トランスフェクショ
ンする。該ベクターを、所望の特定のコピー数により、
種々の割合にて共トランスフェクションする。ついで、
該トランスフェクション細胞を例えば、血清およびハイ
グロマイシンＢまたはメトトレキセイトのような適当な
選択剤を含有するM3培地において選択する。
9）により記載されているごとき方法を用いて、該２ベ
クターをS2ドロソフィラ細胞中に共トランスフェクショ
ンする。該ベクターを、所望の特定のコピー数により、
種々の割合にて共トランスフェクションする。ついで、
該トランスフェクション細胞を例えば、血清およびハイ
グロマイシンＢまたはメトトレキセイトのような適当な
選択剤を含有するM3培地において選択する。
用いうる他の公知のドロソフィラ細胞培養系は、例え
ば、血清不含細胞株であるKC−Ｏドロソフィラ・メラノ
ガスター（Drosophila melanogaster）細胞株である
（シュルツら（Schulz,et al.），プロシーディングス
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シーズ・オブ・ユー・エス・エー・83,9428（198
6））。該KC−Ｏ株を用いた予備的研究は、S2細胞を用
いるよりもトランスフェクションが困難であるというこ
とを示唆している。用いたもう１つの細胞株は、ドロソ
フィラ・ハイデイからの細胞株である。タンパク質発現
は、該ハイデイ細胞株を用いて得ることができるが、こ
の細胞株中へのトランスフェクションは非常に低い効率
でしか発現しないトランスフェクションDNAを生じうる
（シンクレアら，モレキュラー・アンド・セルラー・バ
イオロジー（Sinclair,et al.,Mol.Cell.Biol.），5,32
08（1985））。
ば、血清不含細胞株であるKC−Ｏドロソフィラ・メラノ
ガスター（Drosophila melanogaster）細胞株である
（シュルツら（Schulz,et al.），プロシーディングス
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シーズ・オブ・ユー・エス・エー・83,9428（198
6））。該KC−Ｏ株を用いた予備的研究は、S2細胞を用
いるよりもトランスフェクションが困難であるというこ
とを示唆している。用いたもう１つの細胞株は、ドロソ
フィラ・ハイデイからの細胞株である。タンパク質発現
は、該ハイデイ細胞株を用いて得ることができるが、こ
の細胞株中へのトランスフェクションは非常に低い効率
でしか発現しないトランスフェクションDNAを生じうる
（シンクレアら，モレキュラー・アンド・セルラー・バ
イオロジー（Sinclair,et al.,Mol.Cell.Biol.），5,32
08（1985））。
いったん適当なベクター系を構築し、該S2細胞株中に
トランスフェクションしたならば、tPAの発現は、メタ
ロチオネインプロモーターの場合にはカドミウムまたは
Hsp70プロモーターの場合には熱のような適当な誘導剤
の添加により誘導される。誘導後の該tPAコーディング
配列の転写モニターしうる。
トランスフェクションしたならば、tPAの発現は、メタ
ロチオネインプロモーターの場合にはカドミウムまたは
Hsp70プロモーターの場合には熱のような適当な誘導剤
の添加により誘導される。誘導後の該tPAコーディング
配列の転写モニターしうる。
サザンブロット分析（マニアティスら，モレキュラー
・クローニング，コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー，コールド・スプリング・ハーバー，ニュー
ヨーク（Maniatis,et al.,Molecular Cloning,Cold Spr
ing Harbor Laboratory,Cold Sprig Harbor,N.Y.）,198
2）を用いて該tPA遺伝子のコピー数を測定できる。ノザ
ンブロット分析（アニアティス，前記202頁）は、該転
写遺伝子配列の大きさに関する知見を提供する。転写水
準も定量しうる。約2.4kbの特定のtPAmRNAを測定しう
る。さらに組換え体細胞におけるtPAの発現は、得られ
たタンパク質についてのウエスタンブロット分析および
活性試験により証明しうる。
・クローニング，コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー，コールド・スプリング・ハーバー，ニュー
ヨーク（Maniatis,et al.,Molecular Cloning,Cold Spr
ing Harbor Laboratory,Cold Sprig Harbor,N.Y.）,198
2）を用いて該tPA遺伝子のコピー数を測定できる。ノザ
ンブロット分析（アニアティス，前記202頁）は、該転
写遺伝子配列の大きさに関する知見を提供する。転写水
準も定量しうる。約2.4kbの特定のtPAmRNAを測定しう
る。さらに組換え体細胞におけるtPAの発現は、得られ
たタンパク質についてのウエスタンブロット分析および
活性試験により証明しうる。
本発明のS2細胞は、特に、タンパク質高収率産生に適
している。該細胞を室温（24±１℃）にて懸濁培養中に
維持しうる。培地は、５〜10％（v/v）熱不活性化胎児
ウシ血清にて補足したM3である。本発明の好ましい実施
態様において、培地は、５％胎児ウシ血清を含有する。
誘導後、該細胞を血清不含培地にて培養する。pCOHYGRO
ベクター系を用いる場合、該培地、また、300μg/mlハ
イグロマイシンＢにて補足する、この培地において、該
S2細胞を、50〜60rpmに攪拌しながら、例えば、250ml〜
2000mlスピナー（spinner）フラスコ中、懸濁培養にて
増殖しうる。細胞密度を、代表的には、1ml当り106〜10
7細胞に維持する。本発明の１つの実施態様において、
該細胞を、５％血清含有培地にて1500mlスピナーフラス
コ中誘導前に増殖する。
