DE2365894A1

DE2365894A1 - Biotechnisches verfahren zur herstellung von polynucleotiden

Info

Publication number: DE2365894A1
Application number: DE2365894*A
Authority: DE
Inventors: Yoshiki Katoh; Akira Kuninaka; Kyuji Rokugawa; Hiroshi Yoshino
Original assignee: Yamasa Shoyu KK
Current assignee: Yamasa Shoyu KK
Priority date: 1972-07-21
Filing date: 1973-07-05
Publication date: 1976-09-23
Also published as: IT1043863B; DE2365894C2; CA990671A; JPS524633B2; FR2193878A1; DE2334314B2; GB1394843A; US3849249A; DE2334314C3; JPS4930594A; FR2193878B1; DE2334314A1

Description

"Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von Polynucleotides¹

Zusatz zu Patent

(Patentanmeldung P 23 34 314.8-41)

Die Erfindung betrifft ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden durch Polymerisation der entsprechenden Nucleosiddiphosphate mittels Polynucleotid-Phosphorylase in Gegenwart von Zweiwertigen Metallkationen, wobei die PNPase-Aktivität von einem neuen Mikroorganismus der Gattung Achromobacter stammt.

Polynucleotide wurden 1955 von S. Ochoa und M. Grunberg-Manago (Fed. Prov. 1_4 (1955) S. 221) hergestellt. Seitdem wurden verschiedene biochemische Wirkungen dieser Verbindungen beobachtet. Insbesondere lässt die Interferon induzierende Aktivität dieser Verbindungen eine Verwendbarkeit als Arzneistoffe erwarten. Die wirtschaftliche Herstellung von Polynucleotiden

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in grossem Maßstab war jedoch recht schwierig, da die Polynucleotide wegen ihrer "komplizierten Struktur nicht auf chemischem Weg synthetisiert werden können. Obwohl es bekannt ist, dass Polynucleotide aus Nucleosiddiphosphaten unter der Einwirkung gereinigter Polynucleotid-Phosphorylase hergestellt werden können und * dieses Enzym in vielen Mikroorganismen vorkommt, war bisher dieses Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden in grossem Maßstab nicht geeignet.

■ Die bekannten Polynucleotid-Phosphorylasen sind intracelluläre Enzyme. Bisher konnten sie jedoch in grossem Maßstab wirt-

. schaftlich nicht aus den Zellen extrahiert werden. Ausserdem konnten verunreinigte Polynucleotid-Phosphorylase-Lösungen ohne weitere Reinigung nicht zur Herstellung von Polynucleotiden verwendet werden, da diese Rohenzymlösungen verschiedene andere Enzyme enthalten, die Nueleosiddiphosphate und/oder Polynucleotide abbauen. So enthalten z.B. Extrakte aus Escherichia coli, Micrococcus lysodeikticus und Azotobacter vinelandii, die als Quelle für Polynucleotid-Phosphorylase bekannt sind, grosse Mengen an ITucleasen und an Nucleosiddiphosphat abbauenden Enzymen. Zur Herstellung eines Polynucleotide in guter Ausbeute müssen diese Extrakte daher vorher intensiv gereinigt werden.

Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, wurde ein Screening auf Mikroorganismen durchgeführt, die zur Herstellung von Polynucleotiden in grossem Maßstab geeignet sind. Ferner wurden die für die Herstellung von Polynucleotid'günstigen Be-

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dingungen untersucht. Diese Untersuchungen ergaben, dass Mikroorganismen der Gattungen Pseudomonas, Aerobacter, Proteus, Bacillus, Serratia, Xanthomonas und Brevibacterium eine hohe Polynucleotid-Phosphorylase-Aktivität aufweisen und dass dieses Enzym leicht aus den Zellen extrahiert werden kann. Ausserdem enthalten solche Extrakte nur wenig Nucleasen und Nucleosiddiphosphat abbauende Enzyme. Bei der Fermentation von Stämmen dieser Mikroorganismen, bei der Inkubation von Zellsuspensionen und von aus den aufgebrochenen Zellen hergestellten Präparationen können ohne besonders aufwendige Reinigung aus mindestens einem Nucleosiddiphosphat wirtschaftlich Polynucleotide hergestellt werden (vgl. OS 2 107 148).

