DE2450411A1 - Aminoglykoside, ihre salze, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als bakterizide - Google Patents

Aminoglykoside, ihre salze, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als bakterizide

Info

Publication number
DE2450411A1
DE2450411A1 DE19742450411 DE2450411A DE2450411A1 DE 2450411 A1 DE2450411 A1 DE 2450411A1 DE 19742450411 DE19742450411 DE 19742450411 DE 2450411 A DE2450411 A DE 2450411A DE 2450411 A1 DE2450411 A1 DE 2450411A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
sulfate
compound
methanol
eluted
evaporated
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE19742450411
Other languages
English (en)
Other versions
DE2450411C3 (de
DE2450411B2 (de
Inventor
Isao Kawamoto
Atsuko Morikawa
Takashi Nara
Ryo Okachi
Seiji Sato
Tomoyasu Sato
Seigo Takasawa
Mitsuyoshi Yamamoto
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Publication of DE2450411A1 publication Critical patent/DE2450411A1/de
Publication of DE2450411B2 publication Critical patent/DE2450411B2/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2450411C3 publication Critical patent/DE2450411C3/de
Granted legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/22—Cyclohexane rings, substituted by nitrogen atoms
    • C07H15/222—Cyclohexane rings substituted by at least two nitrogen atoms
    • C07H15/224—Cyclohexane rings substituted by at least two nitrogen atoms with only one saccharide radical directly attached to the cyclohexyl radical, e.g. destomycin, fortimicin, neamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/22—Cyclohexane rings, substituted by nitrogen atoms
    • C07H15/222—Cyclohexane rings substituted by at least two nitrogen atoms
    • C07H15/226—Cyclohexane rings substituted by at least two nitrogen atoms with at least two saccharide radicals directly attached to the cyclohexane rings
    • C07H15/234—Cyclohexane rings substituted by at least two nitrogen atoms with at least two saccharide radicals directly attached to the cyclohexane rings attached to non-adjacent ring carbon atoms of the cyclohexane rings, e.g. kanamycins, tobramycin, nebramycin, gentamicin A2
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/803—Physical recovery methods, e.g. chromatography, grinding