している。該細胞を室温（24±１℃）にて懸濁培養中に
維持しうる。培地は、５〜10％（v/v）熱不活性化胎児
ウシ血清にて補足したM3である。本発明の好ましい実施
態様において、培地は、５％胎児ウシ血清を含有する。
誘導後、該細胞を血清不含培地にて培養する。pCOHYGRO
ベクター系を用いる場合、該培地、また、300μg/mlハ
イグロマイシンＢにて補足する、この培地において、該
S2細胞を、50〜60rpmに攪拌しながら、例えば、250ml〜
2000mlスピナー（spinner）フラスコ中、懸濁培養にて
増殖しうる。細胞密度を、代表的には、1ml当り106〜10
7細胞に維持する。本発明の１つの実施態様において、
該細胞を、５％血清含有培地にて1500mlスピナーフラス
コ中誘導前に増殖する。
細胞培養後、tPAを、モノクローナル抗体アフィニテ
ィカムの使用などにより経時培地から単離しうる。他の
公知のタンパク質精製工程、例えば、金属キレート、種
々のアフィニティクロマトグラフィー工程または吸着ク
ロマトグラフィーを用いて該培地からのtPAを精製でき
る。遺伝子産生物を直接培地中に分泌する細胞株S2の使
用は、本発明の重要な特徴である。培地中への直接分泌
は、効率的な１工程精製法の利用を可能にする。tPAに
向かうモノクローナル抗体カラムを用いる場合、経時培
地を直接該カラムに加えて、リン酸塩緩衝生理食塩水中
の1.5MKSCNを用いてtPAを溶出しうる。
ィカムの使用などにより経時培地から単離しうる。他の
公知のタンパク質精製工程、例えば、金属キレート、種
々のアフィニティクロマトグラフィー工程または吸着ク
ロマトグラフィーを用いて該培地からのtPAを精製でき
る。遺伝子産生物を直接培地中に分泌する細胞株S2の使
用は、本発明の重要な特徴である。培地中への直接分泌
は、効率的な１工程精製法の利用を可能にする。tPAに
向かうモノクローナル抗体カラムを用いる場合、経時培
地を直接該カラムに加えて、リン酸塩緩衝生理食塩水中
の1.5MKSCNを用いてtPAを溶出しうる。
該ドロソフィラ細胞系を用いて完全一本鎖tPAを作製
した。該アミノ末端の長形に対する短形の割合は、哺乳
動物系において見出されたそれと正反対であることが判
明した。予備ゲル移動試験は、ドロソフィラtPAが、グ
リコシル化において異なることを示している。該ヒトtP
Aは昆虫系において産生されているため、該tPAは、ヒ
ト、ハムスターまたはマウス汚染物質完全不含である。
さらに、ドロソフィラにて産生したヒトtPAは、哺乳動
物レトロウイルス不含である。
した。該アミノ末端の長形に対する短形の割合は、哺乳
動物系において見出されたそれと正反対であることが判
明した。予備ゲル移動試験は、ドロソフィラtPAが、グ
リコシル化において異なることを示している。該ヒトtP
Aは昆虫系において産生されているため、該tPAは、ヒ
ト、ハムスターまたはマウス汚染物質完全不含である。
さらに、ドロソフィラにて産生したヒトtPAは、哺乳動
物レトロウイルス不含である。
医薬等級tPAを得るためのそれ以上の精製法に付した
後、該tPAを、それぞれの投与単位が非毒性、すなわ
ち、顕著な有害副作用を示さず、かつ、動物、特に、ヒ
トに投与後血栓崩壊を生じるに有効な量のtPAからなる
ように医薬組成物中に処方する（ヨーロッパ特許出願第
0211592号）。代表的な心筋梗塞の治療用のそのような
医薬組成物は、静脈内注射または点滴に適した形態であ
り、医薬上許容される希釈剤または担体中の0.1〜10mg/
mlのtPAからなる。好適な希釈剤および担体は、医薬組
成物の調整法と同様、当業者によく知られている。
後、該tPAを、それぞれの投与単位が非毒性、すなわ
ち、顕著な有害副作用を示さず、かつ、動物、特に、ヒ
トに投与後血栓崩壊を生じるに有効な量のtPAからなる
ように医薬組成物中に処方する（ヨーロッパ特許出願第
0211592号）。代表的な心筋梗塞の治療用のそのような
医薬組成物は、静脈内注射または点滴に適した形態であ
り、医薬上許容される希釈剤または担体中の0.1〜10mg/
mlのtPAからなる。好適な希釈剤および担体は、医薬組
成物の調整法と同様、当業者によく知られている。
先の記載および以下の実施例は、主に、ドロソフィラ
におけるtPAの発現に関するが、本明細書において記載
した発現ベクターおよび２ベクター発現系は、ドロソフ
ィラにおいて他の遺伝子およびコーディング配列をクロ
ーニングし、かつ、発現するために用いることができ
る。例えば、成長ホルモン、リンホカイン、ウロキナー
ゼ、抗原または重要な他の遺伝子産生物についてのコー
ディング配列を遺伝子発現ユニットの範囲内でpDM100ま
たはpDMtPAのようなベクター中に挿入し、かつ、pHGCO
またはpCOHYGROのようなベクターと共にトランスフェク
ションしうる。ついで、トランスフェクションした細胞
を前記のように選択しうる。
におけるtPAの発現に関するが、本明細書において記載
した発現ベクターおよび２ベクター発現系は、ドロソフ
ィラにおいて他の遺伝子およびコーディング配列をクロ
ーニングし、かつ、発現するために用いることができ
る。例えば、成長ホルモン、リンホカイン、ウロキナー
ゼ、抗原または重要な他の遺伝子産生物についてのコー
ディング配列を遺伝子発現ユニットの範囲内でpDM100ま
たはpDMtPAのようなベクター中に挿入し、かつ、pHGCO
またはpCOHYGROのようなベクターと共にトランスフェク
ションしうる。ついで、トランスフェクションした細胞
を前記のように選択しうる。
実施例 次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する
が、これらに限定されるものではない。
が、これらに限定されるものではない。
実施例１ Hsp70ベクターおよびDHFR選択系を用いるtPAの発現 ベクターの構築： pDMKΔＨ ドロソフィラにおける遺伝子発現用の基本ベクターと
