DE2334314B2 - Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden - Google Patents

Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden

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Description

Die Erfindung betrifft ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden durch Polymerisation der entsprechenden Nucleosiddiphosphate mittels Polynucleotid-Phosphorylase in Gegenwart von zweiwertigen Metallkationen, wobei die PNPase-Aktivität von einem Mikroorganismus der Gattung Achromobacter stammt.
Polynucleotide wurden 1955 von S. Ochoa und M. Grunbere-Manago (Fed. Prov. 14 [19551 S. 221) hergestellt Seitdem wurden verschiedene biochemische Wirkungen dieser Verbindungen beobachtet Insbesondere läßt die Interferon induzierende Aktivität dieser Verbindungen eine Verwendbarkeit als Arzneistoffe erwarten. Die wirtschaftliche Herstellung von Polynucleotiden in großem Maßstab war jedoch recht schwierig, da die Polynucleotide wegen ihrer komplizierten Struktur nicht auf chemischem Weg synthetisiert werden können. Obwohl es bekannt ist, daß Polynucleotide aus Nucleosiddiphosphaten unter der Einwirkung gereinigter Polynucleotid-Phosphorylase hergestellt werden können und dieses Enzym ir. vielen Mikroorganismen vorkommt, war bisher dieses Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden idn großem Maßstab nicht geeignet
Die bekannten Polynucleotid-Phosphorylasen sind intracelluläre Enzyme. Bisher konnten sie jedoch in großem Maßstab wirtschaftlich nicht aus den Zellen extrahiert werden. Außerdem konnten verunreinigte Polynucleotid-Phosphorylase-Lösungen ohne weitere Reinigung nicht zur Herstellung von Polynucleotiden verwendet werden, da diese Rohenzymlösungen verschiedene andere Enzyme enthalten, die Nucleosiddiphosphate und/oder Polynucleotide abbauen. So enthalten z. B. Extrakte aus Escherichia coli, Micrococcus lysodeikticus und Azotobacter vinelandii, die als Quelle für Polynucleotid-Phosphorylase bekannt sind, große Mengen an Nucleasen und an Nucleosiddiphosphat abbauenden Enzymen. Zur Herstellung eines Polynucleotids in guter Ausbeute müssen diese Extrakte daher vorher intensiv gereinigt werden.
Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, wurde ein Screening auf Mikroorganismen durchgeführt, die zur Herstellung von Polynucleotiden in großem Maßstab geeignet sind. Ferner wurden die für die Herstellung von Polynucleotid günstigen Bedingungen untersucht. Diese Untersuchungen ergaben, daß Mikroorganismen der Gattungen Pseudomonas, Aerobacter, Proteus, Bacillus, Serratia, Xanthomonas und Brevibacterium eine hohe Polynucleotid-Phosphorylase-Aktivität aufweisen und daß dieses Enzym leicht aus den Zellen extrahiert werden kann. Außerdem enthalten solche Extrakte nur wenig Nucleasen und Nucleosiddiphosphat abbauende Enzyme. Bei der Fermentation von Stämmen dieser Mikroorganismen, bei der Inkubation von Zellsuspensionen und von aus den aufgebrochenen Zellen hergestellten Präparationen können ohne besonders aufwendige Reinigung aus mindestens einem Nucleosiddiphosphat wirtschaftlich Polynucleotide hergestellt werden (vgl. OS 2107 148).
Trotz dieser scheinbar günstigen Aspekte der bekannten Arbeitsweise hat sich in der Praxis gezeigt, daß so erhältliche Enzympräparate immer noch störende Menger an Enzymen mit Abbauwirkung enthalten, die sich auch durch eine schockartige Aussalzbehandlung mit Ammoniumsulfat nicht in befriedigender Weise entfernen lassen.
