BG60253B2

BG60253B2 - Човешки тъканен плазминогенен активатор

Info

Publication number: BG60253B2
Application number: BG60834A
Authority: BG
Inventors: David Goeddel; William Kohr; Diane Pennica; Gordon Vehar
Original assignee: Genentech, Inc.
Priority date: 1982-05-05
Filing date: 1983-05-05
Publication date: 1994-03-24
Also published as: DE93619T1; NO852065L; ZW10483A1; DK174236B1; PT76636B; PL152438B1; MY8700119A; EP0093619B2; CA1293211C; GR79202B; JPH0448440B2; IL68561A0; JPH05137583A; FR2526443B1; IE831024L; JPH0216981A; GB2119804B; DE3316297A1; BR8302318A; AU1414283A

Abstract

Активаторът намира приложение в медицината за профилактика и лечение на пациенти с различни сърдечно-съдови неразположения и заболявания. Полученият чрез рекомбинантни клетки-приемници деглюколизиранчовешки такънен плазминогенен активатор е високопречистен. 15 претенции, 14 фигури

Description

Изобретението се отнася до човешки тъканен плазминогенен активатор, съответстващ на този, намерен в човешки серум и/или в тъкани, и до нови форми и състави, които го съдържат, и особено до средствата и методите за получаването на човешки тьканен плазминогенен активатор с еднородни, терапевтично значими качества.

Изобретението се базира отчасти на откритието на ДНК последователност и на изведената последователност на аминокиселини на човешкия плазминогенен активатор. Това откритие създаде възможност за производство на човешки плазминогенен активатор чрез прилагането на рекомбинантна ДНК технология, по която се получава достатъчен в количествено и качествено отношение материал, за да се започнат и проведат изследвания върху животни и хора в клиника, които да докажат приложимостта му, без ограниченията, присъщи на методите за изолация, използвани досега, включващи получаване и екстракция от налична клетъчна култура. Изобретението се отнася до всяко възможно приложение в посочения смисъл.

Публикациите и другите материали, разкриващи съществуващото състояние на техниката в тази област, и осигуряващи допълнителни подробности, отнасящи се до осъществяването на изобретението, са включени в описанието чрез рефериране, а за по-голямо удобство са изброени под номер и съответно групирани в приложената библиография.

Предшестващо състояние на техниката А. Човешки тьканен плазминогенен активатор

Фибринолитичната система е в динамично равновесие с коагулиращата система, поддържаща непокътнати кръвоносните съдове. Коагулиращата система отлага фибрин като матрица, служеща за възстановяване на хемостатичния статус. Фибринолитичната система отстранява фибринната мрежа, след като е достигнат хемостатичният статус. Фибри нолитичният процес се осъществява посредством протеолитичния ензимен плазмин, който се образува от плазмения протеин, предшестващ плазминогена. Плазминогенът се превръща в плазмин чрез активиране с активатор.

На пазара са налични два активатора стрептокиназа и урокиназа, предназначени за лечение на акутни заболявания на кръвоносната система, например инфаркт на миокарда, удар, белодробна емболия, дълбоки венни тромбози, запушване на периферни артерии и други венни тромбози. Общо тези заболявания се считат за главна опасност и рисков фактор.

Подчертаната етиологична основа за тези заболявания насочва било към частично, а в някои случаи, и към пълно запушване на кръвоносен съд със кръвен съсирек-тромб или тромбоемболус. Традиционното лечение против коагулиране с хепарин или кумарин не помага за директното разтваряне /разпръсване/ на тромбите и тромбоемболиите. Приложението в практиката на описаните тромболитични средства, стрептокиназата и урокиназата е ефективно, но за всяко от тях има сериозни ограничения. Нямат висок афинитет към фибрина, следователно и двете активират едновременно и кръвообращението и свързания с фибрина плазминоген. Плазминът, формиран в циркулиращата кръв, се неутрализира сравнително бързо и не участва в тромболизата. Остатъчният плазмин разгражда някои протеинсъсирващи фактори, например фибриноген, Фактор V и Фактор VIII, които съставят хеморагичния потенциал. В допълнение, стрептокиназата е силно антигенна и пациенти с висок титър на антителата не реагират задоволително на лечението и не могат да бъдат подложени на продължително лечение. Терапията с урокиназата е скъпа, тъй като се изолира от човешка урина или тъканна култура, и затова не е широко възприета в клиничната практика. Урокиназата е обект на редица разработки /напр. лит.източници от 1 до 6/.

Така наречените плазминогенни активатори се изолират от различни човешки тъкани, например от тъканта на матката, кръвта, серума /лит.източници от 7 до 11/ и от клетъчна култура /лит.източник 94/. Състави на тяхна база също са описани /лит.източници 12 и 13, 14 и 18/. Плазминогенните активатори, посочени в тези източници, са класирани в две главни групи: урокиназен тип плазминогенни активатори /u-РА/ и тьканен тип плазминогенни активатори /t-РА/ въз основа на разликите в техните имунологични свойства. Съкращенията u-РА и t-PA са въведени на XXVIII-та среща “Meeting of the internacional Committee on Thrombosis and Hemostasis, Bergamo”, Италия, 27.VI1.1982 r.

Идентифицирана е човешка меланомна линия, която секретира t-PA. Характерно за този меланомен плазминогенен активатор е, че той е неразличим, както имунологично, така и по аминокиселнния си състав от плазминогенния активатор, изолиран от нормална човешка тъкан /лит.източници 19 и 88/.

Продуктът е изолиран в относително чиста форма, охарактеризиран е и е установено, че същият е силно активно фибринолитично средство /лит.източник 20/.

Някои изследвания /лит.източници от 95 до 98/, при които е използван t-PA, изолиран от меланомна клетъчна линия, показват неговия по-висок афинитет спрямо фибрина, в сравнение с този на плазминогенните активатори от урокиназен тип. По-интензивните изследвания от човешки t-PA като потенциално тромболитично средство, са затруднени от неговата изключително ниска концентрация в кръвта, тъканните екстракти, перфузатите на кръвоносни съдове и клетъчни култури.

Установено е, че рекомбинантна ДНК и свързаните с нея технологии са най-ефективният начин за осигуряването на необходимите големи количества висококачествен плазминогенен активатор от човешка тъкан, порано наричан човешки плазминогенен активатор, по същество свободен от други човешки протеини. Такива материали вероятно биха показали биологична активност, създаваща възможност за тяхното клинично използване при лечението на различни сърдечно-съдови заболявания.

Б. Рекомбинантна ДНК технология

Микробиолозите рекомбинират различни ДНК последователности, създавайки нови ДНК единици, способни да продуцират обилни количества екзогенни протеинови продукти в трансформирани микробни и клетъчни култури. Създадени са общи методи и средства за лигатиране in vitro на различни фрагменти от ДНК с тъпи или лепливи краища, продуциращи мощни експресионни средства, които се използват при трансформиране на отделни организми, насочвайки по този начин техния ефективен синтез към желания екзогенен продукт.

ДНК рекомбинацията на съществените елементи, т.е. произход на репликация, една или повече характеристики на фенотипна селекция /подбор/, експресионен промотор, хетероложно генно включване и оставащ вектор, обикновено се осъществява извън клетката гостоприемник. Полученото рекомбинантно възпроизводимо експресионно средство или плазмид, което може да бъде реплицирано, се въвежда в клетките посредством трансформация и при култивирането на трансформанта е възможна да се получат големи количества рекомбинантни продукти. Когато генът е включен правилно по отношение на частите /областите/, които управляват транскрипцията и транслацията на кодираната в ДНК информация, полученото експресионно средство е полезно и приложима за действително произвеждане на полипептидна последователност, за която кодира включения ген, а процесът се нарича експресия. Произведеният в резултат продукт може да бъде получен при необходимост на клетката гостоприемник в микробната система и възстановяване на продукта чрез подходящо пречистване от други протеини.

На практика използването на рекомбинантната ДНК технология може да доведе до експресия на изцяло хетероложни полипептиди така наречената директна експресия или в даден случай може да доведе до експресия на хетероложен полипептид, включен във аминокиселинната последователност на хомоложен полипептид. В последния случай желаният биологично активен продукт може да се е превърнал в биологично неактивен от присъединяването към хомоложния полипептид и остава такъв, докато хомоложният /хетероложен полипептид не се разцепи в извънклетъчното пространство /лит.източници 21 и 22/.

Установено е използването на клетъчни или тъканни култури, за изучаване генетиката и физиологията на клетката. Създадени са средствата и методите за поддържане на постоянна клетъчна линия, получена посредством последователна серия превръщания от изолат на нормални клетки. Такива клетъчни линии се поддържат върху твърда основа /носител/ в течна среда или посредством култивиране в суспензия, съдържаща хранителни вещества. Получаването на препаратите в по-големи количества поставя проблеми само от механично естество. Повече пояснения на предшестващото състояние на техниката в тази област са посочени в /лит.източници 23 и 24/.

Биохимията на протеините е полезно и необходимо допълнение към биотехнологията. Клетките, продуциращи желания протеин, продуцират също така и стотици други протеини, ендогенни продукти на метаболизма на клетката. Тези замърсяващи протеини, както и други съединения, ако не се отстранят от желания протеин, биха могли да се окажат токсични при администрирането им у животните и човека по време на терапевтичното лечение с желания протеин. Биохимията на протеините предоставя методи за разделяне, подходящи за специфичната система, начини за осигуряване на хомогенен продукт, съхраняван за употреба в бъдеще. Биохимията на протеините също така доказва идентичността на желания продукт, охарактеризира го и потвърждава, че клетките са го продуцирали без промени или мутации. Този клон на науката също така е включен в образеца на биоанализа, изследванията за стабилност и други методи, които по необходимост се прилагат преди успешните клинични изследвания и пускането на препаратите в търговската мрежа.

Техническа същност на изобретението

Изобретението се базира на откритието, че рекомбинантната ДНК технология може да се използва с успех за продуцирането на човешки тъканен плазминогенен активатор /tРА/, за предпочитане в директна форма, и в количества, достатъчни за започване и провеждане на опити с животни и с хора в клиника, като необходимо условие преди реализацията на пазара. Продуктът човешки t-PA е подходящ за използване, във всичките му форми при профилактиката или лечението на пациенти с различни сърдечно-съдови неразположения и заболявания. Един от основните аспекти на изобретението е насочен към методите за лечение на съдови смущения при хора, чрез използване на t-PA и към подходящите фармацевтични състави на базата на t-PA.

По-нататък изобретението включва получаването и използването по същество на чист човешки тъканен плазминогенен активатор.

Продуктът, продуциран с помощта на генетично обработени микроорганизми или клетъчни културални системи, осигурява получаването на човешки тъканен плазминогенен активатор по много по-ефикасен начин, в сравнение с известните методи. В допълнение, в зависимост от клетката приемник, човешкият тъканен плазминогенен активатор може да съдържа свързани гликозиди с по-голяма или по-малка големина в сравнение с естествения продукт. Полученият съгласно изобретението t-PA не съдържа замърсители, обикновено свързани с него в нерекомбинантната му клетъчна форма.

Съгласно изобретението са създадени ДНК експресионни средства, способни да се реплицират /повтарят/, носещи гении последователности, които кодират човешки тъканен плазминогенен активатор във форма, която може да се експресира, към видове микроорганизми или клетъчни култури, трансформирани с тези средства, и до микробиални или клетъчни култури, на така трансформираните видове или култури, способни да продуцират човешки тъканен плазминогенен активатор. Друг аспект на изобретението е насочен към различните методи, използвани за изграждането на посочените генни последователности, ДНК експресионните средства, щамове микроорганизми и клетъчни култури и специфичното им изпълнение. Изобретението се отнася до получаването на ферментационни култури на посочените микроорганизми и клетъчни култури.

Описание на приложените фигури

Фигура I представлява електрофореза с 10 % натриев додецилсулфат полиакриламиден гел /SDS PAGE/ на белязани с 35 Sметионин протеини, които могат да се утаяват с анти t-PA IgG, получени от меланомни клетки със или без протеазен инхибитор;

Фигура 2 - данни от електрофорезата на имуноутаени продукти от транслация на иРНК фракции, секретирани от меланомни клетки;

Фигура 3 - хибридна матрица на 96 бактериални колонии, трансформирани с сДНК, при използването на пул, отбелязан с ³²р 14мер, като проба, от последователност от 5 аминокиселини на човешки t-PA;

Фигура 4 - рестрикционната ендонуклеазна карта на пълната дължина на човешка t-PA сДНК;

Фигура 5а, 5в и 5с - нуклеотидна последователност и съответната аминокиселинна последователност на пълната дължина на човешка t-PA сДНК;

Фигура 6-схема на строежа на експресионния плазмид р ARIPA°;

Фигура 7 - резултатите от анализа на фибринна плочка за фибринолитична активност на клетки, трансформирани с р ARIPA⁰;

Фигура 8 - данните от HPLC /високо ефективна течна хроматография/ на пептиди от човешки t-PA, смлян с трипсин;

Фигура 9 - строеж на плазмид, кодиращ за директна експресия на зрял човешки t-PA в E.Coli;

Фигура 10 - резултатите от изследването на фибринна плочка за фибринолитична активност на човешки t-PA, продуцирана от E.coli, трансформирани с pt-PAtrpl2;

Фигура 11 - строежа на DHFR /мутант или некултивиран тип/ t-PA кодиращи плазмиди, подходящи за трансформиране в тъканни култури от клетки на бозайници;

Фигура 12 - схематична диаграма на човешки тъканен плазминогенен активатор, получен по описания в пример 1 метод.

Подробно описание

А. Определения

Използвани термини: “човешки тъканен плазминогенен активатор” или “човешки t-PA” или “t-PA означават неприсъщ човешки /тъканен тип/ плазминогенен активатор, продуциран с помощта на микробни системи или клетъчни култури, който в биологично активна форма съдържа протеазна част и съответстващите на тези тъкани плазминогенни активатори, съдържащи се в човешката тъкан. Човешкият тъканен плазминогенен активатор, получен съгласно изобретението, е идентифициран посредством определен ДНК ген и съответното аминокиселинно секвениране. Трябва да се разбира, че естествените алелни типове са индивидуални. Тези типове се проявяват чрез аминокиселинни различия в цялата последователност или чрез делеции, замествания, включвания, превръщане или добавяне на аминокиселина /и/ в посочената последователност. В допълнение, разполагането и степента на глюкозилиране зависят от естеството на гостоприемника.

