DE2846320C2

DE2846320C2 - Antibiotikum BN-213 und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2846320C2
Application number: DE2846320A
Authority: DE
Inventors: Norio Ezaki; Jiro Itoh; Mitsugu Machida Tokyo Itoh; Shinji Yokohama Kanagawa Miyadoh; Tomizu Niwa; Yujiro Yokohama Kanagawa Yamada
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1977-10-31
Filing date: 1978-10-24
Publication date: 1983-01-27
Also published as: GB2006750A; DE2846320A1; US4235883A; FR2407219A1; GB2006750B; FR2407219B1; JPS5466601A

Description

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EJementaranalyse:

C 73,93%; H 10,28%; O 15,79%

(Differenz)
Molekulargewicht:

294 (hoch-auflösende Massenspektrometrie)
Molekularformel:

C₁₈H₃₀O₃
spezifische Drehung:

[«]? 0° (C=OA, Methanol)
Schmelzpunkt:

84"C
Ultravidieuabsorpüonsspektrum:

charakteristisches Absorptionsmaximum bei

292 ΐπμ in CH₃OH
Infrarotabsorptionsspektrum:
_ charakteristische Absorptionsbanden bei 2920, - 2850, 2650. 1660, 1630, 1570, 1440, 1405, 1300, 1260, 1240, 1170, 1130,= 1000, 850, 760, 720,

2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums BN-213 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ■t'seudomonas ATCC 31 421 in einem üblichen Kulturmedium kultiviert und die angesammelte Substanz BN-213 aus dem Kulturmedium gewinnt, indem man das Kulir-rmedium Filtriert, das Filtrat mit Äthylacetat extrahiert, den Extrakt unter Bildung von rohem, öligem BN-213 konzentriert und dieses Konzentrat unter Anwendung einer Kombination von Silicagel, Aluminiumoxid und Gelfiltrationsmaterial reinigt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung bei 20 bis 35°C durchführt

Mikroorganismen eingesetzt wird, bei 20 bis 35° C kultiviert

Die Substanz BN-213 gemäß der Erfindung ist wirksam, um das Wachstum von grampositiven Bakterien zu hemmen. Die Substanz zeigt jedoch nur eine niedrige Toxizität gegenüber Säugetieren und sie ist als antibakterielles Arzneimittel oder als Ausgangsmaterial hierfür geeignet

Die Erfindung wird anhand der Zeichnungen näher erläutert Es zeigen:

F i g. 1 das Ultraviolettabsorptionsspektrum der erfindungsgemäßen Substanz BN-213 bei einem Test bei dem die Substanz in Methanol zu einer Konzentration von 25 mcg/ml vor der Messung aufgelöst wurde, und

F i g. 2 das Infrarotabsorptionsspektrum der Substanz BN-213 gemäß der Erfindung, gemessen mit Tabletten, die durch Vermischen der Substanz mit Kaliumbromid hergestellt worden sind.

Von den Erfindern wurde festgestellt, daß beim Kultivieren von Pseudomonas ATCC 31 421 in dem Medium eine Substanz vorhanden ist die eine antibakterielle Wirkung gegen grampositive Bakterien aufweist Nach der Isolierung, Reinigung und Charakterisierung dieser Substanz wurde festgestellt, daß es sich hierbei um ein neues Antibiotikum handelt das sich von allen bekannten unterscheidet. (Diese Substanz wurde als Substanz BN-213 bezeichnet)

Pseudomonas ATCC 31 421 wurde aus einer Erdprobe, die in Gunma-ken, Japan, gesammelt worden war, isoliert Dieser Samm wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Hinterlegungsnummer 31 421 hinterlegt

Die bakteriologischen Eigenschaften des Stammes Pseudomonas ATCC 31 421 sind wie folgt:

(a) Morphologische Eigenschaften

Die in Bouillonagar gewachsenen Zellen sind Bazillen bzw. Stäbchen, die sich mit winpernartigen Geißeln bewegen, von den Abmessungen Pfi bis 0,8 χ 2,0 bis 3,0 μπι. Sie bilden keine Sporen und sie zeigen keinen Polymorphismus, Sie sind grammnegativ.

3)

Die Erfindung betrifft mit dem Patentanspruch 1 definierte Antibiotikum BN-213. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieses Antibio- so tikums, wie es im Patentanspruch 2 angegeben ist Der Patentanspruch 3 nennt eine Ausgestaltung dieses Verfahrens.