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

11 Aminoglykoside, ihre Salze, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Bakterizide "
Priorität: 24. Oktober 1973, Japan, Nr. 118 932/73
Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
Figur 1 zeigt das UV-Absorptionsspektrum des Sulfats der Verbindung XK-88-1;
Figur 2 zeigt das IR-AbsorptionsSpektrum des Sulfats der Verbindung XK-88-1;
Figur 3 zeigt das UV-AbsorptionsSpektrum des Sulfats der Verbindung XK-88-2;
Figur 4 zeigt das IR-Absorptionsspektrum des Sulfats der Verbindung XK-88-2;
Figur 5 zeigt das UV-Absorptionsspektrum des Sulfats der Verbindung XK-88-3;
Figur 6 zeigt das IR-Absorptionsspektrum des Sulfats der Verbindung XK-88-3; 509818/1088
-■- ι
Figur 7 zeigt das UV-Absorptionsspektrum des Sulfats der Verbindung XK-88-5;
Figur 8 zeigt das IR-Absorptionsspektrum des Sulfats der Verbindung XK-88-5;
Figur 9 zeigt das NMR-Spektrum der Verbindung
XK-88-1 als freie Base;
Figur 10 zeigt das NMR-Spektrum der Verbindung XK-88-2 als freie Base;
Figur 11 zeigt das NMR-Spektrum der Verbindung XK-88-3 als freie Base;
Figur 12 zeigt das NMR-Spektrum der Verbindung XK-88-5 als freie Base;
Figur 13 zeigt das C1^-NMR-Spektrum der Verbindung XK-88-1
als freie Base;
13
Figur 14 zeigt das C -NMR-Spektrum des Sulfats der Verbindung
XK-88-2 und
1 ^
Figur 15 zeigt das C -NMR-Spektrum des Sulfats der Verbindung
XK-88-5.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I werden auf mikrobiologischem Wege unter Verwendung von Streptomyces hofuensis ATCC 21970 oder Mutanten dieses Stammes, die nach üblichen Methoden erhalten werden, in einem assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthaltenden Nährmedium gezüchtet. Nach beendeter Züchtung werden die Antibiotika nach an sich bekannten Methoden isoliert, beispielsweise als aktive Fraktionen an einem Ionenaustauscherharz und weitere Reinigung der Fraktionen,
50981 8/1088
Der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Stamm von Streptomyces hofuensis ist ein neuer Stamm, der nicht nur bei der American Type Culture Collection, sondern auch bei dem Fermentation Research Institute, Japan unter der Nummer FERM-P 2216 hinterlegt wurde« Nachstehend wird dieser Stamm auch als ΜΚ-88-Stamm bezeichnet. Dieser Stamm hat die folgenden Eigenschaften:
I. Morphologische Eigenschaften
Im allgemeinen zeigt der ΜΚ-88-Stamm schlechtes Wachstum. Von den nachstehend in Tabelle I aufgeführten Nährmedien zeigt der Stamm nur in drei Medien mäßiges Wachstum, nämlich in Hafermehl-Agar, Stärke-Agar und Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar. In den restlichen Nährmedien zeigt der Stamm nur geringes Wachstum. Die Bildung von - Luftmycel ist schlecht,- nur auf Rohrzukker-,Nitrat-Agar, Stärke-Agar und Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar bildet sich ein weißes Luftmycel. Das Luftmycel zeigt einfache Verzweigung. Die Sporophoren sind gerade oder gebogen; der obere
jedoch keine Spirale. Teil bildet bisweilen eine Schleife, / Häufig bilden sich am Ende der Sporophoren mehr als 10 Sporen mit einer warzigen oder stacheligen Oberfläche»
II. Züchtungseigenschaften auf verschiedenen Nährmedien
Die Züchtungseigenschaften auf verschiedenen allgemein verwendeten Nährmedien nach einer zweiwöchigen Züchtung bei 3O0C sind., in"Tabelle I zusammengestellt. Die Farbangaben entsprechen der Einteilung in "Color Harmony Manual", 4. Auflage, Container Corporation of America.
L -'■■■ ' 509818/1088 J
Tabelle I
Medium
Züchtungseigenschaften auf verschiedenen Nährmedien Wachstum Substratmycel Luftmycel
lösliches Pigment
Sucrose-Nitrat-Agar
Glueοse-Asparagin-Agar
Nähragar
Hafermehl-Agar
° Stärke-Agar
oo
Tyrosin-Agar
Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar
Glycerin-Asparagin-Agar
schlecht farblos bis cremefarben (1-1/2 ca)
schlecht farblos bis cremefarben (1-1/2 ca)
schlecht farblos bis ahorngelb (3ng)
mäßig senfgoldfarben
(2 pg) bis hell- . senffarben (2 ie)
mäßig bambuschamois (2 ge)
schlecht farblos bis ahorngelb (3 ng)
mäßig ahorngelb (3ng)
schlecht farblos bis hellelfenbein eierschalenfarbig (2 ca) W: schlecht
F: weiß (a)
W: keines
W: keines
W: keines
W: schlecht
F: weiß (a)
W: keines
W: schlecht
F: weiß (a)
W: keines
keines keines keines keines
keines keines keines keines
W: Wachstum; F: Farbe
Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß das Substratmycel farblos oder cremefarben bis braun und das Luftmycel weiß ist und sich auf keinem der Medien ein lösliches Pigment bildet.
III. Physiologische Eigenschaften Wachstumstemperatur:
Verflüssigung von Gelatine: Hydrolyse von Stärke:
Coagulation und Peptonisierung von Magermilch:
Bildung von melanoiden Pigmenten:
26 bis 43°C
negativ
positiv
negativ
auf Tyrosin-Agar und Pepton-Hefe-Eisen-Agar bilden sich keine Pigmente.
IV. Verwertung von Kohlenstoffquellen
Kohlenstoffquelle Verwertung
D-Glucose ++
Saccharose ++
Mannit ++
D-XyIose ++
L-Rhamnose ++
D-Arabinose +_ Inosit
D-Fructose
D-Raffinose
In dem Buch "The Actinomycetes", Bd.II, herausgegeben von S.A.
WaKsman u. H.A. Lechevalier, 1962, und in der Zeitschrift International Journal of
/Systematic Bacteriology, Bd. 18, Nr. 2, Seiten 69 bis 189, Bd. 18, Nr. 4, Seiten 279 bis 392, Bd. 19, Nr. 4, Seiten bis 512 und Bd. 22, Nr. 4, Seiten 265 bis 394 wurde nach Stämmen von Arten mit folgenden Kriterien recherchiert.
-. S09818/1088 J
Einfache Verzweigungen, keine Bildung von melanoiden Pigmenten oder lösliqhen Pigmenten, gerade, gekrümmte oder schleifenartige
Sporophoren, warzige oder stachelige Sporenoberfläche, weißes Luftmycel und farbloses oder gelbstichig braunes Substratmycel, das keine andere spezielle Farbe zeigt. Aufgrund dieser Untersuchungen wurde der Stamm MK-88 als ähnlich befunden zu den Stämmen von Streptomyces craterifer und insbesondere Streptomyces bluensis. Die unterschiedlichen Eigenschaften des Stammes MK-88 gegenüber den beiden vorgenannten Arten sind in Tabelle II angegeben.
Tabelle II S. craterif er S. bluensis MK-88
Die Sporophoren Die Sporophoren Die Sporophoren bilden bilden selten bilden selten keine Spiralen unter Spiralen Spiralen den gleichen Kulturbedingungen wie die beiden Stämme von S. craterifer und S. bluensis.
Bildet Luftmycel Bildet Luftmycel Bildet kein Luftmycel
auf Hafermehl-Agar auf Hafermehl- auf Hafermehl-Agar und
und Glycerin-Aspa- Agar und Glycerin- Glycerin-Asparagin-Agar
ragin-Agar Asparagin-Agar
Luftmycel ist bis- Luftmycel ist auf Hefeweilen auf Hefe- extraict-Malzextrakt-Agar extrakt-Malzex- weiß gefärbt. trakt-Agar blau
gefärbt
Verwertet Inosit, Keine Verwertung von Fructose und Inosit, Fructose und Raffinose Raffino s e.
Aufgrund der vorgenannten Eigenschaften wird der Stamm MK-88 . einer neuen Art zugeordnet, die mit Streptomyces hofuensis bezeichnet wird, da sie aus einer Erdprobe bei Hofu, Yamaguchi Präfektur, Japan isoliert wurde.
809 8 18/10 8-8
Wie im Fall von anderen Stämmen der Actinomyceten können aus dem Stamm MK-88 künstliche Mutanten nach üblichen Methoden erhalten werden, beispielsweise durch Bestrahlung mit UV-Licht, Co -Strahlen, Röntgenstrahlen oder Behandlung mit verschiedenen mutagenen Verbindungen. Die Erfindung betrifft somit neben dem Stamm MK-88 auch sämtliche Mutanten, die zur Bildung von Verbindungen der allgemeinen Formel I in der Lage sind.
Zur Züchtung des erfindungsgemäßen Stammes und seiner Mutanten können übliche Verfahren zur Züchtung von Actinomyceten verwendet werden. Das Nährmedium kann verschiedene Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Stärke, Mannose, Sucrose (Rohrzucker),Melassen
.. oder pflanzliche Öle oder deren Gemisch enthalten. Je nach ihrer Verwertbarkeit können auch Kohlenwasserstoffe, Alkohole und Carbonsäuren verwendet werden. Als anorganische und organische Stickstoffquellen können Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenmehl, casaminsäure und/oder lösliche pflanzliche Proteine verwendet werden. Gegebenenfalls können anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat und/oder verschiedene Phosphate zugesetzt werden. Außerdem können gegebenenfalls anorganische oder organische Substanzen zugesetzt werden, die das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus und die Bildung der Antibiotika der Erfindung fördern. Die Züchtung wird vorzugsweise in einem flüssigen Nährmedium durchgeführt. • Insbesondere eignet sich das Submersverfahren unter gleichzeitigem Rühren. Die Züchtungstemperatur beträgt 26 bis 430C bei einem pH-Wert um den Neutralpunkt. Die ZUchtüngsdauer beträgt
U "■ 509818/1088 J
gewöhnlich 2 bis 15 Tage. Sobald die Ausbeute an Verbindungen der allgemeinen Formel I ein Maximum erreicht hat, wird die Züchtung abgebrochen, die Zellmasse abfiltriert und das Filtrat zur Gewinnung von Verbindungen der allgemeinen Formel I aufgearbeitet.