して、β−ガラクタマーゼを含有するスモールpBR322ベ
クターであるpML2を用いた（メロンら（Mellon et a
l.）、セル（cell）、27:297,（1982））。このベクタ
ーを、該プラスミドにおいて唯一の切断を形成するSalI
で消化した。この部位に、SV40初期プロモーター、つづ
いてガラクトキナーゼ遺伝子およびSV40初期ポリアデニ
レーション部位を含有するSalIカセットを挿入した。
して、β−ガラクタマーゼを含有するスモールpBR322ベ
クターであるpML2を用いた（メロンら（Mellon et a
l.）、セル（cell）、27:297,（1982））。このベクタ
ーを、該プラスミドにおいて唯一の切断を形成するSalI
で消化した。この部位に、SV40初期プロモーター、つづ
いてガラクトキナーゼ遺伝子およびSV40初期ポリアデニ
レーション部位を含有するSalIカセットを挿入した。
該SalIカセットは、pDSPIから得た（プファーら（Pfa
rr et al.）、ディ・エヌ・エイ（DNA）、4:461（198
5））。挿入方向は、HindIIIおよびBamHIを用いる精密
制限分析によって測定した。新規構築物pDMKは、対向方
向に向かうガラクトキナーゼおよびβ−ラクタマーゼ遺
伝子用の転写単位を有する。pDMKΔＨは、SV40初期プロ
モーターに対する５′のpBR322におけるHindIII部位の
欠失によって作製した。pDMKをHindIIIで消化し、該部
位を末端補充し（マニアティス（Maniatis）、前記文
献、113頁）、該ベクターを再連結した。この場合pDMK
ΔＨは、SV40初期プロモーターおよびガラクトキナーゼ
遺伝子の間に位置する唯一のHindIII部位を有する。
rr et al.）、ディ・エヌ・エイ（DNA）、4:461（198
5））。挿入方向は、HindIIIおよびBamHIを用いる精密
制限分析によって測定した。新規構築物pDMKは、対向方
向に向かうガラクトキナーゼおよびβ−ラクタマーゼ遺
伝子用の転写単位を有する。pDMKΔＨは、SV40初期プロ
モーターに対する５′のpBR322におけるHindIII部位の
欠失によって作製した。pDMKをHindIIIで消化し、該部
位を末端補充し（マニアティス（Maniatis）、前記文
献、113頁）、該ベクターを再連結した。この場合pDMK
ΔＨは、SV40初期プロモーターおよびガラクトキナーゼ
遺伝子の間に位置する唯一のHindIII部位を有する。
pDMKHSP pDMKΔＨを、SV40初期プロモーターを切断するSmaIお
よびHindIIIで消化した。HIndIII部位を末端補充し、ド
ロソフィラHSP70プロモーターフラグメントをこのベク
ターに挿入した。
よびHindIIIで消化した。HIndIII部位を末端補充し、ド
ロソフィラHSP70プロモーターフラグメントをこのベク
ターに挿入した。
使用フラグメントは、pDM301のXbaIおよびXmnI消化に
よって得られる460bpフラグメントであった（マックガ
リーら（McGatty et al.）、セル、42:903（1985））。
このフラグメントは熱誘導に対する調節配列であると考
えられるものを含有している。該フラグメントを末端補
充し、SmaI、HindIII切断ベクターに連結した。
よって得られる460bpフラグメントであった（マックガ
リーら（McGatty et al.）、セル、42:903（1985））。
このフラグメントは熱誘導に対する調節配列であると考
えられるものを含有している。該フラグメントを末端補
充し、SmaI、HindIII切断ベクターに連結した。
連結DNAをE.coli中に形質転換し、所望プラスミドを
含有するコロニーを、HindIIIおよびXhoIでのDNAのミニ
調製の精密制限により同定した。
含有するコロニーを、HindIIIおよびXhoIでのDNAのミニ
調製の精密制限により同定した。
pDM100 pDMKHSPをXbaIで切断し、ついで末端補充し、最後にH
indIIIで切断した。これはガラクトキナーゼ遺伝子を切
除する。tPAコーディング配列を、tPAのプレプロペプチ
ド（prepropeptide）および全コーディング配列を有す
るHindIII−BalIフラグメント上のシュロイニングら（S
chleuning et al.）の前記文献から得られるcDNAクロー
ンから単離した。このフラグメントを切断pDMKHSPベク
ターに挿入した。連結DNAをE.coli中に変質転換し、酵
素HindIII、BamHIおよびXbaIでの制限によって正確なプ
ラスミドを同定した。すべての制限に関する条件は、製
造業者（ニューイングランド・バイオラブス（New Engl
and Biolabs）によって推奨されているごとくである。
indIIIで切断した。これはガラクトキナーゼ遺伝子を切
除する。tPAコーディング配列を、tPAのプレプロペプチ
ド（prepropeptide）および全コーディング配列を有す
るHindIII−BalIフラグメント上のシュロイニングら（S
chleuning et al.）の前記文献から得られるcDNAクロー
ンから単離した。このフラグメントを切断pDMKHSPベク
ターに挿入した。連結DNAをE.coli中に変質転換し、酵
素HindIII、BamHIおよびXbaIでの制限によって正確なプ
ラスミドを同定した。すべての制限に関する条件は、製
造業者（ニューイングランド・バイオラブス（New Engl
and Biolabs）によって推奨されているごとくである。
ドロソフィラS2細胞へのトランスフェクション pDM100を、COPIA5′LTRによって駆動されるE.coli由
来原核生物DHFR遺伝子を含有するプラスミドであるpHGC
Oと一緒に、S2ドロソフィラ細胞に共トランスフェクシ
ョンした（ボウロウイスら（Bourouis et al.）、EMB
O、2:1104、（1983））。該トランスフェクション方法