Bekannte Antibiotika, deren chemische Eigenschaften, ähnlich sind wie diejenigen der Substanz BN-213, 55 4) sind z. B. Albocycline (The Journal of Antibiotics, Band 20, Seiten 261 bis 266, 1967), Conocandin (Helvetica Chemica Acta, Band 59, Seiten 2506 bis 2514, 1967), Chilaphylin (The Journal of Antibiotics, Band 26, Seiten bis 130. 1973) und das neue Antibiotikum 5057 (JP-OS 1 08 902/1977). Diese unterscheiden sich jedoch, wie weiter unten dargelegt werden wird, von der Substanz BN-213 gemäß der vorligenden Erfindung.

Das erfindungsgemäße neue Antibiotikum BN-213 wird in der Weise hergestellt, daß man Pseudomonas sd. ATCC 31 421 kultiviert bzw. züchtet. Erfindungsgemäß werden die Erzeugerstämme in einem Medium, das üblicherweise zur Kultivierung oder Fermentierung von

(b) Kultivierungseigenschaften

1) Bouillonagarkullur: Die Zellen werden braun und sie wachsen, wobei sie ein cremeartiges Aussehen zeigen. Die Kolonien zeigen kein feststellbares faltenförmiges Wachsum, keine Viskosität und keine Wand?rungstendenz. Sie erzeugen kein ausbreitungsfähiges Pigment
Bouillonkultur: Das Medium wird durch und durch trüb. Ein Bakterienfilm wird auf der Flüssigkeitsoberfläche gebildet.

Bouillongelatine-Stabkultur: Laminare Verflüssigung.
Milchkultur: Verflüssigung unter Alkalinsidierung.

(c) Physiologische Eigenschaften

1) Reduktion von Nitrat: negativ.

2) Denitrifizierung: negativ.

3) Methylrottest: negativ.

4) Voges-Proskauer-Test: negativ.

5) Erzeugung von Indol: negativ

6) Erzeugung von Schwefelwasserstoff: negativ.

7) Hydrolyse von Stärke: negativ.

8) Verwertung von Zitronensäure (Simmond'sche Methode): positiv.

9) Mit Ammoniumsalzen als ausschließliche Stickstoffquelle erfolgt ein Wachstum.

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10) Erzeugung von Pigmenten: Es werden gelbgrüne, wasserlösliche und fluoreszierende Pigmente erzeugt,

11) Oxidasetest; positiv.

12) Viteilus-Reaktion; positiv.

13) Argminzsrsetzung: positiv

14) Bildung von Levan: positiv.

15) Ansammlung von Poly-/? hydroxybuttersäure; negativ.

16) Kein Bedarf für Nährstoffe.

17) Wachstumstemperatur: 10 bis 30⁰C; kein Wachstum bei 41°C

18) Kein Wachstum unter anaeroben Bedingungen.

19) O-F-Test (Heuleifson'sche Methode): O-Typ.

20) Verwertung von Kohlenstoffquellen: (i) Mit folgenden Kohlenstoffverbindungen als ausschließliche Kohlenstoffquellen erfolgt ein . Wachstum: Glucose, Trehalose, 2-Ketogluconsäure, L-Valin, /f-Alanin, DL-Arginin, L-Arabinose. Xylose, SaccharaL

(ii) Die folgenden Verbindungen von Kohlenstoff können nicht als ausschließliche Kohfenstoffquellen verwendet werden: Maltose, Stärke, Lactose, Adonit, Geraniol, Sorbit, Saccharose.

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Beim Vergleich der obengenannten bakteriologischen Eigenschaften des Stammes ATCC 3142t mit den Eigenschaften von identifizierten Stämmen, die in Berge/s Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, 1974, angegeben sind, werden die folgenden Schlußfolgerungen erhalten:

1. Der Stamm gehört zur Gattung Pseudomonas, da es sich um gramnegative Bazillen, die nicht dazu imstande sind, Sporen zu erzeugen, mit wimpernartigen Geißeln, die absolut aerob sind, handelt

2. Angesichts der Tatsache, daß kein Bedarf für Nährstoffe besteht, daß keine Ansammlung von Poly-/?-hydroxybuttersäure in den Bakterienkörpern erfolgt, daß fluoreszierende Pigmente gebildet werden und aufgrund des Verwertungsmusters für Kohlenstoffquellen, stimmt der Stamm ATCC 31421 gut mit der Art Pseudomonas fluorescence (die Art Pseudomonas 3—5 ist in der obigen Literaturstelle auf Seite 220, Tabelle 7—1, angegeben) überein.