Überraschenderweise wurde jedoch festgestellt, daß Mikroorganismen der Gattung Achromobacter besonders viel Polynucleotid-Phosphorylase leicht extrahierbarer und weitgehend stabiler Form enthalten.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden, wobei die Polynucleotide durch Polymerisation der entsprechenden Nucleosiddiphosphate mittels Polynucleotid-Phosphorylase in Gegenwart von zweiwertigen Metallkationen hergestellt werden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus
der Gattung Achromobacter, der eine hohe und leicht extrahierbare Polynucleotid-Phosphorylase-Aktivität aufweist, ausgenommen den Stamm Achromobacter Sp. KR170-4 (ATCC 21 942), entweder
a) in üblicher Weise fermentiert und die durch Fermentation erhaltene Kultur ohne Trennung der Zellmasse von der Kulturbrühe in Gegenwart von Mg++- oder Mn++-Ionen und von mindestens einem Nucleosiddiphosphat inkubiert oder
b) in üblicher Weise fermentiert, die Zellmasse von der Kulturbrühe abtrennt, die Zellen in einer Inkubationslösung suspendiert und in Gegenwart von Mg+ +- oder Mn+ +-Ionen und von mindestens einem Nucleosiddiphosphat inkubiert oder
c) in üblicher Weise fermentiert, die Zellmasse von der Kulturbrühe abtrennt, die Zellen aufbricht, einen Zellrohextrakt oder eine daraus hergestellte partiell gereinigte Polynucleotid-Phosphorylase-Präparation, wobei in dem Fall, daß beträchtliche Mengen von Nucleosiddiphosphat abbauenden Enzymen vorhanden sind, diese Enzyme vor der Herstellung der Polynucleotide entfernt werden müssen, in einer Inkubationslösung suspendiert und in Gegenwart von Mg++- oder Mn++-Ionen und von mindestens einem Nucleosiddiphosphat inkubiert.
Bisher war nicht bekannt, daß Mikroorganismen der Gattung Achromobacter besonders viel Polynucleotid-Phosphorylase enthalten und daß sich dieses Enzym für die wirtschaftliche Herstellung in großem Maßstab von Polynucleotiden eignet Es wurde festgestellt, daß alle untersuchten Stämme der Gattung Achromobacter, sowohl Stammkulturen als auch frisch isolierte Kulturen, besonders viel Polynucleotid-Phosphorylase enthalten. Das erfindungsgemäße Verfahren kann z. B. mit Hilfe der folgenden Stämme durchgeführt werden:
Achromobacter cycloclastes
Achromobacter delmarvae,
Smart.
Achromobacter parvulus,
(Conn) Breed.
Achromobacter parvulus,
(Conn) Breed.
(ATCC21921)
(ATCC 21922)
(ATCC 4335)
(NRRLB-2395)
ίο
Im erfindungsgemäßen Verfahren können Polynucleotide, z. B. Polyinosinsäure, Polyguanylsäure, Polycytidylsäure, Polyadenylsäure und Polyuridylsäure (im folgenden als Poly I, Poly G, Poly C, Poly A und Poly U bezeichnet) hergestellt werden. Als Nucleosiddiphosphate können im erfindungsgemäßen Verfahren z. B, Inosindiphosphat, Guanosindiphosphat, Cytidindiphosphat, Adenosindiphosphat und Uridindiphosphat (im folgenden mit IDP, GDP, CDP, ADP und UDP bezeichnet) verwendet werden. Wird im erfindungsgemäßen Verfahren ein Gemisch mehrerer Nucleosiddiphosphate eingesetzt, so entstehen gemischte Polynucleotide. Setzt man z. B. als Ausgangsverbindung IDP ein, so entsteht Poly I; wird ein Gemisch aus GDP und CDP eingesetzt, so entsteht das gemischte Poly G-C. In letzterem Fall werden die als Ausgangsverbindungen verwendeten Nucleosiddiphosphate so vermischt, daß das Verhältnis der Nucleosiddiphosphate dem gewünschten Verhältnis der Basen im Polynucleotid entspricht.
Im erfindungsgemäßen Verfahren kann jeder Mikroorganismus der Gattung Achromobacter, der eine hohe und leicht extrahierbare Polynucleotid-Phosphorylase-Aktivität aufweist, verwendet werden, unabhängig von seiner taxonomischen Stellung.