は、実質上、ウィグラーら（Wigler et al.）、セル、1
6:777、（1979）によって記載されている。20μｇのプ
ラスミドDNApDM100およびpHGCOを、3X106細胞に必要な
コピー数に依存して種々の割合にて共トランスフェクシ
ョンし、沈澱物を18時間細胞上に放置した。ついで該細
胞を洗浄し、48時間増殖させ、DHFRの発現を行った。細
胞をスピンダウンし、2X10-7Ｍのメトトレキセイトを含
有する培地中に懸濁させ、DHFR遺伝子を発現する形質転
換体を選択した。６週間選択後、安定な形質転換体が得
られた。
来原核生物DHFR遺伝子を含有するプラスミドであるpHGC
Oと一緒に、S2ドロソフィラ細胞に共トランスフェクシ
ョンした（ボウロウイスら（Bourouis et al.）、EMB
O、2:1104、（1983））。該トランスフェクション方法
は、実質上、ウィグラーら（Wigler et al.）、セル、1
6:777、（1979）によって記載されている。20μｇのプ
ラスミドDNApDM100およびpHGCOを、3X106細胞に必要な
コピー数に依存して種々の割合にて共トランスフェクシ
ョンし、沈澱物を18時間細胞上に放置した。ついで該細
胞を洗浄し、48時間増殖させ、DHFRの発現を行った。細
胞をスピンダウンし、2X10-7Ｍのメトトレキセイトを含
有する培地中に懸濁させ、DHFR遺伝子を発現する形質転
換体を選択した。６週間選択後、安定な形質転換体が得
られた。
遺伝子産生物の分析 耐性細胞を、血清不含M3培地中、5X106細胞/mlの密度
で接種した。培地を集め、tPA蛋白質の存在について検
定する前に、該細胞を３日間tPA発現させた。実質的
に、ビットナーら（Bittner,et al.）、アン・バイオケ
ム（Ann.Biochem.）、102:549、（1980）によって記載
されているようなウェスタン分析は、高分子量のtPA蛋
白質の存在、すなわち、該蛋白質が一本鎖tPAについて
予想分子量（約70kd）を有することを示した。tPA蛋白
質が発現され、かつ活性であるということを、S2251活
性検定、ランビーら（Ranby,et al.）、トロンボシス・
リサーチ（Thromb.Res.）、27:743（1982）を用いて確
認した。
で接種した。培地を集め、tPA蛋白質の存在について検
定する前に、該細胞を３日間tPA発現させた。実質的
に、ビットナーら（Bittner,et al.）、アン・バイオケ
ム（Ann.Biochem.）、102:549、（1980）によって記載
されているようなウェスタン分析は、高分子量のtPA蛋
白質の存在、すなわち、該蛋白質が一本鎖tPAについて
予想分子量（約70kd）を有することを示した。tPA蛋白
質が発現され、かつ活性であるということを、S2251活
性検定、ランビーら（Ranby,et al.）、トロンボシス・
リサーチ（Thromb.Res.）、27:743（1982）を用いて確
認した。
tPA産生ポリクローナル細胞のサザーン分析は、それ
らが１細胞当たり1000コピーまでのtPA遺伝子発現ユニ
ットを含有し、tPA遺伝子発現ユニットが増幅し、頭−
尾パターンの宿主染色体に組み込まれることを示した。
らが１細胞当たり1000コピーまでのtPA遺伝子発現ユニ
ットを含有し、tPA遺伝子発現ユニットが増幅し、頭−
尾パターンの宿主染色体に組み込まれることを示した。
実施例２ ハイグロマイシンＢ選択系を用いるtPAの発現 ベクターの構築： pUCOPIA ドロソフィラにおける遺伝子発現用の基本クローニン
グベクターとして、BamHIおよびSmzI部位を有するpUC18
を用いた。組込みCOPIA成分からの５′LTR（357塩基
対）を、ベクターpUC18のBAMHI部位にクローニングし、
pUCOPIAと称するベクターを得た。COPIAは、ドロソフィ
ラゲノム中に散在していることが判明している分解中位
反復配列の代表的構成員である（ルビンら（Rubin,et a
l.）、コールド・スプリング・ハーバー・シンプ・キュ
アント・バイオロ（Cold Spring Harbor Symp.Quant.Bi
ol.）45:619（1980））。
グベクターとして、BamHIおよびSmzI部位を有するpUC18
を用いた。組込みCOPIA成分からの５′LTR（357塩基
対）を、ベクターpUC18のBAMHI部位にクローニングし、
pUCOPIAと称するベクターを得た。COPIAは、ドロソフィ
ラゲノム中に散在していることが判明している分解中位
反復配列の代表的構成員である（ルビンら（Rubin,et a
l.）、コールド・スプリング・ハーバー・シンプ・キュ
アント・バイオロ（Cold Spring Harbor Symp.Quant.Bi
ol.）45:619（1980））。
pCOHYGRO ベクターpUCOPIAをSmaI部位で切断し、ハイグロマイ
シンＢホスホトランスフェラーゼ（ハイグロマイシンＢ
カセット）に関するE.coli遺伝子コーディングを、標準
的クローニング法を用い、pUCOPIA中にクローンした。
ハイグロマイシンＢカセットを、ベクターDSP−ハイグ
ロからの1481塩基対のHindIII−BamHI上で単離した（ゲ
ルツら（Gertz,et al.）ゲネ（Gene）、25:179（198
3））。ハイグロマイシンＢカセットは、ハイグロマイ
シンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子およびSV40初期
ポリＡ部位についてコードする配列を有する。HindIII
およびBamHI部位を、T4DNAポリメラーゼを用いて充足
し、該ハイグロマイシンＢカセットをベクターpUCOPIA
のSmaI部位に連結した。
シンＢホスホトランスフェラーゼ（ハイグロマイシンＢ
カセット）に関するE.coli遺伝子コーディングを、標準
的クローニング法を用い、pUCOPIA中にクローンした。