При използването на рекомбинантната

ДНК технология съществува възможност за получаване на различни производни на човешкия тъканен плазминогенен активатор, различно модифициран с помощта на единично или многократно заместване на аминокиселина, заличаване, допълване или разместване, например, посредством директна мутагенеза на лежащата в основата ДНК. Включват се препарати на производни, запазващи съществения крингьл участък и серинно-протеазния участък, които са характерни за човешкия тъканен плазминогенен активатор, съгласно изобретението, модифициран по посочения погоре начин. Всички подобни алелни типове и модификации, водещи в резултат до получаването на производни на човешки тъканен плазминогенен активатор, се включват в обхвата на изобретението, както и други подобни, но неприсъщи на човека /тъканен-тип/ плазминогенни активатори, подобни физически и биологически, доколкото характерната за човешкия тъканен плазминогенен активатор активност остава непроменена.

Човешки тъканен плазминогенен активатор се получава, като в даден случай съдържа като първа аминокиселина метионин, включена при началния ATG сигнален кодон на структурния ген, в друг случай, където метионинът е вътре - или извънклетъчно отцепен, съдържа естествената за него първа аминокиселина или в трети случай се получава заедно с неговия сигнален полипептид или свързан протеин, различен от обичайния сигнален полипептид, или със сигналния полипептид, или един свързан протеин, който може да се отцепи специфично вътре в или извънклетъчното пространство /лит.източник 21/ или в друг случай чрез директна експресия в зряла форма, без да е необходимо отцепването на какъвто и да е външен, ненужен полипептид. Последният е от особено значение, когато даден гостоприемник на е в състояние, или не може ефективно да отстрани сигнален пептид, когато експресионното средство е предназначено за експресия на тъканния плазминогенен активатор заедно с неговия сигнален пептид. Във всеки от случаите, така полученият човешки t-PA в различните му форми се възстановява и пречиства до степен, в която става годен за приложение при лечението на различни съдови смущения или заболявания.

По-нататък t-PA има форми, които включват двата протеина - едноверижен /1верига/ протеин и 2-верижния протеин, който произхожда протеолитично от I-верижния. Съгласно теорията 2-верижния протеин е свързан с продуциран фибрин и протеолитичната конверсия /превръщане/ на 1- в 2-верижен материал се появява на мястото на превръщането на плазминоген в плазмин. Съгласно изобретението е осигурено приложението иа едноверижен протеин за конверсия in vivo, както е описано или приложението на двуверижен протеин, който също се е оказал активен. Двуверижният протеин може да се получи посредством протеолитично превръщане in vitro, след като е получен едноверижният материал. Така нареченият крингьл участък е разположен пред серинпротеазната част и се смята, че играе значителна роля при свързването на тьканния плазминогенен активатор, описан погоре, към фибринната матрица, вследствие на което се наблюдава специфична активност на тьканния плазминогенен активатор съгласно изобретението спрямо съществуващи тромби. Тъканният плазминогенен активатор съгласно изобретението съдържа ензимно активна част, съответстваща на природното вещество, а терминът човешки тьканен плазминогенен активатор определя продукти, включващи такава част самостоятелно или заедно с допълнителни аминокиселинни последователности до достигане на пълната дължина на молекулата.

За да се обобщи човешкият t-PA съгласно изобретението има функционална насоченост, способен е да катализира превръщането на плазминоген в плазмин, да свързва фибрин и е класифициран като t-PA на базата на имунологичните му свойства, описани по-горе.

Когато се използва за описание на състоянието на човешки t-PA, изразът “съществено чиста форма” означава, че t-PA е свободен от протеин и други материали, които обикновено са свързани с човешкия t-PA, когато последният е продуциран с помощта на нерекомбинантни клетки, т.е. както се среща в природата.

Терминът “DHFR протеин” се отнася до протеин, който е способен да проявява активност, свързана с дихидрофолатна редуктаза /DHFR/, и който поради това е необходимо да се продуцира от клетки, способни да преживеят върху среда, на която не достига или липсва хипоксантин, глицин и тимидин /

HGT среда/. Обикновено клетки, несъдържащи DHFR протеин, са неспособни да се култивират в тази среда, а клетки, които съдържат DHFR протеин, са способни да нарастват в нея.

Изразът “клетки, чувствителни спрямо МТХ” се отнася до клетки, които са неспособни да се култивират в среда, която съдържа DHFR инхибитор метотрексат /МТХ/. Например клетки, чувствителни спрямо МТХ са такива, които без генетична промяна или дообработване по друг начин няма да могат да нарастват при условия, подходящи за клетъчния тип, когато концентрацията на МТХ е 0,2 микрограм/мл или по-висока. Някои клетки, като бактериалните, не проявяват чувствителност спрямо МТХ, което се дължи на тяхната неспособност да пропускат МТХ вътре в клетката, дори да съдържат DHFR, който при други случаи е чувствителен спрямо това лекарство. Общо клетки, които съдържат като собствен некултивиран тип DHFR протеин, са чувствителни към метотрексат, ако проявяват пропускливост спрямо МТХ.

Изразът некултивиран тип DHFR се отнася до дихидрофолатна редуктаза, която обикновено се намира в описаните организми, некултивираният тип DHFR обикновено е чувствителен in vitro към ниски концентрации метотрексат.

Изразът “DHFR протеин с нисък афинитет на свързване към МТХ” представлява функционална дефиниция. Това е DHFR протеин, който, когато се образува в клетките, позволява растежа на чувствителните спрямо МТХ клетки в среда, съдържаща 0,2 микрограма/мл или повече МТХ. Прието е, че такава функционална дефиниция зависи от лекотата, с която организмът продуцира DHFR с нисък афинитет на свързване към МТХ, както и от самия протеин. Обаче, както се използва в контекста на това описание, балансът между тези два механизма не е от значение. За изобретението е от значение само клетките, преживели при тези нива МТХ, без оглед на това дали тази способност да е постигната чрез повишаване на експресията в допълнение на присъщата способност на получения DHFR. DHFR-протеин, който се включва в това определение, е описан в патент на US 459, 151 от 19.01.1983.

Изразът “експресионен вектор” включ ва вектори, които са способни на експресия на ДНК последователностите, включени тук, като такива последователности са оперативно свързани към други последователности, способни да инициират експресията им. Подразбира се, макар че не винаги е изрично подчертано, че тези експресионни вектори трябва да могат да се реплицират в организмите гостоприемници, като епизоми или като съставна част на хромозомната ДНК. Ясно е, че липсата на способност за репликация би ги направила невъзможни за ефективна работа. Всъщност “експресионен вектор” представлява функционална дефиниция и всяка ДНК последователност, която е способна да инициира експресия на специфичен ДНК-код съгласно изобретението, е включена в този термин, тъй като той се отнася до специфична последователност. Общо, експресионните вектори, използвани при рекомбинантните ДНК технологии, са често под формата на “плазмиди”, което се отнася до кръгови двойноверижни ДНК пръстени, които в тяхната векторна форма не са свързани към хромозома. В описанието на изобретението изразите “плазмид” и “вектор” се използват равнозначно, като плазмидът е най-използваната форма на вектор. Обаче в обхвата на изобретението се включват други такива форми на експресионни вектори, които служат като еквивалентни функции и които се поясняват по-нататък.

Изразът “рекомбинантни клетки приемници” се отнася до клетки, които са трансформирани с вектори, изградени при използването на рекомбинантни ДНК технологии. Както е определено тук, t-PA се продуцира в постигнатите количества, вследствие на тази трансформация, а не в по-малки количества, даже често в минимални, както би се продуцирал с помощта на нетрансформиран приемник. t-PA, продуциран посредством такива клетки, може да се означи като “рекомбинантен t-PA”.

Б. Клетъчни култури гостоприемници и вектори.

Описаните тук вектори и методи са подходящи за използване при клетки приемници на голям брой прокариотни и еукариотни организми.

Прокариотните организми са предпочитани за клониране на ДНК последователности при изграждането на векторите, които се при лагат съгласно изобретението. Например E.coli К12 от вид 294 /АТСС № 31446/ е особено полезен. Други микробиални видове, които могат да бъдат използвани, включват E.coli видове, като E.coli В, и E.coli XI776 / АТСС № 31537/. Тези примери поясняват, но не ограничават изобретението.

Прокариотите могат също така да бъдат използвани за експресия. Изброените по-горе щамове, както и E.coli W3110 /F', λ ·, прототрофичен, АТСС № 27325/, бацили, като Bacillus subtilus и други ентеробактерии, като Salmonella typhimurium или Serratia marcesans и различни видове pseudomonas, които също така могат да бъдат използвани.

Плазмидни вектори, съдържащи репликон и контролни последователности, които произхождат от видове, съвместими с клетката приемник, се използват във връзка с тези приемници. Векторът обикновено носи място за репликация и маркиращи редове, които са способни да осигурят фенотипна селекция в трансформираните клетки. Например E.coli обикновено се трансформира при използването на рВ11322-плазмид, който произхожда от E.coli видове. /Bolivar и кол., Gene 2:95 /1977/ . pBR322 съдържа гени за устойчивост спрямо ампицилин и тетрациклин и така осигурява удобни средства за идентифициране на трансформираните клетки. Плазмидът pBR322 или други микробиални плазмиди също трябва да съдържат или да бъдат модифицирани така, че да съдържат промотори, които могат да бъдат използвани с помощта на микробиалния организъм за експресия на неговите собствени протеини. Промоторите, които най-често се използват при рекомбинантната ДНК технология, включват β· лактамаза /пеницилаза/ и системи лактозни промотори /Chang и кол., Nature, 275:615 /1978/; /ItaKura и кол., Scieance, 198:1056 /1977/; /Goeddel и кол., Nature 281:544 /1979/ и триптофан /trp/ промоторна система /Goeddel и кол., Nucleic Acids Res., 8:4057 /1980/; /ЕРО Appl 0036776/. Докато тези са най-често използваните, открити са също и са използвани и други микробни промотори, отнасящи се техните нуклеотидни последователности, подробности за специалистите в тази област на техниката, за да ги лигират функционално с плазмидни вектори, са публикувани в Siebenlist и кол., Cell 20:269 /1980/.

Освен прокариотите, могат да се изпол зват и еукариотни микроби, катЬ дрождените култури. Най-често използвани от еукариотните микроорганизми са Saccharomyces сегеvisiae или обикновената хлебна мая, въпреки че редица други видове са достъпни. За експресия в Saccharomyces най-често се използва например плазмидът YRp7 /Stinchcomb и кол., Gene, 10:157 /1980/. Този плазмид вече притежава trpl ген, който осигурява селекционен маркер за мутантен щам дрожди, на непритежаващи способността да нарастват в триптофан, например АТСС № 44076 или РЕР4-1 /Jones, Genetics, 85:12 /1977/. Наличието на trpl като характеристика на гостоприемника дрожден клетъчен геном осигурява ефективна среда за осъществяване на трансформация чрез култивиране в отсъствие на триптофан.

Подходящи промоторни последователности в дрождените вектори, включват промоторите за 3-фосфоглицерат киназа /Hitreman и кол., J.Biol.Chem. 255:2073 /1980/ или други глюколитични ензими /Hess etal., J.Adv.Ensyme Reg., 7:149 /1968/; Holland и кол., Biochemistry, 17:4900 /1978/, такива като енолаза, глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа, хексокиназа, пируват декарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкоза-6-фосфат изомераза, 3-фосфоглицерат мутаза, пируват киназа, триосефосфат изомераза, фосфоглюкоза изомераза, и глюкокиназа. При изграждането на подходящи експресионни плазмиди завършващите последователности, свързани с тези гени, също са лигирани в експресионния вектор 3 на последователността, която трябва да бъде експресирана, за да се осигури полиаденилиране на uRHK и завършване. Други промотори, които имат допълнителното предимство на транскрипция, контролирана посредством условията на култивиране, са промоторните участъци за алкохол дехидрогеназа 2, изоцитохром С, кисела фосфатаза, разграждащи ензими, свързани с азотния метаболизъм и описаната глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа и ензими, които са отговорни за усвояването на матозата и галактозата /Holland, ibid./. Всеки плазмид, съдържащ съвместим с дрождите промотор, като източник на репликация и завършващи последователности, може да бъде използван съгласно изобретението.

Освен посочените микроорганизми, като приемници могат да се използват и култури на клетки от многоклетъчни организми. По принцип всяка такава клетъчна култура може да се използва, независимо дали е взета от гръбначни или безгръбначни животни. Най-голям е интересът към гръбначните клетки и размножаването на гръбначни клетки в култура / тъканна култура/ се превърна през последните години в обичайна методика /Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors /1973/. Примери за такива клетъчни линии, използвани като приемници са VERO и Hela клетки, Chinese hamster ovary /СНО/ клетъчни линии, и VV138, ВНК, COS-7 и MOCK клетъчни линии. Експресионните вектори за такива клетки обикновено включват източник на репликация, промотор, разположен в предната част на гена, който трябва да бъде експресиран, заедно с някакви необходими свързващи рибозоми сайтове, RHK прекъсващи сайтове, полиаденилиращо сайт и транскрипционни завършващи последователности.

Контролните функции на експресионните вектори при прилагането им в клетки на бозайници се осъществяват чрез вирусен материал. Например използваните промотори обикновено са получени от полиома, Adenovirus 2 и най-често от Simian Virus 40 /SV 40/. Първият и последният промотор на SV 40 вируса са особено полезни, той като и двата се получават лесно от вируса като фрагмент, който също съдържа SV 40 вирусен източник на репликация /Fiers и кол., Nature, 273:113 /1978/. Могат също да бъдат използвани помалки или по-големи SV 40 фрагменти, където има осигурен /включен/ приблизително 250 вр последователности, простиращи се от Hind III сайт към Bg II сайт, разположен във вирусния източник на репликация. По-нататък е възможно и често е желателно да се използват промотор или контролни последователности, които естествено са свързани с желаната генна последователност, при условие, че такива контролни последователности са съвместими с клетъчните системи приемници.