Die Fermentation der Mikroorganismen wird in üblicher Weise in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Bestandteile und Spuren wichtiger Nährstoffe enthaltenden Nährmedium durchgeführt Die pH-, Belüftungs- und Temperaturoptima werden für jeden Stamm entsprechend gewählt
Bei der Arbeitsweise a) wird dem Fermentationsgemisch direkt ein Nucleosiddiphosphat und eine Mg++- oder Mn++-Ionen liefernde Verbindung zugesetzt
Bei der weiteren Inkubationsbehandlung wird das zugesetzte Nucleosiddiphosphat in das entsprechende Polynucleotid umgewandelt
Gewöhnlich erfolgt der Zusatz der gesamten Menge des Nucleosiddiphosphats auf einmal, die portionsweise Zugabe der Nucleosiddiphosphate ergibt ebenfalls zufriedenstellende Ergebnisse.
Bei der Arbeitsweise b) isoliert man die Zellen einer Kultur durch Zentrifugieren zu einem Zeitpunkt, wo die Polynucleotid-Phosphorylase-Aktivität der Zellen das Maximum srreicht hat. Das Maximum wird im allgemeinen in der späten Log-Phase beobachtet. Die abzentrifugierte Zellmasse wird in einem Inkubationsmedium, das mindestens ein Nucleosiddiphosphat, mindestens eine Mg++- oder Mn++-Ionen liefernde Verbindung und einen Puffer oder Natriumchlorid enthält, suspendiert. Die Suspension wird dann unter für die Herstellung von Polynucleotiden günstigen Bedingungen inkubiert. Die Konzentration des Puffers oder der Natriumchloridlösung liegt zweckmäßig zwischen 0,001 m und 0,3 m. Der pH-Wert liegt bevorzugt zwischen 6 und 12. Die optimalen Bedingungen werden im allgemeinen bei einer Konzentration von 0,1 m und einem pH-Wert von 9 beobachtet.
Bei der Arbeitsweise c) werden als PNPase-Lieferant aufgebrochene Zellen, Zeilrohextrakte oder daraus hergestellte partiell gereinigte Priiparationen verwendet. Die Zellen können z. B. durch Ultraschallbehand- |ungi Durchpressen durch eine enge Düse, Verreiben mit Aluminiumoxid oder Quarzsand, durch Behandlung mit einer lysierenden Verbindung oder einer hochkonzentrierten Natriumchloridlösung aufgebrochen werden.
Die Extraktion der Polynucleotid-Phosphorylase in großem Maßstab läßt sich besonders wirksam mit einer hochkonzentrierten Natriumchloridlösung durchführen. Zu diesem Zweck wird die abzentrifugierte Zellmasse in einer hochkonzentrierten, gewöhnlich gesättigten, Natriumchloridlösung suspendiert. Die Suspension wird einige Zeit, im allgemeinen über Nacht, stehen gelassen und dann zentrifugiert. Die abzentrifugierte Zellmasse wird in einem Puffer oder in Wasser suspendiert, wobei die Polynucleotid-Phosphorylase aus den aufgebrochenen Zellen extrahiert wird. Die Extraktion wird noch wirksamer, wenn man die aufgebrochenen, mit Natriumchlorid behandelten Zellen einer Dialyse unterwirft. Die aufgebrochenen Zellen werden mit einer geringen Menge Wasser oder Puffer in einen Dialysierschlauch eingebracht, der in viel Pufferlösung oder Wasser eingetaucht wird. Nach der Dialyse wird die im Dialysierschlauch befindliche Lösung zentrifugiert. Der von den Zelltrümmern befreite Zellrohextrakt enthält die Polynucleotid-Phosphorylase-Aktivität
Einige Stämme, z. B. Achromobacter parvulus, enthalten beträchtliche Mengen an Nucleinsäuren und/oder Nucleosiddiphosphat abbauenden Enzymen. Diese Enzyme müssen vor der Herstellung der Polynucleotide
