DE2108739C2 - Antibiotikumkomplex S-3466 und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Description

Ordlnal-Nähragarmedlum Wachstum: gut Luft-Mycel: fahlgelb

lösliches Pigment: leicht gelbbraun

Bennet-Medlum

Wachstum: gut, faltig und erhöht Im Mittelpunkt Luft-Mycel: gelblich-srau lösliches Pigment: dunkelgelbbraun

Stärke-Agur-Medlum Wachstum: mäßiges Wachstum, farblos, Luft-Mycel: gelbweiß

lösliches Pigment: leicht gelborange

Kartoffel-Medium

Wachstum: gutes Wachstum, gelbbraun, faltig Luft-Mycel: leicht braungrau lösliches Pigment: schwarz

Nitrat-Medium

Wachstum: geschmeidiges, haarähnliches Wachstum

Sonstiges: Nitratreduktion positiv Gelatlne-Agar-Medlum

Wachstum: Wachsen an der Oberfläche Luft-Mycel: weiß

lösliches Pigment: braun

Sonstiges: langsames Schmelzen und Verflüssigen;

wird kraterähnlich U Lackmus-Mllch-Medium

Wachstum: gutes Wachstum, ringförmig Sonstiges: schwache Koagulation und Peptonisle-

rung

keine Invertaseaktlvitat

Stärke-Pepton-Agar-Medlum Wachstum: gutes Wachstum, faltig Luft-Mycel: leicht gelbbraun lösliches Pigment: dunkelgelbbraun Cellulose-Aspagarln-Medlum kein Wachstum

keine Hydrolyse

Dextrln-Caseln-Medlum Wachstum: faltig, gelbbraun Luft-Mycel: braunweiß

lösliches Pigment: dunkelgelbbraun

Der erfindungsgemäße Antibiotikumkomplex S-3466 sammelt sich In dem Mycel an, wenn Streptomyces aureus ATCC 21428 aerob In einem chemisch definierter cder natürlichen Kulturmedium kultiviert wird. Das Medium kann ein solches sein, wie es in der Regel zur Kultivierung von Streptomyces aureus benutzt wird, und es kann assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthalten. Falls erforderlich, kann auch eine kleine Menge an Nährboden, wachstumsfördernden Substanzen, Vorstufen usw. zu dem Kulturmedium hinzugegeben werden.

Bei den zur Kultivierung benutzten Kohlenstoffqueilen

handelt es sich beispielsweise um Glucose, Maltose, Fructose, Melasse, Stärke, Dextrin oder Glycerin. Die Stlckstoffquellen können organische Stickstoffverbindungen sein. z.B. SojabohnenmehJ, Fleischextrakt, Pepton,

Malswasser oder Hefe sowie anorganische Verbindungen, wie Nitrate oder Ammoniumsalze. Die anorganischen Salze umfassen z. B. Natriumchlorid, Kallumdihydrogenphosphat, Dikallumhydrogenphosphat oder Calclumcarbonat.

in In das aus den vorgenannten Bestandteilen hergestellte Medium, welches einen In etwa neutralen pH-Wert aufweist, wird mit dem Streptomyces aureus ATCC 21428 geimpft, woran sich die aerobe Kultivierung bei einer Temperatur von 25 bis 30° C anschließt. Nach einer Kulis tlvlerungszelt von zwei bis sechs Tagen erreicht die Anreicherung an Antibiotikumkomplex S-3466 in dem Mycel den Maximalwert.

Zur Trennung und Gewinnung des Antibiotikumkomplexes S-C466 wird ein bekanntes Verfahren benutzt. Die

Fermentationsbrühe wird gefiltert .₊iid der Filterkuchen mit den mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmitteln Methanol und/oder Aceton extrahiert. Der Extrakt wird Im Vakuum unter Entfernen des Lösungsmittels konzentriert und sodann mit den nicht mit Was-

ser machbaren Lösungsmitteln Ethylacetat oder n-Hexan erneut extrahiert. Der Antibiotikumkomplex wird durch Konzentrieren des Extrakts In einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel unter Vakuum erhalten. Er fällt als teerige und ölige Substanz an.

Zum Sammeln des Mycels durch Filtrieren wird vorher die Brühe eine bis drei Stunden auf 80° C erhitzt, wobei der pH-Wert 3 beträgt. Das Ist nötig, weil das Mycel des Streptomyces aureus so fein und breiig Ist, daß die Filtration Schwierigkelten macht und ein beträchtlicher Ver-

lust an Mycel eintritt. Der pH-Wert wird mit Hilfe einer Mineralsäure oder einer organischen Säure, z. B. Salzsäure, Schwefelsäure oder Essigsäure, eingestellt.