ハイグロマイシンＢカセットを、ベクターDSP−ハイグ
ロからの1481塩基対のHindIII−BamHI上で単離した（ゲ
ルツら（Gertz,et al.）ゲネ（Gene）、25:179（198
3））。ハイグロマイシンＢカセットは、ハイグロマイ
シンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子およびSV40初期
ポリＡ部位についてコードする配列を有する。HindIII
およびBamHI部位を、T4DNAポリメラーゼを用いて充足
し、該ハイグロマイシンＢカセットをベクターpUCOPIA
のSmaI部位に連結した。
pDMtPA β−ガラクタマーゼ遺伝子を含有するプラスミドpBR3
22を、基本ベクターをして用いた。ラストフスキー−ペ
リーら（Lastowski−Perry,et al.）、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリィ（J.Biol.Chem.）、
260:1527（1985）のメタロチオネインプロモーターを、
EcoR1−StuIフラグメント上で単離し、該プレペプチド
を含有する全tPA遺伝子の前のpBR322に挿入した。SV40
初期ポリＡ部位が該tPA遺伝子に続く。
22を、基本ベクターをして用いた。ラストフスキー−ペ
リーら（Lastowski−Perry,et al.）、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリィ（J.Biol.Chem.）、
260:1527（1985）のメタロチオネインプロモーターを、
EcoR1−StuIフラグメント上で単離し、該プレペプチド
を含有する全tPA遺伝子の前のpBR322に挿入した。SV40
初期ポリＡ部位が該tPA遺伝子に続く。
ドロソフィラS2細胞へのトランスフェクション pCOHYGROを、ドロソフィラメタロチオネインプロモー
ターの調節下、tPA遺伝子を保持するpDMtPAと一緒にS2
ドロソフィラ細胞中に共トランスフェクションした。該
トランスフェクション細胞を、300μg/mlのハイグロマ
イシンＢを有する血清含有M3培地において選択した。同
一条件下にて２〜３日後、非トランスフェクション細胞
は分割を停止し、死滅し始める。トランスフェクション
培養中、安定した増殖ハイグロマイシンＢ耐性細胞を得
るための選択期間は約２ないし３週間である。種々のコ
ピー数のtPA遺伝子をその染色体に組み込ませた培養を
得るために、２種のベクターの割合を、第１表に示すよ
うにトランスフェクションにて変えた。
ターの調節下、tPA遺伝子を保持するpDMtPAと一緒にS2
ドロソフィラ細胞中に共トランスフェクションした。該
トランスフェクション細胞を、300μg/mlのハイグロマ
イシンＢを有する血清含有M3培地において選択した。同
一条件下にて２〜３日後、非トランスフェクション細胞
は分割を停止し、死滅し始める。トランスフェクション
培養中、安定した増殖ハイグロマイシンＢ耐性細胞を得
るための選択期間は約２ないし３週間である。種々のコ
ピー数のtPA遺伝子をその染色体に組み込ませた培養を
得るために、２種のベクターの割合を、第１表に示すよ
うにトランスフェクションにて変えた。
10μＭのカドミウムでメタロチオネインプロモーター
を誘導した後、tPAの発現を確認した。ノーザンブロッ
ト分析により、約2.4kbの特異的tPAmRNAを検出した。同
時に、誘導細胞培養からの時間の経過した上清のウェス
タンブロット分析は、約70kdにて単一tPA帯を示した。
を誘導した後、tPAの発現を確認した。ノーザンブロッ
ト分析により、約2.4kbの特異的tPAmRNAを検出した。同
時に、誘導細胞培養からの時間の経過した上清のウェス
タンブロット分析は、約70kdにて単一tPA帯を示した。
細胞上清におけるtPA濃度を、S2251活性試験を用いて
測定した。5X106細胞を、血清不含M3培地1mlに接種し、
３ないし４日間誘導した。上清において測定したtPA濃
度を第２表に示す。
測定した。5X106細胞を、血清不含M3培地1mlに接種し、
３ないし４日間誘導した。上清において測定したtPA濃
度を第２表に示す。
標準的軟質寒天クローニング法を用いたポリクローナ
ル培養Ｂから誘導した２種の単一クローン培養と共にポ
リクローナル培養Ｂのスケールアップは、第３表に示す
ようにtPA産生において有意な増加をもたらした。
ル培養Ｂから誘導した２種の単一クローン培養と共にポ
リクローナル培養Ｂのスケールアップは、第３表に示す
ようにtPA産生において有意な増加をもたらした。
250ml〜2000mlのスピナーフラスコにおいて、細胞を
懸濁培養として維持した。培地は、300μＭのハイグロ
マイシンＢを補足したM3を用いた。培養は24±１℃にて
インキュベートし、50〜60rpmで撹拌した。細胞密度
は、一般的に、1ml当たり106および107間の細胞を維持
した。
懸濁培養として維持した。培地は、300μＭのハイグロ
マイシンＢを補足したM3を用いた。培養は24±１℃にて
インキュベートし、50〜60rpmで撹拌した。細胞密度
は、一般的に、1ml当たり106および107間の細胞を維持
した。
誘導については、細胞を、低速遠心分離によって収穫
し、ハイグロマイシンＢを補足したM3培地において、1m
l当たり5X106細胞の密度で再懸濁させた。塩化カドミウ
ムを10μＭの最終濃度まで添加し、該培養を、tPAを収
穫する前に血清不含培地において、３ないし４日間増殖
させた。
し、ハイグロマイシンＢを補足したM3培地において、1m
l当たり5X106細胞の密度で再懸濁させた。塩化カドミウ
ムを10μＭの最終濃度まで添加し、該培養を、tPAを収
穫する前に血清不含培地において、３ないし４日間増殖
させた。
実施例３ 調節細胞培地からのtPAの精製 PAM−２セファロース（Sepharose）（アメリカン・ダ