Die Isolierung und Reinigung der entstandenen Antibiotika aus dem Filtrat wird nach an sich bekannten Methoden zur Isolierung und Reinigung von mikrobiellen Stoffwechselprodukten aus Kulturbrühen durchgeführt. Da die Verbindungen der allgemeinen Formel I basisch und in Wasser leicht löslich, in üblichen organischen Lösungsmitteln jedoch schlecht löslich sind, lassen sich die Produkte nach üblichen Methoden reinigen, wie sie zur Reinigung von sogenannten wasserlöslichen basischen Antibiotika angewendet werden. Die Verbindungen der allgemeinen Formel I ' können durch entsprechende Kombination von Adsorption und Desorption an Kationenaustauscherharzen und Aktivkohlen, Säulenchromatographie an Cellulose, Adsorption und Desorption an Sephadex LH-20, Kieselgelchromatographie und ähnliche Methoden gereinigt werden.
Beispielsweise wird das zellfreie Kulturfiltrat zunächst auf einen pH-Wert von 7»5 eingestellt und anschließend zur Adsorption der Verbindungen auf einen Kationenharzaustauscher Amberlite IRC-5Ö in der Ammoniumform gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 0,5 normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die aktive Fraktion wird unter vermindertem Druck eingedampft. Das Konzentrat wird auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und auf eine mit Aktivkohle gefüllte Säule gegeben. Die j
; 509318/1088
Säule wird mit wenig Wasser gewaschen und sodann mit 0,5 normaler Schwefelsäure eluiert. Gefärbte Verunreinigungen werden kaum eluiert. Das Eluat wird mit einem Anionenaustauscher Dowex 44 in der 0H~Form auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt
mit
und auf eine / Kationenharzaustauscher Amberlite CG-50 in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 0,2 normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Dabei wird zunächst die Verbindung XK-88-1, sodann die Verbindung XK-88-3 und hierauf die Verbindung XK-88-5 eluiert. Schließlich kann die Verbindung XK-88-2 mit 0,5 normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert werden.
Die XK-88-1 als Hauptkomponente enthaltende Fraktion wird eingedampft. Das Konzentrat wird auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule gegeben, die sodann mit 50prozentigem wäßrigen Methanol eluiert wird. Fraktionen mit der aktiven Substanz mit FU-Werten von 0,58 und 0,31 bei der DünnschichtChromatographie an Kieselgel mit dem Entwiekler II (Methanol und lOprozentige wäßrige Ammoniumacetatlösung 1:1) und Entwickler M (n-Butanol, Äthanol, Chloroform und I7prozentige wäßrige Ammoniaklösung 4:5:2:5) werden vereinigt und eingedampft. Das Konzentrat wird auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und sodann auf eine mit dem Kationenharzaustauscher Amberlite CG-50 in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 0,2 normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die akr tiven Fraktionen werden vereinigt und eingedampt, und das Konzentrat wird mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt. Nach Zugabe von Methanol fällt das Sulfat der Verbindung XK-88-1 als weißes Pulver aus.
509818/1088
Die XK-88-3 und XK-88-5 als Hauptbestandteile enthaltenden Fraktionen .werden eingedampft. Das Konzentrat wird auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule gegeben. Eine etwa vorhandene Verunreinigung durch XK-88-1 wird zunächst mit 50prozentigem wäßrigen Methanol eluiert. Sodann wird die Verbindung XK-88-3, die einen Rf-Wert von 0,39 bzw. 0,27 bei der DünnschichtChromatographie an Kieselgel mit dem Entwickler II bzw. dem Entwickler M zeigt, mit einem Gemisch von Methanol und lOprozentiger wäßriger Ammoniumacetatlösung (1:1) eluiert. Die Verbindung XK-88-5 mit einem Rf-Wert von 0,20 bzw. 0,50 bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel mit dem Entwickler II bzw. dem Entwickler M wird danach eluiert. Die XK-88-3 als Hauptbestandteil enthaltende aktive Fraktion und die XK-88-5 als Hauptbestandteil enthaltende Fraktion werden jeweils auf eine mit dem Kationenharzaustauscher Amberlite CG-50 in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 0,5 normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die jeweils erhaltenen aktiven Fraktionen v/erden eingedampft und auf mit Kieselgel gefüllte Säulen gegeben. Sodann wird mit einem Gemisch von n-Butanol, Äthanol, Chloroform und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (4:5:2:5) eluiert. Die XK-88-3 als einzigen Bestandteil enthaltende aktive Fraktion sowie die XK-88-5 als einzigen Bestandteil enthaltende aktive Fraktion werden eingedampft und auf mit dem Kationenharzaustauscher Amberlite CG-50 in der Ammoniumform gefüllte Säulen gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 0,5 normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die jeweils erhaltenen aktiven Fraktionen werden eingedampft und mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt. Nach Zugabe von Methanol j
509818/1088
fällt das Sulfat der Verbindung XK-88-3 bzw. XK-88-5 als weißes Pulver aus.
Die XK-88-2- als Hauptbestandteil enthaltende aktive Fraktion wird eingedampft. Das Konzentrat wird auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule gegeben. Die Säule wird sodann mit einem Gemisch von Methanol und lOprozentiger wäßriger Ammoniumacetatlösung (1 : 1) eluiert. Es wird eine Fraktion mit XK-88-2 erhalten. Diese Verbindung hat Rf-Werte von 0,45 bzw. 0,38 bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel mit dem Entwickler II bzw. dem Entwickler M. Die aktive Fraktion wird auf eine mit dem Kationenharzaustauscher Amberüte CG-50 in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 0,5 normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die eluierte aktive Fraktion wird eingedämpft und auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule gegeben. Die Säule wird sodann mit einem Gemisch von n-Butanol, Äthanol, Chloroform und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (4:5:2:5) eluiert. Die XK-88-2 als einzigen Bestandteil enthaltende aktive Fraktion wird eingedampft und auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. Das Konzentrat wird auf eine mit dem Kationenharzaustauscher Amberlite CG-50 in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 0,5 normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die aktive Fraktion wird eingedampft und mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt. Nach Zugabe von Methanol fällt das Sulfat der Verbindung XK-88-2 als weißes Pulver aus.·
Sofern in einem XK-88-Bestandteil oder einem Gemisch der Be-
■runreinigungen ν 5098 18/1088
standteile gefärbte Verunreinigungen vorliegen, kann die Ent-
Γ -12- 245Ü411
färbung durch Behandlung mit Aktivkohlegranulat, einem porösen· Kunstharz, wie Diaion HP-IO, oder Amberlite XAD-2, und einem Anionenharzaudtauscher wie Dowex 1x2 in der 0H~"Form, durchgeführt
werden. 3ei-
/spielsweise wird eine wäßrige Lösung einer Verbindung der allgemeinen Formel I, die gefärbte Verunreinigungen enthält, auf eine mit Diaion HP-10 gefüllte Säule gegeben. Sodann wird mit Wasser eluiert. Das Eluat enthält eine Verbindung der allgemeinen Formel I und ist frei von gefärbten Verunreinigungen.
Während der vorgenannten Reinigungsstufe wird das Verhalten der Verbindungen der allgemeinen Formel I bei aufsteigender DünnschichtChromatographie an Kieselgelplatten mit dem Entwickler II und dem Entwickler M untersucht. Die Entwicklung wird 3 "bis 4 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Rf-Werte der Verbindungen XK-88-1, -2r -3 und -5 im Dünnschi cht chromatogramm sind nachstehend in Tabelle III angegeben.
Die Antibiotika XK-88-1
Das Sulfat der Verbindung XK-88-1 ist ein weißes, kristallines Pulver, das bei 200 bis 240°C unter Zersetzung schmilzt. Der optische Drehwert des Sulfats /o/q8 = + 77,9° (c = 1,08, HgO). Auf Grund der massenspektrographischen Analyse hat die freie Base ein Molekulargewicht von 454 und eine Summenformel von
2H2SO4 .3H2O; 29 C 6 H N
bpr.: 29 ,23 6 ,35 8,02
gef.: ,35, ,48 8,35
509818/1088 J
Das UV-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung des Sulfats (.Fig. 1) zeigt keine charakteristischen Absorptionsmaxima zwischen 220 und 360 πιμ und nur Endabsorption. Das IR-Absorptions spektrum des Sulfats als Kaliurabromidpreßling ist in Fig. 2 wiedergegeben.
= 3355, 2900, 2000, 1610, 1505, 1120, 1025, 615 cm"1.
Figur 9 zeigt das charakteristische NMR-Spektrum
der freien Base von XK-88-1. Figur 13 zeigt das C ^-NMR-Spektrum der freien Base von XK-88-1.
Das Sulfat von XK-88-1 gibt eine positive Ninhydrin-Reaktion und eine positive Reaktion beim Rydon-Smith-Test (H.N. Rydon, Nature, Bd. 169 (1952), S. 922) und eine negative Sakaguchi-, Maltol-, Eisen(III)-chlorid-,Fehling- und Biuret-Reaktion.
Das Sulfat von XK-88-1 ist leicht löslich in Wasser, schlecht löslich in Methanol und Äthanol und unlöslich in anderen organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Äthylacetat, Diäthyläther und Chloroform.
Aufgrund der vorstehenden Untersuchungen hat die Verbindung XK-88-1 vermutlich folgende Strukturformel:
509818/1088
:h2oh
HO'
XK-88-2
Das Sulfat der Verbindung XK-88-2 ist ein weißes Pulver, das bei 225 bis 25O0C unter Zersetzung schmilzt. Der optische Drehwert des Sulfats /Ö/q8 - +74,7° (c = 0,56, H2O). Aufgrund der massenspektrographischen Analyse hat die freie Base ein Molekulargewicht von 306 und die Summenformel C^H^N^Oc.
C12H26N4°5'2H2S04#3H20; CHN
ber.: 25,90 6,52 10,07 gef.: 25,47 6,76 9,68.
Das UV-AbsorptionsSpektrum einer wäßrigen Lösung des Sulfats (Fig. 3) zeigt keine charakteristischen Absorptionsmaxima zwischen 220 und 360 mn,sondern lediglich Endabsorption. Das IR-Absorptionsspektrum des Sulfats als Kaliumbromidpreßling ist
in Fig. 4 wiedergegeben. _
509818/1088
"1
= 3*00, 3000, 1605, 1490, 1115, 1035, 605 cm"1.
,1,3
Die Eigenschaften von XK-88-2 werden ferner durch das C -NMR-. Spektrum des Sulfats und das NMR-Spektrum der freien Base bestätigt, die in Fig. 14 und 10 wiedergegeben sind.
■ Das Sulfat von XK-88-2 ergibt eine positive Ninhydrin-Reaktion und einen positiven Rydon-Smith-Test, sowie eine negative Sakaguchi-, Maltol-, Eisen(III)-chlorid-, Fehling- und Biuret-Reaktion.
Das Sulfat von XK-88-2 ist leicht löslich in Wasser, schlecht löslich in Methanol und Äthanol und unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Äthylacetat, Diäthyläther und Chloroform.
Aufgrund der vorstehenden Befunde hat die Verbindung XK-88-2. vermutlich die Strukturformel
CH2NH2
5 0 9'B 1 8 / 1 0 8 8
XK-88-3
Das Sulfat der Verbindung XK-88-3 ist ein weißes Pulver, das bei 215 bis 24O0C unter Zersetzung schmilzt. Der optische Drehwert des Sulfats faj^8 = +87,3° (c = 0,53, H2O). Aufgrund der massenspektrographischen Analyse hat die freie Base ein Molekulargewicht von 453 und die Summenformel C17H35N5Og. C17H35N5O9.5/2 H2SO4. 5H2O; CHN
ber.: 25,89 6,39 8,88. gef.: 26,02 6,72 8,61.
Das UV-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung des Sulfats von XK-88-3 (Fig. 5) zeigt keine charakteristischen Absorptionsmaxima zwischen 220 und 360 mu, sondern nur Endabsorption. Das IR-Absorptionsspektrum des Sulfats von XK-88-3 (als Kaliumbromidpreßling) ist in Fig. 6 wiedergegeben.
= 3400, 3000, 1615, 1505, 1125, 1030, 620 cm"1.
Eine weitere Bestätigung der Eigenschaften von XK-88-3 ergibt das NMR-Spektrum der freien Base von XK-88-3, das in Fig. 11 wiedergegeben ist.
Das Sulfat von XK-88-3 ergibt eine positive Ninhydrin-Reaktion und Rydon-Smith-Reaktion und eine negative Sakaguchi-, Maltol-, Eisen(IIl)-chlorid-, Fehling- und Biuret-Reaktion.
Das Sulfat von XK-88-3 ist leicht löslich in Wasser, schlecht löslich in Methanol und Äthanol und unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Äthylacetat, Diäthyläther und
Chloroform* ·
J 509818/1088
Aufgrund der vorstehenden Ergebnisse hat XK-88-3 folgende Strukturformel:
CH2NH2
HO'
OH
XK-88-5 .
Das Sulfat der Verbindung XK-88-5 ist ein weißes Pulver, das bei 215 bis 2400C unter Zersetzung schmilzt. Der optische Drehwert des Sulfats /Ö/q8 = +93,9° (c = 0,54, H2O). Aufgrund der massenspektrographischen Analyse hat die freie Base ein Molekulargewicht von 45Ο und die Summenformel C^gH-XgNgOy C18H38N6O7. 3H2SO4. 6H2O; CHN
ber.: 25,35 6,62 9,85. gef.: 25,89 6,50 9,74.
Das UV-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung des Sulfats von XK-88-5 (Fig. 7) zeigt keine charakteristischen Absorptionsmaxima zwischen 220 und 360 mu, sondern nur Endabsorption. Das IR-Absorptionsspektrum des Sulfats von XK-88-5 (als Ka-
1 509818/108 8
ORIGINAL
liumbromidpreßling) ist in Fig. 8 wiedergegeben. 24 5 041 Ί vmQV = .3400, 2900, 1600, 1500, 1390, 1110, 1040, 610 cm""1.
Eine weitere Bestätigung der Eigenschaften von XK-88-5 ergibt
13 das NMR-Spektrum der freien Base und das C -NMR-Spektrum des Sulfats, das in Fig. 12 und 15 wiedergegeben ist.
Das Sulfat von XK-88-5 ergibt eine positive Ninhydrin-Reaktion und Rydon-Smith-Reaktion und eine negative Sakaguchi-, Maltol-, Eisen(III)-chlorid-, Fehling- und Biuret-Reaktion.
Das Sulfat von XK-88-5 ist leicht löslich in Wasser, schlecht löslich in Methanol und Äthanol und unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Äthylacetat, Diäthyläther und Chloroform.
Aufgrund der vorstehenden Ergebnisse hat die Verbindung XK-88-5 vermutlich folgende Strukturformel:
CH NH2
H2N
5 09818/1088
Die Salze der Verbindungen der allgemeinen Formel I lassen sich in an.,sich bekannter Weise durch Neutralisation von freien Basen mit einer anorganischen oder organischen Säure auf einen pH-Wert von unterhalb 7,0 und vorzugsweise 2 bis 6 herstellen. Spezielle Beispiele für verwendbare Säuren sind Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Rhodanwasserstoffsäure, Fluorkieselsäure, Hexafluorarsensäure, Hexafluorphosphorsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Kampfersäure, Glutarsäure, Glykolsäure, Phthalsäure, Weinsäure, Laurinsäure, Stearinsäure und Salicylsäure. Die Salze sind weiße Pulver, die in Wasser löslich und in den meisten organischen Lösungsmitteln schlecht oder unlöslich sind.
Die FU-Werte der Verbindungen der allgemeinen Formel I bei der Papierchromatographie und der DUnnschichtchromatographie unter Verwendung verschiedener Entwicklungslösungsmittel sind in Tabelle III zusammengestellt. Diese Werte werden mit den R^- Werten verschiedener ähnlicher Antibiotika verglichen, die in gleicher Weise entwickelt werden.
Entwickler I: Chloroform : Methanol : 17prozentige wäßrige
Ammoniaklösung (2:1 : 1; die obere Schicht des Gemisches).
II: Methanol : lOprozentige wäßrige Ammoniumacetatlösung (1 : 1)
M: n-Butanol : Äthanol : Chloroform : 17prozentige wäßrige Ammoniaklösung (4:5:2:5)
509818/108 8
1: 20prozentige wäßrige Ammoniumchloridlösung 2: Mit Wasser gesättigtes n-Butanol 3: n-Butanol : Essigsäure : Wasser (3:1 : 1)
4: Mit Wasser gesättigtes n-Butanol mit 2 Prozent (Gewicht pro Volumen) p-Toluolsulfonsäure und 2 Vol.-Prozent (pro Volumen) Piperidin
5: Chloroform : Methanol : 17prozentige wäßrige Ammoniaklösung (2:1:1; die untere Schicht des Gemisches).
509818/1088
- 21 Tabelle III
Ri-
Kieselgel-Dünn-
schichtchromatngraphi!p
Papierchromatographie (aufsteigende Methode)"
ittel
II M
XK-88-1
80 0758
31 0,97 0f00 0,10
00 0f00
XK-88-2
0,73 0.45 0,38 0,98 0,00 0,08 0.00 0f00
XK-88-3 0,75 0,39 0,27 0,97 0,00 0.00 0,00 0,00
XK-88-5
0.81 0,20 0r50 0,75 0?00 0,05 OjOO 0,01
Gentamicin A 0,66 0,39 0,38 0,98 0,00 0f05 0,00 0f00 Gentamicin B 0f75 0,38 0f28 0,98 0r00 0,08 0,00 0,00 Gentamicin Cla 0,86 0,18 0,52 0r98 0,02 0,08 0f05 0f
18
Gentamicin C, 0.87 0,17 0,59 0,98 0?03 0r08 0,08 0,59 Gentamicin C- · 0786 0,18 0,61 0,98 0,02 0.03 0,09 0,38
Sisomicin
! ? 8 9 0,66 - 0,98 0f00 0,06 0.10 0,18
Kanamycin A' 0^77 0,76 0,15 0,92 0,00 0,00 0,00 0v02 Kanamycin B 0r80 0,80 0^16 0,98 0,00 0;00 0,00 0;
01
Kanamycin C 0,84 0f84 0,17 0f96 0,00 0f00 0,00· 0,02 Ribostamycin 0f75' 0,72 0f12 0,98 0r01 0?03 0,01 0;00 Apramycin 0.80 0^35 0,15 0,95 OjOO 0;00 0,00 0,02
Nebramycin Faktor 4
0,78 0f45 0,16 0,95 0,00 0,05 0?00 0;01
5098 18/1088
- 22 Tabelle III - Fortsetzung 24 5OA 11
Nebramycin
Faktor 57 		Rf-Wert :
• Tobramycin Kieselgel-Dünn- Papierchroniatographie*-
schichtchroma- (aufsteigende Methode)
tographie "~~ _ ~
Neomycin A EntwicklunffSlösungRTni t.t.ei
NK-1003 I II M 1 2 3 4 5
0}79 0,45 0,14 0,95 0,00 0.05 0^00 0.00
0j80 0;54 0,25 0,97 0,00 0,02 0,02 0,02
0,40 0?71 - 0,97 0;00 0,02 0,02 0,00
0,66 0f91 - 0,93 0,00 0,05 0,00 -
Das antibakterielle Spektrum der XK-88-Antibiotika, bestimmt nach der Agar-Verdünnungsmethode (pH 8,0),ist in Tabelle IV wiedergegeben.
Tabelle IV
untersuchter Mikroorganismus
minimale Hemmkonzentration, y/ml
XK-88-1 XK-88-2 XK-88-3 XK-88-5
Streptococcus faecalis >416,5 >83.3 >83.3 10.5 ATCC 10541 '
Bacillus subtilis 52?1 0r35 2,7 0r04
No. 10703
Bacillus cereus 6,6 2,7 V 1,31
ATCC 9634
Bacillus cereus vair. 3,3 0,7 2r7 0.66
mycoides ATCC 9463
Staphylococcus aureus 6,6 0f 18 0,18 0,07
ATCC 6538P
509818/1088
Staphylococcus aureus 24130411
KY 89^2 (resistent gegen- 52 χ χ 4 ι 4 ο.66 über Kanamycin, Paromomy- 1 ' · '
ein, Streptomycin, Gentamicin und
Nebramycin)
Staphylococcus aureüs ■
KY 8950 (resistent gegen- ■
' über Streptomycin, Tetra- ' , π 35 0 17
cyclin, Penicillin und 13T1 0J35 üJJb U'X/ SuIfonamiden
Staphylococcus aufeus KY 8956 (resistent gegenüber Streptomycin, Paromo-
mycin, Tetracyclin, 208,5 0.09 5,3 <0.02 Kanamycin, Nebramycin, ' ' ■ Tobramycin und ■ ' Erythromycin) . - ■ '
Staphylο co ccus aureus KY 8957 iresistent gegenüber Chloramphenicol,
Streptomycin, Kanamycin, 104 2 0.09 5.3 0.04 Paromomyein, Nebramycin, ·'
Tobramycin und
Tetracyclin)
Staphylococcus aureus
KY 8953 {resistent gegenüber Streptomycin, >416,5 0.35 >83,3 0.17 Kanamycin, Paromomy cm, 1 I } ' Neomycin, Tetracyclin, ·
Erythromycin)
Klebsiella pneumoniae
ATCC 10031 X3^1 o,18 0,05 <0105
Escherichia coli 26 1 0,35 0,18 0.08
ΔΦΠΠ Pf1 T 1 « ■ '
Escherichia coli KY 8310 (resistent gegenüber Chloramphenicol, Streptomycin,