Die Extraktion des Antibiotikumkomplexes mit dem wassermischbaren Lösungsmittel kann bei normaler

Temperatur ausgeführt werden. Es Ist jedoch günstig, die Extraktion bei Rückflußtemperatur durchzuführen, um die Ausbeute an dem gewünschten Komplex zu erhöhen. Bei Verwendung von Methanol kann durch die Extraktion bei Rückflußkochen die Reinheit des Komplexes

ebenso wie die Ausbeute merklich gesteigert werden. Wenn die Fermentationsbrühe; deren pH-Wert mit Schwefelsäure auf 3 eingestellt worden ist, auf eine Temperatur von 8O⁰C während einer Stunde erhitzt, dann gefiltert, und der Filterkuchen drei Stunden mit Metha-

nol zum Rückfluß erhitzt wird, so ist die Extraktion 5 bis 150mal wirksamer als In dem Fall, bei dem der Kuchen bei normaler Tempeidtur ohne pH-Wert-Elnstellung, Wärmebehandlung und Rückfi'ußkochen extrahiert wird. Hinzu kommt noch die kürzere Extraktionszeit. Di? Ver-

Suchsergebnisse der Tabelle 1 zeigen diese Wirkung auf. Tabelle 1 Behandlung der Brühe Filtrationszeit Lösungsmittel Extraktionsbedingungen Ausbeute *)

unbehandelt

pH 3; 1 Stunde auf 80° C erhitzt pH 3; 1 Stunde auf 80°C erhitzt

Min. Aceton 100 ml

Zimmertemperatur über Nacht

63 μg/ml

2,5 Min. Aceton 100 ml 3 Stunden Rückfluß 1 600

Min. Methanol 100 ml 3 Stunden Rückfluß 10 000 μg/m!

*) Die Ausbeute wurde nach dem Verfahren mit der Trübescheibe bestimmt.

Der Anllbiotlkumkomplex S-3466 wird gewöhnlich In der Form von farblosen oder leicht gelben, prismatischen Kristallen erhallen. In manchen Rillen erhalt man jedoch eine ölige Substanz, die eine rotbraune bis fahlgelbe Farbe aufweist. Im letzteren lall kann die Substanz durch Stehenlassen In einem Uefrlerapparal wilhrcnd einer relativ langen Zelt. /. B. einer Woche oder mittels elnei Silulenchronuitographle unter Verwendung von SlII-cagel kristallisiert werden. Der Anilbloilkumkomplcx S-3466 Ist eine neutrale Substanz, die gegen Licht und Hitze stabil Ist. Ihr Schmelzpunkt liegt nach der IJmkrlstalllsatlon aus n-llexan bei 72 bis 75" C. Der Komplex Ist In den meisten organischen Lösungsmitteln, wie n-Hexan, Benzol. Chloroform, Diethylether, Aceton, Ethylaeelat, l'etrolether und Alkoholen leicht loslich, In Wasser dagegen unlöslich. Die Elcmentaranalyse ergab 60.07 % C und ^l'.(>7(, II. Halogene, Stickstoff und Schwefel konnten nicht nachgewiesen werden Die nachfolgenden Reaktionen sind alle negativ: Fehllng. Tollens. Carbazol. Elson-Morgan und Nlnhydrln.

Eine Dünnschichtchromatographie der so erhaltenen rohen Krislalle des Antiblollkumkomplexes S-3466 auf Slllcagel zeigt unter Verwendung einer geeigneten Menge eines Lösungsmittels, wie η-Hexan, Chloroform, Elhylacetal und dergleichen oder einer Mischung hiervon, drei benachbarte, etwa gleich große Flecken. Dies zeigt, daß der Antibiotikumkomplex S-3466 wenigstens drei eng verwandle Komponenten enthält, die als S-3466 A. S-3466 B und S-3466 C bezeichnet werden. Die Komponenten S-3466 A. S-3466 B und S-3466 C sind voneinander durch Saulenchroniatographie unter Verwendung von Slllcagel und η-Hexan. Chloroform, Ethylacetat und dergleichen als Elulcrungsniittcl trennbar. Wird z. B. eine Lösung des Antlhiotlkumkomplcxcs S-3466 In Chloroform auf den Kopl der mit Slllcagel gefüllten Säule gegeben, so wird S-3466 A zuerst elulert, wenn ein Gemisch aus Chloroform und Ethylaceliit Im Verhältnis 2 ; I zugegeben wird Danach wird S-3466 B clulerl, wenn ein Lösungsniittclgemlscli aus Chloroform und F.lhylacelat im Verhältnis I : I verwendet wird. Schließlich wird die Säule noch mit Fthylacciai ausgewaschen. Dabei wird S-3466 C erhalten und kann durch Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum gewonnen werden. Jede Komponente kann nach den gleichen wie für den S-3466-Komplex angegebenen Kristallisationsverfahren in Form von Prismen zur Kristallisation gebracht werden.

