Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, Bleomycin, in reinem oder rohem Zustand, durch Kultivieren von Microorganismen. Das Bleomycin lässt sich als Base oder Säuresalz entweder in gereinigtem oder rohem Zustand und entweder in Lösung oder in fester Form erhalten. Bleomycin verhindert das Wachstum vom Gram-negativen und -positiven Bakterien, einschliesslich säurefesten Bakterien. Es weist therapeutische Wirkung gegen experimentelle Infektion bei Mäusen mit pathogenen Bakterien und gegen experimentelle tierische Tumore auf. Auf Grund bisheriger Untersuchungen verspricht es nützlich zu sein, für die Therapie gegen bakterielle Infektion und insbesondere gegen Krebs bei Mensch und Tieren.
Ausserdem verhindert es das Wachstum von pflanzenpathogenen Organismen, und es wird erwartet, dass es wirksam ist für die Verhütung von Erkrankungen der Reis-, Erbs-, Weizen- und anderen Pflanzen.
Das erfindungsgemäss erhaltene Antibiotikum ist ein Bleomycin A oder Bleomycin B oder eines ihrer Säureadditionssalze, wobei jedes dieser Bleomycine eine Substanz darstellt, welche in Wasser und Methanol löslich ist und praktisch unlöslich in Äthanol, Butanol, Aceton, Äthylacetat, Äther, Chloroform und Benzol, welche mit Säuren Salze bildet, in der Ultraviolettabsorption maxima bei 244zu und 295mm aufweist, eine positive Pauly-, Ehrlich-, Dragendorfund eine negative Fehling-, Tollens-, Anthron- und Ferrichloridreaktion aufweist, während Bleomycin Al, A2, A3, B1, B2, B3, B4 und B5 eine negative Ninhydrinreaktion ergeben und A4, A5 und A6 eine positive Ninhydrinreaktion aufweisen, alle Bleomycine A, d. h.
Al, A2, A3, A4, A5 und A6 eine negative Sakaguchi Reaktion und alle Bleomycine B, d. h. B1, B2, B3, B4, B5 eine positive Sakaguchi-Reaktion ergeben, und jede dieser Substanzen Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel, mit oder ohne Kupfer enthält.
In den beiliegenden Figuren zeigt
Fig. 1 das Ultraviolettspektrum von Bleomycin A und Bleomycin B,
Fig. 2 das Infrarotspektrum von Bleomycin A und Bleomycin B,
Fig. 3 das Ultraviolettspektrum von Bleomycin Cu-At2, Bleomycin Cu-At5 und Bleomycin Cu-Bt2,
Fig. 4 das Infrarotspektrum von Bleomycin Cu-Aatl, Bleomycin Cu-At5 und Bleomycin Cu-Bt±.
Wie später beschrieben, zeigte die weitere Reinigung, dass Bleomycin A in Al, A2, A3, A4, A5, und A6 aufgeteilt werden kann, von welchen im allgemeinen A2 und A5 die Hauptkomponenten darstellten, und das Bleomycin B in B1, B2, B3, B4 und B5 aufgeteilt werden konnten, von welchen B2 und B4 die Hauptkomponenten darstellten.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Bleomycin ist dadurch gekennzeichnet dass ein Bleomycin erzeugender Stamm von Streptomyces verticillus unter submersen aeroben Bedingungen in einer wässrigen Kohlehydratlösung, welche ein stickstoffhaltiges Nährmittel enthält, kultiviert wird, bis eine beträchtliche Menge des Antibiotikums im genannten Medium erzeugt ist.
Bleomycin wurde nach systematischer Forschung von Antibiotica entdeckt und ein Bleomycin erzeugender Organismus aus einer Erdprobe isoliert, welche bei den Kohlenminen in Kaho-Gun, Fukuoka-Prefektur gewonnen wurde. Das Bleomycin produzierende Isolat wurde mit B80-Z2 bezeichnet und bei der Division of Mycology, Department of Antibiotics, National Institute of Health, Japan, unter der Nummer NIHJ 424 deponiert. Dieser Stamm wurde in der American Type Culture Collection unter der ATCC Nummer 15003 deponiert.
Dieser Stamm (BS0-Z2) besitzt folgende Charakteristiken:
1. Mikroskopische Charakteristiken
Das Luftmycelium wird aus fein verzweigtem vegetativem Mycelium entwickelt. Das Luftmycelium bildet Wirbel. Im allgemeinen ist die Photographie von Spo ren auf Wirbeln mittels eines Elektronenmikroskops schwer. Bei diesem Stamm soll die Sporenoberfläche jedoch glatt sein.