Trotz dieser scheinbar günstigen Aspekte der bekannten Arbeitsweise hat sich in der Praxis gezeigt, daß so erhältliche Enzympräparate immer noch störende Mengen an Enzymen mit Abbauwirkung enthalten, die sich auch durch eine schockartige Aussalzbehandlung mit Ammoniumsulfat nicht in befriedigender Weise entfernen lassen.

überraschenderweise wurde jedoch festgestellt, dass ein spezieller Mikroorganismus der Gattung Achromobacter besonders viel Polynucleotid-Phosphorylase enthält. Dieses Enzym ist ausserdem leicht extrahierbar und weitgehend stabil.

biotechnisches Gegenstand der Erfindung ist daher ein/Verfahren zur Herstellung von Polynucleotides wobei die Polynucleotide durch Polymerisation der entsprechenden Nucleosiddiphosphate mittels PoIy-

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nucleotid-Phosphorylase in Gegenwart von zweiwertigen Metallkationen hergestellt v/erden, wobei man einen Mikroorganismus der Gattung Achromobacter, der eine hohe und leicht extrahierbare Polynucleotid-Phosphorylase-Aktivität aufweist, entweder

a) in üblicher Weise fermentiert und die durch Fermentation ·-. —■*■ - ⁱ

erhaltene Kultur ohne Trennung der Zellmasse von der Kultur-

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brühe in Gegenwart von Mg - oder Mn -Ionen undvon mindestens einem Nucleosiddiphosphat inkubiert oder

b) in üblicher Weise fermentiert, die Zellmasse von der Kulturbrühe abtrennt, die Zellen in einer Inkubationslösung suspendiert und in Gegenwart von Mg - oder Mn -Ionen und von mindestens einem Nucleosiddiphosphat inkubiert oder

c) in üblicher Weise fermentiert, die Zellmasse von der Kulturbrühe abtrennt, die Zellen aufbricht, einen Zeilrohextrakt oder eine daraus hergestellte partiell gereinigte Polynucleotid-Phosphorylase-Präparation, wobei in dem Fall, dass beträchliche Mengen von Nucleosiddiphosphat abbauenden Enzymen vorhanden sind, diese Enzyme vor der Herstellung der Polynucleotide entfernt werden müssen, in einer Inkubationslösung suspendiert und in Gegenwart von Mg - oder Mn -Ionen und von mindestens einem Nucleosiddiphosphat inkubiert, nach

Patent (Patentanmeldung P 23 34 314.8-41) welches

dadurch gekennzeichnet ist, dass man den Stamm Achromobacter •sp. KR 170-4 (ATCC 21942 ) einsetzt.

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Bisher war nicht bekannt, dass Mikroorganismen der Gattung Achromobacter besonders viel Polynucleotid-Phosphorylase enthalten und dass sich dieses Enzym für die wirtschaftliche Herstellung in grossem Maßstab von Polynucleotiden eignet.

Der Stamm Achromobacter sp. KR 170-4 (ATCC 21942) wurde aus "Kamaboko" isoliert. Die mikrobiologischen Merkmale dieses Stammes sind:

1. Mikroskopisches Erscheinungsbild:

a) Kurze Stäbchen mit einer Langesvon 1,5 Mikron und einer Dicke von 0,5 Mikron

b) nicht beweglich

c) gramm-negativ

2. Eigenschaften der Kultur:

a) Gelatine-Nährböden:

kreisförmige, aufgewölbte, glänzende, durchsichtige und bläulich-weisse Kolonien; die Gelatine wird nicht verflüssigt

b) Agar-Schrägröhrchen:

dichtes Wachstum, faserförmige, konvexe, glänzende, weiche, durchsichtige und bläulich-weisse Kolonien

c) flüssiges Nährmedium:

trüb, dünnes Häutchen auf der Oberfläche, reichliches Sediment, weiss; die Farbe des Mediums ist unverändert

d) Gelatine-Stichkultur:

schwaches Wachstum, die Gelatine wird nicht verflüssigt

e) Kartoffel-Nährböden:

dichtes Wachstum, gräulich-weisse, glänzende, weiche

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und aufgewölbte Kolonien; die Farbe des Mediums ändert sich von weiss auf rauch-grau

