DE3500961A1 - Escherichia-coli-staemme, dna-teilsequenzen dieser staemme und herstellungsverfahren - Google Patents

Escherichia-coli-staemme, dna-teilsequenzen dieser staemme und herstellungsverfahren

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DE3500961A1
DE3500961A1 DE19853500961 DE3500961A DE3500961A1 DE 3500961 A1 DE3500961 A1 DE 3500961A1 DE 19853500961 DE19853500961 DE 19853500961 DE 3500961 A DE3500961 A DE 3500961A DE 3500961 A1 DE3500961 A1 DE 3500961A1
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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    • C12N1/205—Bacterial isolates
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Description

  • Escherichia-coli-Stämme, DNA-Teilsequenzen dieser Stämme
  • und Herstellungsverfahren Escherichia coli wird bekanntlich technisch zur Herstellung von Proteinen verwendet, die von Plasmiden kodiert erden.
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die technische Herstellung von Proteinen mit Hilfe von Escherichia coli dadurch zu verbessern, daß die Biomasse durch Zugabe von Glukose erhöht wird. Wenn man jedoch Glukose zum Kulturmedium zugibt, so wird die Proteinproduktion inhibiert.
  • Erfindungsgemäß wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß sich aus scherichia-coli-ildstämmen Mutanten gewinnen lassen, die chromosomal kodierte und/oder plasmidkodierte Proteine in einem glukosehaltigen Medium ohne Repression exprimieren. Demgemäß betrifft die Erfindung gemäß einer Ausführungsform Escherichia-coli-Stämme, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie chromosomal kodierte und/oder plasinidkodierte Proteine in einem glukosehaltigen Medium ohne Repression exprimieren. Insbesondere betrifft die Erfindung den Escherichia-coli-Stamm GM 52.
  • Erfindungsgemäße Escherichia-col-i-Stämme kann man dadurch herstellen, daß man (a) einen Escherichia-coli-\ildstamm in einem glukosehaltigen Medium kultiviert, (b) die gewonnene Kultur mit einer Penicillin-G-haltigen Kultur von Serratia marcencens zusammenbringt und (c) Escherichia-coli-Stämme isoliert, die einen Wachstumshemmhof für Serratia marcencens bilden. In dieses Verfahren kann man beispielsweise einen Escherichia-coli-Stamm HB 101 (beispielsweise ATCC 11105 = DSM 1900) und den Serratia-marcencens- Stamm D 217 (beispielsweIse ATCC 27117) einsetzen.
  • Vorteilhafterweise verwendet man einen plasmidfreien !,I ildst amm .
  • Die erfindungsgemäßen Escherichia-coli-Stamme lassen sich als Wirtsstämme für Plasmide verwenden, an deren Genproduktion man interessiert ist. Die Fermentatlon dieser Escherichia-coli-Stämme bietet den Vorteil einer erhöhten Protein-Ausbeute.
  • Gemäß einer weiteren Ausftihrungsform betrifft die Erfindung chromosomale Escherichia-coli-DrElA-Teilsequenzen die den erfindungsgemäßen Escherichia-coli-Stämmen die Eigenschaft verleihen, daß sie chromosomal kodierte und/oder plasmidkodierte Proteine in einem qlukosehaltigen Medium ohne Repression exprimieren.
  • Diese DrXlA-Teilsequenzen kann man dadurch herstellen, daß man von einem erfindungsgemäßen Escherichia-coli-Stamm ausgeht und die DrlA-Teilsequenz in an sich bekannter Weise gewinnt. Zur Isolierung gewünschter DNA-Teilsequenzen sei beispielsweise auf Marx, Science 210 (1980) 1334 verwiesen.
  • Nach Rothstein et al, Cold Spring Harbor Symposia on quantitative Biology, Vol. XLV (1981) 99 - 105, ist die Lokalisierbarkeit eines Gens durch Insertions-Inaktivierung eines Transposons bekannt. Die DNA-Sequenzierung ist nach Maxam & Gilbert, Methods Encymology 65 (1980) 499 - 560, bekannt.
  • Beispiel 1 In diesem Beispiel wurden folgende Medien und Geräte verwendet: LB-Medium 10 g Tryptone (Difco) 10 g Hefe-Extrakt (Difco) 5 g NaCl (Merck) ad 1000 inl deionisiertes H20 LB-Agar LB-Medium + 20 g/l Agar (Difco) Nawl-Lösung 0,85 % in deionisiertern H20 L8 + Glukose LB-Agar + Glukose (Merck) 100 g/l Penicillin G (Sigma) N-hethyl-* nitro-N-nitrosoguanidin (NG) (Sigma) Zentrifuge (J2-21 Beckmann) Rotor (JA-17 Seckmann) Schüttelmaschine (US-PS 3 430 926 von New Brunswick Scientific) Brutschränke (Heräus) (1) Herstellung der mutanten Aus einer frischen Flüssigkultur von HB 101 (z.3. ATCC 11 105) wurden 1o0 ul auf einer Petrischale mit Lß + Glukose ausplattiert. ATCC lt 105 trägt das Penicillin-acylase-Gen auf dem Chromosom und läßt sich plasmidfrei verwenden. Anschließend wurde ein Kristall von N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NG) in die Mitte gelegt. Die Platten wurden über Nacht bei 37 C inkubiert. Die Zellen, die sich in der Nähe des Kristalls befanden, wurden abgetötet. Der Rand mit den überlebenden Zellen wurde mit flüssigem L3-° indium abgeschwemmt und eine Stunde bei 37 C auf einer Schüttelmaschine inkubiert. Danach wurden die Zellen bei ° 8000 U/min 10 rnin lang bei 4 C abzentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde in einer NaCl-Lösung suspendiert und bei 4 ° C gelagert.
  • (2) Vorbereitung einer Serratia-marcencens-Stocklösung Aus einer Platte mit Serratia marcencens (z.B. ATCC 27 117) wurde eine Kolonie geholt, um 10 ml LB-Medium anzuimpfen.
  • Nach dem man über Nacht kultiviert hatte, wurden die Zellen bei 8000 U/min 10 min lang bei 4 OC abzentrifugiert und danach in 10 ml einer NaCl-Lösung suspendiert. Diese Stock-° lösung wurde dann bei 4 0 gelagert.
  • (3) Screening Es wurde nach der Methode von Oostendorp, Antonie van Leeuwenhock 38 (1972) 201 - 206 gearbeitet.
  • Um etwa 20 Kolonien aus 100 /ul Flüssigkeit zu erhalten, wurde eine geeignete Verdünnung eingestellt. Diese 100 /ul wurden auf LB + Glukose ausplattiert und 10 h lang bei 37 C inkubiert. Danach wurde LB-Medium mit 5 g/l Agarose und 250 ng/l Penicillin-G vorbereitet. Dieses Medium wurde mit Serratia marcencens bei 40 OC angeimpft (1 ml der Stocklösung für 100 ml Vedium). Die bereits oewachsenen Platten wurden mit 5 ml dieser Lösung überschichtet und über Nacht bei 30 0C inkubiert.
  • Die Escherichia-coli-Kolonien, die unter diesen Bedingungen gute Enzymproduzenten waren, bildeten einen -Nachstumshemmhof für Serratia marcencens. Da der ursprüngliche Escherichia-coli-Wildstamm unter diesen Bedingungen keinen Hemmhof bildete, waren diese Kolonien als Mutanten anzusehen.
  • Alle guten Enzymproduzenten wurden danach unter zwei Gesichtspunkten quantitativ getestet, nämlich im Hinblick auf die Proteinexpression und im Hinblick auf die Biomasse.
  • Dabei war zusätzlich zu beachten, daß dieser Test durch Diffusion begrenzt ist.
  • Dabei wurde ein Stamm erhalten, der als GM 62 bezeichnet wurde.
  • (4) Testen von GM 62 Der Stamm GM 62 wurde mit verschiedenen Penicillin-acylaseplasmide transformiert und mit dem ursprünglichen Wildstamm und anderen Stämmen verglichen. Dabei erwies er sich als der bessere Produktionsstamm.
  • Ferner wurde der Stamm GM 62 mit anderen Plasmiden getestet, wobei gleichfalls positive Ergebnisse erhalten wurden.
  • (5) Hinterlegung von GM 62