2. Kulturcharakteristiken auf verschiedenen Medien
1. Auf Czapek-Dox-Agarplatte, bei 270 C inkubiert: schwach gelblichbraunes Wachstum mit guter Bildung von weissem Luftmycelium. Schwach bräunlichgelbes, lösliches Pigment.
2. Auf Krainsky-Glucose-asparagin-agarplatte, bei 270 C inkubiert: Das Wachstum ist hellbraun mit gelblichem Stich. Gute Bildung von Luftmycelium, gefärbt mit einem schwachen, dumpfen Grünlichgrau. Kein lösliches Pigment.
3. Auf Stärkeagarplatte bei 27 C inkubiert: Das Wachstum ist gelblich. Das Luftmycelium ist weiss bis gräulichweiss. Leicht bräunliches, lösliches Pigment.
Keine oder schwache Hydrolyse der Stärke um das Wachstum herum.
4. Auf Caldummalatagarplatte, bei 270 C inkubiet: farbloses Wachstum mit schwachem weissem Luftmycelium. Kein lösliches Pigment.
5. In Peptonlösung enthaltend 0,2 O/o NaNO5, bei 370 C inkubiert: Hellbräunlichgelbes Wachstum auf der Flüssigkeitsoberfläche in Form eines Ringes entlang dem Reagenzglas. Eine kleine Menge der Miyce- liummasse wird auch am Boden beobachtet. Weisses bis hellbräunliches oder gelblichgraues Luftmycelium auf dem Oberflächenwachstum. Kein lösliches Pigment. Durch die Stärke-Jodreaktion wird Nitrit aus Nitrat nachgewiesen.
6. Auf Bouillon-Agarschräge, bei 370 C inkubiert: farbloses bis cremefarbiges Wachstum mit gelegentlicher Bildung von weissem Luftmycelium. Kein lösliches Pigment.
7. Auf Loeffler's koagulierter Serumschräge, inkubiert bei 37 C: farbloses bis cremefarbiges Wachstum mit schwachem weissem Luftmycelium. Kein lösliches Pigment und keine Verflüssigung des koagulierten Serums.
8. Auf Blutagarplatte, inkubiert bei 37 C: rötlichbraunes Wachstum mit weissem Luftmycelium. Kein lösliches Pigment und keine Hämolyse.
9. Auf Gelatinestich (stab.), inkubiert bei 18-20 C: farbloses bis hellbräunliches Wachstum. Weisses Luftmycelium. Kein lösliches Pigment und keine Verflüssi- gung der Gelatine.
10. Auf Eimediumschräge, inkubiert bei 370 C: cremefarbiges Wachstum mit reichlichem, schneeweis- sem Luftmycelium. Kein lösliches Pigment.
11. Auf abgerahin r Milch, inkubiert bei 37 C: cremefarbiges Wachstum mit weissem Luftmycelium auf der Flüssigkeitsoberfläche entlang dem Reagenzglas. Kein lösliches Pigment. Schwache Koagulation und keine oder schwache Peptonisierung.
12. Auf Kartoffelstück, inkubiert bei 27 C: gelblichbraunes Wachstum mit pulverigem weissem bis grauem Luftmycelium mit bräunlicher Tönung. Kein lösliches Pigment.
13. Auf Karottenstück, inkubiert bei 27 C: cremefarbiges Wachstum mit bräunlicher Tönung. Weisses, schneeiges Luftmycelium. Kein lösliches Pigment.
14. Verwendung von Kohlehydrat für das Wachstum auf Czapek's Grundagarmedium. Dextrin, Glycerin, Stärke, Glucose und Maltose werden für ein gutes Wachstum verwendet. Fructose, Inosit und Mannose ergeben verschiedene Resultate, kein oder schwache Wachstum ergaben Arabinose, Galactose, Inulin, Lactose, Mannit, Raffinose, Rhamnose, Salicin, Sorbit, Sorbose, Saccharose, Xylose, Natriumacetat, Natriumcitrat und Natriumsuccinat.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass der Stamm B80-Z2 zur Art Streptomyces gehört und charakterisiert ist durch die Bildung von wirbelförmigem, helibräunlichgelbem Wachstum, weiss bis gräulichem Luftmycelium, kein chromogener Typ, keine oder schwache Hydrolyse von Stärke und proteolytische Wirkung.