3. Physiologische Eigenschaften:

a) Lackmus-Milch:

b) Indolbildung:

c) Nitrat-Reduktion:

d) Sauerstoffbedarf:

e) Temperaturoptimum:

f) Zuckerverwertung:

alkalisch, keine Veränderung keine

Nitrat wird zu Nitrit reduziert aerob
25°C

gutes Wachstum bis 30 C schwaches Wachstum bei 0 C Säure-, jedoch keine Gasbildung aus Glukose, Fruktose, Galaktose, Mannose und Xylose

alkalische Reaktion, jedoch keine Gasbildung aus Saccharose, Lactose und Arabinose.

Die meisten der angeführten Merkmale ähneln sehr den Merkmalen von Achromobacter delmarvae (vgl. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7.Auflage, (1957), S. 308). Der oben beschriebene Stamm unterscheidet sich jedoch von der bekannten Art Achromobacter delmarvae dadurch, dass er aus lactose keine Säure bildet; er erhält daher den Namen Achromobacter sp. KR17.0-4-·

Im erfindungsgemässen Verfahren können Polynucleotide, z.B. Polyinosinsäure, Polyguanylsäure, Polycytidylsäure, PpIyadenylsäure und Polyuridylsäure. (im folgenden als Poly I,

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Poly G, Poly C, Poly A und Poly U bezeichnet) hergestellt werden. Als ITucleosiddiphosphate können im erfindungsgemässen Verfahren ZcB. Inosindiphosphat, Guanosindiphosphat, Cytidindiphosphat, Adenosindiphosphat und Uridindiphosphat (im folgenden" mit IDP, GDP, CDP, ADP und UDP bezeichnet) verwendet werden. Wird im erfindungsgemässen Verfahren ein Gemisch mehrerer ITucleosiddiphosphate eingesetzt, so entstehen gemischte Polynucleotide. Setzt man z.B. als Ausgangsverbindung IDP ein, so entsteht Poly I; wird ein Gemisch aus GDP und CDP eingesetzt, so entsteht das gemischte Poly G-C. In letzterem Fall werden die als Ausgangsverbindungen verwendeten ITucleosiddiphosphate so vermischt, dass das Verhältnis der Hucleosid- . diphosphate dem gewünschten Verhältnis der Basen im Poly-

nücleotid entspricht. ^:

Die Fermentation des Mikroorganismus wird in üblicher Weise in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Bestandteile und Spuren wichtiger Nährstoffe enthaltenden Nährmedium durchgeführt. Die pH-, Belüftungs- und Temperaturoptima werden entsprechend, gewählt.

Bei der Arbeitsweise a) wird dem Fermentationsgemisch ein Nucleosiddiphosphat und Mg⁺⁺- oder Mn⁺⁺-Ionen liefernde Verbindung zugesetzt.

Bei der weiteren Inkubationsbehandlung wird das zugesetzte Nu-"cleosiddiphosphat in das entsprechende Polynucleotid umgewandelt.

Gewöhnlich erfolgt der Zusatz der gesamten Menge des Nucleosiddiphosphats auf einmal; die portionsweise Zugabe der Nucleo-

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siddiphosphate ergibt ebenfalls zufriedenstellende Ergebnisse.

Bei der Arbeitsweise b) isoliert man die Zellen einer Kultur durch Zentrifugieren zu einem Zeitpunkt, wo die Polynucleotid-Phosphorylase-Aktivität der Zellen das Maximum erreicht hat. Das Maximum wird im allgemeinen in der späten L]og-Phase beobachtet.

Die abzentrifugierte Zellmasse wird in einem Inkubationsmedium,

++ das mindestens ein Nucleosiddiphosphat, mindestens eine Mg oder Mn -Ionen liefernde Verbindung und einen Puffer oder Natriumchlorid enthält, suspendiert. Die Suspension wird dann unter für die Herstellung von Polynucleotiden günstigen Bedingungen inkubiert. Die Konzentration des Puffers oder der Natriumchloridlösung liegt zweckmässig zwischen 0,001 m und 0,3 m. Der pH-Wert liegt bevorzugt zwischen 6 und 12. Die optimalen Bedingungen werden im allgemeinen bei einer Konzentration von 0,1 m und einem pH-Wert von 9 beobachtet.