Източник на репликация може да бъде осигурен при изграждането на вектор, който да включва външен /чужд/ източник, например, произхождащ от SV 40, или от друг вирус, например Polyoma, Adeno, VSV, BPV и др., или може да бъде осигурен от хромозомния механизъм на репликация на клетката приемник. Ако векторът е включен /интегриран/ в хромозома на клетката приемник, често това е достатъчно.

При подбора на предпочитана клетка приемник за трансфекция с помощта на векторите съгласно изобретението, които включват ДНК последователности, кодиращи едновременно за t-PA и DHFR протеин, подходящо е да се подбира приемникът в съответствие на типа на DHFR протеина, който се използва. Ако се използва див тип DHFR протеин, за предпочитане е да се избере клетка приемник, на която липсва DHFR, с което е възможно използването на DHFR, кодиращата последователност, като маркер за последващата трансфекция в избрана среда, в която липсва хипоксантин, глицин и тимидин. В този случай подходяща клетка приемник е СНО клетъчната линия, на която липсва DHFR активност, приготвена и размножена по описания от Urlaub and Chasin начин в Proc., Natl. Acad. Sci /САЩ/77:4216 /1980/.

Когато, като контролираща последователност се използва DHFR протеин с нисък афинитет на свързване с МТХ, не е необходимо да се използват клетки, резистентни спрямо DHFR. Тъй като мутантът DHFR е резистентен към метотрексат, може да се използва среда, съдържаща МТХ, като средство за селекция на клетки гостоприемници, чувствителни към метотрексат. Повечето от еукариотните клетки, които са способни да абсорбират МТХ, проявяват чувствителност към метотрексат. Пример за такава клетъчна линия е СНО линията, СНО-К1 АТТС № CCI 61.

Примерите, които са описани понататък, поясняват употребата на E.coli при използване на lac и trp промоторна система и използването на СНО клетки, като приемници и експресионни вектори, които включват SV 40 източник на репликация, като промотор. Известно е, че не е трудно да използват аналогични методи за получаването на експресионни вектори за експресия на желани протеинови последователности в алтернативни прокариотни или еукариотни клетки гостоприемници.

Задоволително количество от човешки t-PA са продуцирани от клетъчни култури, като усъвършенстването /пречистването/ на последните при използването на вторично кодираща последователност повишава произвеж даните количества в още по-голяма степер. Вторичната кодираща последователност включва дехидрофолатна редуктаза /DHFR/, която се повлиява от контролирани отвън параметри, като метотрексат, което създава възможност за контролиране на експресията посредством контролирането на концентрацията на метотрексата /МТХ/.

В. Използвани методи.

Ако се използват клетки гостоприемници без непроницаема мембрана, трансфекцията се осъществява с помощта на метода за утаяване с калциев фосфат, описан от Graham and van der Eb, Virologu, 52:546 /1978/. Могат да бъдат използвани и други методи за въвеждане на ДНК в клетките, като ядрено инжектиране или сливане на протоплазми.

Ако се използват прокариотни клетки или клетки, които съдържат здрави клетъчни конструкции, предпочитаният метод за трансфекция е третирането с калций при използване на калциев хлорид, както е описано от Cohen, F.N. и кол., в Proc. Nall. Acod. Sci. /САЩ/, 69:2110 /1972/.

Изграждането на подходящи вектори, които съдържат желаните кодиращи и контролни последователности, се осъществява по стандартните методи на лигиране. Изолираните плазмиди или ДНК фрагменти се разцепват, съединяват се и се лигират наново в желаната форма до образуването на търсените плазмиди.

Разцепването се осъществява посредством третиране с рестрикционен ензим /или ензими/ в подходящ буфер. Общо около 1 микрограм плазмид или ДНК фрагменти се използва с около 1 единица ензим в около 20 микролитра буферен разтвор. /Подходящите буфери и количествата на субстратите за отделните рестрикционни ензими са определени от производителя/. Най-подходящи условия за провеждането му са следните: времетраене около 1 час и температура 37°С. След инкубирането протеинът се изолира посредством екстракция с фенол и хлороформ и нуклеиновата киселина се извлича от водните фракции посредством утаяване с етанол.

Ако се изисква наличието на тъпи краища, препаратът се обработва в продължение на 15 мин при температура 15°С с 10 единици полимераза 1 /Klenow/, екстрахира се с фенолхлороформ и се утаява с етанол.

Разделянето по големина на разцепени те фрагменти се осъществява при използването на 6-процентен полиакриламиден гел, описан от Goeddel., и кол. в Nucleic Acid Res., 8:4057 /1980/.

За осъществяване на лигирането приблизително еквимоларни количества от желаните компоненти с подходящо обработен край за осигуряване на правилно съчетаване се обработват с около 10 единици Т4 ДНК лигаза за 0,5 микрограма ДНК. Когато като компоненти се използват разцепени вектори, може да се окаже полезно да се избегне повторното лигитиране на разцепения вектор, като предварително се обработи с бактериална алкална фосфатаза.

За целите на изследванията за потвърждаване на правилните последователности в изградените плазмиди лигатираните смеси се използват за трансформиране на E.coli К12 вид 294 /АТСС 31446/ и получените след това трансформанти се подбират по устойчивост спрямо ампицилин или тетрациклин. От трансформантите се приготвят плазмиди, анализират се по метода на рестрикцията и/или по метода за определяне на последователностите на Messing и кол., Nucleic Acids Res., 9:309 /1981/ или с помощта на метода на Махам, et al., Methods in Enrumolegu, 65:499 /1980/.

Увеличаването на DHFR протеин кодиращите последователности се осъществява посредством култивиране на клетъчни култури приемници в присъствието на приблизително 20-50,000 пМ концентрации метотрексат, конкуриращ инхибитор на DHFR активността. Ефективните граници на концентрацията зависят в голяма степен от естеството на DHFR гена, протеина и характеристиките на приемника. Ясно е, че определена обща горна и долна граница не може да се даде. Могат също да бъдат използвани подходящи концентрации от други аналози на фолиевата киселина или от други съединения, които инхибират DHFR. Самият МТХ обикновено е удобен, лесно се набавя и е ефективен.

Г. Общо описание на предпочитаните изпълнения.

Човешки тъканен плазминогенен активатор се получава в следващия ред.

1. Човешки меланома клетки, активно продуциращи тъканен плазминогенен активатор, се култивират до сливане.

2. Клетъчни пелети от такива клетъчни култури се екстрахират в присъствието на инхибитори на рибонуклеаза за изолиране на цялата цитоплазмена РНК.

3. Изолира се с помощта на олиго-dt колона информационна RNK /uRHK/ в полиаденилирана форма. Тази uPNK се фракционира по големина при използването на електрофореза с киселинокарбамиден агарозен гел.

4. Геловите фракции, съдържащи тъканна плазминогенна активаторна специфична РНК, се идентифицират по следващия начин. РНК от всяка от геловите фракции се транслира в in vitro система от заешки ретикулоцитни лизати, допълнена с кучешки панкреасни микрозоми. Получените транслационни продукти след това се имунопреципитират със специфично IgG антитяло на човешки тъканен плазминогенен активатор.

5. Подходящата РНК /21 до 24 S/ се превръща в съответната едноверижна комплементарна ДНК /сДНК/, от която се получава двойноверижната сДНК. След поли-dC съединяване тя се включва във вектор, например плазмид, носещ един или повече фенотипни маркери.

6. Получените вектори се използват за трансформиране на бактериални клетки, осигуряващи клонирана сДНК банка. Приготвя се пул от радиобелязани синтетични дезоксиолигонуклеотиди с белязан атом, комплементарни към кодони за известни аминокиселинни последователности в t-PA, например пултът на 8 14-мера 5-dTC/^G/CA/^c/TA/^T/ ТСССА-3' комплементарен към последователности, кодиращи за известния-виж infraаминокиселинна последователност: триптофан-глутаминова киселина-тирозин-цистеинаспаргинова киселина /W-E-Y-C-D/, и се използва за изпробване на банката колонии.

7. От позитивните сДНК колони се изолира плазмид ДНК и се определя последователността.

8. След определяне на секвенираната ДНК, кодираща t-PA, се съединява in vitro за включване в подходящо експресионно средство, което се използва за трансформиране на подходяща клетка гостоприемник, която може да нарастне в култура и да продуцира желания човешки тъканен плазминогенен активатор.

9. Полученият по този начин човешки тъканен плазминогенен активатор има 251 аминокиселини в неговата ензимно серинпротеазна част и крингьл участък, съдържащ предхождаща ги последователност, за който е прието, че е отговорен за фибринното свързване. Зрелият протеин плюс неговата предхождаща предпоследователност съдържа общо 562 аминокиселини.

Описаният метод се прилага успешно за получаването на чист t-PA. Методите съгласно изобретението, използващи допълнителна кодираща последователност, чувствителен спрямо метотрексат, създават възможност за получаването в клетъчни култури приемници на антигенно активен t-PA протеин в количества, по-големи от 0,1 pg, от клетка за ден. При подходящо прилагане на условията за разработка могат да се получат количества, поголеми от 20 pg. По-специално могат да се достигнат нива на експресия на гена, които водят в резултат до получаване на повече от 9 х 10^-6Ptough единици от клетка за ден или при подходяща разработка - повече от 18 х 10'⁴ Ptough единици от клетка за ден на t-PA активност.

Предимството на изобретението е следното. Въпреки че метотрексатьт, като лекарство, обикновено е токсичен за клетките, които го приемат, съгласно изобретението е възможно култивирането на клетки в присъствието на контролирани количества МТХ чрез умножаване на гена, който е кодиращ за DHFR кодираща последователност /Schimke, Robert Т. et al., Science, 202:1051 /1978/; Biedler, I. L. et al., Cancer Res., 32:153 /1972/; Chang S. E. et al., Cell, 7:391 /1976/.

От голямо значение при този аспект на изобретението е да се докаже, че умножаването на гена за DHFR може да причини умножаване на съответните последователности, които са кодиращи за други протеини. Такъв е случаят, когато съответният протеин е повърхностен антиген на хепатит В /HBsAg/ /Chris tman J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 79:1815 / 1982/; E.coli протеин XGPRT /Ringold, Gordon etal., J. Molec. and Appl. Gen., 1:165 /1981/; и ендогенен ред от DHFR/SV 40 плазмидна комбинация /Kaufman, R. F. et al., J. Molec. Biol., 159:601 /1982/.

Други механизми за придаване на резистентност към метотрексат включват понижаване на свързващия афинитет на DHFR протеина, така че той става по-малко подат лив на метотрексата /Flintoff, W. F. et al., Somat. Cell. Genet., 2:145 /1976/, но вероятно в този случай съпроводено с умножаване.

Следователно гените както за некултивирания тип DHFR, така и за DHFR, който е резистентен към МТХ, поради понижената му свързваща способност, се умножават в присъствието на МТХ. Този аспект на изобретението се отнася до приложението на умножението на DHFR последователност върху съответния протеин, кодиращ последователности за осигуряване контролен механизъм, чрез който се повишават експресионните нива на t-PA последователностите в присъствието на МТХ или въз основа на предварителното третиране на трансформирани клетки с МТХ.

Е. Примери за изпълнение на изобретението.

Следващите примери поясняват, но не ограничават изобретението. В примерите, като клетъчни култури гостоприемници се използват E.coli култура и СНО клетъчна линия, подходяща за типа на DHFR протеина, кодиращ последователност, която трябва да бъде въведена. За реализиране на метода съгласно изобретението са подходящи и други еукариотни и прокариотни клетки.

I. Експресия на човешки t-PA ген в E.coli.

I.A. Обяснение на фигурите.

Фигура 1 представлява авторадиограма на 10 % SDS акриламиден гел, показваща имуноутаен протеин/и/, белязан с /³⁵5/-метионин, секретиран от човешки меланомни клетки в продължение на 3 часа in vivo, в присъствието /линия Ь/ и в отсъствието /линия а/ на протеазния инхибитор апротинин. След имуноутаяването с тъканния плазминогенен активаторен специфичен IgG се наблюдават три ивици /линия а/, които имат молекулни тегла, приблизително 65,000, 63,000 и 35,000 далтона. В присъствието на протеазния инхибитор обаче, вида с молекулно тегло 35,000 не се наблюдава. Когато се използва предимунен серум, никакви продукти не се имуноутаяват /линия с/. Миграциите и молекулните тегла на стандартни протеини, белязани с ¹⁴С, са показани вляво от линия а.

Фигура 2 показва данните от геловата електрофореза на имуноутаените транслационни продукти на РНК фракции, изолирани от кисел карбамид агарозен гел. Основна ивица се наблюдава при фракции с номера 7 и 8 след транслация в присъствието на панкреас ни микрозоми на куче, последвана от имунно утаяване с тъканен плазминогенен активаторен специфичен IgG. Тази ивица има молекулно тегло, приблизително 63,000 далтона. Размерът на uPNK, мигрираща във фракциите 7 и 8, е приблизително 21 до 24 S. Положенията на рибозомните РНК маркери, които са определени след електрофорезата на РНК карбамидния гел, и са визуализирани посредством оцветяване с етидиум бромид, са отбелязани над съответните гелови линии.

Фигура 3 показва характера на хибридизационната матрица на 96 колонии с проба ³ⁱP-dTC/^c/CA/^c/TA/^T/TCCCA/W-E-Y-C-D/. 96 индивидуални трансформанта се култивират в микротитърна посявка. Точно копие /реплика/ се посява и се култивира върху нитроцелулозна мембрана. След това колониите се лизират, фиксира се бактериална ДНК и филтрите се хибридизират с проба ³²Р -14 мер/WЕ-Y-C-D/. Филтрите се промиват за отстраняване на нехибридизираната проба и се излагат на Х-лъчи. Тази авторадиограма е представителна за образците, получени с 48 индивидуални филтъра /4, 600 независими колонии. Пример за позитивен тъканен плазминогенен активаторен сДНК клон върху филтър номер 25 е отбелязан като Е10 /стрелка/.