Kanamycin, Gentamicin, >416,5 > 83f3 · >83,3 >41f6 Paromomycin, Nebramycin,
Tobramycin, Spectinomycin .
und Tetracyclin) .
Escherichia coli KY 8314 52 χ 1 4 0 35 0,33 (resistent gegenüber ) ■ ) ' ' Streptornycin) :
609818/10 8-8
Escherichia coli KY 8327 fresistent gegenüber Kanamycin, Gentamicin, Nebramycin 'und Tobramycin)
13,1
Escherichia coli KY 8331 (resistent gegenüber Kanamycin, Ribostamycin, Neomycin Paromomycin, Lividomycin und Nebramycin)
>416,5
0718 0.05 0,04
41,7 41}7
Escherichia coli KY 8334 (resistent gegenüber Kanamycin und Tobramycin)
1,65
Escherichia coli KY 8348 (resistent gegenüber Streptomycin und Gentamycin)
13I5
0,18 0,09
Shigella sonnei ATCC 9290
52,1
Salmonella typhosa ATCC 9992
26,1
0,7
0766
2J7
Proteus vulgaris 416f5 10,5 >416,5 0f53
ATCC 6897
Pseudomonas aeruginosa >416,5 8.3
BMH Nr. 1
0(35 0f14
0,18 0;09
Aus Tabelle IV geht hervor, daß die Antibiotika der XK-88-Reihe eine sehr starke antibakterielle Wirkung gegen die verschiedensten gram-positiven und gram-negativen Bakterien aufweisen. Insbesondere zeigen XK-88-1, XK-88-2, XK-88-3 und XK-88-5 eine starke antibakterielle Wirkung gegenüber Staphylococcus aureus und Escherichia coli, die normalerweise gegenüber verschiedenen bekannten Antibiotika resistent sind.
$09818/1088
Ein Vergleich der' Verbindungen der Erfindung mit anderen Antibiotika zeigt ihre Neuheit. Die Antibiotika der XK-88-Reihe sind sämtlich wasserlösliche, basische Antibiotika, die rechtsdrehend sind. Die UV-Absorptionsspektren zeigen lediglich Endabsorption und keine charakteristischen Absorptionsmaxima. Die Molekulargewichte der freien Basen von XK-88-1, XK-88-2, XK-88-3 und XK-88-5 betragen 454, 306, 453 bzw. 450. Aus den vorstehend angegebenen Werten sind die Antibiotika Gentamicin A, Gentamicin B, Gentamicin C, , Gentamicin C1, Gentamicin C9, Kanamycin A, Kanamycin B, Kanamycin C, Ribostamycin, Tobramycin, Apramycin, Nebramycin Faktor 4, Nebramycin Faktor 5 und Sisomycin verhältnismäßig ähnlich dem XK-88-1, XK-88-3 und XK-88-5. Neomycin A und NK-1003 scheinen der Verbindung XK-88-2 verhältnismäßig ähnlich zu sein. Die R^-Werte von XK-88-3 bei der DünnschichtChromatographie an Kieselgel und der Papierchromatographie (vergleiche Tabelle III) kommen den Werten für Gentamicin B sehr nahe. Die R^-Werte der anderen Glieder der XK-88-Reihe sind jedoch von denen der bekannten Antibiotika völlig verschieden. Das Molekulargewicht der freien Base von XK-88-3 von 453 ist völlig· verschieden von dem der freien Base von Gentamicin B von 486. Aus Tabelle IV geht hervor, daß nicht immer eine vollständige Kreuzresistens zwischen XK-88-1, XK-88-2, XK-88-3, XK-88-5 und den bekannten Antibiotika besteht.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
509818/1088
Beispiel 1
Streptomyces hofuensis MK-88 (FERM-P 2216; ATCC 21970) wird als Inoculum verwendet. Eine Platinöse des Einsaatstammes wird in 30 ml eines ersten Einsaatmediums folgender Zusammensetzung in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben überimpft und 3 Tage bei 300C unter Schütteln gezüchtet:
Lösliche Stärke 20 g/Liter
Polypepton 5 g/Liter
Hefeextrakt 1 g/Liter
Calciumcarbonat 1 g/Liter pH-Wert 7,0 vor der Sterilisation.
Sodann werden 30 ml der ersten Einsaatkultur in 300 ml eines zweiten Anzuchtmediums in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben überimpft, der mit Prallplatten ausgerüstet ist. Die Zusammensetzung des zweiten Anzuchtmediums ist die gleiche wie die des ersten Einsaatmediums. Die zweite Anzuchtkultur wird 2 Tage bei 3O0C unter Schütteln durchgeführt. Sodann werden 1,5 Liter der zweiten Anzuchtkultur (entsprechend 5 Kolben) in 15 Liter eines dritten Anzuchtmediums in einem 30 Liter fassenden Edelstahlfermenter überimpft. Die Zusammensetzung des dritten Anzuchtmediums ist die gleiche wie die des ersten Einsaatmediums.
Die Züchtung in dem Fermenter wird 2 Tage unter Belüftung (15 Liter/min) bei 300C und einer Rührgeschwindigkeit von 350 U/min durchgeführt. Sodann werden 15 Liter der dritten Anzuchtkultur in 100 Liter eines vierten Anzuchtmediums in einem 300 Liter fassenden Fermenter überimpft. Die Zusammensetzung des vierten Anzuchtmediums ist die gleiche wie die des ersten
S09818/1088
Einsaatmediums. Die Züchtung in dem Fermenter wird 2 Tage unter Belüftung (100 Liter/min) bei 3O0C und einer Rührgeschwindigkeit von 150 U/min durchgeführt. Schließlich werden 100 Liter der vierten Anzuchtkultur in 1000 Liter eines Nährmediums in einem 2000 Liter fassenden Fermenter überimpft. Dieses Nährmedium hat folgende Zusammensetzung:
lösliche Stärke 40 g/Liter
Sojabohnenmehl 20 g/Liter
Fleischextrakt 5 g/Liter
K2HPO4 0,5 g/Liter
MgSO4. 7H2O 0,5 g/Liter
KCl 0,3 g/Liter
CaCO, 3 g/Liter
(pH 7,0 vor der Sterilisation)
Die Züchtung wird 4 Tage unter Belüftung (400 Liter/min) bei 300C und einer Rührgeschwindigkeit von 150 U/min durchgeführt. Nach beendeter Züchtung enthält die Kulturbrühe die Verbindungen XK-88-1, XK-88-2, XK-88-3 und XK-88-5 in einer Konzentration von 3,5 mg/Liter, berechnet auf das Sulfat von XK-88-5.
Beispiel 2
1000 Liter der in Beispiel 1 erhaltenen Kulturbrühe werden mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-.Wert von 7,5 eingestellt. Nach Zusatz von 10 kg einer Filtrierhilfe (Radiolite Nr. 600) werden die Zellmasse und unlösliche Stoffe abfiltriert. Das Filträt wird auf eine mit 100 Liter eines Kationenharzaus-. tauschers Amberlite IRC-50 in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Aktive Substanzen werden am Austauscher adsorbiert. Nach dem Waschen mit etwa 300 Liter Wasser wird mit 0,5 normaler wäßriger Ammoniaklösung elu'iert. Die Aktivität des Eluats _j
509818/1088
wird nach der Papierscheibenmethode auf einer Agarplatte mit Bacillus subtilis Nr. 10707 bestimmt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf 6 Liter eingedampft. Das Konzentrat wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und die entstandene Fällung abfiltriert. Das Filtrat wird auf eine mit 2 Liter des Kationenharzaustauschers Amberlite IRC-50 in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem Waschen mit 10 Liter Wasser wird mit 0,5 normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf etwa 300 ml eingedampft. Das Konzentrat enthält braun gefärbte Verunreinigungen. Es wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und auf eine mit etwa 500 ml Aktivkohlegranulat gefüllte Säule gegeben. Zunächst wird mit 1 Liter Wasser und sodann mit 2 Liter 0,5 normaler ' Schwefelsäure eluiert. Hierbei werden die aktiven Verbindungen
reiner
in ziemlich / Form eluiert. Die durch Eluieren mit 0,5 normaler Schwefelsäure erhaltenen aktiven Fraktionen werden mit einem Anionenharzaustauscher Dowex 44 in der OH~Form neutralisiert und mit den aktiven Fraktionen vereinigt, die durch Eluieren mit Wasser erhalten wurden. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck eingedampft. Es wird ein Rohpulver erhalten, das die Verbindungen der XK-88-Reihe enthält. Die Gesamtaktivität des Rohpulvers entspricht der von etwa 3 g des Sulfats von XK-88-5.
Beispiel 3
Das in Beispiel 2 erhaltene Rohpulver wird in 3 Liter Wasser gelöst und mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert
«509818/1088
von 8,0 eingestellt. Die Lösung wird auf eine mit 500 ml eines Kationenharzaustauschers Amberl ite CG-50 in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 4,5 Liter einer 0,2 normalen wäßrigen Ammoniaklösung und sodann mit 0,5 normaler wäßriger Ammoniaklösung in einer Geschwindigkeit von etwa 1 Liter/Stunde eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen von jeweils 20 ml aufgefangen. Mit 0,2 normaler wäßriger Ammoniaklösung werden die Verbindung XK-88-1 und ein Gemisch von XK-88-3 und XK-88-5 in den Fraktionen Nr. 50 bis 165 bzw. den Fraktionen 166 bis 230 eluiert. Mit 0,5 normaler wäßriger Ammoniaklösung wird die Verbindung XK-88-2 eluiert.
Die in jeder Fraktion enthaltenen aktiven Komponenten werden durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel identifiziert. Die Entwicklung wird bei Raumtemperatur während 3 bis 4 Stunden mit dem Entwicklungslösungsmittel II (lOprozentige wäßrige Ammoniumacetatlösung : Methanol 1 : 1) und dem Entwicklungslösungsmittel M (n-Butanol : Äthanol : Chloroform : 17prozentige wäßrige Ammoniaklösung 4:5:2:5) durchgeführt. Die Komponenten werden durch Farbreaktionen, wie die Ninhydrin-und Rydon-Smith-Reaktion, festgestellt. Die Aktivität der Komponenten wird durch Bioautographie mit einer Agarplatte von Bacillus subtilis Nr. 10707 bestimmt. Mit dem Entwicklungslösungsmittel II zeigen die Verbindungen XK-88-1, XK-88-2, XK-88-3 und XK-88-5 Rf-Werte von 0,58, 0,45, 0,39 bzw. 0,20. Mit dem Entwicklungs-. lösungsmittel M zeigen die Verbindungen XK-88-1, XK-88-2, XK-88-3 und XK-88-5 Rf-Werte von 0,31, 0,38, 0,27 bzw. 0,50.
509818/108 8