Unter den bekannten Arten von Streptomyces sind Streptomyces verticillus, Streptomyces cinnamoneus und Streptomyces flavopersicus als wirbelbildende und nicht chromogene Typen bekannt. In der folgenden Tabelle werden die Stämme B80-Z2 und die bekannten Arten miteinander verglichen.
Eigenschaften B8SZ2 Streptomyces Streptomyces Streptomyces Stämme verticillus cinnamoneus flavopersicus Wirbel + + + + Spirale chromogenität - Hydrolyse von Stärke + + ++ ? Nitratreduktion + - - + Proteolyse + + + ++ Farbe des Luft- grau mit Olivetönung Grauoliv mit zimtfarben hellgelblich mit myceliums auf rötlicher Tönung rötlicher Tönung synth.
Medium Eigenschaften B80-Z2 Streptomyces Streptomyces Streptomyces Stämme verticillus cinnamoneus flavopersicus Farbe des farblos, cremefarbig cremefarbig gelblich Wachstums gelblich bis braun erzeugtes Bleomycin Phleomycin Cinnamycin Acinospectacin Antibioticum Duramycin
Heptaene
Wie in der obigen Tabelle gezeigt, gleichen sich die verschiedenen Stämme mit Ausnahme kleiner Unterschiede. Unter den obigen Arten gleicht der Stamm B80-Z2 am meisten S. verticillus, während S. cinnamoneus ein zimtfarbenes Luftmycelium, starke Hydrolyse von Stärke und starke proteolytische Wirkung aufweist, was bei Stamm B80-Z2 nicht der Fall ist. S. flavopersicus bildet hellgelbliches Luftmycelium auf synthetischem Agar und zeigte wesentliche proteolytische Wirkung in entrahmter Milch und Gelatinemedium, wodurch sich der Stamm B80-Z2 unterscheidet.
Ausserdem wächst der Stamm B80-Z2 sehr gut in einem aus Stärke als Kohlenstoffquelle und Sojabohnenmehl als Stickstoffquelle dienenden Medium, und es ist anzunehmen, dass die Hydrolyse von Stärke und die Proteolyse je nach den Kulturbedingungen variiert werden können. Die Unterschiede zwischen dem Stamm B80 Z2 und S. verticillus in bezug auf die Stärkehydrolyse und die proteolytische Wirkung kann daher nicht als wesentlich bezeichnet werden. S. verticillus bildet im allgemeinen rötlichgraues Luftmycelium, gelegentlich jedoch olivgraues Luftmycelium, welches sehr ähnlich demjenigen des Stammes B80-Z2 ist. In anderer Beziehung, wie z. B. der Nitratreduktion bestehen gewisse Unterschiede zwischen ihnen, doch ist die Mehrzahl ihrer Charakteristiken dieselbe, und es wird daher als richtig betrachtet, dass der Stamm B80-Z2 zu S. verticillus gehört.
Es ist allgemein anerkannt, dass Actinomycetes leicht Mutationen bilden. Die vorliegende Erfindung ist daher nicht auf die Erzeugung von Bleomycin mittels S. verticillus, dem Stamm B80-Z2 oder Organismen, welche der obigen Beschreibung voll entsprechen, beschärnkt. S. verticillus umfasst im vorliegenden Patent den Stamm B80-Z2 und dessen künstliche und natürliche Mutationen. In anderen Worten sind im vorliegenden Patent alle Organismen, welche Bleomycin erzeugen, in S. verticillus umfasst, mit Ausnahme derjenigen, welche sich von S. verticillus ohne jede Zweideutigkeit oder Ungewissheit unterscheiden.
Wenn S. verticillus unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird, wird Bleomycin erzeugt. Die Mycelien oder Sporen eines Bleomycin erzeugenden Organismus werden auf ein geeignetes Medium geimpft und aerobisch fermentiert unter Bildung des Bleomycin enthaltenden Kulturproduktes. Die Bleomycinerzeugung kann durch Kultivierung auf einem festen Medium durchgeführt werden, doch ist es empfehlenswert, die Kultivierung für eine Produktion in grossem Rahmen in flüssigem Medium vorzunehmen. Die Inkubationstemperatur ist bei all den Temperaturen gut, bei welchen ein Bleomycin erzeugender Stamm wachsen kann, doch wird die Fermentation vorzugsweise bei 25 bis 350 C, insbesondere bei 27 bis 32 C durchgeführt.