Фигура 4 представлява рестрикционна ендонуклеазна карта на пълната дължина сДНК на човешка тъканна плазминогенна активаторна сДНК. Броят и размерът на фрагментите, получени от рестрикционното отцепване с ендонуклеазата, се установяват посредством електрофореза през 6 % акриламидни гелове. Положенията на сайтовете са потвърдени от последователността на нуклеиновите киселини, от фиг.5. Кодиращата област на по-голямата отворена четяща рамка е оградена и затвореният участък представлява предполагаемата последователност на сигналния пептид, докато останалият участък представлява предполагаемата последователност на зрелия тъканен плазминогенен активатор /527 аминокиселини/. 5' края на иРНК е в лявата страна, докато 3' края на иРНК е вдясно.

Фигурите 5А, 5В и 5С показват нуклеотидната последователност и съответната аминокиселинна последователност на пълната дължина сДНК на човешкия тъканен плазминогенен активатор. 35-те аминокиселини /-35 до

1/, предхождащи зрялата последова-телност, са показани като непрекъсната последователност. Смята се, че тази 35-аминокиселинна последователност е съставна на хидрофилна пропоследователност, предшестваща серина /+1/ на зрелия протеин, на около 12 до 15 аминокиселини, на свой ред предшествани от обикновения хидрофобен сигнал, простиращ се от 5' до -35. Този тип на препро структура върху секретирани протеини е описан предварително, например при препроалбумина. Приемайки тази теория, всички молекули на секретирания тъканен плазминогенен активатор се започват със серина /+1/, като аминокрай. Според друга теория, хидрофилната последователност може да бъде включена във функцията на тьканния плазминогенен активатор по начин, аналогичен на този, наблюдаван при плазминоген, където пептид с 10,000 далтона може да бъде отцепен от аминокрайната част на природния плазминоген GIu-плазминоген, наименован според крайния аминоостатьк, като в резултат се получава по-малка молекула с нов аминокрай, обозначена като Lys-плазминоген. Lys-плазминогенът по-лесно се активира до плазмин и също има по-голям афинитет към фибрина, отколкото GIu-плазминогена. Известно е, че плазминът катализира превръщането на GIuв Lys-плазминоген. Този тип на контролен механизъм подпомага механизма на положителната обратна връзка. Първото количество образуван плазмин, освен че разгражда фибрина, също генерира плазминогенни молекули, които се активират по-лесно и също се свързват по-здраво към субстрата си, отколкото природният плазминоген. Резултатът е по-бързо разграждане на фибрина. Хидрофилният пептид на тьканния плазминогенен активатор може да бъде включен в подобен механизъм, като неговото разцепване води в резултат до модифицирано свързване на ензима към фибрина.. Във всеки случай 35-аминокиселинната последователност се счита за препоследователност на зрелия протеин.

Фигура 6 е схематична диаграма на структурата на експресионен плазмид на тьканен плазминогенен активатор р ARIPA⁰. Изходният плазмид рРА25Е10 първоначално се смила с Psti за изолиране на 376 вр фрагмент, след което се смила, както е показано на фигурата.

Фигура 7 представя резултатите от анализа на фибринна плочка за фибринолитична активност на експресионния продукт, получен посредством р ARIPA⁰ в трансформирани клетки.

Фигура 8 показва резултатите от МРИС /високоефективна течна хроматография/ на пептиди от тъканен плазминогенен активатор смлян с трипсин. Поглъщане при 210 нанометьра. Стрелката идентифицира пика, съответстващ на пептида, който е използван за по10 лучаване на нуклеотидната проба, използвана с колонийната банка. Установено е, че пептидът, представен с този пик, има следната пълна последователност: L-T-W-E-Y-C-D-V5 P-S-C-S-T-C-G-L. По подобен начин са секвенирани и другите главни пикове и е установено, че потвърждават точната аминокиселинна последователност на човешкия тъканен плазминогенен активатор. Еднобуквеният код на пептидите отговаря на означения на аминокиселините, както следва:

Asp Thr	DD T	Аспаргинова киселина Среонин	lie Leu	1 L	Изолевцин Левцин
Ser	S	Серин /а-амино-β хидроксипропионова киселина	Tyr	Y	Тирозин
Glu	E	Глутаминова киселина	Phe	F	Фенилаланин
Pro	P	Пролин	His	H	Хистидин
Gly	G	Глицин /аминооцетна киселина/	Lys	K	Лизин
Ala	A	Аланин	Arg	R	Аргинин
Cys	C	Цистеин	Trp	W	Триптофан
Vai	V	Валии	Gin	Q	Глутамин
Met	M	Метионин	Asn	N	Аспарагин

Фигура 9 показва структурата на плазмид, кодиращ за директната експресия на зрял човешки тъканен плазминогенен активатор в E.coli. 50 микрограма плазмид рРА17 се смила с Sau3A 1, Hindi и Hhal и се подлага на електрофореза върху 6 % полиакриламиден гел. Възстановява се приблизително 0,5 мкг от 55 вр Sau3Al-Hhal фрагмента. По подобен начин, приблизително 3 мкг от 263 вр HhalNarl фрагмента се пречиства от 80 мкг клон рРА25Е10 чрез първо изолиране на фрагмент 300 вр Pstl-Narl фрагмент и след това този фрагмент се смила с Hhal. Смилането се осъществява при температура 37^ОС в продължение на 1 час и реакционните продукти се разтварят наново, и се подлагат на електроелюиране от 6 % полиакриламидни гелове. Двата показани дезоксиолигонуклеотида /5’d AATTCATGTCTTATCAAGT /I/ и 5' GATCACTTGATAAGACATG /II/ се синтезират твърдофазов метод с фосфотриестер (51). 100 рмола от олигонуклеотида II се фосфорилират в 30 микролитра реакционна смес, съдържаща в милимола: 60 Трие /рН 8/, 10 маг30 незиев двухлорид, 15 β-меркаптоетанол и 50 микро Ci /У²р/ ATP /Amersham 5,000 Ci милимола ^л/. Добавят се 12 единици Т4 полинуклеотидна киназа и реакционната смес се оставя да реагира при температура 37°С в продължение на 15 мин. Един микролитър 10 милимола АТР и 12 единици Т4 киназа след това се прибавят и реакционната смес се оставя да взаимодейства в продължение на още 30 мин. След екстракция с фенол/хлороформ, фосфорилирания олигомер II и 5' хидроксилолигомера I се смесват с 0,5 мкг елюиран 55 вр Sau 3Al-Hhal фрагмент и 2 микрограма 263 вр Hhal-Narl фрагмент и се утаяват с етанол. Тези фрагменти се лигатират при стайна температура в продължение на 4 ч в 60 микролитра 20 милимола Трис-HCI /рН 7,5/, 10 милимола магнезиев двухлорид, 10 милимола дитиотреитол, 0,5 милимола АТР и 1000 единици Т4 ДНК лигаза. Сместа се смила в продължение на 1 час с 48 единици Narl, 20 единици EcoRl и 40 единици Bglll за елиминиране на полимеризацията чрез лигиране на кохезионния Sau3Al край и се подлага на елект рофореза върху 6 % гел. Посредством електроелюиране се извлича 338 вр продукт /приблизително 0,1 микрограма/. Остатъкът от tРА кодиращите последователности /аминокиселини 111-528/ се изолират върху 1645 вр фрагмент чрез смилане на плазмида рРА25Е10 с Narl и Bglll. Плазмидът pLelF Atrl03 е производен на плазмида pLelF А25 /лит.източник 52/, в който EcoRI сайта, краен LelFA гена е отстранен /лит.източник 53/. Три микрограма pLelF Atrpl03 се смилат с 20 единици EcoRI и 20 единици Bglll в продължение на 90 мин при температура 37°С, подлагат се на електрофореза върху 6 % полиакриламиден гел и чрез електроелюиране се извлича големият /приблизително 4,200 вр/ векторен фрагмент. За крайното изграждане 80 нанограма EcoRI-Bglll pLelF Atrpl03 се лигира с 100 нанограма 1645 вр Narl-Bglll фрагмент и 20 нанограма 338 вр EcoRl-Narl фрагмент в продължение на 10 часа при стайна температура. Тази лигираща смес се използва за трансформиране на E.coli К-12 щам 294. От 38 от тези трансформанти се получава плазмидна ДНК, която се смила с EcoRI. Десет от тези плазмида съдържат желаните 600 вр и 472 вр EcoRI фрагменти. Анализът на ДНК последователността потвърждава, че един от тези плазмида /pt-PAtrpl2/ съдържа желаната нуклеотидна последователност при връзките между trp промотор, синтетична ДНК и сДНК.

Фигура 10 представя резултатите от анализ на фибринна плочка за фибринолитична активност на тъканния плазминогенен активатор на експресионния продукт. Култура от едно денонощие на E.coli W3110 /pt-PAtrpl2 в Luria хранителна среда, съдържаща 5 микрограма мл^-1 тетрациклин, се разрежда 1:100 в М9 хранителна среда, съдържаща 0,2 % глюкоза, 0,5 % квази аминокиселини и 5 микрограма мл'¹ тетрациклин. Клетките се култивират при температура 37°С до получаването на A_JJ0 от порядъка на 0,2 и след това се прибавя индолакрилова киселина до концентрация от 20 мкг/мл. При A_J5o=O,5-O,6, приблизително 2x10· клетки мл'¹, се събират проби чрез центрофугиране и веднага се замразяват. Клетъчните пелети се суспендират в 6М гуанидин хидрохлорид при 5x10’ клетки/мл, обработват се с ултразвук в продължение на 10 сек, инкубират се при температура 24°С в продължение на 30 мин и след това се подлагат на диализа в продължение на 4 ч в противоток с 25 милимола Трис-HCI /рН 8/, 250 милимола натриев хлорид, 0,25 милимола EDTA /етилендиамино тетраоцетна киселина/ и 0,01 % Tween 80. След диализата пробите се центрофугират при 13,000 х g в продължение на 2 мин и 10 микролитра от супернатанта се анализират за активност на тъканен плазминогенен активатор. По метода, описан от GranelliPipemo and Reich /лит.изт.87/, посявката се инкубира в продължение на 3,5 ч при температура 37°С и лизираните зони се измерват. Количественото определяне се осъществява чрез сравняването с разреден разтвор на пречистен меланомен тъканен плазминогенен активатор.

Е.1.Б. Източник на иРНК на тъканен плазминогенен активатор. Използват се човешки меланомни клетки /Bowes/. Меланомните клетки се култивират до сливане на монослоеве в 100 мл Earles Minimal Essential Media, допълнена c натриев бикарбонат /0,12 % крайна концентрация/, 2 милимола глутамин и 10 % инактивиран при нагряване фетален телешки серум. За да се потвърди, че меланомните клетки активно продуцират човешки тъканен плазминогенен активатор, човешки меланомни клетки се култивират до сливане в микротитърна плочка с 24 гнезда Well. В присъствие или отсъствие на 0,33 микромола протеазен инхибитор апротинин клетките се промиват еднократно, като се използва фосфатно буфериран физиологичен разтвор и 0,3 мл среда, свободна от серум и метионин. Прибавя се 75 микро Ci от /³ⁱS/ метионин и клетките се бележат при температура 37°С в продължение на 3 часа. В края на третия час от периода на белязането клетките се отстраняват от средата и се обработват или с тъканен плазминогенен активаторен специфичен IgG, или с предимунен серум за имуноутаяване /лит.изт.54/. Имуноутаените продукти са показани чрез електрофореза върху 10 % SDSакриламиден гел. Вискозният гел се фиксира, изсушава се и се подлага на флуорография.

E.I.B. Изолиране на иРНК и фракциониране по размер. Общото количество РНК от меланомните клетъчни култури се екстрахира главно по метода, описан от Ward et aL /55/. Клетките се концентрират чрез центрофугиране и след това се суспендират наново в 10 милимола натриев хлорид, 10 милимола Трис14

HCI /pH 7,5/ и 1,5 милимола магнезиев двухлорид. Клетките се лизират чрез прибавяне на NP-40 /1 % крайна концентрация/ и нуклеите се концентрират чрез центрофугиране. Супернатантьт съдържа цялото количество РНК, което по-нататък се пречиства чрез многократни екстракции с фенол и хромоформ. Получава се 0,2 М водна фаза в натриев хлорид и след това цялото количество РНК се утаява чрез прибавяне на два обема етанол. За пречистване на иРНК от общото количество РНК препарати /54/ се използва олиго-dT целулозна хроматография. Типичните добиви от 10 г култивирани меланомни клетки са от 5 до 10 мг обща РНК и 50-200 мкг Поли /А/ плюс иРНК.

Фракционирането на Поли /А/⁺ иРНК /200 мкг/ /56/ се осъществява чрез електрофореза през карбамид-агарозен гел. Вискозният агарозен гел е съставен от 1,75 % агароза, 0,025 М натриев цитрат с pH 3,8 и 6 М карбамид. Електрофорезата се осъществява в продължение на 7 часа при 25 милиампера и температура 4“С. След това гелът се фракционира със скалпел. Отделните парчета се стапят при температура 70°С и се екстрахират двукратно с фенол и един път с хлороформ. След това фракциите се утаяват с етанол и впоследствие се анализират чрез in vitro транслиране в заешка ретикулоцитна лизатна система, Bethesda Reasearch Labs. /59, 60/, допълва се с кучешки панкреасни микрозоми, както следва. Транслациите се осъществяват при използването на 25 микро Ci от белязан със /^MS/ метионин и 500 нанограма от всяко гелово парче РНК в краен обем 30 микролитра, съдържащо в ммол: 25 HEPES, 48,3 калиев хлорид, 10 креатинфосфат /фосфат на метилгуанидин оцетната киселина/, 19 аминокиселини по 50 ммола от всяка, 1,1 магнезиев хлорид, 16,6 EDTA /етилендиаминотетраоцетна киселина/, 0,16 дитиотреитол, 8,3 хемин, 16,6 мкг/мл креатин киназа, 0,33 калциев хлорид, 0,66 EGTA, 23,3 натриев хлорид.

Инкубирането се осъществява при температура 30°С в продължение на 90 мин. Кучешки панкреасни микрозомни мембрани, приготвени от необработени микрозоми при използване на EDTA за отстраняване на рибозомите /61/ се обработват с нуклеаза /62/ и присъстват в сместа за транслация при крайна концентрация 7 А_26О единици/мл. Продук тите от транслацията или имуноутаените продукти от транслацията се анализират чрез електрофореза върху 10 % полиакриламиден гел в натриев додецилсулфат /63/. Вискозни телове без петна се фиксират, сушат се и се подлагат на флуорография /64/.