Die jeweils erhaltenen aktiven Fraktionen werden unter vermindertem Druck eingedampft. Es werden die entsprechenden Konzentrate von XK-88-1, XK-88-2, XK-88-3 und XK-88-5 erhalten. Die Ausbeute an aktiven Substanzen in jedem Konzentrat entspricht etwa 250 mg, 200 mg und 1,5 g des Sulfats von XK-88-5.
Beispiel 4
Die in Beispiel 3 erhaltene aktive Fraktion mit XK-88-1 als Hauptbestandteil wird konzentriert. Das Konzentrat wird in etwa 50 ml 50prozentigem wäßrigen Methanol gelöst und die Lösung auf eine mit 200 ml Kieselgel gefüllte Säule gegeben, das vorher mit 50prozentigem wäßrigen Methanol behandelt wurde. Zunächst wird XK-88-1 mit 50prozentigem wäßrigen Methanol eluiert. Sodann werden Spuren von XK-88-3 und XK-88-5 mit 50prozentigem wäßrigen Methanol eluiert, das 5 Prozent Ammoniumacetat enthält. Nach der Bestätigung durch DünnschichtChromatographie an Kieselgel mit dem Entwicklungslösungsmittel II und dem Entwicklungslösungsmittel M, daß die zuerst erhaltene Fraktion als einzigen Bestandteil die Verbindung XK-88-1 enthält, wird die Fraktion unter vermindertem Druck eingedampft und von Methanol befreit. Das Konzentrat wird mit 6 normaler Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und auf eine mit 200 ml eines Kationenharzaustauschers Amberlite CG-50 in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 1 Liter einer 0,2 normalen wäßrigen Ammo- · niaklösung eluiert. Die aktive Fraktion wird unter vermindertem Druck auf etwa 50 ml eingedampft und von Ammoniak befreit. Sodann wird das Konzentrat mit 6 normaler Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und unter Rühren tropfenweise mit j
509818/1088
200 ml Methanol versetzt. Die entstandene weiße Fällung wird abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Ausbeute 12 g gereinigtes Sulfat von XK-88-1.
Beispiel 5
Die in Beispiel 3 erhaltene aktive Fraktion mit der Verbindung XK-88-1 als Hauptbestandteil wird unter vermindertem Druck auf etwa 50 ml eingedampft. Sodann werden 250 ml Methanol zugegeben, und das Gemisch wird 15 Minuten gerührt. Hierauf wird das Gemisch 15 bis 18 Stunden bei O0C stehengelassen. Die entstandene Fällung wird auf einer Glasfilternutsche abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Hierauf wird die Fällung in 500 ml Me-.: thanol suspendiert und unter Erwärmen gelöst. Die Lösung wird filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Die entstandene kristalline Fällung wird 15 bis 18 Stunden bei O0C stehengelassen. Die Fällung wird abfiltriert und mehrmals aus Methanol umkristallisiert. Die erhaltenen farblosen Kristalle werden mit Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 7 g der freien Base XK-88-1.
B e i s ρ i e 1 6
Ih diesem Beispiel wird die in Beispiel 3 erhaltene aktive Fraktion mit XK-88-2 als Hauptbestandteil unter vermindertem Druck eingedampft und sodann mit dem gleichen Volumen Methanol versetzt. Das Gemisch wird auf eine mit 200 ml Kieselgel gefüllte Säule gegeben, das vorher mit 50prozentigem wäßrigen Methanol behandelt wurde. Nach dem Waschen mit 1 Liter 50prozentigem wäßrigen Methanol wird mit 50prozentigem Methanol entwickelt,' das 5 Prozent Aramoniumacetat enthält. Zunächst wird
5 0 9 8 18/1088
γ ~ι
- 32 -
die Verbindung ΧΚ-88-2 eluiert, die bei der DünnschichtChromatographie m^-t dem Entwicklungslösungsmittel II und dem Entwicklungslösungsmittel M FU-Werte von 0,45 bzw. 0,38 zeigt. Sodann werden Spuren von XK-88-3 und XK-88-5 eluiert. Durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel wird bestätigt, daß die erste Fraktion die Verbindung XK-88-2 als Hauptbestandteil enthält. Diese aktive Fraktion wird zur Abtrennung des Methanols eingedampft. Das Konzentrat wird zum Entsalzen auf eine mit 100 ml des Kationenharzaustauschers Amberlyte CG-50 in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 0,5 normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die aktive Fraktion wird eingedampft und auf eine mit 300 ml Kieselgel gefüllte Säule gegeben. Die Entwicklung wird mit einem Gemisch von n-Butanol, Äthanol, Chloroform und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (4:5:2:5) durchgeführt. Die eluierte aktive Fraktion wird zur Abtrennung der organischen Lösungsmittel und des Ammoniaks eingedampft. Das Konzentrat wird sodann auf eine mit 100 ml des Kationenharzaustauschers Amber-Iite CG-50 in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem Waschen mit V/asser wird mit 0,5 normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die aktive Fraktion wird unter vermindertem Druck zur Abtrennung des Ammoniaks auf etwa 3 ml eingedampft. Das Konzentrat wird sodann in 100 ml Methanol gelöst und die Lösung mit 6 normaler Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt. Die entstandene weiße Fällung wird abfiltriert, . mit Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 250 mg gereinigtes Sulfat von XK-88-2.
509818/1088
Beispiel 7
In diesem Beispiel wird das in Beispiel 3 erhaltene Gemisch von XK-88-3 und XK-88-5 auf etwa 10 ml eingedampft. Das Konzentrat wird auf eine mit 500 ml Kieselgel gefüllte Säule gegeben und mit einem Gemisch von n-Butanol, Äthanol, Chloroform und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (4:5:2:5) entwickelt. Das Eluat wird in Fraktionen von jeweils 20 ml aufgefangen. Die Verbindung XK-88-5 wird in den Fraktionen 95 bis 121 und die Verbindung XK-88-3 in den Fraktionen Nr. 133 bis 158 eluiert. Die Verbindung XK-88-3 in den letztgenannten Fraktionen zeigt Rf-Werte von 0,39 bzw. 0,27 bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel mit dem Entwicklungslösungs-■ mittel II bzw. dem Entwicklungslösungsmittel· M. Die in den erstgenannten Fraktionen enthaltene Verbindung XK-88-5 zeigt R^- Werte von 0,25 bzw. 0,50 bei der DünnschichtChromatographie an Kieselgel mit den gleichen Entwicklungslösungsmitteln. Hierauf werden die Fraktionen, die die gleichen Verbindungen enthalten, vereinigt.
Beispiel 8
In diesem Beispiel wird die in Beispiel 7 erhaltene aktive Fraktion mit der Verbindung XK-88-3 als Hauptbestandteil unter vermindertem Druck zur Abtrennung der organischen Lösungsmittel und des Ammoniaks unter vermindertem Druck getrocknet. Der trockene Rückstand wird in 5 Op ro ζ ent i gem wäßrigem Methanol ge·? löst und auf eine mit 50 ml Kieselgel gefüllte Säule gegeben. Sodann wird die Säule mit 50prozentigem wäßrigen Methanol gewaschen, um Spuren von XK-88-1 abzutrennen. Hierauf wird die Verbindung XK-88-3 mit 50prozentigem wäßrigen Methanol eluiert,
50981 8/1088
das 5 Prozent Ammoniumacetat enthält. Die aktiven Fraktionen v/erden vereinigt und zur Abtrennung des Methanols unter vermindertem Druck eingedampft. Das Konzentrat wird auf eine mit
ι
50 ml des Kationenharzaustauschers Amberlite CG-50 in der
Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser zur Abtrennung des Ammoniuraacetats wird mit 0,5 normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die erhaltenen aktiven Fraktionen werden vereinigt und zur Abtrennung des Ammoniaks auf etwa 3 ml eingedampft. Das Konzentrat wird mit 6 normaler Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und in 100 ml Äthanol eingetropft. Die entstandene weiße Fällung wird abfiltriert, mit Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 60 mg gereinigtes Sulfat von XK-88-3.
Beispiel 9
In diesem Beispiel wird die in Beispiel 7 erhaltene aktive Fraktion mit XK-88-5 als Hauptbestandteil unter vermindertem Druck eingedampft. Das Konzentrat wird in überschüssigem Methanol gelöst und mit 6 normaler Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt. Die entstandene Fällung des rohen Sulfats von XK-88-5 wird abfiltriert, mit Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 600 mg. Das erhaltene Rohpulver wird in einem Gemisch von n-Butanol, Äthanol, Chloroform und konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung (4:5:2:4) suspendiert. Die Suspension wird auf eine mit 500 ml Kieselgel gefüllte Säule gegeben. Die Säule wird mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch entwickelt. Die in den eluierten Fraktionen enthaltenen aktiven Bestandteile werden auf _j
509818/1088
Grund der Rf-Werte bei der DunnschichtChromatographie an Kieselgel untersucht. Die XK-88-5 enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zur Abtrennung der organischen Lösungsmittel und des Ammoniaks unter vermindertem Druck eingedampft. Sodann wird das Konzentrat auf eine mit 200 ml des Kationenharzaustauschers Amberlite CG-50 in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem Waschen' der Säule mit Wasser wird mit 0,5 normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die aktive Fraktion wird zur Abtrennung des Ammoniaks unter vermindertem Druck auf etwa 10 ml eingedampft. Das Konzentrat wird in 200 ml Methanol gelöst und mit 6 normaler Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt. Die entstandene weiße Fällung wird abfiltriert, mit Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 400 mg gereinigtes Sulfat von XK-88-5.
SO 98 18/1088