Bei der Arbeitsweise c) werden als PNPäse- Liefer'ant aufgebrochene Zellen, Zeilrohextrakte oder daraus hergestellte partiell gereinigte Präparationen verwendet. Die Zellen können z.B. durch Ultraschallbehandlung, Durchpressen durch eine enge Düse, Verreiben mit Aluminiumoxid oder Quarzsand, durch Behandlung mit einer lysierenden Verbindung oder einer hochkonzentrierten umchloridlösung aufgebrochen werden.

Die Extraktion der Polynucleotid-Ph.osph.oryläse in grossem Maßstab lässt sich besonders wirksam mit einer hochkonzen-

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trierten Natriumchloridlösung durchführen. Zu diesem Zweck

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wird die abzentrifugierte Zellmasse in einer hochkonzentrierten, gewöhnlich gesättigten₅Natriumchloridlösung, suspendiert. Die Suspension wird einige Zeit, im allgemeinen über Nacht, stehen gelassen und dann zentrifugiert. Die abzentrifugierte Zellmasse wird in einem Puffer oder in Wasser suspendiert, wobei die Polynucleotid-Phosphorylase aus den aufgebrochenen

. Zellen extrahiert wird. Die Extraktion wird noch wirksamer, wenn man die aufgebrochenen,mit Natriumchlorid' behandelten Zellen einer Dialyse unterwirft. Die aufgebrochenen Zellen werden mit einer geringen Menge Wass,er oder Puffer in einen Dialysierschlauch eingebracht, der in viel Pufferlösung oder Wasser eingetaucht wird. Nach der Dialyse wird die im Dialysierschlauch befindliche lösung zentrifugiert. Der von

• den Zelltrümmern befreite Zellrohextrakt enthält die PoIynucleotid-Phosphorylase-Aktivität. · ·

Nucleinsäure und oder Nucleosiddiphosphat abbauende Enzyme müssen vor der Herstellung der Polynucleotide entfernt werden, z.B. durch Behandeln der Extrakte mit Streptomycin zur Entfernung der Nucleinsäuren und durch fraktioniertes Aussalzen mit Ammoniumsulfat. Die meisten der störenden Enzyme werden durch Aussalzen mit zu 50 Prozent gesättigtem Ammoniuiasulfat entfernt. Die Hauptmenge der Polynucleotid-Phosphorylase-Aktivität wird dann durch fraktionierte Fällung mit zu 50 und 80 Prozent gesättigtem Ammoniumsulfat wiedergewonnen. Auf diese Weise erhält man leicht eine Enzyralösung, die besonders reich an Polynucleotid-Phosphorylase-Aktivität ist und nur wenig Nucleinsäure und/oder Nucleosiddiphosphat abbauende Enzyme " enthält. Man kann die störenden Enzyme aber auch durch Prak-

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tionieren mit organischen Lösungsmitteln entfernen. Die von* den störenden Enzymen befreite Polynucleotid-Phosphorylase kann dann ohne weitere Reinigung zur Herstellung von PoIynucleotiden verwendet werden. Gegebenenfalls kann man.das Enzym noch durch Kolonnenchromatographie mit vernetztem Dextran mit Ionenaustauschereigenschaften, DEAE-Sephadex, reinigen. Da die Polynucleotid-Phosphorylase aus dem Mikroorganismus Achromobacter sp.KR 170-4 weitgehend stabil ist, müssen bei der Extraktion, Reinigung und Inkubation keine besonderen Vorsicht smassnahmen ergriffen werden. Dieser Mikroorganismus ist deshalb für die Herstellung in grossem Maßstab von Polynucleotiden besonders geeignet.