Получените транслационни продукти от всяка гелова фракция се имуноутаяват със заешки противоположен на човешкия тьканен плазминогенен активатор, специфичен IgG. Основната ивица на имуноутаения полипептид се наблюдава при транслационните РНК фракции с номера 7 и 8 /миграция от 21 до 24S/ с молекулно тегло приблизително 63,000 далтона. Тази ивица не се наблюдава, когато се използва предимунен IgG за имуноутаяване, което подсказва, че тези полипептиди са специфичният тьканен плазминогенен активатор.

Ε.Ι.Γ. Получаване на банка колонии, съдържащи последователностите на тъканен плазминогенен активатор. 5 мкг от гел фракционираната иРНК /гелов отрязък 7 иРНК/ се използва за приготовляване на двойно усукана /нишкова/ сДНК по стандартните методи /52, 65, 66/. сДНК се фракционира по големина върху 6 % полиакриламиден гел. сДНК по-големи от 350 базови двойки по дължина / 125 нанограма/ се подлагат на електроелюиране. 30 нанограма сДНК се удължава с деокси /С/ остатъци при използването на терминална деаксинуклеотидил трансфераза /67/ и се свързва с 300 нанограма от плазмида pBR 322 /68/, който е снабден също така с подобни краища от деокси /G/ остатъци при Psi I мястото /67/. Тази смес след това се трансформира в E.coli К12 вид 294 /АТСС № 31446/ . Получават се приблизително 4,600 трансформанти.

Е.1.Д. Получаване на ДНК проба. Получен е пречистен човешки плазминогенен активатор по известни методи /19, 20/.

Молекулата се сканира, за да се определи мястото на областите, които са най-подходящи за осъществяване на синтетичните проби, както следва. За да се направят протеините податливи на усвояване с помощта на трипсин, те се редуцират и карбоксиметилират. 2 мг проба от тьканен плазминогенен активатор първо се подлага на диализа срещу 0,01 % Твин 80 в продължение на една нощ при стайна температура. След това леофилизираният протеин се разтваря в 12 мл 0,56 М Трис-НС1 буфер /pH 8,6/, 8 моларен в карбамид и 5 милимола ЕДТА. Дисулфидните връзки се редуцират посредством прибавянето на 0,1 мл β-меркаптоетанол. Това взаимодействие се осъществява в азотна атмосфера в продължение на 2 ч при температура 45°С. Редуцираните дисулфиди се алкилират до получаването на карбоксиметилно производно посредством прибавянето на 1,0 мл 1,4 М йодоцетна киселина в I N натриева основа. Взаимодействието протича при стайна температура и след 20 мин се прекратява чрез диализа срещу 0,01 % Твин 80 в продължение на 18 ч при стайна температура и продуктът се лиофилизира.

Полученият в резултат лиофилизиран карбоксиметил протеин се разтваря наново в 3 мл 0,1 М натриево-фосфатен буфер /рН 7,5/. Прибавя се трипсин /ТРСК/ /съотношение 1 към 50/ и се усвоява при температура 37°С. Аликвотни проби /0,1 мл/ се вземат на 3-ия,

6-ия и 12-ия час. На 12-ия час се прибавя повторно трипсин. След 24 часа реакцията се прекратява чрез замразяване на пробата, преди да се подложи на ВЕТХ /високоефективна течна хроматография/. Нарастването на усвояването се определя чрез SDS гелове върху аликвотните проби. Всички гелове са безцветни с изключение на слабата ивица на аликвота, взет на 3-ия час, което показва, че за 24 часа смилането е завършено и не са останали големи пептиди.

Проба /0,5 мл/ се инжектира в колона с Altex С-8 ултрасфери 5 микрона на два цикъла. Увеличаването на ацетонитрила се осъществява бавно и постепенно: от 1 до 5 % за 5 мин, от 5 до 35 % в продължение на 100 мин и от 35 до 50 % в продължение на 30 мин. При един от двата цикъла, елюатът се наблюдава при две дължини на вълните: 210 нм и 280 нм. Отношението на абсорбциите при двете дължини на вълните се използва, за да покаже триптофансъдържащите пептиди.

Пептидните пикове, които вероятно съдържат триптофан или тези, които се предполага, че са полезни по други цели, първо се секвенират, чрез което се определя последователността около повечето от триптофаните. След секвениране на около 25 от най-вероятните пептидни пикове, всички данни от секвенирането, които могат да се изравнят, се събират, за да се получи предварителният модел на първичната структура на тъканния плазминогенен активатор. От те зи данни от модела се определят няколко възможни проби.

E.I.E. Идентифициране на бактериални клонове, съдържащи сДНК последователности на тъканен плазминогенен активатор.

Поотделно колониите се инокулират в ямките на микротитьрна плочка, съдържаща LB /93/ +5 мкг/мл тетрациклин и се съхраняват при температура -20°С след прибавяне на ДМСО до 7 %. Двете копия на банката се култивират върху нитроцелулозни филтри и ДНК от всяка колония се фиксира върху филтъра при използване на методиката на Grunstein Hogness /лит.изт. 69/.

Получава се ”р-ТС/⁰/СА/°/ТА/^т/ ТСССА /белязана проба от синтетичния олигомер/ /W-E-Y-C-D/ 14-мерен пул, както е описано по-горе. Филтрите, съдържащи 4,600 трансформанта се подлагат на предхибридизация в продължение на 2 ч при стайна температура в 50 ммола натриев фосфат с pH 6,8, 5Х SSC /80/ 150 микрограма/мл обработена със ултразвук ДНК от сперма на пъстърва 5Х разтвор на Denhardt /85/, 10 % формамид и след това се хибридизира с 5Х 10⁶импулса за минута на белязаната проба в същия разтвор. След инкубиране в продължение на едно денонощие при стайна температура филтрите се промиват 3 пъти при стайна температура в 6Х SSC, 0,1 % SDS в продължение на 30 мин, еднократно в 2Х SSC и след това се излагат на Кодак XR-5, рентгенографски филм със светкавица Dupont Lighthning Plus усилващи екрани в продължение на 16 часа.

Изолира се плазмид ДНК по бързия метод /71/ от всички колонии, показващи положителна реакция на хибридизация. След това сДНК включванията от тези клонове се секвенират след субклониращи фрагменти в М13 вектор мр7 /73/ и с помощта на химическия метод на Махат Gilbert /74/. Фигура 3 показва филтър № 25, представляващ модела на хибридизация на положителен тъканен плазминогенен активаторен клон. сДНК включването в клон 25Е10 показва, че описаният клон е ДНК кодиращ за тъканен плазминогенен активатор при сравняване на неговите аминокиселинни последователности с пептидна последователност /виж Supra/, получена от пречистен тъканен плазминогенен активатор и чрез неговия експресионен продукт, продуциран в E.coli, както е описано по-горе. сДНК включването чрез най-дългата отворена четяща рамка е установено, че клонът 25Е10 /плазмид рРА25Е10/ е със дължина 2304 двойки бази и кодира протеин с 508 аминокиселини /MW 56, 756/ и съдържа 772 вр 3’ нетранслиран участък. На този сДНК клон липсват N-крайните кодиращи последователности.

E.I.G. Директна експресия на човешки тьканен плазминогенен активаторен клон в E.coli.

Както е показано на фигура 6, 50 микрограма рРА25Е10 /Supra/ се усвояват с Pst 1 и се изолира 376 вр фрагмент, посредством електрофореза върху 6 % полиакриламиден гел. Приблизително 3 мкг от този фрагмент се изолират от гела посредством електроелюиране, усвояват се с 30 единици Dde 1 в продължение на 1 час при температура 37°С, екстрахират се с фенол и хлороформ и се утаяват с етанол. Получените в резултат Dde 1 лепливи краища се увеличават до тъпи краища чрез прибавянето на 5 единици ДНК полимераза 1 /фрагмент на Klenow/ и по 0,1 милимола от всеки dATP, dCTP, dGTP, dTTP към реакционната смес, която се инкубира при температура 4°С в продължение на 8 часа. След екстракция с фенол и хлороформ ДНК се смила с 15 единици Nar 1 в продължение на 2 ч и реакционната смес се подлага на електрофореза върху 6 % полиакриламиден гел. Изолира се приблизително 0,5 мкг от желания с 125 вр Nar 1 фрагмент с тъп край. Този фрагмент е кодиращ за аминокиселини №№ от 69 до 110 от пълната дължина на зрелия тьканен плазминогенен активаторен протеин.

За изолирането на 1645 вр Nar 1 - Bgl 11 фрагмента, 30 мкг рРА25Е10 се усвояват с 30 идиници Nar 1 и с 35 единици Bgl 11 в продължение на 2 ч при температура 37°С и реакционната смес се подлага на електрофореза върху 6 % полиакриламиден гел. Извличат се приблизително 6 мкг от желания 1645 вр Nar 1 - Bgl 11 фрагмент.

Плазмидът pdeltaRlSRC е производен на плазмида pSRCexl6 /79/, в който Eco R1 сайтовете, които са близки до trp промотора и са крайни спрямо SRC гена, са отстранени с ДНК полимера за 1 /28/ и се включва самокомплементарен олигодезоксинуклеотид / AATTATGAATTCAT/, синтезиран по фосфор триестерния метод /75/ в останалия Eco R1 сайт, в непосредствена близост до Xba 1 сайт. 20 мкг от pdeltaRlSRC се усвояват за допълване с Eco R1, екстрахират се с фенол и хлороформ, и се утаяват с етанол. След това плазмидът се утаява с 100 единици нуклеаза S1 при температура 16°С в продължение на 30 мин, в 25 милимола натриев ацетат с pH 4,6, 1 милимол цинков двухлорид и 0,3 М натриев хлорид до създаването на тъп край с последователността ATG. След екстракция с фенол и хлороформ и утаяване с етанол. ДНК се смила с Bam HI, подлага се на електрофореза върху 6 % полиакриламиден гел, и големият /4,300 вр/ векторен фрагмент се извлича чрез електроелюиране.

Експресионният плазмид се присъединява посредством лигатиране с 0,2 мкг вектор, 0,06 мкг 125 вр сляп край - Nar 1 фрагмент и 0,6 мкг 1645 вр Nar 1 - Bgl 11 фрагмент с 10 единици Т₄ДНК лигаза в продължение на 7 часа при стайна температура и се използва за трансформиране на E.coli вид 294 /АТСС № 31446/ за устойчивост спрямо ампицилин. Плазмидът ДНК се приготовлява от 26 от колониите и се усвоява с Xba 1 и Eco R1. Дванадесет от тези плазмиди съдържат желаните 415 вр Xba 1 - Eco R1 и 472 вр Eco Rlфрагменти. Анализът на ДНК последователността потвърждава, че някои от тези плазмиди има един ATG иницииращ кодон, разположен правилно при началото на аминокиселина, номер 69 /серин/. Един от тези плазмиди р Δ RIPA⁰ се изследва и продуцира желаният тьканен плазминогенен активатор /фиг. 7/.

Е.1.3. Пълна дължина на сДНК на тьканен плазминогенен активатор.

а/ Получаване на банка колонии лайбрери, съдържаща N-крайни последователности на тьканен плазминогенен активатор.

Последователности на тьканен плазминогенен активатор.

Използва се 0,4 микрограма от синтетичния олигонуклеотид 5' TTCTGAGCAGGGCG 3' за праймерна реакция на 7,5 мкг голова фракция № 8 uPHK /supra/ за получаване на двойноверижна сДНК по познатите методики /65,66/. сДНК се фракционира по големина върху 6 % полиакриламиден гел. Фракция с големина, по-голяма от 300 базови двойки /36 нанограма/, се подлага на електроелюиране. 5 наног рама сДНК се разширява с деокси /С/ остатъци при използването на терминална деоксицитидил трансфераза /67/ и се присъединява с 50 мг от плазмида pBR322 /68/, който аналогично е снабден с краища от деокси / G/ остатъци при Pst 1 сайт /67/. Сместа след това се трансформира в E.coli К12 щам 294. Получават се приблизително 1,500 трансформанта.

б/ Хибридизация на Southern на човешка геномна ДНК.

Тъй като сДНК праймерната реакция се осъществява с използването на синтетичен фрагмент, който хибридизира 13 базови двойки от N-края на клон рРА25Е10, в този участък на 29-та базова двойка, който няма наличен удобен рестрикционен фрагмент (споменатата област включва 16-мерна последователност) за скрининг на сДНК клоновете. Необходимо е да се изолира човешки тъканен плазминогенен активаторен геномен клон, за да се идентифицира всеки праймер, разширяващ сДНК клонове, съдържащи N-крайни кодиращи последователности на тъканен плазминогенен активатор.

Първият етап на този метод включва проверка на това, че в човешката геномна ДНК присъства само един хомоложен тъканен плазминогенен активаторен ген, което се определя чрез т.нар. “южна хибридизация”. По този метод, описан в лит.източник /77/, 5 мкг от високомолекулна човешка лимфоцитна ДНК, получена, както е описано в лит.източник /80/, се смила за допълване с различни рестрикционни ендонуклеази, подлага се на електрофореза върху 0,1 % агарозни гелове /81/ и се нанася върху нитроцелулозен филтър /77/. Приготвя се ³²Р, /76/, белязана с ДНК проба от 5' края на сДНК включване на сДНК клона на рРА25Е10 /230 вр НРа II-RSal фрагмент / и се хибридизира /82/ с нитроцелулозния филтър. 35 X 10⁶ импулс на минута от пробата се хибридизират в продължение на 40 часа и след това се промиват по описания в лит.източник /82/ метод. Две матрици на ендонуклеазно смилане осигуряват само единичен хибридизационен ДНК фрагмент: Bgl 11 /5,7 Кбр/ и PVu 11 /4,2 Кбр/ С Hine 11/5,1 Кбр и 4,3 Кбр/ се наблюдават два хибридизиращи ДНК фрагмента. Взети заедно тези данни доказват присъствието само на единичен ген на тъканен плазминогенен активатор в човешкия геном и този ген съдържа поне една прекъсваща секвенция интервираща последователност.