Claims (9)

  1. - 36 -
    Patentansprüche
    Aminoglykoside der allgemeinen Formel I
    NH
    (D
    in der X ein Wasserstoffatom oder die Gruppe
    oder
    OCH-
    bedeutet, Y eine Amino- oder Hydroxylgruppe und Z ein Wasserstoff atom oder eine Hydroxylgruppe darstellt, wobei Y eine Aminogruppe und Z ein Wasserstoffatom bedeuten, wenn X ein Wasserstoffatom ist, und ihre Salze mit Säuren.
    509818/1088
  2. 2. Aminoglykosid-XK-88-1 der Formel
    CH2 0H
    HO
    HO'
    und sein Sulfat.
  3. 3. Aminoglykosid XK-88-2 der Formel
    und sein Sulfat.
    509818/1088
  4. 4. Aminoglykosid XK-88-3 der Formel
    HO.
    NH, HO
    H2N
    HO
    H-
    und sein Sulfat.
  5. 5. Aminoglykosid XK-88-5 der Formel
    und sein Sulfat.
    OCH.
  6. 6. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1 Ms 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces hofuensis ATCC 21970 oder nach üblichen Methoden erhaltene Mutanten dieses Stammes in einem assimilierbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthaltenden Nährmedium züchtet, aus dem Kulturmedium die Verbindungen nach an sich bekannten Me-
    $09818/1088
    thoden isoliert und gegebenenfalls durch Umsetzen mit einer Säure in die Salze überführt.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung während 2 bis 15 Tagen durchführt.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei Temperaturen von 26 bis 430C und bei etwa neutralem pH-Wert durchführt.
  9. 9. Verwendung der Verbindungen gemäß Anspruch 1 bis 5 als Bakterizide.
    509818/1088
    L e e r s e i t e
DE19742450411 1973-10-24 1974-10-23 Aminoglykoside, xk-88-1, xk-88-2, xk-88-3 und xk-88-5 ihre salze, verfahren zu ihrer herstellung und arzneimittel Granted DE2450411B2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP11893273A JPS5615232B2 (de) 1973-10-24 1973-10-24