Anhand der Figuren werden die physikalischen Eigenschaften des erfindung.sgemäHen Antibiotikumkomplexes näher erläule.t Es zeigt

Flg. 1 ein Ulirr-violetmbsorptlonsspektrum des Antibiotikumkomplexes S-3466:

Flg. 2 ein Infraro!:ibsorptionsspektriim des Antlblotikumkomplcxes S-346f>;

Fig. 3 ein lnfraroiahsorptlonsspektrum des Antibiotikums S-34'.(» Λ;

Fig. 4 ein !ntrarotabsorpiionsspektrum des Antibiotikums S-3466 B:

Fig. 5a bis b ein Inlrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums S-346(> C.

Fig. 6a bis 6j ein Massenspektrogramm des Antibiotikumkomplexes S-3466. das oberhalb von m/e 457 mit erhöhter Empfindlichkeit des Spektrometer aufgenommen wurde;

Flg. 7a bis 7h ein Massenspektrogramm des Antibiotikums S-3466 A. das oberhalb von m/e 360 mit erhöhter Empfindlichkeit des Spektrometer aufgenommen wurde;

Fig. 8a bis 8e ein Massenspektrogramm des Antibiotikunis S-3466 B, das oberhalb von m/e 500 mit erhöhter Empfindlichkeit des Spektrometer aufgenommen wurde;

I Ig "a bis 9p ein Massenspektrogramm des Antlblotlkums S-3466 C;

Flg. 10 ein NMR-Spektrum des Antibiotikumkomplexes S-3466 In ti« I, Als Innerer Standard wurde Tel rumct hy lsi lan verwendet;

I Ig. Il ein NMR-Spektrum des Antibiotikums ίο S-3466 A, das unter den gleichen Bedingungen wie bei Fig. H) aufgenommen wurde;

FIg 12 ein NMR-Spektrum des Antibiotikums S-3466 I) unter den gleichen Aufnahmebedingungen;

I Ig 13 ein NMK Spektrum des Antibiotikums S-3466 C unter den gleichen Aufnahmebedingungen.

Der Komplex S-3466 zeigt in Methanol Im Bereich von 200 bis 400 um keine UV-Absorptlonsmaxlma. Wird von der Substanz als flüssiger I Hm ein Infrarotspektrum aufgenommen, so erscheinen charakteristische Banden bei 2960, 2920. 2860. 1733. 1460. 1381, 1334, 1274. 1195, 1171. 1122, 1092. 1063 und 950cm¹. Diese Banden beweisen das Vorliegen von Methyl-, Methylen-, Carbonylund Caibonsiiureeslergruppen

Im Massenspektriim findet sich der Molekulpeak bei m/e 792. Has in CDCI, aufgenommene Kernresonan/spcktruin gibt Signale bei 9,12 r (Triplett), 8.81: (Duplett) und 8,73 r (Duplett).

Die Eigenschaften der Antibiotika S-3466 A. S-3466 B und S-3466 C sind nachstehend zusammengestellt.
jo Alle drei bilden farblose oiler leicht gelbliche prismatische Kristalle und sind neutral und stabil gegenüber W!Irine und Licht. Die Schmelzpunkte der aus n-Hexan kristallisierten Substanzen betragen 73 bis 74" C. 79 bis 80 C bzw. ins bis 106 C. Die Antibiotics sind löslich In den meisten organischen Lösungsmitteln wie Alkoholen. Aceton. Benzol, n-llexan. Chloroform, Pelrolelher, Dieihyicuici und !:;!;y!;;ec!;:!. F.leriierüaranalysen ergaben jeweils eine Zusammensetzung aus Kohlenstoff, Wasserstoff und Saucrstoll als konstituierenden Elemen-•to ten. mit C 65.58% und H 8.85%. C 66.48% und H 8.97% bzw. C 65.41 und Il 9.1.Vv

Das an einem flüssigen Film gemessene IR-Spektrum

des S-3466 A zeigt Absorptionen bei 2920, 2860, 2960, 1733, 1460, 1381. 1334. 1274, 1195. 1171, 1122, 1092, 1063 und 950 cm '. Nahezu die gleichen Werte wurden mit S-3466 B und S-3466 C erhalten. In allen drei Fällen ergaben sich starke Absorptionen mit einem KBr-Preß-

ling bei 1720cm ' und ir, CHCl₁ bei 1720cm '. Dies deutet hin auf die Gegenwart von Methyl-, Methylen-, Carbonyl- und Carbonsikireestergruppen.

In den Massenspektmgramnien des S-3466 A. S-3466 B und S-3466 C ergaben sich Molekülpeaks bei m/e 764, 7?S bzw 792. Diese Zahlen entsprechen den jeweiligen Molekulargewichten

Die NMR-Speklren des S-3466 A. S-3466 B und S-3466 C in CDDI, ergaben Signale bei 9.12 r (Triplett), 8,81 τ (Duplett) und. ausgenommen S-3466 C. 8,73 r (Duplett).