3. Im Vergleich zu dem Inhalt der Tabelle 7—2 der obigen Literaturstelle auf Seite 22t unterscheidet sich der Stamm ATCC 31 421 von jedem Biotyp der Art Pseudomonas fluorescence geringfügig. Es so wird kein Biotyp gefunden, der perfekt mit dem Stamm ATCC 31 421 übereinstimmt

Die Erfinder haben daher diesen Stamm als Pseudomonas sp. BW-213 bezeichnet; er ist als Stamm ss Pseudomonas ATCC 31 421 eindeutig definiert

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können zur Herstellung des neuen Antibiotikums BN-213 verschiedene Kulturmedien eingesetzt werden, die üblicherweise für die Fermentierung von üblichen Mikroorganis- men verwendet werden. Beispiele för geeignete Kohlenstoffquellen sind Glucose, Dextrin, Hirsegelee etc. Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind Pepton, Hefeextrakt, gepulverte Bouillon, Sojabohnenpulver, Maisquellwasser, Ammoniumsulfat, Atnmoni- umchlorid etc. Erforderlichenfalls können anorganische Salze, wie Natriumchlorid und Calciumcarbonat, und Antischaummittel zu dem Medium gegeben werden.

För die Kultivierung sind Methoden, bei denen flüssige Medien eingesetzt werden, geeignet, beispielsweise ein Sohüttelkultivierungs- und Tauchbelüftungskultivierungsverfanren. Die richtige Kultivierungstemperatur ist 20 bis 35° C. Die richtige Kultivierungsperiode ist 1 bis 3 Tage.

Die Substanz BN-213 kann nach folgenden Methoden untersucht werden:

Als Untersuchungsmedium kann ein Gemisch aus 2% Mycinagar und 0,5% Bactoagar verwendet werden. Ein Stamm von Bacillus subtilis (ATCC 6633) wird als Testorganismus eingesetzt.

Die Ergebnisse der Untersuchung der Substanz BN-213 (rein) zeigen, daß innerhalb eines Konzentrationsbereichs von 500 bis 2000 mcg/ml zwischen dem Logarithmus der Konzentration und dem Durchmesser der Hemmzonen eine lineare Beziehung besteht Die Durchmesser der Hemmzonen betrugen 9,0 bis 11,0 mm (Papierschefbenmethode).

Die Substanz BN-213 hat die unten angegebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften. Sie kann daher aufgrund dieser Eigenschaften extrahiert und gereinigt werden. Zu diesem Zweck kann das folgende Verfahren angewendet werden:

Zunächst werden feste Teile aus der Kultivierungssubstanz, die die Wirkstoffe enthält, durch Filtration entfernt Sodann wird der Wirkstoff aus dem Filtrat mit Äthylacetat extrahiert und der Extrakt wird konzentriert, wodurch die rohe ölige Substanz BN-213 erhalten wird. Diese rohe Substanz BN-213 wird unter Anwendung der richtigen Kombination aus Silicagel, Aluminiumoxid, Gelfiltrationsmaterial und dergleichen gereinigt, wodurch die gereinigte Substanz BN-213 erhalten wird.

Die gereinigte Substanz BN-213, die auf diese Weise erhatten wurde, wurde dünnschichtchromatographiert, wobei verschiedene Lösungsmittelsysteme verwendet wurden. Bei jedem Lösungsmittelsystem erschien ein einziger Flecken. Daraus wird die Schlußfolgerung gezogen, daß die auf obige Weise gereinigte Substanz BN-.?13 perfekt rein ist

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Substanz BN-213 sind wie folgt:

1. Elementaranalyse:

C 73,93%. H 10,28%, O 15,79% (Differenz)

2. Molekulargewicht:

294 (hoch-auflösende Massenspektroskopie)

3. Molekularformel: C₁₈H₃₀O₃

4. Schmelzpunkt: 84T.

5. Spezifische Drehung: £oj? 0° (C= 0,4, Methanol)

6. Ultraviolettabsorptionsspektrum:

Das in Methanol aufgenommene Spektiam ist in F i g. 1 gezeigt

Charakteristisches Absorptionsmaximum bei 292 ηιμ

7. Infrarotabsorptionsspektrum:

Das nach der Käliümbrömidtablettenmethode gemessene Spektrum ist in F i g. 2 dargestellt. Charakteristische Absorptionsbanden bei 2920, 2850, 2650, 1660, 1630, 1570, 1440, 1405, 1300, 1260. 1240, M 70.1130,'000,850,760,720(Cm-¹)

8. Löslichkeit:

Löslich in Methanol, Äthylacetat und Aceton und unlöslich in Wasser und Chloroform.