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE2450411A1 true DE2450411A1 (de) 1975-04-30
DE2450411B2 DE2450411B2 (de) 1977-07-21
DE2450411C3 DE2450411C3 (de) 1978-03-09

Family

ID=14748770

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19742450411 Granted DE2450411B2 (de) 1973-10-24 1974-10-23 Aminoglykoside, xk-88-1, xk-88-2, xk-88-3 und xk-88-5 ihre salze, verfahren zu ihrer herstellung und arzneimittel

Country Status (16)

Country Link
US (1) US3939043A (de)
JP (1) JPS5615232B2 (de)
AR (1) AR205726A1 (de)
AT (1) AT332547B (de)
AU (1) AU496758B2 (de)
BE (1) BE821441A (de)
CA (1) CA1032100A (de)
CH (1) CH606425A5 (de)
DE (1) DE2450411B2 (de)
DK (1) DK139588B (de)
FR (1) FR2248850B1 (de)
GB (1) GB1479179A (de)
IN (1) IN140482B (de)
NL (1) NL7413859A (de)
NO (1) NO141343B (de)
ZA (1) ZA746606B (de)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5315343A (en) * 1976-07-27 1978-02-13 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Novel antibiotic derivatives and their preparation
US4187372A (en) * 1976-09-08 1980-02-05 Abbott Laboratories Seldomycin factor 5 derivative
US4218441A (en) * 1979-03-29 1980-08-19 Abbott Laboratories O-Demethylseldomycin factor 5
US4239752A (en) * 1979-03-29 1980-12-16 Abbott Laboratories O-Demethylseldomycin factor 5 derivatives
JPH07116209B2 (ja) * 1986-04-11 1995-12-13 メクト株式会社 シアロシルセラミド類及びその製造方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3652536A (en) * 1969-06-02 1972-03-28 Upjohn Co Novenamine compounds and derivatives

Also Published As

Publication number Publication date
US3939043A (en) 1976-02-17
DE2450411C3 (de) 1978-03-09
ZA746606B (en) 1975-12-31
DE2450411B2 (de) 1977-07-21
DK555974A (de) 1975-07-14
AR205726A1 (es) 1976-05-31
DK139588C (de) 1979-08-20
BE821441A (fr) 1975-04-24
FR2248850B1 (de) 1978-07-21
JPS5615232B2 (de) 1981-04-09
AU496758B2 (en) 1978-10-26
DK139588B (da) 1979-03-12
NL7413859A (nl) 1975-04-28
GB1479179A (en) 1977-07-06
CA1032100A (en) 1978-05-30
ATA853374A (de) 1976-01-15
IN140482B (de) 1976-11-20
JPS5070590A (de) 1975-06-12
NO743760L (de) 1975-05-20
AT332547B (de) 1976-10-11
NO141343B (no) 1979-11-12
FR2248850A1 (de) 1975-05-23
CH606425A5 (de) 1978-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2435160A1 (de) Fortimicin a, verfahren zu seiner herstellung, mikroorganismen zur durchfuehrung des verfahrens und arzneimittel
DE2900591A1 (de) Antibiotica, ein verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als pflanzenschutzmittel
DE2167325C2 (de) Antibiotikum A-201B und Verfahren zu seiner Herstellung
DE2450411C3 (de)
DE2748530C3 (de) Fortimicin D und KE und deren Salze mit Säuren, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
DE3012014C2 (de) Istamycine, Verfahren zu deren Herstellung sowie Verwendung derselben als antibakterielle Mittel
DE2928373C2 (de) Antibiotika KA-7038I bis KA-7038VII, deren Salze, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende antibiotische Mittel
DE2455992A1 (de) Neues antibioticum sf-1623 und verfahren zur herstellung desselben
DE2418349A1 (de) Fortimicin b, verfahren zu seiner herstellung, mikroorganismen zur durchfuehrung des verfahrens und arzneimittel
DE2344780A1 (de) Antibiotikum xk-49-1-b-2, verfahren zu seiner herstellung auf mikrobiologischem wege und arzneipraeparate
DE2908150C2 (de) Fortimicin KG&amp;darr;1&amp;darr;, KG&amp;darr;2&amp;darr; und KG&amp;darr;3&amp;darr; Verfahren zu ihrerHerstellung und pharmazeutische Zubereitung
DE2326781C3 (de) Antibioticum XK-62-2, dessen Sulfat und Verfahren zur Herstellung desselben
DE2233555C3 (de) Verfahren zur Herstellung von Spectinomycin
DE2108739C2 (de) Antibiotikumkomplex S-3466 und Verfahren zu seiner Herstellung
DE2039990C2 (de) Neue Antibiotika B-5050 A bis F (Maridomycin I bis VI), Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre pharmazeutische Zubereitung
DE2633508A1 (de) Fortimicin c, verfahren zu seiner herstellung und arzneimittel
DE2818544A1 (de) Antibiotikum sf-1942, verfahren zu dessen herstellung und pharmazeutische zusammensetzung, die das antibiotikum sf-1942 enthaelt
DE2821948C3 (de) Antibiotika XK-62-3 und XK-62-4 und ihre Salze, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung bei der Bekämpfung bakterieller Infektionen
AT364455B (de) Verfahren zur herstellung von neuen phosphonsaeuren
DE1077380B (de) Herstellung des Antibiotikums Lemacidin
DE1617451C2 (de) Antibiotika-Komplex aus Tenebrimycin I,I&#39;, II, III, IV, V und VI und ein Verfahren zu dessen Herstellung
DE2916155A1 (de) Verbindung dc-11, verfahren zu ihrer herstellung, pharmazeutische zubereitung und mikroorganismenstamm zur durchfuehrung des herstellungsverfahrens
AT249265B (de) Verfahren zur Gewinnung des neuen Antibiotikums Danomycin
DE2649604C2 (de) Neue antibiotische Substanz SF-1771-B, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
DE2846320C2 (de) Antibiotikum BN-213 und Verfahren zu seiner Herstellung

Legal Events

Date Code Title Description
C3 Grant after two publication steps (3rd publication)
8339 Ceased/non-payment of the annual fee