Die in Chloroform gemessenen optischen Drehungen von S-3466 A. S-3466 H und S-3466 C ergaben sich zu +6,9", + 2.0' bzw. 0.0', wahrend die Summenformeln zu C_J2H₆«O,2. C₄₁H₀O,; bzw. CwIh₂Oi₂ errechnet wurden.

Bei allen drei Substanzen fielen die folgenden Reaktionen negativ aus: Fehllng. Tollens. Carbazol, Elson-Morgan und Nlnhydrln.

Der erfindung5gcrn3'3e Antibiotikurnkorrsplex S-3466 und die hieraus Isolierten Antibiotika S-3466 A, S-3466 B und S-3466 C besitzen ausgezeichnete antibakterielle, insektizide und mitleide Aktivitäten und sind besonders

geeignet zum Abtöten von ausgewachsenen Würmern und Mllbenelern. Sie können mit Vorteil In der Landwirtschaft gegen verschiedene Mikroorganismen, Insekten und Milben elhgesetzt werden.

Von Vorteil Ist die nennenswert niedrige Toxlzltät gegenüber Tieren, Menschen und Pflanzen. So Ist z. B. Oberhaupt keine Toxlzltat gegenüber Pflanzen, wie Gänseblün.oien, Tomaten, Auberginen, französischen Bohnen und Gurken, selbst bei einer Menge von 1600 ppm, vorhanden. Bei Versuchen an Mäusen zeigte sich, daß die Antibiotika eine 50% tödliche Dosis von 3450 mg/kg bei oraler Verabreichung haben. Entzündungen der menschlichen Haut sind nicht zu befürchten.

Anhand der nachstehenden Versuche wird die Aktivität des erflndungsgemaOen Komplexes aufgezeigt.

Versuch 1 Antibakterielle Aktivität

Die Mlndestlnhlbltorkonzentratlonen des Antibiotikumkomplexes S-3466 gegenüber verschiedenen Mikroorganismen wurde mittels der Agar-Medlum-Verdünnungsverfahren bestimmt.

Positiver Fall

(mcg/cm¹)

Bacillus megaterlum IAM 1030 0,2 Bacillus subtllls IAM 1033 0,2 Mlcrococcus luteus IAM 1490 0,8 Corynobacterlum mlchlganense 0,2 Mycobacterlum tuberculosis H RV 0,63 Tabelle 2

A: Prozentsatz der getöteten ausgewachsenen Milben B: Prozentsatz der getöteten Eier

Fortsetzung

ι Positiver Fall

(meg/cm¹)

Staphylococcus aureus IAM 1296 0,8 Negativer Fall

(bei Mengen größer als SO μg des Antibiotikums) Escherlchla coll IAM 1016 Proteus vulgarls Asperglllus fumigates

Versuch 2 Mltlzldaktlvltat gegenüber Tetranychus telarlus L

Blatter von französischen Bohnen (Phaseolus vulgarls)

υ wurden mit 90 bis 120 ausgewachsenen Milben und 200 bis 250 Eiern von Tetranychus telarlus L geimpft und In eine Emulsion eingetaucht, die auf die aus Tabelle 2 ersichtlichen Konzentration verdünnt war und aus 40 Gewicht!'.«!!«» S-3466-Komplex.. S-3466 A. S-3466 B oder S-3466 C, 40 Teilen Xylol, 10 Teilen Cyclohexanol und 10 Teilen eines anlonlschen, oberflächenaktiven Agens bestand. Zum Ausbrüten der Eier wurden die Blatter in einem thermostatlslerten Raum bei einer Temperatur von 25" C gehalten. Der Prozentsatz der getöteten ausgewachsenen Milben wurde nach 24 Stunden und der der Eier nach sieben Tagen festgestellt. Verglelchsergebnlsse wurden mit derselben Versuchsanordnung unter Verwendung einer Vergleichsemulslon aus l,l-Bls(chlorphenyl)-2,2,2-trlchlorethanol erhalten. Die Versuchs- und Vergleichswerte sind aus der Tabelle 2 ersichtlich.

Konzentration des	S-3466 Complex	S-3466 A	S-3466 B	S-3466 C	Vergleichs
aktiven Wirkstoffe«	Emulsion	Emulsion	Emulsion	Emulsion	emulsion
	A B	A B	A B	A B	A B

100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
100	100	100	100	98,8	80,5	100	96,4	100	98,5
100	94,1	100	96,0	93,2	63,3	98,2	82,5	98,8	90,2
96,0	91,2	98,0	90,3	91,2	61,2	92,4	60,4	96,0	73,0
85,4	88,9	88,3	91,5	75,5	48,9	74,2	50,6	83,4	60,4
76,8	74,0	79,1	70,3	64,3	36,3	60,5	42,1	72,3	21,7
63,5	69,5	68,3	69,1	50,1	20,1	51,4	30,5	52,1	H,5
Versuch 3			wui de der Prozen	tsatz der	eetöteten	Blattläuse	: festoi