9. Farbreaktion:

Ninhydrinreaklion: ncg.iiiv

Sakiiguchi-Reaktion: negativ

EiscnflllJ-chloridrcaklion: negativ

Schwefei.säiirereaktion: positiv

Kaliumpermangiina(reaktion: positiv
tO. Rf-Wer(e bei der Diinnschichtchromaiographie mit Silicagel:

Lösungsmittelsystem

Rf-Wert

Chloroform : Methanol (5 : 1)
Benzol : Äthylacetat (5 : I)
Benzol: Aceton (20 : 1)
n-Butanol : Methanol: Wasser (4

0,81
0,52
0,23
0,79

r-n _ λ I..:..:.^. — _j — o..u_. η Iw ι 11 j .. _i_:_

I_/IC r\tMIV|l(1tCff UCl O U U*t (I II/. LfIT^I-JgCgCII VCtSt-MIC-

dene Mikroorganismen sind in Tabelle I zusammengestellt. Aus Tabelle I wird ersichtlich, daß die Substanz BN-213 als antibaklerielles Arzneimittel oder als Ausgangsmaterial hierfür geeignet ist. Beim Test der akuten Toxizität führt eine Dosis von 50 mg/kg der Substanz BN-213, die Mäusen intravenös verabreicht wurde, zum Überleben sämtlicher Testmäuse.

Eine Dosis von lObis 100 mg/kg der Substanz BN-213 kann dem menschlichen Körprer durch intramuskuläre Injektion, hypodcrmische Injektion oder venöse Injektion verabreicht werden. Die Substanz kann auch als Arzneimittel extern bzw. äußerlich angewendet werden.

Tabelle I

Testorganismus

MHK

(mcg/ml)

Staphylococcus aureus 209-P JC-I 12,5

Staphylococcus au.cus Smith S-424 12,5

Staphylococcus aureus Nr. 26 12,5

Staphylococcus aureus N-0041 12,5

Staphylococcus epidermidis N-OO15 25

Bacillus subtilis ATCC 6633 12,5

Bacillus anthracis Nr. 119 3,13

Escherichia coli NIHJ JC-2 > 100

Proteus vulgaris OX 19 > 100

Bekannte Antibiotika, deren chemische Eigenschaften ähnlich sind wie diejenigen der Substanz BN-213. sind Albocyclin (The Journal of Antibiotics, Band 20, Seiten 261 bis 266. 1967). Conocandin (Helvetica Chemica Acta. Band 59. Seiten 2506 bis 2514, 1967), Chilaphylin (The Journal of Antibiotics. Band 26, Seiten 126 bis 130. 1973) und das neue Antibiotikum 5057 (JP-OSl 08 902/1977).

So ist z. B. der Schmelzpunkt der Substanz BN-213 84°C was nahezu gleich ist mit dem Schmelzpunkt von Albocyclin (83 bis 84°C). Albocyclin zeigt jedoch kein Ultraviolettabsorptionsspektrum. Seine spezifische Drehung ist [«]? -90° (C=\, Methanol). Albocyclin unterscheidet sich daher von der Substanz BN-213 durch diese Umstände.

Conocandin hat zwar die gleiche Molekularformel wie die Substanz BN-213, zeigt aber kein Ultraviolettabsorptionsspektrum und seine spezifische Drehung ist [ä]2> -7± Γ (C=0$57, Methanol). Daher ist Conocandin von der Substanz BN-213 verschieden.

Obgleich Chilaphylin eine Elementarzusammensel /ung hat. die ähnlich ist wie diejenige der Substanz BN-213. ist doch sein charakteristisches ! lltraviolettabsorptionsmaximum bei 225 ιημ und die spezifische Drehung ist [λ]; +38" (C=OA, Chloroform). Daher unterscheidet sich dieses Antibiotikum von der Substanz HN 21 3.

Bei dem neuen Antibiotikum 5057 liegt sein charakteristisches UltnivKilettabsorptinnsmaximum bei to 292 πιμ, wie bei der Substanz BN-213. c'och ist der Schmelzpuntk der erstercn Substanz I 33 bi*. I 3VC und das Molckularg wicht ist bb4 bis 66b. Diese Substanz unterscheidet sich daher von der Substanz MN 213

Daraus ergibt sich, daß die Substanz HN-21 i ein neues ■5 Antibiotikum ist. Unter den chemisch synthetisierten Verbindungen ist keine Verbindung, die perfekt der Substanz BN-213 entspricht.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