Im allgemeinen wird im erfindungsgemassen Verfahren die Inkubation bei einer Temperatur von O bis 6O⁰C und einem pH-Wert von-6 bis 12 durchgeführt. Die bei der Fermentation bzw. Inkubation nicht umgesetzten Nucleosiddiphosphate können in herkömmlicher Weise aus der KuItürbrühe bzw, aus 'dem Inkubationsgemisch leicht zurückgewonnen und bei weiteren Umsetzungen erneut als Ausgangsverbindungen eingesetzt v/erden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

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Achroitiobacter sp.KR 170-4 (ATCC 21942) wird 24 Stunden bei 28°C in 10 ml Nährmedium, das 10 Prozent pulverisierten Fleischextrakt enthält, unter Schütteln inkubiert.

Mit dieser Kultur werden 2 Liter eines Nährmediums, das aus 5 Prozent Koji-Schimmelpilz-Extrakt und 0,8 Prozent Hefeextrakt, pH 7,0, besteht, beimpft. Die Fermentation wird 10 Stunden unter Kreisschütteln bei 28°C durchgeführt.

Man erhält daraus 32 g feuchte Zellmasse, die in gesättigter Natriumchloridlösung suspendiert und über Nacht stehengelassen wird. Die Suspension wird dann zentrifugiert, der Niederschlag wird in Leitungswasser suspendiert und 12 Stunden gegen Leitungswasser dialysiert. Die im Dialysierschlauch zurückbleibende Suspension wird tropfenweise unter Rühren mit einer lOprozentigen Streptomycinsulfatlösung, pH 7,6, versetzt. Der sich bildende Niederschlag wird abzentrifugiert. Der Überstand wird gegen 0,02 m Tris-HCl-Pufferlösung, pH 7,6, dialysiert. Die im Dialysierschlauch zurückbleibende Lösung, etwa 62 ml, wird als Rohenzymlösung verwendet.

15g IDP-Natriumsalz und 0,5 g Mangan(II)-chlorid werden in 1 Liter 0,-1 m Natriumchloridlösung, pH 8,7, gelöst und mit 30 ml Rohenzymlösung versetzt. Das Gemisch wird 8 Stunden bei 30 C inkubiert und dann mit 1 Liter Äthanol versetzt. Aus dem Niederschlag wird nach herkömmlicher Weise Poly I isoliert und gereinigt. Man erhält 6,5 g (43 Prozent) gereinigtes Poly I mit einem Sedimentationskoeffizienten von 9,2 S. ■

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Beispiel

1,5 g UDP-Natriurnsalz und 200 mg Magnesiumchlorid werden in 100 ml

0,1/Natriumchloridlösung, pH 9,2, gelöst und mit 4 ml gemäss Beispiel 1 hergestellter Rohenzymlösung versetzt. Das Gemisch wird 6 Stunden bei 37°C inkubiert und dann mit 100 ml Äthanol versetzt. Aus dem Niederschlag wird in herkömmlicher Weise Poly U isoliert und' gereinigt. Man erhält 620 mg (41 Prozent) gereinigtes Poly U mit einem Sedimentationskoeffizienten von 5,0 S.

Beispiel

Achromobacter sp. KR 170-4 (ATCC 21942) wird über Nacht unter Schütteln bei 38°C in 10 ml Nährmedium inkubiert.

1 ml dieser Kultur wird in einem Erlenmayer-Kolben überführt, der 100 ml Nährmedium enthält, und 10 Stunden bei 28 C fermentiert.

Zu dem Fermentationsgemisch setzt man 2 g gepulvertes CDP-Natriumsalz und 0,15 g Mangan(II)-chlorid hinzu und setzt das Inkubieren

Nach 48 Stunden werden die Zellen abzentrifugiert, der überstand wird mit 200 ml Äthanol versetzt. Poly C wird in üblicher Weise aus dem gebildeten Niederschlag isoliert und gereinigt. Man erhält 952 mg (47,6 Prozent) gereinigtes Poly C mit einem Sedimentationskoeffizienten von 7,2 S.

Die nachstehende Tabelle zeigt die überraschend hohe Enzymaktivität von aus Achromobacter sp. KR 170-4 gewonnenen Präparaten im Vergleich zu bekannten PNPase-Lieferanten.

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Für die Vergleichsversuche wurde jeder Mikroorganismus bei 28 C in einem Sakaguchi-Kolben in 100 ml Nährmedium bis zum Eintreten der spaten log-Phase fermentiert. Das gebildete Enzym wurde dann mittels der schockartigen Aussalzmethode extrahiert.