в/ Скрининг на банка от човешки λ фаги за гени на тъканен плазминогенен активатор.

За идентифициране на λ-фаговите рекомбинанти, носещи тъканни плазминогенни активаторни гени, се открива нуклеотидната хомология с радиоактивна проба, получена от клон сДНК на рРА25Е10 на тъканен плазминогенен активатор. Един милион рекомбинантни λ-фаги се посяват върху DP 50 Sup F при плътност 10,000 ptu /15 см посявка и нитроцелулозните филтърни копия се приготовляват за всяка посявка с помощта на метода на Benton и Davis /78/. По обичайните методи се приготвя ДНК проба, белязана с ³²р /83/ от 250 базова двойка Нра II - RSa I фрагмент, разположен 34 базови двойки от 5' края на плазмид рРА25Е10. Всеки нитроцелулозен филтър предварително се хибридизира при температура 42°С в продължение на 2 часа в 50 милимола натриев фосфат /pH 6,5/, 5Х SSC /77/, 0,5 мг/мл, обработена със ултразвук ДНК от пъстърва, 5Х разтвор на Denhardt /84/, 50 % формамид и след това се хибридизира с 50 х 10⁶ импулса за мин на белязаната проба в същия разтвор, съдържащ 10 % натриев декстран сулфат /85/. След инкубиране в продължение на една нощ при температура 42°С филтрите се промиват 4 пъти при температура 50°С в 0,2Х SSC, 0,1 SDS в продължение на 30 мин, еднократно в 2Х SSC при стайна температура и след това се облъчват с екрани Dupont Cronex върху Kodak XR5 рентгенографски филм в продължение на една нощ. Получават се общо 19 клона, които се хибридизират с пробата. Приготвя се фагова ДНК по известен начин /86/ от 6 рекомбинанта. Подбира се λ-клон С за получаване на PVu II фрагмент за скрининг на колония. 30 мкг ДНК се смила с PVu II в продължение на 1 час при температура 37°С, и след това се подлага на електрофореза върху 0,1 % агарозен гел. Елюира се и се пречиства 4,2 килобазови двойки фрагмент, който предварително е показал, че съдържа последователности на тъканен плазминогенен фрагмент. Приготвя се проба, белязана с ³²Р, по познатите методи /83/ за хибридизация на колонии, както е описано тук.

г/ Скрининг на банка колонии за 5' последователности на тъканен плазминогенен активатор.

Колониите се прехвърлят от посявките и се култивират върху нитроцелулозни филтри и ДНК от всяка колония се фиксира към филтъра с помощта на Grunstein-Hogness методиката /69/. Проба, белязана с ³²Р, се приготвя посредством заливане с телешки тимус /83/ 4,2 килобазова двойка PVu II фрагмент от изолиран тъканен плазминогенен активатор λ-геномен клон. Филтрите, съдържащи 1,500 трансформанти, се хибридизират с 112 х 10* срм ³²Р-геномен PVu II фрагмент. Хибридизацията се осъществява в продължение на 16 часа при условията, описани от Fritsen и кол. /82/. Филтрите се промиват обилно и след това се облъчват с усилващи екрани на Dupont Lightning - Plus върху Kodak XR-5 рентгенографски филм в продължение на 1648 часа. Осемнадесет колонии са хибридизирани отчетливо с геномната проба. Изолира се плазмид ДНК от всяка от тези колонии и се свързва към нитроцелулозни филтри и се хибридизира с белязан с ³²Р, синтетичен олигонуклеотид /16-мег/, използван за праймерна реакция. От осемнадесетте клони седем хибридизират с киназирания 16-mer. При анализа на последователностите след субклониране на фрагментите в м13 вектор мр’ /73/ един клон /рРА17/ показва, че съдържа правилен 5' N краен /участък/ на тъканен плазминогенен активатор, сигнална водеща последователност и 84 вр 5' нетранслиран участък. Определени са от двата клона рРА25Е10 и рРА17, пълната нуклеотидна последователност фиг.5 и рестрикционният модел /фиг.4/ на пълната дължина на тъканния плазминогенен активаторен клон.

Молекулата на природния тъканен плазминогенен активатор има способността да се стабилизира чрез 17 дисулфидни моста, подобно на други серинови протеази. Има четири потенциални N-гликозилиращи сайтове, три от тях разположени в крингьл участъците при asn_U7, asn_1M, asn_1M и един потенциален сайт в лековерижния участък, при asn₄₄₈. Промените в структурата на олигозахаридните лиганди може би пораждат разлика в молекулните форми с 65,000 и 63,000 молно тегло.

E.I.I. Директна експресия на пълна дължина на сДНК клон на тъканен плазминогенен активатор. Изграждането наново на цялата кодираща последователност е възможно при използването на обичайното Hhal рестрикционно ендонуклеазен сайт, споделяно от двата частични клона рРА17 и рРА25Е10. От плазмида рРА17 се изолира 55 вр Sau 3A1-Hhal рестрикционен фрагмент, съответстващ на аминокиселини 5-23. Sau ЗА1 рестрикционен сайт е разположен при кодон 4 на предполагаемата зряла кодираща последователност и се използва за отстраняване на участък, кодиращ сигналния пептид. От плазмида рРА25Е10 се изолира също 263 вр Hhal - Narl фрагмент /кодиращ за аминокиселини 24-110/. Създадени са два синтетични дезоксиолигонуклеотида, които възстановяват кодоните за аминокиселини 1 -4, включват ATG транслационен иницииращ кодон и създават един EcoRI кохезивен край. След това тези три фрагмента се лигират заедно до образуването на 338 вр фрагмент, кодиращ за аминокиселини 1-110. След това този фрагмент и 1645 вр Narl-Bglll фрагмент от рРА25А10 се лигират между EcoRI и Bglll сайтовете на плазмида pLelF AtrplO3 /53/ до получаването на експресионния плазмид ptPAtrpl2. Клонираният t-PA ген е транскрибиран под контрола на 300 вр фрагмент на E.coli trp оперона, който съдържа trp промотора, оператора и Snine-Dalgarno последователност на trp водещ пептид, но не включва иницииращ кодон за водещия пептид ATG /52/.

Култивира се E.coli К12 щам W3110 /АТСС № 27325/, съдържащ плазмида pt-PAtrpl2, и се приготвят екстракти за анализ за фибринолитична активност. Един от методите, използван за измерване на активността на тъканния плазминогенен активатор, е анализът на фибринна посявка /87/. Така се измерва количеството образуван плазмин чрез определяне степента на смилане на фибрин плазмина от фибрин в агарозна плочка, съдържаща плазминоген и фибрин. Плазминът създава прозрачна лизисна зона в фибринната посявка и областта около тази зона може да съответства на количеството тъканен плазминогенен активатор в пробата. Когато екстрактите от pt-PAtrpl2 клоните се изследват за активност на тъканен плазминогенен активатор, при използването на фибринна посявка прозрачната лизисна зона е очевидна. Тази фибринолитична активност се инхибира чрез анти t-PA IgG, но не и с преимунна IgG или с антиурокиназна IgG и не се наблюдава активност при екстракт, приготвен от клетки, съдържащи като контрола плазмид pLelF Atrpl03 на левкоцитен интерферон. При използване на стандартна крива на пречистен t-PA е възможно да се установи, че приблизително 20 единици на екстрахираната активност се получават на 10’ клетки /за пречистен t-PA, 90,000 Plough единици - 1 мг/ /фигура 10/.

E.I. Анализ на последователността. Анализът на последователността се основава на разпадането /деградацията/ на Edman /836/ . Пробата се внася в купата на Beckman 890В или 890С спининг апарат секвенатор с въртящо се блюдо. Като носител в блюдото се използва полибрен ™/поли N.N.N’N'-TeTpaMeтил-М-триметиленхексаметилен диамониев ацетат/, /63с/. Секвенаторът е модифициран със студен уловител и някои програми са променени за намаляване на фоновите пикове. Реагентите са Бекманови, 0,1 моларен квадратен буфер, финилизотиоцианат и хептафлуормаслена киселина.

Събраните Едманови цикли се превръщат в 2-анилино-5-тиазолинови производни. Iхлорбутанът е изсушен в азотна атмосфера. След това към 2-анилино-5-тиазолинона се прибавя 0,1 N воден разтвор на солна киселина и се нагрява до температура 70°С в продължение на 10 мин до превръщането му в 3-фенил-

2-тиохидантоин /РТН производно/. След това РТН-аминокиселия остатък се разтваря в 50 % ацетонитрил и вода и се инжектира в обратно фазов течен хроматограф с високо налягане. След това всяка РТН-аминокиселина се идентифицира чрез сравняването на времената на задържане на стандартна смес от РТН-аминокиселини, внесена в конверсионна ампула и е обработена по същия начин, като цикъл на секвентора.

1.1.К. Аанализ за откриване на експресия на тьканен плазминогенен активатор.

1. Директен анализ за образуване на плазмин.

а/ Теория. Чувствително изследване на тъканен плазминогенен активатор може да се осъществи, като се наблюдава катализирано с тъканен плазминогенен активатор превръщане на плазминоген в плазмин. Плазминът е ензим, който може да бъде анализиран по известни методи за хромогенни субстратни анализи. Тези анализи се базират на протеолитичното разцепване на трипептид от хромофорна група. Степента на разцепването е в директна връзка със специфичността и с концентрацията на протеазата, която се изследва. Базата на анализа е определянето на количеството плазмин, образуван по време на инкубирането на съдържащ тъканния плазминогенен активатор разтвор с разтвор на плазминоген. Колкото е по-голямо количеството на активатора, толкова по-голямо е и количеството на образувания плазмин. Плазминът се измерва при наблюдаването на неговото разцепване от хромогенния субстрат S2251 /Kabi Group, Inc., Greenwich, СТ/.

б/ Методика. Аликвотна част на пробата се смесва с 0,10 мл 0,7 Mg/мл плазминоген в 0,05 М Трие HCI с pH 7,4, съдържаща 0,012 М натриев хлорид, и обемът се нагласява на 0,15 мл. Сместа се инкубира при температура 37°С в продължение на 10 мин, прибавят се 0,35 мл S2251 /0,1 ммол разтвор в посочения по-горе буфер/ и взаимодействието продължава още 30 мин при температура 37°С. Прибавя се 25 мкл ледена оцетна киселина за приключване на взаимодействието. Пробите се центрофугират и се измерва поглъщането им при 405 нм.

Количественото определение на активността се осъществява посредством сравняване със стандартен разтвор на урокиназа. Условията на изследването за определяне на пълната дължина на тъканния плазминогенен активатор се модифицира с прибавянето на фибриноген /0,2 мг/ към разтвора. Резултатът от прибавянето на фибриногена е повишаване активността на тъканния плазминогенен активатор, затова и наблюдаваната активност се повишава в известна степен. Активността се отбелязва в Plough единици, при което 90,000 Plough единици се равняват на активността, проявена от 1 мг пречистен тъканен плазминогенен активатор.

2. Индиректен анализ на образуване на плазмин.

а/ Теория. Известен е чувствителен анализ за активност на тъканния плазминогенен активатор /37/. Анализът се базира на определянето на образуването на плазмин чрез измерване на степента на смилане на плазмин от фибрина в агарова плочка, съдържаща фибрин и плазминоген. Плазминът образува прозрачна лизисна зона във фибриновата плочка. Площта на тази лизисна зона може да се сравни с количеството на тъканния плазминоге нен активатор в пробата.

б/ Методика. Следвайки методите на Granelli-Piperno и Reich /87/ посявките се инкубират в продължение на 3,5 ч при температура 37°С и се измерват лизисните зони. Количественото определяне се осъществява посредством сравняване със стандартен разтвор на урокиназа.

Е.1.Л. Определяне активността на тъканен плазминогенен активатор.

1. Култивиране на бактерии и приготвяне на проба. Колония на E.coli, съдържаща плазмида /pARIP А/, се инкубира в епруветка, съдържаща 5 мл от LB хранителна среда, която съдържа 20 мкг/мл ампицилин. Клетките се култивират в продължение на една нощ при температура 37°С. Аликвотна част от тази култура се разрежда 1:100 в 300 мл М9 хранителна среда, съдържаща 20 мкг/мл ампицилин. Клетките се култивират в колба на клатачна машина при температура 37°С в продължение на 4 ч, като получената в резултат абсорбция при 550 нм е 0,419. Прибавя се триптофановият аналог на индолакрилова киселина при концентрация 30 мкг/мл. След това клетките се инкубират в продължение на 90 мин, като получената в резултат абсорбция при 550 нм е 0,628. Клетките се събират чрез центрофугиране и се суспендират наново в 0,8 мл 0,01 М Трие HCI с pH 8,0, съдържаща 0,01 М EDTA /етилендиаминотетраоцетна киселина/. Получената суспензия се разбърква енергично при стайна температура в продължение на 18 часа. Пробата се центрофугира и супернатантата /горния слой/ се изследва за активност на тъканен плазминогенен активатор.

Експресията на pt-PAtrpl2 е описана подробно в легендата към фигура 10.

2. Определяне на активността. В таблиците 1 и 2 са показани резултатите, получени при изследване за активиране на плазминогена с помощта на съответните E.coli екстракти. Активност се проявява, което зависи от присъствието на плазминоген /таблица 1/. Тази активност не се влияе от преимунен серум на заек, но забележимо се инхибира от антисерум, действащ срещу тъканен плазминогенен активатор, получен от пречистени меланомни клетки /88/ /таблици 1 и 2/. Това показва, че на екстрактите от E.coli е присъща активираща плазминогена активност, която се инхибира с антитела срещу тъканен плазминогенен активатор.