イアグノスティカ、グリーンウィッチ、コネチカット州
（American Diagnostica,Greenwich,Ct.）は、セファロ
ース4Bに結合したtPAモノクローナル抗体である。PAM−
２セファロース5ml（１カラム容量当たり約10mgのモノ
クローナルtPA抗体）を、1X6cmカラムに移し、2M KSCN
を用いて5ml/時間の速度にて一夜洗浄し、ゆるく結合し
たモノクローナル抗体を除去した。洗浄後、リン酸塩緩
衝セライン（PBS）50mlを、該カラムに通し、該ゲルを
平衡にした。
イアグノスティカ、グリーンウィッチ、コネチカット州
（American Diagnostica,Greenwich,Ct.）は、セファロ
ース4Bに結合したtPAモノクローナル抗体である。PAM−
２セファロース5ml（１カラム容量当たり約10mgのモノ
クローナルtPA抗体）を、1X6cmカラムに移し、2M KSCN
を用いて5ml/時間の速度にて一夜洗浄し、ゆるく結合し
たモノクローナル抗体を除去した。洗浄後、リン酸塩緩
衝セライン（PBS）50mlを、該カラムに通し、該ゲルを
平衡にした。
誘導ドロソフィラ細胞（１リットル）からの滅菌濾過
した調節培地を、0.8ml/minの速度にてゆっくりと該カ
ラムに通した。ついで、該カラムを、0.8ml/minの速度
にてPBS30ml、つづいてPBSの0.5M KSCN30mlで洗浄し
た。該tPAを1.5M KSCNつづいて2.0M KSCN30mlを用い、
0.8ml/minの流速で溶出した。90％以上のtPAが、1.5M K
SCNで一本のピークにて溶出した。しっかりと結合して
いるいずれの残tPAをも溶出するために2.0M KSCNで溶出
した後、該カラムをPBS30mlで洗浄し、ついでPBSの0.01
％ナトリウムアジド中に貯蔵した。
した調節培地を、0.8ml/minの速度にてゆっくりと該カ
ラムに通した。ついで、該カラムを、0.8ml/minの速度
にてPBS30ml、つづいてPBSの0.5M KSCN30mlで洗浄し
た。該tPAを1.5M KSCNつづいて2.0M KSCN30mlを用い、
0.8ml/minの流速で溶出した。90％以上のtPAが、1.5M K
SCNで一本のピークにて溶出した。しっかりと結合して
いるいずれの残tPAをも溶出するために2.0M KSCNで溶出
した後、該カラムをPBS30mlで洗浄し、ついでPBSの0.01
％ナトリウムアジド中に貯蔵した。
ドロソフィラ細胞において産生したtPAの分析は、誘
導期間での細胞密度と産生したtPA量の間に直接相関関
係を示した。密度5X106における細胞誘導が、培地中に
分泌されるtPAの濃度を大いに増加させることが判明し
た。
導期間での細胞密度と産生したtPA量の間に直接相関関
係を示した。密度5X106における細胞誘導が、培地中に
分泌されるtPAの濃度を大いに増加させることが判明し
た。
検定 tPA濃度は、HPLC、S2251検定、製造業者（パンデック
ス研究所、インコーポレイテッド、マンデライン、イリ
ノイ州（Pandex Laboratories,Inc.Mundelein,Ill）に
よって提供されるプロトコルに従って行う粒子蛍光イム
ノアッセイ（PCFIA）、および実質的に製造業者（アメ
リカン・ダイアグノステカ）によって提供されるプロト
コルにおける記載のように実施する酵素イムノアッセイ
（EIA）を包含する種々の標準検定を用いて測定した。
ス研究所、インコーポレイテッド、マンデライン、イリ
ノイ州（Pandex Laboratories,Inc.Mundelein,Ill）に
よって提供されるプロトコルに従って行う粒子蛍光イム
ノアッセイ（PCFIA）、および実質的に製造業者（アメ
リカン・ダイアグノステカ）によって提供されるプロト
コルにおける記載のように実施する酵素イムノアッセイ
（EIA）を包含する種々の標準検定を用いて測定した。
S2251検定を用いた場合、精製tPAの活性は、少なくと
も哺乳動物細胞における発現で報告されている最高値と
同じ強度であることが判明した。
も哺乳動物細胞における発現で報告されている最高値と
同じ強度であることが判明した。
前記記載および実施例は、その好ましい具体例を含
め、本発明を十分に開示している。記載方法の変形は分
子遺伝学および関連分野における当業者にとっては明ら
かであり、前記本発明の範囲内にある。
め、本発明を十分に開示している。記載方法の変形は分
子遺伝学および関連分野における当業者にとっては明ら
かであり、前記本発明の範囲内にある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アリアン・アドリーネ・バン・デル・ス トラテン−ポントツ アメリカ合衆国ペンシルベニア州19146、 フィラデルフィア、ロドマン・ストリー ト 1911番 (56)参考文献 特開 昭62−285787（ＪＰ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】ドロソフィラ（Drosophila）細胞における
異種遺伝子産生物の発現方法であって、ドロソフィラ細
胞を、異種遺伝子産生物についての遺伝子発現ユニット
およびDHFR（またはハイグロマイシンＢ）選択マーカー
と共トランスフェクションし、そのトランスフェクショ
ンされた細胞を培養し、それによってさらに増幅するこ
となくDHFR（またはハイグロマイシンＢ）遺伝子および
異種遺伝子発現ユニットが発現し、異種遺伝子産生物を
収集することからなる方法。 - 【請求項２】プロモーターがメタロチオネインプロモー
ターである請求項１記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4773687A | 1987-05-08 | 1987-05-08 | |