Diese besteht darin, daß man die Zellsubstanz in gesättigter Salzlösung über Nachtstehen lässt, anschliessend die Suspension-zentrifugiert und den abgetrennten Niederschlag nochmals in 0,01 m Tris-HCl-Puffer bei pH 7,6 suspendiert. Anschliessend dial'siert man gegen den gleichen Puffer oder gegen Wasser.

Zu der nicht dialysierbaren Fraktion setzt man auf einen pH-Wert von 7,6 eingestellte 10%ige Streptomycinsulfatlösung tropfenweise unter Rühren hinzu und zentrifugiert den gebildeten Niederschlag ab. Der überstand wird wiederum gegen die Pufferlösung dialysiert/ und der Inhalt des Dialysierschlauches wird dann auf seine PNPase-Aktivität geprüft.

Hierfür wird eine Mischung aus 48z/mol IDP-Natriumsalz, 5^mol MnCl, 1 ,0 ml Tris-HCl-Puffer (pH 9,2) 0,5 ml H₂O und 0,5 ml Enzymlösung 60 Minuten lang bei 37°C inkubiert . 0,5 ml dieser Reaktionsmischung werden mit 0,5 ml üranylreagenz versetzt (10%ige Perchlorsäurelösung mit einem Gehalt von 0,3 % Uranylacetat). Man lässt Minuten im Eis stehen und zentrifugiert. Der flüssige überstand · wird mit 0,01 η hcI um den Faktor 250 verdünnt, und dann wird die Lichtabsorption bei 250nm bestimmt. Die^inheit an PNPase wird als diejenige Menge an Enzymen definiert, die unter den angegebenen

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Bedingungen je Minutei^/mol IDP polymerisiert.

TABELLE	Mikroorganismus	Aktivität (E/mg Protein) χ 10²
	Achromobacter sp. KR 170-4	--* 34,0
Pseudomonas sp. R-399 (ATCC 21 638)	26,5
Pseudomonas Putrefaciens	25,2
Xanthromonas begoniaQ	20,2
Micrococcus lysodeikticus	16,7

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Claims

IS

Patentansprüche

Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von Polynucleotide^ wobei die Polynucleotide durch Polymerisation der entsprechenden Nucleosiddiphosphate mittels Polynucleotid-Phosphorylase in Gegenwart von zweiwertigen Metallkationen hergestellt werden, . man einen Mikroorganismus der Gattung Achroraobacter, der eine hohe und leicht extrahierbare Polynucleotid-Phosphorylase-Aktivität aufweist, entweder

a) in üblicher Weise fermentiert und die durch Fermentation "erhaltene Kultur ohne Trennung der Zellmasse von der Kultur-• brühe ⁱⁿ Gegenwart von Mg - oder Mn -Ionen und von mindestens einem Nucleosiddiphosphat inkubiert oder

b) in üblicher Weise fermentiert, die Zellmasse von der Kulturbrühe abtrennt, die Zellen in einer Inkubationslösung suspendiert und in Gegenwart von Mg - oder Mn -Ionen und von mindestens einem Nucleosiddiphosphat inkubiert oder

c) in üblicher Weise fermentiert, die Zellmasse von der Kulturbrtihe abtrennt, die Zellen aufbricht, öinen Zellrohextrakt .oder eine daraus hergestellte partiell gereinigte Polynucleotid-Phosphorylase-Präparation, wobei in dem Fall; dass beträchtliche Mengen von Nucleosiddiphosphat abbauenden Enzymen vorhanden sind, diese Enzyme vor-der Herstellung der'

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der Polynucleotide entfernt werden müssen, in einer Inku-

++ batiemslösung suspendiert und in Gegenwart von Mg - oder Mn -Ionen und von mindestens einem Nucleosiddiphosphat

inkubiert/ nach Patent (Patentanmeldung P 23 34

314.8-41) dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Achromobacter sp. KR 17O-4(atcc 21942Jeinsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Inkubation bei einer Temperatur von 0 bis 6O C und einem pH-Wert von 6 bis 12 durchführt.

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