На фигура 7 са представени резултатите от анализа с фибринна плочка за фибринолитична активност. Стандартно количество урокиназа се прибавя към централната редица, в концентрации отляво-надясно: 0,24, 0,14, 0,10, 0,05 и 0,02 Plough единици. В долния ред са пробите на естествен тъканен плазминогенен активатор със същите количества ензим във всяко гнездо, съответстващо на ямки. Ямките отляво-надясно, съдържат тъканен плазминогенен активатор, антиплазминогенен активатор плюс преимунен серум и тъканен плазминогенен активатор плюс тъканен плазминогенен активатор антитела. В горната последователност всяко петно съдържа 8 микролитра екстракти на рекомбинантен тъканен плазминогенен активатор - E.coli. Първата ямка е само екстракт, второто съдържа преимунен серум и третата ямка съдържа прибавени антитела на тъканен плазминогенен активатор. Установено е, че предимунният серум не влияе върху естествения или рекомбинантен тъканен плазминогенен активатор и че антителата на тьканния плазминогенен активатор инхибират активността на естествения, както и на екстрактите от E.coli. На базата на урокиназните стандарти екстрактите съдържат помалко от 2,5 Plough единици на мл. Тези резултати са благоприятни в сравнение със стойностите, получени в таблица 1: 1,3 Plough единици на мл.

Таблиците 1 и 2 поясняват резултатите, получени при изследванията, осъществени по описания в дял Е.1.К.1.6/ начин.

Активиране на плазминоген с E.coli екстракти на култури, съдържащи р ARIPA.

Таблица 1

Активиране на плазминоген с E.coli екстракти на култури, съдържащи р ARIPA

Проба	А⁴⁰⁵	Активност¹, в %	Изчислени Plough ед./мл
Екстракт	0,043	/0/
/не плазминоген/
Екстракт	0,451	/100/	1,3
Екстракт плюс	0,477	106	-
преимунен серум
Екстракт плюс	0,079	9	-
анти t-PA антитела

¹ Процент активност, изчислен чрез изваждане на празната проба /0.043/ от получените стойности за останалите проби и разделянето им със стойността, получена от екстракта.

Таблица 2

Активиране на плазминоген с E.coli екстракти на култури на Pt-PAtrp 12

Проба	А⁴⁰⁵	% Активност
Екстракт	0,657	/100/
Екстракт плюс	0,665	101
преимунен серум
Екстракт плюс
Анти t-PA антитела	0,059	9

На фигура 10 са представени резултатите, получени от анализа на фибринна плочка, осъществен с екстракти от 10 л ферментационни култури на E.coli, съдържащи тъканен плазминогенен активатор експресиращ плазмид.

Фибринолитичната активност на съдържащия тъканен плазминогенен активатор екстракт е представен на фиг. 10 с ямка А. Тази фибринолитична активност се инхибира с анти t-PA IgG /ямка С/, но не и с преимунен IgG / ямка В/ или антиурокиназен IgG /ямка D/ и не се наблюдава активност при екстракт, приготвен от клетки, съдържащи като контрола левкоцитен интерферонен плазмид pLelF Atrpl03 /Н/.

Е.2. Получаване на tPA при използване на DHFR протеин с нисък свързващ афинитет спрямо МТХ.

Е.2.А. Изграждане на вектор. Последователността, кодираща тъканен плазминоге35 нен активатор /t-РА/ се включва в експресионен плазмид, съдържащ мутант на DHFR с нисък свързващ афинитет спрямо МТХ по следния метод /виж фиг.11/.

Приготвят се три фрагмента от препокриващи се t-PA плазмиди, рРА25Е10, и рРА17 и р ARIPA /supra/ по следния начин. Плазмид рРА17 се смила с Dde 1, запълнен при използване на Klenow ДНК полимераза 1, и се третира с Pst 1. Изолира се приблизително 200 вр фрагмент, съдържащ 5'-край на t-PA последователност. Вторият t-PA фрагмент се получава чрез смилане на р ARIpAc Pst 1 и Narl и се изолира приблизително 310 вр фрагмент. Третият t-PA фрагмент се получава чрез смилане на рРА25Е10 с Narl и Bgll 1 и се изолира приблизително 1645 вр фрагмент, който съдържа, в допълнение към t-PA кодиращ участък, някои 3' нетранслирани последова22 телности.

Плазмид рЕ342 за експресия HBV повърхностен антиген /също означаван като рНВ 348-Е/, е описан от Levison и кол. патент по искане per. № 326, 980, подадено 3.XII.1981 г., съответстващо в Европейска патентна заявка, публ. № 73, 656. Източникът на Simian вирус SV40 се изолира чрез смилане на SV40 ДНК с Hind III и превръщане на Hind III краищата в EcoRl краища чрез прибавянето на конвертора /AGCTGAATTC/. Тази ДНК се отрязва с PVuII и се прибавят RI линкери. След смилане с EcoRl се изолира 348 вр фрагмент, обхващащ източника, чрез електрофореза с полиакриламиден гел и се подлага на електроелюиране, и се клонира в pBR322.

Експресионният плазмид pHBs 348-Е се изгражда чрез клониране на 1986 вр фрагмент, получен чрез смилането на HBV с EcoRl и BgHI /Animal virus genetics, /Ch.5/ Acad. Press. N.Y. /1980//, /който обхваща гена, кодиращ HBSag/ в плазмида pML /Lusku и кол., Nature, 293:79 /1981/ при EcoRl и BamHI сайтовете. /pML произхожда от pBR322, на който са заличени елиминиращи последователности, които инхибират репликацията на плазмида в маймунски клетки /полученият в резултат плазмид е pRl-BgL/, след това се прави линеен с EcoRl, и полученият 348 фрагмент, представляващ участък, източник SV40, се въвежда в EcoRl сайта на pRl-BgL. Фрагментът - източник може да се въведе в която и да е посока. Тъй като този фрагмент кодира и ранния и късния SV40 промотор, в допълнение към източника на репликация, експресията на HBV гени може да се осъществи под контрола на който и да е промотор, в зависимост от тази посока /pHBs 348-Е представлява HBs след експресия под контрола на ранния промотор/. рЕ342 се модифицира чрез частично смилане с EcoRl, запълване при сайта на разцепване, като се използва Klenow ДНК полимераза 1 и плазмидът се лигира отново заедно с ДНК полимеразата, като се отстранява EcoRl сайта, предшестващ SV40 източника в рЕ342. Полученият в резултат плазмид, обозначен като рЕ342 AR1, се смила с EcoRl, запълва, като се използва Klenow ДНК полимераза 1 и се прекъсва с BamHI. След електрофореза върху акриламиден гел фрагмент с приблизително 3500 вр се електроелюира, екстрахира се с фенол/хлороформ и се утаява с етанол.

Така приготвеният р342Е 3500 вр вектор и описаните по-горе t-PA фрагменти, съдържащи приблизително 2160 вр се лигират заедно при използването на обичайните методи. Плазмид, съдържащ трите t-PA кодиращи фрагмента в правилната посока, се изолира, охарактеризира се и се обозначава като рЕ342t-PA. Този плазмид се смила с Sac II и се обработва с бактериална алкална фосфатаза /BRL/. За да се осигури DHFR последователността заедно с контролните последователности за неговата експресия, се създава фрагмент с приблизително 1700 вр чрез смилане на pEHER с Sac II. /pEHER е плазмид за експресия на мутант на DHFR, описан в искане за патент в САЩ, рег.№ 459, 151 /Supra/. Този фрагмент се лигира в pE342-t-PA плазмида до създаването на pEdPAER400 плазмид, който е аналогичен на pEHER с изключение на това, че HBsAg кодиращия участък е заменен с сДНК последователности от t-PA.

Е.2.Б. Експресия и умножаване на t-PA последователността.

Трансфектира се pETPAER400 /pETPER/ в dhfrCHO-DUX В11 клетки и в DHFR* СНОК1 /АТСС CCL61/ клетки по метода на Graham and van der Eb /Supra/. Трансформираните dhfr-клетки се селекционират чрез култивиране в среда с намалено количество глицин, хипоксантин и тимидин. Трансформираните DHFR* клетки се селекционират чрез култивиране в <100 nM МТХ. Колониите, които израстват върху подходящата селекционна среда, се изолират, като се използват клониращи пръстени, и се размножават в същата среда до получаване на няколко поколения.

За умножаване клетките от колониите се разделят в среда, съдържаща 5 х ΙΟ⁴, 10⁵, 2.5 х 10*, 5 х 10⁵ и 10⁶ пМ МТХ. Клетките се посяват при много ниска /10²-10³ клетки/ в блюдо клетъчна плътност в 10-сантиметрови блюда и получените колонии се изолират.

Е.2.С Методи за анализ. Експресията на t-PA в трансфектирани и увеличени колонии може удобно да се анализира с помощта на методи, подобни на тези, описани в подточка D.l.K.l.b /Supra/.

Съвместното умножаване на DHFR и tРА последователностите се изследва чрез изолирането на ДНК от съединяващи се монослоеве на умножени колонии, както следва.

Съединяващи се монослоеве в 150-милиметрови блюда се промиват с 50 мл стерилен PBS и се лизират чрез прибавянето на 5 мл 0,1 % SDS, 0,4 М калциев двухлорид, 0,1 М EDTA с pH 8. След 10-15 мин сместа се отстранява, екстрахира се с фенол, екстрахира се с хлороформ, и се утаява с етанол. ДНК се суспендира наново в 1 мл /за 150-милиметрова плочка/ 10 милимола Трие HCI с pH 8,1 милимол EDTA /ТЕ/, прибавя се RNase до 0,1 мг/мл и разтворът се инкубира при температура 37°С в продължение на 30 мин. След това се прибавя SDS до 0,1 % и проназа /Sigma/ до 0,5 мг/мл. След 3-16 часа инкубиране при температура 37°С разтворът пак се екстрахира с фенол, екстрахира се с хлороформ и се утаява с етанол. Пелетите ДНК се суспендират наново в 0,5 мл вода и се смилат с рестрикционни ензими. Приблизително 5-10 мкг от усвоената ДНК се подлагат на електрофореза в агарозен гел /1 % агароза в Трис-ацетатен буфер/ 40 милимола Трие, 1 милимол ЕДТА, нагласен до pH 8,2 с ацетна киселина /Crouse и кол., J. Biol. Chem., 257:7887 /1982/. След като бромфенол синьо багрило е мигрирало 2/3 от дължината надолу по гела, гелът се отстранява и оцветява с етидиум бромид. След това ДНК се прави видима с ултравиолетова светлина, после се трансферира от гела към нитроцелулозни филтри, по метода на Southern /J. Mol. Biol. 98:503 /\915/. След това филтрите се хибридизират с белязана проба, получена от 1700 вр SacII фрагмента на pEHER /получен и хибридизиран, както е описано по-горе/ или от съдържащия приблизително 1970 вр фрагмент Bglll на pEHER.

Е.З. Продуциране на t-PA в смес с дивия тип DHFR протеин.

Е.З.А. Изграждане на вектор. Работи се по метода, използван за изграждането на pETPFR, като се изгражда плазмид pETPFR, съдържащ ДНК последователност, кодираща некултивиран тип DHFR. Изграждането се осъществява, както е описано в пример С.2.А., с изкл. на това, че вместо плазмида pEHER като източник на последователност на ген на DHFR протеина се използва плазмидът pE342.HBV.E.400.D22, описан в Genetech Docket № 100/92; САЩ сериен № 459, 152, подаден на 19.01.1983 г., съответстващ на Европейска патентна заявка № 117, 058. Плазмидът pE342.HBV.E400.D22 е същият, ка то pEHER, с изкл. на това, че има разлика в единична базова двойка между некултивирания тип и мутантния DHFR. Полученият плазмид pETPFR е аналогичен във всичко останало на pETPFR, с изкл. на това, че ДНК последователността, кодираща за некултивирания тип DHFR, е заместена с тази за мутанта.

Е.З.Б. Експресия на t-PA последователност. Използва се pETPFR за трансфекция на СНО клетки, съдържащи малко DHER /Urlaub and Chasin /Supra// по метода на Graham and van der Eb чрез утаяване c калциев фосфат. Двадесетте и една колонии, които израстват върху селективната среда /-HGT/, се анализират чрез наблюдаване образуването на плазмин, като се изследва чрез смилане на фибрина в агарова плочка, съдържаща фибрин и плазминоген, както е описано от GranelliPipemo et.al., в J. Exp. Med., 148:223 /1978/.

Четири от най-добрите положителни клона след това се изследват количествено за образуване на плазмин върху клетъчни основи по метода, описан в D.2.C.

При това количествено изследване е установено, че четирите изследвани клона показват същата или сравнима секреция на tРА в средата, определена като единици/клетки/ден. Приготвят се вторични клонове чрез прехвърляне на инокулум от два от клоновете в отделни блюда, съдържащи -HGT среда. Два от получените в резултат вторични клона, 18В и 1 се използват при по-нататъшно изследване.

Е.З.В. Увеличаване и ниво на продуциране на t-PA. Описаните субклонове се посяват при 2 х 10* за 100 мм плочка в 50 пМ МТХ за предизвикване на умножаването. Онези клетки, които оживеят, след това се изследват по описания по-горе начин, давайки във всички случаи около 10 пъти по-голямо от неувеличеното количество активност на тъканен плазминогенен активатор. Два от тези клона се избират за по-нататъшно изследване и се наименоват 1-15 и 188-9.

Субклонът 1-15 по-нататък се умножава чрез посяване на 2 х 10⁵ клетки в 100 мм блюдо, съдържащи 500 пМ МТХ. Анализът на умножените клетки показва по-нататъшно увеличение /около три пъти/ на продуцирането на t-PA. Когато се анализира количествено по описания в B.I.B. метод, количествата са в границите на 7 х 10“* единици/клетка/ден.

Част от тези умножени клетки, след това се прехвърля и се държи в присъствието на 10,000 пМ МТХ. Субклонове 1-15 и 188-9 се изслед ват по-нататък, след като са държани в продължение на приблизително 1-2 месеца при условията, посочени в таблица Г.