entfernt werden, ζ. B. durch Behandeln der Extrakte mit Streptomycin zur Entfernung der Nucleinsäuren und durch fraktioniertes Aussalzen mit Ammoniumsulfat Die meisten der störenden Enzyme werden durch Aussalzen mit zu 50 Prozent gesättigtem Ammoniumsulfat entfernt. Die Hauptmenge der Polynucleotid-Phosphorylase-Aktivität wird dann durch fraktionierte Fällung mit zu 50 und 80 Prozent gesättigtem Ammoniumsulfat wiedergewonnen. Auf d-ese Weise erhält man leicht eine Enzymlösung, die besonders reich an Polynucleotid-Phosphorylase-Aktivität ist und nur wenig Nucleinsäure und/oder Nucleosiddiphosphat abbauende Enzyme enthält. Man kann die störenden Enzyme aber auch durch Fraktionieren mit organischen Lösungsmitteln entfernen. Die von den störenden Enzymen befreite Polynucleotid-Phosphorylase kann dann ohne weitere Reinigung zur Herstellung von Polynucleotiden verwendet werden. Gegebenenfalls kann man das Enzym noch durch Kolonnenchromatographie mit vernetzten! Dextran mit Jonenaustauschereigenschaften DEAE-Sephadex, reinigen. Da die Polynucleotid-Phosphorylase aus Mikroorganismen der Gattung Achromobacter weitgehend stabil ist, müssen bei der Extraktion, Reinigung und Inkubation keine besonderen Vorsichtsmaßnahmen ergriffen werden. Die Mikroorganismen der Gattung Achromobacter sind deshalb für die Herstellung in großen Maßstab von Polynucleotiden besonders geeignet.
Im allgemeinen wird im erfindungsgemäßen Verfahren die Inkubation bei einer Temperatur von 0 bis 6O0C und einem pH-Wert von 6 bis 12 durchgeführt. Die bei der Fermentation bzw. Inkubation nicht umgesetzten Nucleosiddiphosphate können in herkömmlicher Weise aus der Kulturbrühe bzw. aus dem Inkubationsgemisch leicht zurückgewonnen und bei weiteren Umsetzungen erneut als Ausgangsverbindungen eingesetzt werden.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Achromobacter cycloclastes (ATCC 21921) wird 24 Stunden bei 28°C in 10 ml Nährmedium, das 10 Prozent pulverisierten Fleischextrakt enthält, unter Schütteln inkubiert. Mit dieser Kultur wird ein 500 ml Nährmedium enthaltender 3 Liter-Erlenmeyer-Kolben beimpft. Die Fermentation wird 24 Stunden bei 28° C unter Kreisschütteln durchgeführt. Man erhält daraus 8 g feuchte Zellmasse, die in 80 ml gesättigter Natriumchloridlösung suspendiert und über Nacht stehengelassen wird. Die Suspension wird dann zentrifugiert, der Niederschlag wird in 16 ml Leitungswasser suspendiert und 12 Stunden gegen Leitungswasser dialysiert. Die im Dialysierschlauch zurückbleibende Suspension wird tropfenweise unter Rühren mit 6 ml einer lOprozentigen Streptomycinsulfatlösung, pH 7,6, versetzt. Der sich bildende Niederschlag wird abzentrifugiert Der Überstand wird gegen 0,02 m Tris-HCl-Pufferlösung, pH 7,6, dialysiert. Die im Dialysierschlauch zurückbleibende Lösung, etwa 25 ml wird als Rohenzymlösung verwendet.
1,5 g CDP-Natriumsalz und 0,05 g Mangan(Il)-chlorid werden in 100 ml 0,1 m Natriumchloridlösung, pH 9,2, gelöst und mit 15 ml der Rohenzymlösung vermischt. Das Reaktionsgemisch wird 6 Stunden bei 37°C inkubiert und dann mit 100 ml Äthanol unter Rühren versetzt. Aus dem entstandenen Niederschlag wird Poly C in herkömmlicher Weise isoliert und gereinigt. Man erhält 672 mg (45 Prozent) gereinigtes Poly C mit einem Sedimentationskoeffi/ienten von 5.2 S.