200 ppm

100 ppm

50 ppm

25 ppm

12,5 ppm

6,3 ppm

3,1 ppm

1,6 ppm

Insektizidaktivitat gegenüber grünen Pfirsichblattläusen

40 bis 50 grüne Pfirsichblattläuse (Myzus perclae SuI- ss zer) wurden wie Parasiten auf topfgepflanzte Auberginen aufgebracht und sorgfältig mit einem netzbaren Pulver ties Antibiotikumkomplexes S-3466 besprüht, der die aus der Tabelle 3 ersichtlichen Konzentrationen aufwies. Dieses netzbare Pulver wurde hergestellt durch inniges Mischen von 40 Teilen Antibiotikumkomplex S-3466, 35 Teilen Diatomenerde und 20 Teilen »White Carbon«. 3,5 Teile eines anlonlschen oberflächenaktiven Agens und Llgninsulfonat wurden der resultierenden Mischung zugegeben, woran sich ein gründliches Durchmischen der Mischung anschloß. Die Blattläuse und die Pflanzen wurden in einem thermostatlschen Raum bei einer Tem-Deratur von 25° C stehen gelassen. Nach 24 Stunden stellt. Die Vergleichsergebnisse wurden unter Verwendung eines benutzbaren DDT-Pulvers erhalten. Die Versuchswerte und Vergleichsergebnisse sind aus der Tabelle 3 ersichtlich.

Tabelle 3

Konzentration des aktiven Agens

S-3466 Emulsion % Sterblichkeit

DDT-Pulver % Sterblichkeit

200 ppm	100	98,0
100 ppm	90,5	82,2
50 ppm	8U	50,3
25 ppm	62,4	13,5

Versuch Toxlzltät gegenüber Pflanzen

Topfgepflanzte Chrysanthemen, Gänseblümchen, Tomaten, Auberginen, französische Bohnen, Gurken und chinesischer Koiil wurden sorgfältig mit demselben Agens wie In Versuch 3 besprüht, das auf die aus der

10

Tabelle 4 erslchi'lchen Konzentralionen verdünnt worden war. Die so behandelten Pflanzen wurden sodann In einem Gewächshaus stehen gelassen. Nach zwei und vier Tagen wurden die Pflanzen auf angenommene Schäden untersucht. Die hierbei gewonnenen Ergebnisse sind aus der Tabelle 4 ersichtlich.

Tabelle 4

Pflanze

Zeit nach dem Besprühen in Tagen

Sprühkonzentration (ppm) 1600 800 400

200

100

nicht behandelt

Chrysanthemen

Gänseblümchen

Tomaten

Auberginen

französische Bohnen

Gurken

Chinesischer Kohl

2 4

2 4

2 4

2 4

Die in der vorstehenden Tabelle henutzten Symbole haben folgende Bedeutung

— : keine Flecken

± : Fläche der Flecken weniger als 3%

+ : Fläche der Flecken 3 bis 10%

++ : Fläche der Flecken 10 bis 30*,'.

Fläche der Flecken mehr als 30%

Versuch Giftigkeit bei Mäusen

Die 50%-tödllche Dosis (LD<„) des Antibiotikumkomplexes S-3466 gegenüber Mäusen beträgt bei oraler Verabreichung 3450 mg/kg.

Versuch

Mltlzldaktivltät gegenüber Tetranychus urtlcae Koch Nach der Verfahrenswelse des Versuchs 2 wurden VerTabelle 5

gleiche der Wirkungen des erflndungsgemäßen Komplexes S-3466, des l.l-BlstchlorphenyD^^-trlchlorethanols (Vergleichsemulsion 1) und des Tetradlfons (Tetrachlordlphenylsulfon, Vergleichsemulsion 2) auf doppeltgetüpfelte Spinnenmilben der Art Tetranychus urticae Koch durchgeführt, die gegenüber dem organl-, sehen. Phosphor enthaltendem Mitizid Vamldothlon resistent waren. Die Ergebnisse sind In der Tabelle 5 dargestellt.

Konzentration des	Komplex	S-3466	Vergleichsemulsion 1	B	Vergleichsemulsion 2	8,9	B
aktiven Wirkstoffs	A	B	A	100	A	5,3	100
200 ppm	100	100	100	100	-	100
100 ppm	100	100	100	100	-	99,0
50 ppm	98,8	100	100	100	-	97,3
25 ppm	94,4	76,2	100	97,5	-	87,0
12,5 ppm	88,8	72,7	100	62,7	-	83,7
6,3 ppm	51,0	65,0	95,3	12,0	50,0
3,1 ppm	32,9	50,0	41,2

U Fortsetzung Tabelle 5	Komplex A	21	08	739	6,8 6,0	12
Konzentration des aktiven Wirkstoffs	19,4 6,1	S-3466 E			Vergleichsemulsion 2 A B
1,6 ppm LD50 (ppm)	41,8 3,1		Vergleichsemulsion 1 A B	4*,2 > 200 3,1
	27,2 3,4

A: Prozentsatz der getöteten ausgewachsenen Milben B: Prozentsatz der getöteten Eier

Versuch 7 Mltlzldaktlvlist gegenüber Tetranychus urtlcae Koch

Der Versuch 6 wurde wiederholt, wobei jedoch Vergleiche der Wirkungen der drei Substanzen auf doppelt- getüpfelte Spinnenmilben durchgeführt wurden, die jegenüber dem organischen, Phosphor enthaltenden MItis izld Malathlon und dem organischen. Chlor enthaltenden MItIzId Chlorbenzilat reslstent waren. Die Ergebnisse sind In der Tabelle 6 dargestellt.