Таблица Г

Клетъчна линия	Условия на култивиране	нг t-PA/ клетка/ден
1-lSsoo	500 пМ МТХ	28,5 х 10 ³
1-15,00	500 пМ МТХ	26,0 х 10³
1-15_ίοο	/-HGT среда, няма МТХ/	8,3 х 10³
1-15,оо	/-HGT среда, няма МТХ/	18,0 х ΙΟ ³
1-1510,000	10 микроМ МТХ	29,3 х 10 ³
1-1510,000	10 микроМ МТХ	49,0 х ΙΟ ³
188-9	50 пМ МТХ	14,3 х 10 ³
188-9	50 пМ МТХ	14,4 х ΙΟ ³
188-9	/-HGT среда, няма МТХ/	14,3 х 10'³
188-9	/-HGT среда, няма МТХ/	14,4 х ΙΟ ³
1	/-HGT среда, няма МТХ/	1,0 х 10³
1	/-HGT среда, няма МТХ/	0,7 х ΙΟ ³

* t-PA се анализира количествено в културалната среда с помощта на радиоимунния анализ по следния начин. Пречистен t-PA и пречистен t-PA, белязан с йод, произхождащи от меланома клетки, се разреждат серийно при концентрации от 12,5 до 400 нг/мл в буфер, съдържащ фосфатен буферен разсол, рН 7,3, 0,5 % говежди серумен албумин, 0,01 % Твин 80, и 0,02 % натриев азид. Подходящи разтвори на пробите, които трябва да се изследват, се прибавят към белязани с радиоактивен атом протеини. Антигените се инкубират в продължение на една нощ при стайна температура в присъствието на 1:10,000 разредена IgG фракция на заешки анти-t-PA антисерум. Утаява се комплексът антитяло-антиген чрез абсорбция от кози антизаешки IgG Immunobeads / BioRad/ в продължение на 2 ч при стайна температура. Гранулите се пречистват чрез прибавянето на разредител физиологичен разтвор, паследвано от центрофугиране в продължение на 10 мин при 2000 х g при температура 4°С. Супернатантите се изхвърлят и се определя радиоактивността на утайките. Концентрациите се определят посредством сравняване със стандарт.

Клетъчните линии са следващите. Клетъчна линия 1 е един неувеличен /неумножен/ клон от оригиналната група на четирите клона. 1-15_JOO е умножен вторичен клон на клетъчна линия 1, който е увеличен първоначално в 50 пМ МТХ до получаването на клона 1 15 и след това е прехвърлен за по-нататъшно умножаване в 500 пМ МТХ. 1-15_{|0 000} е вторичен клон на 1-15_JOO, който е увеличен по-нататък в присъствието на 10,000 пМ МТХ. Клетъчна линия 188-9 е вторичен клон на един клон, показан на оригиналните фигури, увеличен в 50 пМ МТХ.

Всички емплифицирани клетки показват повишени количества на продуциране на t-PA спрямо тази, показана от неемплифицирана клетъчна култура. Дори неемплифицираната култура продуцира повече от 0,5 pg/клетка/ ден; емплифицираните водят до получаване на количества, доближаващи 50 pg/клетка/ден.

Ж. Фармацевтични състави. Съединенията съгласно изобретението могат да се получат в съответствие с известните методи за получаване на фармацевтично приемливи състави, при което човешкият тьканен плазминогенен активатор съгласно изобретението се комбинира в смес с фармацевтично приемливи носители. Подходящи носители и тяхното получаване, включително и за други човешки протеини, например, човешки серумен албумин, са описани в Remington’s Pharmaceutical Sciences от E.W.Martin. Такива композиции съдържат ефективно количество от протеина заедно с подходящо количество носител, за да се приготвят фармацевтично приемливи състави, подходящи за ефективно въвеждане в гостоприемника.

Например човешкият тьканен плазминогенен активатор може да се приложи парентерално на субекти, страдащи от сърдечно-съдови болести и смущения. Дозировката и прилаганите дози могат да съответстват на използваните при клиничните изследвания на други сърдечно-съдови, тромболитични сред-ства, например, около 440 Ш/кг телесно тегло, интравенозна първоначална доза, последвана от продължителна интравенозна инфузия с около 440 IU/кг/час в продължение на 12 ч при пациенти, страдащи от белодробна емболия.

Пример за подходяща доза за хомогенен по същество човешки тьканен плазминогенен активатор за парентерално приложение е ампула, съдържаща човешки тьканен плазминогенен активатор с 2500 IU активност, 25 мг манитол, 45 мг натриев хлорид, който може да бъде възстановен с 5 мл стерилна вода за инжектиране и смесен с подходящо количество 0,9 % натриев хлорид инжекционен разтвор или 5 % инжекционен разтвор на декстроза за интравенозно приложение.

Ж. Подробно описание на рекомбинантен човешки t-PA. Структурата на човешкия t-PA, получен в съответствие с примерите съгласно изобретението, е изследвана в някои подробности едновременно чрез изясняване на кодираща последователност на гена и чрез някои методи от биохимията на протеините. Последните разбирания за структурата на протеините са пояснени на фигура 12.

От Collen и кол. /88/ е описано, че двойнонишковият /верижния/ човешки t-PA се формира чрез протеолитично разцепване на едноверижна молекула на два полипептида, свързани чрез дисулфидна връзка.

Съгласно изобретението тежката верига /30882 мол.тегло/ е производна от NH₂ - край на част и леката верига /28216 мол.тегло/ включва СООН-краен участък. Определянето на N-крайното секвениране на двуверижната молекула се установява, че двуверижната форма е възникнала при разцепване на единична аргинил-изолевцинова връзка /фиг. 12 посочена със стрелка/.

Първичната структура на част от тежковерижния участък на човешкия t-PA /фиг. 12/ разкрива висока степен на хомоложност на последователността с тази на крингьл участъците на плазминоген /89/ и протромбин /40 и 41/. Крингьл участъкът е свързан с характерна тройна дисулфидна структура, открита за първи път в профрагмента на протромбина и описана за първи път с подробности от Magnusson et al., /91, 92/. В първичната последователност на t-PA са открити два т.нар. крингьл участъка, всеки с по 82 аминокиселини, които имат висока степен на хомология с 5 крингьл участъка на плазминогена. Останалите N-терминални 91 аминокиселини проявяват ниска хомоложност с обикновените крингьл участъци. Може да се допусне, че този участък може също да приеме структура, съдържаща множествени дисулфидни връзки, тъй като в него са установени 11 допълнителни цистеинови остатъци.

Каталитичният сайт на леката верига на човешкия t-PA, т.нар. серинпротеазен участък, както при другите серинови ензими, е най-вероятно да се образува при хистидинов 322, аспаргинов 371 и серинов 478 остатък. По-нататък аминокиселинните последователности, обграждащи тези остатъци, са почти хомоложни на съответните части на други серинови протеази, например трипсин, протромбин и плазминоген.

Claims

Патентни претенции

1. Човешки тьканен плазминогенен активатор, несъдържащ по същество други протеини от човешки произход.
2. Човешки тьканен плазминогенен активатор съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че не участва в природно глюкозилиране.
3. Човешки тьканен плазминогенен активатор съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че е продуциран от рекомбинантни клетки гостоприемници.
4. Човешки тьканен плазминогенен ак тиватор съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че по същество е чист продукт.
5. Човешки тъканен плазминогенен активатор съгласно претенциите от 1 до 4, характеризиращ се с това, че съдържа полипептидна последователност, простираща се от Nкрая на приетата обикновено за първа аминокиселина на описания човешки тъканен плазминогенен активатор.
6. ДНК последователност, характеризираща се с това, че включва последователност, кодираща човешки тъканен плазминогенен активатор.
7. Способен на репликация вектор за експресия на ДНК последователността съгласно претенция 6, осъществяващ експресията в трансформантни микроорганизми или клетъчни култури.
8. Плазмид р ARIPA или pt-PAtrp 12.
9. Микроорганизъм или клетъчна култура, трансформирани със средство съгласно претенциите 7 или 8.
10. Микроорганизъм съгласно претенция 9, получен чрез трансформиране на щама E.coli.
11. Състав съгласно претенциите от 1 до 5, съдържащ терапевтично ефективно количество от човешки тъканен плазминогенен активатор и включващ фармацевтично приемлив носител.
12. Състав съгласно претенция 11 за парентерално приложение.
13. Приложение на човешки тъканен плазминогенен активатор съгласно претенциите от 1 до 5 за лечение на съдови заболявания или смущения или за приготвяне на фармацевтични средства за тяхното лечение.
14. Метод за получаване на човешки тьканен плазминогенен активатор, характеризиращ се с това, че включва експресия на ДНК, кодираща за човешки тъканен плазминогенен активатор, в рекомбинантна клетка гостоприемник.
15. Метод съгласно претенция 1 за получаване на човешки тъканен плазминогенен активатор, характеризиращ се с това, че се състои в получаване на способен на репликация вектор за експресия на ДНК последователност, кодираща за човешки тъканен плазминогенен активатор, в подходяща клетка гостоприемник, трансформиране на клетъчна култура гостоприемник до получаване на ре комбинантна клетка гостоприемник, култивиране на тези клетки при условия, позволяващи експресия на описаната ДНК последователност, кодираща за тъканен плазминогенен активатор, за получаване и извличане на човешки тъканен плазминогенен активатор.

Приложение: 12 фигури

Литература

1. US 3355361.

2. US 3926727.

3. US 4029767.

4. US 4258030.

5. US 4271150.

6. ЕР 0037687.

7. Rijken, D.C., “Plasminogen Activator from Human Tissue”, Krips Repro Meppel, 1980.

8. US 3555000.

9. US 3998947.

10. US 4245051.

11. EP 0023860.

12. US 4083961.

13. US 4177262.

14. US 3082612.

15. Wallen, P., Proc. Serono Symp. 9, 91 (1977).
16. Thorsen, S., et al., Thrombos. Diathes. haemorrh. 28, 65 (1972).
17. Collen, Thrombos. Haemostas. 43, 77 (1980).
18. Wiman et al., Nature 272, 549 (1978).
19. EP 0041766.
20. Weimar, W., et al., The Lancet Vol. II, 8254, p. 1018 (1981).
21. British Patent Application Publn. 2007676A.
22. Wetzel, American Scientist 68, 664 (1980).
23. Microbiology, 2d Ed., Harper and Row Publications, Inc., Hagerstown, Maryland (1973), esp. pp. 1122 et seg.
24. Scientific American 245, 106 (1981).
25. GB 2055382A.
26. DE 2644432.
27. Chang et al., Nature 275, 617 (1978).
28. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977).
29. Goeddel et al., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980).
30. EP 0036776.
31. Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980).
32. Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979).
33. Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979).
34. Tschumper et al.. Gene 10, 157 (1980).
35. Mortimer et al., Microbiological Reviews 44, 519 (1980).
36. Miozzari et al., Journal of Bacteriology 134, 48 (1978).
37. Jones, Genetics 85, 23 (1977).
38. Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255, 12073 (1980).
39. Hess et al., J. Adv. Enzyme Regul. 7, 149 (1968).
40. Holland et al., Biochemistry 17, 4900 (1978).
41. Bostian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 4504 (1980).
42. The Molecular Biology of Yeast (Aug 11-18, 1981), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
43. Chambon, Ann. Rev. Biochemistry, 44 613 (1975).
44. Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson eds, (1973).
45. Gluzman, Cell 23, 175 (1981).
46. Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977).
47. Lusky et al., Nature 293, 79 (1981).
48. Gluzman et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 44, 293 (1980).
49. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978).
50. Reddy et al., Science 200, 494 (1978).
51. Crea et al., Nucleic Acids Research 8, 2331 (1980).
52. Goeddel etal., Nature 287, 411 (1980).
53. Gray et al., Nature 295, 503 (1982).
54. Oppermann et al., Virology 108, 47 (1981).
55. Ward et al., J. Virol. 9, 61 (1972).
56. Aviv et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69, 1408 (1972).
57. Lehrach et al., Biochemistry 16, 4743 (1977).
58. Lynch et al., Virology 98, 251 (1979).
59. Lodish, Am. Rev. of Biochem. 45, 40 (1976).
60. Pelham et al., Eur. J. Biochem. 43, 247 (1976).
61. Blobel, et al., J. Cell Biology 67, 852 (1975).
62. Shields et al., J. Biol. Chemistry 253, 3753 (1978).
63. Laemmli, Nature 227, 680 (1970).
64. Bonner et al., Eur. J. Biochem. 46, 83 (1974).
65. Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979).
66. Wickens et al., J. Biol. Chem. 253, 2483 (1978).
67. Chang et al., Nature 275, 617 (1978).
68. Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977).
69. Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3961 (1975).
70. Hanahan et al., Gene 10, 63 (1980).
71. Bimboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979).
72. Smith, Methods Enzymol. 65, 499 (1980).
73. Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981).
74. Maxam et al., Methods in Enzymol. 65, 499 (1980).
75. Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75, 5765 (1978).
76. Lawn et al., Cell 15, 1157 (1978).
77. Southern, J. Mol. Biol. 98, 503 (1975).
78. Benton et al., Science 196, 180 (1977).
79. McGrath and Levinson, Nature 295, 423 (1982).
80. Blin et al., Nucleic Acid Res. 3, 2303 (1976).
81. Lawn et al., Science 212, 1159 (1981).
82. Fritsch et al., Cell 19, 959 (1980).
83. Taylor et al., Biochem. Biophys. Acta 442, 324 (1976).

83b. Edman et al., European J. Biochem. 1, 80 (1967).
84. Denhardt, Biochem. Biophys. Res. Comm. 23, 641 (1966).
85. Wahl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 3683 (1979).
86. Davis et al., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1980).
87. Granelli-Piperno et al., J. Exp. Med. 148, 223.
88. Rijken et al., J. Biol. Chem. 256, 7035 (1981).
89. Sottrup-Jensen et al., Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, Vol. 3, Raven Press, N.Y. P. 191 (1978).
90. Sothrup-Jensen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 72, 2577 (1975).
91. Magnussen et al., Proteolysis and

Physiological Regulation, Ribbons et al., Eds., Academic Press. New York, p. 203 (1976).
92. Magnussen et al., Proteases and Bio- logical Control, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., p. 123 (1975). 5
93. Miller, Experiments in Molecular Genetics, p. 431-3, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York (1972).
94. Reich, E., Proteases and Biological

Control, (Ibid) p. 333-341.
95. Matsuo, 0., et al., Throm. Haemostasis

45 225 (1981).
96. Koringer, C., et al., Throm. Haemostasis

46 561, 662 (1981).
97. Hoylaerts, M., et al., J. Biol. Chem. 257 2912 (1982).
98. Koringer, C., et al., Thromb. Haemostasis 46 685 (1981).

Издание на Патентното ведомство на Република България 1113 София , бул. Д-р Γ. М. Димитров 52-Б