| US047736 | 1987-05-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63304982A JPS63304982A (ja) | 1988-12-13 |
| JP2706260B2 true JP2706260B2 (ja) | 1998-01-28 |
Family
ID=21950656
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63111390A Expired - Lifetime JP2706260B2 (ja) | 1987-05-08 | 1988-05-06 | ドロソフィラ細胞における外来性遺伝子の発現 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0290261B1 (ja) |
| JP (1) | JP2706260B2 (ja) |
| AT (1) | ATE90969T1 (ja) |
| AU (1) | AU618952B2 (ja) |
| CA (1) | CA1341345C (ja) |
| CY (1) | CY1929A (ja) |
| DE (1) | DE3881953T2 (ja) |
| DK (1) | DK175595B1 (ja) |
| ES (1) | ES2058274T3 (ja) |
| HK (1) | HK1006852A1 (ja) |
| IE (1) | IE63005B1 (ja) |
| PT (1) | PT87424B (ja) |
| ZA (1) | ZA883213B (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01108995A (ja) * | 1987-10-23 | 1989-04-26 | Hoechst Japan Kk | 培養動物細胞による蛋白質の産生を向上させるための遺伝子増幅方法 |
| CA2003794C (en) * | 1988-12-01 | 2000-02-08 | Hanne R. Johansen | Expression of hiv proteins in drosophila cells |
| KR910700352A (ko) * | 1988-12-21 | 1991-03-14 | 스미스클라인 바이올로지칼즈(s.a.) | 곤충 세포내에서 플라스모듐 서컴스포로 조이트 단백질의 발현 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL68561A (en) * | 1982-05-05 | 1991-01-31 | Genentech Inc | Preparation of polypeptide with human tissue plasminogen activator function,processes for making it,and dna and transformed cell intermediates thereof |
| IE56716B1 (en) * | 1983-01-19 | 1991-11-20 | Genentech Inc | Method for producing human tpa and expression vectors therefor |
| AU593264B2 (en) * | 1985-07-10 | 1990-02-08 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Chromosomal DNA sequence, expression vector for human tissue plasminogen activating factor, cultured cells transfected with same and method of producing said activating factor |
| JP2515299B2 (ja) * | 1986-06-03 | 1996-07-10 | 三井東圧化学株式会社 | ヒ−トシヨツクたんぱく質遺伝子ｈｓｐ８３を含む発現ベクタ−及びこれを用いる誘導的発現 |
-
1988
- 1988-05-02 CA CA000565686A patent/CA1341345C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-05-03 AU AU15510/88A patent/AU618952B2/en not_active Expired
- 1988-05-04 DK DK198802433A patent/DK175595B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-05-05 ZA ZA883213A patent/ZA883213B/xx unknown
- 1988-05-05 PT PT87424A patent/PT87424B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-05-06 JP JP63111390A patent/JP2706260B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-06 DE DE88304093T patent/DE3881953T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-06 ES ES88304093T patent/ES2058274T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-06 AT AT88304093T patent/ATE90969T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-05-06 IE IE137388A patent/IE63005B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-05-06 EP EP88304093A patent/EP0290261B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-05-16 CY CY192997A patent/CY1929A/xx unknown