Beispiel 2
Achromobacter delmarvae (ATCC 21922) wird in 1 Liter des in Beispiel 1 angegebenen Nährmediums 14 Stunden unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen fermentiert. Es wird gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet, wobei man 17,5 g feuchte Zellmasse und schließlich 30 ml Rohenzymlösung erhält
1,5 g IDP-Natriumsalz und 50 mg Mangan(II)-chlorid
ίο werden in 100 ml 0,1 m Tris-HCI-Puffer, pH 9,2, gelöst und mit 10 ml der Rohenzymlösung versetzt. Das Gemisch wird 6 Stunden bei 37° C inkubiert und dann mit 100 ml Äthanol versetzt Aus dem gebildeten Niederschlag wird Poly I in herkömmlicher Weise isoliert und gereinigt Man erhält 760 mg (51 Prozent) gereinigtes Poly I mit einem Sedimentationskoeffizienten von 6,9 S.
Beispiel 3
_'" Achromobacter delmarvae (ATCC 21922) wird in 10 ml des in Beispiel 1 angegebenen Nährmediums bei 28°C über Nacht fermentiert Ein 100ml Nähimedium enthaltender Erlenmeyer-Kolben wird mit 1 ml dieser Kultur beimpft. Die Fermentation wird 10 Stunden bei
2'. 280C durchgeführt. Diese Kultur wird mit 2 g pulverisiertem CDP-Natriumsalz und 0,15 g Mangan(!I)-chlorid versetzt und weiter inkubiert. Nach 48 Stunden werden die Zellen abzentrifugiert der Überstand wird mit 200 ml Äthanol versetzt. Poly C wird in üblicher
j(i Weise aus dem gebildeten Niederschlag isoliert und gereinigt. Man erhält 923 mg (46 Prozent) gereinigtes Poly C mit einem Sedimentationskoeffizienten von 6,7 S.
Beispiel 4
Achromobacter parvulus (ATCC 4335) wird unier Schütteln bei 28°C in 10 ml des in Beispiel 1 angegebenen Nährmediums über Nacht fermentiert. Mit dieser Kultur wird ein 3 Liter-Erlenmeyer-Kolben.
der 500 ml eines Nährmediums enthält, das aus 5 Prozent Koji-Schimmelpilz-Extrakt und 0,8 Prozent Hefeextrakt, pH 7,0, besteht, beimpft. Die Fermentation wird 14 Stunden unter Kreisschütteln bei 280C durchgeführt. Es wird gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet.
4) Man erhält 11 g feuchte Zellmaße und schließlich 30 ml Rohenzymlösung. Die eisgekühlte Rohenzymlösung wird portionsweise mit 10,6 g gepulvertem Ammoniumsulfat unter Rühren versetzt. Der gebildete Niederschlag wird abzentrifugiert.
-,Ii Der eisgekühlte Überstand wird unter Rühren portionsweise mit 6,4 g gepulvertem Ammoniumsulfat versetzt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in 0,02 m Tris-HCI-Puffer, pH 7,6, gelöst und gegen diesen Puffer über Nacht dialysiert. Die im Dialysierschlauch
ν} zurückbleibende Lösung, 3,1 ml, wird als Enzymlösung verwendet.
1,5 g IDP-Natriumsalz und 50 mg Mangan(II)-chlorid werden in 100 ml 0,1 m Tris-HCI-Puffer, pH 9,2, gelöst und mit 1,5 ml der Enzymlösung versetzt. Das Gemisch
bo wird 6 Stunden bei 37°C tnkubiert und dann mit 100 ml Äthanol versetzt. Aus dem Niederschlag wird Poly I in üblicher Weise isoliert und gereinigt Man erhält 826 mg (55 Prozent) gereinigtes Poly 1 mit einem Sedimentationskoeffizienten von 6,5 S.
Be i spi el 5
Achromobacter parvulus (NRRL B-2395) wird in 1 Liter des in Beispiel 4 aneesebenen Nährmediums und
unter denselben Bedingungen fermentiert. Man erhält 21 g feuchte Zellmasse und nach fraktioniertem Aussalzen mit Ammoniumsulfat gemäß Beispiel 4 schließlich 6,5 ml Rohenzymlösung.