Tabelle 6	Komplex	S-3466	Vergleichsemulsion 1	B	Vergleichsemulsion 2
Konzentration des	A	B	A	69,7	A B
aktiven Wirkstoffs	100	99,6	90,5	58,5	28,0 98,9
200 ppm	100	86,7	85,3	34,4	23,1 92,1
100 ppm	95,1	67,3	61,9	30,9	67,8
50 ppm	86,6	47,3	32,0	19,2	27,5
25 ppm	72,4	38,1	26,3	7,5	13,4
12,5 ppm	51,9	30,2	11,3	0	4,3
6,3 ppm	35,1	8,2	6,7	0	0
3,1 ppm	29,1	-	0	93,8	0
1,6 ppm	6,9	24,0	36,0		> 200 37,2
LD50 (ppm)

A: Projentsiiz dsr gelötet»« ausjiwachsinen Müben B: Prozentsatz der getöteten Eier

Anhand der nachstehenden Beispiele wird das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert.

Beispiel 1

Es wurden 10 I eines aus 1% Glucose, 2% Glycerin, 0,2% Pepion, 0,2* Nährhefe, 0,2% Fleischextrakt, 2% Sojabohnenmehl, 0,0596 Magnesiumsulfat, 0,1% Dlkallumhydrogenphosphat, 1% Calclumcarbonat und Wasser bestehenden Mediums In ein Fermentatlonsgefäß eingegeben und In herkömmlicher Welse sterilisiert. In das Medium wurden sodann 200 cm¹ einer Keimflüssigkeit mit Streptomyces aureus ATCC 21428 eingeimpft, die wahrend dreier Tage bei 27° C In einem Medium der vorstehenden Zusammensetzung einer Schüttelkulturbehandlung unterzogen worden war. Der Mikroorganismus wurde vier Tage bei 27° C einer Luftzufuhr von 5 l/min ausgesetzt, wobei mil einer Geschwindigkeit von 250 U/mln gerührt wurde. Das feine, pulpenähnliche Mycelium wurde mit einer Zentrifuge zusammen mit einem Separator abgetrennt und zweimal mit 2 I Aceton extrahiert. Das Extrakt wurde unter reduziertem Druck zum AbdestlUieren von Aceton konzentriert. Das resultierende Konzentrat wurde zweimal mit 11 η-Hexan extrahiert. Das letztgenannte Extrakt wurde sodann unter reduziertem Druck zum AbdestilUeren von η-Hexan konzentriert, wobei sich eine ölige, rotbraune Substanz ergab. Diese ölige Substanz wurde sodann durch eine Säule (25 χ 300 mm) geleitet, die mit 100 g Silicagel gepackt war. η-Hexan wurde als Lösungsmittel benutzt. Die Säule wurde mit einer Mischung von Lösungsmitteln, die aus n-Hexan-Ethy!acetat (9:1) bestand, elulert. Die hiernach gewonnene Substanz wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wobei sich ein roher AntlHoUkumkomplex S-3466 als ölige, leicht gelbe Substanz ergab.

Diese blieb In einem Gefrierapparat eine Woche stehen, wobei 2 g rohe Kristalle des Antibiotikumkomplexes S-3466 erhalten wurden.

Beispiel 2

Es wurde 11 eines aus 2,0% Glucose, 0,5% Maiswasser, 2,0% Sojabohnenmehl, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,2% Peptori und 0,2% Glycerin (Rest Wasser) bestehenden Mediums In Teilen von 100 cm¹ In zehn 500 cm¹ Sakaguchi-Kolben eingegeben. Nachdem die Kolben In der ObIl- chen Welse sterilisiert worden waren, erfolgte ein Impfen mit Streptomyces aureus ATCC 21428. Hierdurch folgte eine Kultivierung bei 27° C während 72 Stunden unter Schütteln. Die Fermentationsbrühe wurde In einem 3-1-Erlenmeyer-Kolben eingegeben, auf einen pH-Wert von ca. 3,0 durch Zugabe von Schwefelsäure eingestellt und auf 80° C erhitzt. Diese Temperatur wurde ca. zwei Stunden aufrechterhalten. Nach dem Abkühlen wurde die Fermentationsbrühe gefiltert, um das Mycel zu gewinnen, das sodann mit 11 Aceton unter Erhitzen zum Rückfluß extrahiert wurde. Das Acetonextrakt wurde sodann unter reduziertem Druck destilliert und das resultierende Konzentrat zweimal mit 500 cm¹ η-Hexan extrahiert. Das Extrakt wurde getrocknet und unter reduzier-