Beispiel 1

Ein flüssiges Medium, enthaltend 2% Weizenkeime. 3% Glycerin. 0.4% Ammoniumacetat und 0.4¹Vu Calciumcarbonat, wurde in zwanzig 500-ml-Sakaguchi-Kolben eingegossen. In jeden Kolben wurden jeweils 100ml eingegeben. Sodann wurden die Kolben mit Baumwolle abgeschlossen. 10 min bei 120 C unter Druck sterilisiert und sodann von einer Si hrägkulttir des Starr..«;es ATCC 31 421 mit derjenigen Menge inokuliert, die auf einmal durch eine Platinschleife übertragen wurde. Die so auf das Medium inokulierte Kultur wurde 2 Tage unte^r Schütteln bei 28"C kultiviert. Es wurden 1.81 eines flüssigen Mediums erhalten, das 80 ng der Substanz BN-213 ml enthielt.

Sodann wurden feste Teile aus diesem flüssigen Medium durch Filtration entfernt. Das Filtrai wurde mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt. Hierauf wurde der Wirkstoff mit 1.8 I Äthylacetat extrahiert. Dieses Äthylacetat wurde bei vermindertem Druck konzentriert, bis 380 mg Substanz BN-213 in Form eines

•to braunen öligen Materials erhalten wuröen.

Dieses ölige Material wurde auf eine 80-ml-Säule von Wakogel C-200 aufgegeben, die zuvor mit Chloroform gefüllt worden war. Die Entwicklung erfolgte mit Chloroform/Methanol-Systemlösungsmitteln, deren Methanolgehalt stufenweise erhöht war. Die aktiven Fraktionen wurden unter vermindertem Druck konzentriert, wodurch 34,5 mg eines Pulvers erhalten wurden. Dieses Pulver wurde in Methanol aufgelöst und auf einer geringen Menge von Wakogel C-200 adsorbiert.

so Sodann wurde es auf eine 20-ml-Säule von Wakogel C-200 aufgegeben, die zuvor mit Benzol gefüllt worden war. Die Entwicklung erfolgte mit Benzol/Äthylaeetat-Systemlösungsmitteln, deren Äthylacetatgehalt stufenweise erhöht worden war. Die aktiven Fraktionen wurden konzentriert, wodurch 11,5 mg weißes Pulver erhalten wurden.

Beispiel 2

20 I eines Kulturmediums, enthaltend 2°/o Weizenkeime, 3% Glycerin, 0.4% Ammoniumchlorid und 0,4% Calciumcarbonat, wurden in einen 30-1-Kulturtank eingeführt und 15 min bei 120^eC sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde der Kulturtank mit einer Impfkultur des Stammes ATCC 31 421. der zuvor auf dem gleichen Medium 2 Tage in einem Sakaguchi-Kolben kultiviert worden war, inokuliert. Das Medium in dem Tank wurde unter Belüften und Rühren (Belüftungsgeschwi.idigkeit:

15 l/min, Rührgeschwindigkeit: 200 Upm) 2 Tage lang

bei 28 C kultiviert, wodurch 17 1 eines flüssigen Mediums, enthaltend IOO(ig/ml der Substanz BN-213. erhalten wurden.

Feste Teile wirden aus diesem flüssigen Medium durch Filiration entfernt. Das Filtrat wurde mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt. Sodann wurde der Wirkstoff mit 20 I Äthylacetat extrahiert. Sodan" wurde das Äthylacetat unter vermindertem Druck konzentriert, bis 3.97 g der Substanz. BN-213 in Form eines braunen öligen Materials erhalten wurden.

Dieses ölige Material wurde auf eine 270-ml-Siiule von Wakogel C-200, die zuvor mit Chloroform gefüllt worden war. aufgegeben. Es wurde mit Chloroform/

Methanol-Systemlösungsmitteln entwickelt, deren Methanolgehalt stufen weise erhöht wurde. Die aktiven Fraktionen wurden bei einem verminderten Druck konzentriert, wodurch 630 mg Pulver erhalten wurden. Dieses Pulver wurde in Methanol aufgelöst und auf einer geringen Menge von Wakogel C-200 adsorbiert. Sodann wurde es auf eine 20OmI-SiUiIc von Wakogel C-200 aufgegeben, die zuvor mit Benzol gefüllt worden war. Es wurde mit Bcnz.ol/Äthylacctat-.Systemlösiingsmitteln entwickelt, deren Äthylacetatgehalt stufenweise erhöht worden war. Die aktiven Fraktionen wurden konzentriert, wodurch 101.-3 mg eines weißen Pulvers erhalten wurden.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche;

1. Antibiotikum BN-213 mit einer Hemmwirkung für das Wachstum von grampositsven Bakterien, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

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