1,5 g IDP-Natriumsaiz und 50 mg Mangan(II)-chlorid werden in 100 ml 0,1 m Natriumchloridlösung, pH 9,2, gelöst, dann mit 0,8 ml Enzymlösung versetzt. Das Gemisch wird 9 Stunden bei 200C inkubiert und mit
Äthanol versetzt. Aus dem Niederschlag wird in
herkömmlicher Weise Poly I isoliert und gereinigt. Man ι ο Mikroorganismus erhält 584 mg (39 Prozent) gereinigtes Poly I mit einem Sedimentationskoeffizienten von 8,5 S.
Beispiel 6
i,5 g ÄDP-NairiurrtSälz und 50 mg Mangan(iI)-ChIorid werden in 100 ml 0,1 m Natriumchloridlösung gelöst und mit einer gemäß Beispiel 5 hergestellten Enzymlösung versetzt. Das Gemisch wird 4 Stunden bei 37° C inkubiert und dann mit 100 ml Äthanol unter Rühren versetzt. Aus dem Niederschlag wird Poly A in herkömmlicher Weise isoliert und gereinigt. Man erhält 870 mg (58 Prozent) gereinigtes Poly A mit einem Sedimentationskoeffizienten von 6,2 S.
Die Vorteile der Anwendung von einem Mikroorganismus der Gattung Achromobacter im Vergleich zu dei als Stand der Technik bekannten Ausführungsforn unter Verwendung von Pseudomonas Sp. R-39? ergeben sich aus der nachstehenden Tabelle, in der di< Aussalzwirkung auf störende Enzymverunreinigunger wiedergegeben isL
Tabelle
l-nzym (NH4)I-SO4-
Siiuigungsgrad in der
Aussul/Iösung
<U.5 a 0.5
Achromobacter delmarvae ATCC 21922
Pseudomonas 2o Sp. R-399
PNPase 19,8 E/mg -
Nucleasc 0,1 E/mg 0,3 E/mg
PNPase 28,6 E/mg -
Nucleasc 1,0 E/mg 1,0 E/mg
Aus den Tabellen ist ersichtlich, daß mittel! Achromobacter wesentlich bessere Ergebnisse bei dei Reinigungsbehandlung zu erzielen sind.

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden, wo';ei die Polynucleotide durch Polymerisation der entsprechenden Nucleosiddiphosphate mittels Polynucleotid-Phosphorylase in Gegenwart von zweiwertigen Metallkationen hergestellt werden, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Achromobacter, der eine hohe und leicht extrahierbare Polynucleotid-Phosphorylase-Aktivität aufweist, ausgenommen den Stamm Achromobacter Sp. KR 170-4 (ATCC 21942), entweder
a) in üblicher Weise fermentiert und die durch Fermentation erhaltene Kultur ohne Trennung der Zellmasse von der Kulturbrühe in Gegenwart von Mg++- oder Mn++-Ionen und von mindestens einem Nucleosiddiphosphat inkubiert oder
b) in üblicher Weise fermentiert, die Zellmasse von der Kulturbrühe abtrennt, die Zellen in einer Inkubationslösung suspendiert und in Gegenwart von Mg++- oder Mn++-Ionen und von mindestens einem Nucleosiddiphosphat inkubiert oder
c) in üblicher Weise fermentiert, die Zellmasse von der Kulturbrühe abtrennt, die Zellen aufbricht, einen Zeilrohextrakt oder eine daraus hergestellte partiell gereinigte Polynucleotid-Phosphorylase Präparation, wobei in dem Fall, daß beträchtliche Mengen von Nucleosiddiphosphat abbauenden Enzymen vorhanden sind, diese Enzyme vor der Herstellung der Polynucleotide entfernt werden müssen, in einer Inkubationslösung suspendiert und in Gegenwart von Mg++- oder Mn++-Ionen und von mindestens einem Nucleosiddiphosphat inkubiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen der nachstehenden Stämme einsetzt:
Achromobacter cycloclastes
Achromobacter delmarvae
Achromobacter parvulus
Achromobacter parvulus
ATCC 21921
ATCC 21922
ATCC 4335
NRRLB-2395.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inkubation bei einer Temperatur von 0 bis 600C und einem pH-Wert von bis 12 durchführt.
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