-
1998
- 1998-06-18 HK HK98105660A patent/HK1006852A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CY1929A (en) | 1997-05-16 |
| IE63005B1 (en) | 1995-03-22 |
| DE3881953D1 (de) | 1993-07-29 |
| EP0290261B1 (en) | 1993-06-23 |
| EP0290261A1 (en) | 1988-11-09 |
| PT87424B (pt) | 1992-09-30 |
| IE881373L (en) | 1988-11-08 |
| JPS63304982A (ja) | 1988-12-13 |
| ZA883213B (en) | 1989-03-29 |
| HK1006852A1 (en) | 1999-03-19 |
| CA1341345C (en) | 2002-03-05 |
| DK243388D0 (da) | 1988-05-04 |
| ATE90969T1 (de) | 1993-07-15 |
| DE3881953T2 (de) | 1993-09-30 |
| DK243388A (da) | 1988-11-09 |
| AU1551088A (en) | 1988-11-10 |
| DK175595B1 (da) | 2004-12-13 |
| ES2058274T3 (es) | 1994-11-01 |
| AU618952B2 (en) | 1992-01-16 |
| PT87424A (pt) | 1989-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU1830081C (ru) | Способ получени рекомбинантного активированного белка С человека | |
| KR100188302B1 (ko) | 활성화피브린용해성과항-혈전성단백질 | |
| BG60253B2 (bg) | Човешки тъканен плазминогенен активатор | |
| JP2003504082A (ja) | エカリンポリペプチド、エカリンをコードするポリヌクレオチド、及びその利用のための方法 | |
| JPH05103678A (ja) | チモーゲン型ヒトプロテインｃの発現のためのベクターおよび化合物 | |
| JPH0246296A (ja) | 雑種プロテインｃ及びその製造方法 | |
| JP3043403B2 (ja) | ヒトプラスミノーゲン変異体を発現させる方法及びその原料 | |
| EP0195592A2 (en) | Factor IX protein | |
| US5171569A (en) | Factor IX preparations uncontaminated by plasma components or pox virus | |
| CA1341459C (en) | Modified fibrinolytic enzymes | |
| JP2706260B2 (ja) | ドロソフィラ細胞における外来性遺伝子の発現 | |
| JP2851287B2 (ja) | 酵素前駆体型ヒトプロテインｃの発現のためのベクターおよび化合物 | |
| JP2728240B2 (ja) | ヒトプロテインｃ変異体及びその製造方法 | |
| JP2585532B2 (ja) | 動物細胞の形質転換体及びそれを得る方法並びにその形質転換体を用いてｔ−ＰＡを生産する方法 | |
| US5534419A (en) | Method of producing foreign gene products | |
| JP3083324B2 (ja) | 動物細胞の培養方法 | |
| JP3045307B2 (ja) | 活性化プロテインｃを生成するための細胞培養法 | |
| EP0225177B1 (en) | Dna sequence coding for human tissue plasminogen activator | |
| JP2557385B2 (ja) | ヒトプロテインｓ | |
| JP5851410B2 (ja) | 組換えビタミンｋ依存性タンパク質の生成法 | |
| RU2079553C1 (ru) | Способ получения эукариотического полипептида | |
| JPS6232896A (ja) | 有用たん白質の産生方法 | |
| JP3265587B2 (ja) | 血清非要求性ジヒドロ葉酸還元酵素欠損チャイニーズ・ハムスターオバリー細胞の形質転換体、その製造方法及び異種蛋白質の製造方法 | |
| JPS6344898A (ja) | ヒトアンチトロンビン３（ａｔ３）の製造 | |
| JP2832358B2 (ja) | モノクローナル抗体の増収法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081009 Year of fee payment: 11 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081009 Year of fee payment: 11 |