tem Druck destilliert, wobei sich eine rotbraune, ölige Substanz ergab. Nach dem Stehenlassen dieser Substanz in einem Gefrierapparat ergaben sich 100 mg an rohem Antibiotikumkomplex S-3466 als leicht gelbliche Kristalle. Die verbleibcrde ölige Substanz wurde der Säulen-Chromatographie mit Silicagel unterzogen. Die Säule wurde mit einer Mischung aus n-Hexan-Ethylacetat (9:1) entwickelt. Hieran schloß sich die Abtrennung des Produktes an, wobei weitere 95 mg an rohem, kristallinen Komplex S-3466 erhalten wurden.

Beispiel 3

Es wurde 1 I eines aus 2% Glucose, 2* Sojabohnenmchl, 0,5% Maiswasser, 0,025% Dlkaliumhydrogenphosphat, 0,05% Magnesiumsulfat und 0,2% Glycerin (Rest is Wasser) bestehenden Mediums in Teilen von 100 cm' In zehn 500 cm' Sakuguchi-Kolben eingegeben. Nachdem die Kolben in üblicher Weise sterilisiert worden waren, wurden sie mit einer Impfprobe des Sireptomyces aureus ATCC 21428 geimpft, die sodann bei 27° C 72 Stunden unter Schütteln kultiviert wurde. Die Ferraentatlonsbrühe wurde in einen 3-1-Erlenmeyer-Kolben eingebracht, auf einen pH-Wert von ca. 3,0 durch Zugabe von Schwefelsäure eingestellt und auf 80° C erwärmt. Diese Temperatur blieb eine Stunde aufrechterhalten. Nach einem Abkühlenlassen wurde die Fermentationsbrühe zur Gewinnung des Mycels gefiltert, welches sodann mit 1 I Methanol unter Rückflußerhitzen extrahiert wurde. Das Extrakt wurde sodann unter reduziertem Druck zur Entfernung von Methanol destilliert und der Rückstand zweimal mit 500 cm^J η-Hexan extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden getrocknet, zu 100 cm^J konzentriert und stehen gelassen, wobei sich 4,2 g rohe Kristalle des Antibiotikumkomplexes S-3466 ergaben.

Es wurden 2,0 g der rohen Kristalle des erhaltenen S-3466 in einer kleinen Menge Ethylacetat gelöst und die Lösung der Säulenchromatographie unterzogen, wobei 400 g Silicagel (Teilchendurchmesser weniger als 0,08 mm) und als Lösungsmittel Ethylacetat benutzt wurden. Es ergaben sich 1.5 I des Komplexes S-3466.

Hierzu 24 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikumkomplexes S-3466, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) Streptomyces aureus ATCC 21428 aerob kultiviert,

b) den pH-Wert der Fermentatlonsbrühe mit einer Mineralsäure oder einer organischen Säure auf 3 einstellt und die Fermentatlonsbrühe auf 80° C während ein bis drei Stunden erwärmt,

c) das Mycel durch Filtrieren der Fermentatlonsbrühe gewinnt,

d) das Mycel mit Methanol und/oder Aceton extrahiert und den Extrakt konzentriert,

e) das Konzentrat mit η-Hexan und/oder Ethylacetat extrahiert;

den Is jtufe e) erhaltenen Extrakt konzentriert und,

g) wenn in der Stufe 0 der Komplex als Ölige Substanz anfällt, eine Kristallisation durchführt.

2. Anllbiotlkumkomplex S-3466, erhältlich durch die Maßnahmen des Anspruchs I und mit folgenden Eigenschaften:

a) farblose oder leicht gelbe prismatische Kristalle,

b) Schmelzen bei 72 bis 75° C, wenn er aus n-Hexan umkristallisiert wurde,

c) löslich In rj-Hexan, Benzol, Chloroform, Diethylether, Aceton, Ethylacetat. Petrolether und Alkoholen,

d) unlöslich in V/asser,

e) 66,07% C und 9,07% H; Halogene, Stickstoff und Schwefel nicht nachweisbar,

f) negativ bei folgenden Reaktionen: Fehllng, ToI-lens, Carbazol, Elson-Morgan und Nlnhydrln,

g) gelöst in Methanol, Im UV-Spektrum Im Bereich von 200 bis 400 nm keine Absorptlonsmaxlma,

h) Im IR-Spektrum charakteristische Banden bei 2960, 2920. 2860, 1733, 1460, 1381, 1334, 127*, 1195, 1171, 1122, 1092, 1063 und 950 cm"¹, gemessen an einem Flüssigkeltsfllm,