Claims (7)

  1. Patentansprüche 1. Escherichia-coli-Stämme, dadurch g e k e n n z e i c h -n e t , daß sie chromosornal kodierte und/oder plasmidkovierte Proteine in einem glukosehaltigen Medium ohne Repression exprimieren.
  2. 2. Escherichia-coli-Stamin nach Anspruch 1, nämlich GM õ2.
  3. 3. Verfahren zur Herstellung von Escherichia-coli-Stämmen gemäß Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t aaß man (a) einen Escherichia-coll-Wildstarnm in einem glukosehaltigen Medium kultiviert, (b) die gewonnene Kultur mit einer Penicillin-u-haltigen Kultur von Serratia narcencens zusammenbringt und (c) Escherichia-coli-Ställlrne isoliert, die einen Wachstumshemmhof für Serratia marcencens bilden.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man einen plasmidfreinn Wildstamm verwendet.
  5. 5. Verwendung von Escherichia-coli-Stammen gemaß Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von plasmidkodierten Proteinen.
  6. 6. Chromosomale Escherichia-coli-DNA-Teilsequenz, die Escherichia-coli-Stämmen gemäß Anspruch 1 oder 2 die Eigenschaft verleiht, daß sie chromosomal kodierte und/oder plasmidkodierte Proteine in einem glukosehaltigen Medium ohne Repression exprimieren.
  7. 7. Verfahren zur Herstellung der Teilsequenz gernäß Anspruch 6, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man von einem Escherichia-coli-Stam;n gemäß Anspruch 1 oder 2 ausgeht und die Teilsequenz in an sich bekannter Weise isoliert.
DE19853500961 1985-01-14 1985-01-14 Escherichia-coli-staemme, dna-teilsequenzen dieser staemme und herstellungsverfahren Withdrawn DE3500961A1 (de)

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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3220333A1 (de) * 1981-06-02 1983-01-27 Wakunaga Yakuhin K.K., Osaka 27-desamidosecretin und verfahren zu seiner herstellung durch rekombinierte dna-technologie
DE3308030A1 (de) * 1982-03-08 1983-09-29 Genentech, Inc., 94080 South San Francisco, Calif. Tierische interferone
DE3316297A1 (de) * 1982-05-05 1983-11-17 Genentech, Inc., 94080 South San Francisco, Calif. Humangewebe-plasminogen-aktivator

Patent Citations (3)

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