I) Im Massenspektrum den MolekQlpeak bei m/e 792 und

j) im NMP.-Spektrum, In CDCI gemessen. Signale bei 9,12 r (Triplett), 8,81 r (Duplett) und 8.73 r (Duplelt).

die geringere Mengen dieser Antibiotlca enthalten, können sie durch Extraktion mit Ethylacetat oder Methylenchlorid gewonnen werden. Während das Nonactin oft schon aus den Rohextrakten auskristallisiert. Ist die Reindarstellung seiner Homologe, die sich In den Mutterlaugen vorfinden, schwierig. Hierfür Ist die Säulenchromatographie an der 300fachen Menge Kieselgel oder eine mehrfache Craig-Verteilung zwischen Petrolether und 85%igem wäßrigem Methanol in Kombination mit

to der Chromatographie an Kieselgel eingesetzt worden.

Es ist ebenfalls entnehmbar, daß die Makrotetrollde Antiblotica von recht breitem Wirkungsspektrum sind, an denen hohe Aktivitäten gegen Gram-positive und säurefeste Bakterien sowie Pilze beobachtet wurden. Eine -hohe cytostatlsche Wirksamkeit wurde auch an Zellkulturen nachgewiesen.

Ferner wird berichtet, daß toxische Erscheinungen am Menschen schon beim Arbeiten Im Laboratorium durch Kontakt mit Makrotetrolldstaub auftreten können, wobei die wesentlichen Folgen Hautausschläge und AugenentzQndungen sind.

Aufgabe der Erfindung ist es, einen Antibiotikumkomplex und ein Verfahren zu seiner Herstellung vorzusehen, der antibakterielle, Insektlcide und Insbesondere mitleide Aktivitäten bei niedriger Toxlzltät gegenüber Tieren, Menschen und Pflanzen aufweis;.

Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe ergibt sich aus den Patentansprüchen. Der erfindungsgemäß als Ausgangsmaterial benutzte Mikroorganismus *urde aus einer Erdprobe aus Tsurugashlma-cho, Irumagun, Saltama, Japan, Isoliert und gemäß »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology« 7th Edition, »The Actlnomycetes« von S. A. Waksman und anderen Veröffentlichungen betreffend die Klasslfi zierung von Actlnomycetes als ein Stamm von Strep tomyces aureus Identifiziert. Eine Kultur dieser Art wurde bei der American Type Culture Collection unter der Nr. ATCC 21428 hinterlegt. Die Eigenschaften des Mikroorganismus sind nachstehend angegeben.

I. Morphologische Eigenschaften

1. Lange und gerade oder wellenförmige Sporanglenträger, die keine Spirale bilden,

2. kugelförmige oder ovale Sporen ml> Abmessungen von 0,7 bis 0,8 χ 0,9 bis 1,4 μίτι.

II. Kultureigenschaften In verschiedenen Medien

(beobachtet nach einer zweiwöchigen Kultivierung bei 25° C. Die Farbbestimmung w^rde entsprechend »Iro no

_M Hyojun«, veröffentlicht von Nlhon Shlklsal Kenkyu-jo,

Japan, durchgeführt.)

Die Erfindung betrifft den Antibiotikumkomplex S-3466 und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Es Ist bekannt, daß viele Streptomycesstämme In der Lage sind, in Ihren Kulturmedien eine Reihe von Makrotetrollden zu synthetisieren. Über Untersuchungen der Konstitution dieser Verbindungen wird In Helvetica ChI-mlca Ada, Band 45 (1962). Selten 620 bis 630, Band 50 w (1967), Selten 1782 bis 1793, sowie Fortschritte der Chemie organischer Naturstoffe, Band 26 (1968), Selten 161 bis 189 berichtet.

Wie aus der zuletzt genannten Druckschrift hervorgeht, sind die Makrotetrollde Ilpophlle neutrale Verbin- düngen, die sich nach der Filtration der Kulturbrühen Im Fllterrückstand angereichert befinden. Sie lassen sich daraus leicht mit Aceton extrahieren. Aus den Flltraien,

1 Saccharose-Nltral-Agar-Medlum Wachstum: gering

Luft-Mycel: pulvriges und geringes Wachstum,

cremefarben

lösliches Pigment: keine Erzeugung

2 Glycerln-Calclummalat-Agar-Medlum Wachstum: gutes Wachstum, cremefarben

. Luft-Mycel: pulvrig und gelbweiß lösliches Pigment: leicht braun

3 Glucose-Asparagln-Agar-Medlum Wachstum: fahlgelb und gutes Wachstum Luft-Mycel: pulvrig und gelbweiß lösliches Pigment: leicht gelb

4 Glycerin-Asparagln-Agar-Medium Wachstum: gut

Luft-Mycel: pulvriges Wachstum, leicht gelb lösliches Pigment: leicht gelbbraun