Das Medium für die Erzeugung von Bleomycin besteht im allgemeinen aus Stickstoffquellen, Kohlenstoffquellen, anorganischen Salzen mit oder ohne Stimulationsfaktoren und anderem. Als Kohlestoffquellen können Kohlehydrate, Fette oder Öle verwendet werden. Zum Beispiel werden Stärke, Glucose, Glycerin, Maltose, Dextrin und Saccharose sowohl gereinigt wie roh verwendet.
Als Stickstoffquellen eignen sich Sojabohnenmelil, Fleischextrakt, Distiller's soluble , Erdnussmehl, Pepton, Fischmehl, Hefeextrakt, Maiseinweichflüssigkeit, Nitrat, Ammoniumsalze, Harnstoff usw.. Falls notwendig, können anorganische Salze zugesetzt werden, z. B.
Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Phosphate usw.. Schwermetallsalze wie Kupfer, Mangan, Eisen, Zink usw. können dem Medium, falls notwendig, ebenfalls zugesetzt werden.
Alle Materialien, welche bekannt sind zur Verwendung für die Kultivierung von Actinomycetes, wie sie z. B. im kanadischen Patent 513 324, den britischen Patenten 730341, 736 325, den US-Patenten 2 691 618, 2 658 018, 2 653 899, 2 586 762, 2 516 080, 2 483 892, 2 609 329 und 2 709 672 genannt sind, eignen sich für die Erzeugung von Bleomycin.
Für die Schaumverhinderung während der Fermentierung können alle bekannten Schaumverhinderungsmittel, wie Paraffin, Fett, Sojabohnenöl, Siliconharz usw. verwendet werden. Alle anderen bekannten Methoden für die Fermentierung von Penicillin, Streptomycin oder für die Erzeugung von anderen Antibiotica können für die fermentive Erzeugung von Bleomycin angewandt werden.
Sofern nicht spezifisch erwähnt, werden folgende experimentelle Methoden in der vorliegenden Erfindung verwendet:
1. Schüttelkultur
Das Medium von 100 cc wird in einen 500 cc Sakaguchikolben gegeben und während 20 Min. bei 120"C sterilisiert. In dieses sterilisierte Medium werden Mycelium, Sporen oder deren Gemische des Bleomycin erzeugenden Stammes eingeimpft und in einer Schüttelmaschine (120 Ausschläge pro Minute mit 8 cm Amplitude) bei 27 bis 29 C kultiviert. 1 ml der Kulturflüssigkeit des zweiten Tages wird als Inokulum in 100 cm3 eines Mediums in einem 500 cm3-Kolben eingeimpft und kultiviert.
2. Tankkultur a) Kultur in einem Topffermentator: Ein 30 Liter Topffermentator aus rostfreiem Stahl wurde mit 10 Litern eines Mediums beschickt und während 30 Minuten bei 1200 C sterilisiert. Die Fermentierung wurde unter Belüftung mit 10 Litern Luft pro Minute und unter Rühren mit 500 U/Min. durchgeführt. Die Temperatur wurde auf 27 bis 290 C gehalten und Sojabohnenöl oder Siliconharz als Schaumverhütungsmittel verwendet. b) Kultur in einem rostfreien Stahltank von 400 l: Ein Tank wurde mit 180 1 eines Mediums beschickt und während 30 Min. bei 1200 C sterilisiert. Die Belüftung erfolgte mit 200 1 Luft/Min. und das Rühren mit 200 U/Min. Die Temperatur wurde bei 27 bis 290 C gehalten. Sojabohnenöl oder Siliconharz wurden als Antischaummittel verwendet.
3. Nachweis von Bleomycin
Mycobacterium phlei NIHJ wurde als Testorganismus verwendet und die Zylinderplattenmethode angewandt. Mycobacterium phlei wurde in einer Schüttelkultur in Glycerinbouillon bei 27 bis 290 C während einer Woche kultiviert und als Testorganismus verwendet. Das Medium für die Zylinderplattenmethode bestand aus 1,0 % Glycerin, 1,0 % Fleischextrakt, 1,0 /o Pepton, 01,20/0 NaCl und 2,00/0 Agar. 5 ml einer 1,5 0/o-igen Malachitlösung wurde zu 1000 ml des Mediums zugesetzt. Das pH wurde auf 7,0 eingestellt.
Nach der Sterilisierung bei 1200 C während 20 Minuten wurden 95 cm3 dieses Mediums 5 cm3 M. phlei Kultur zugesetzt und als Impfschicht verwendet. Die anderen Verfahrensschritte waren dieselben wie die in der Zylinderplattenmethode für Penicillin angewandten.
Eine Menge Bleomycin, welche aus dem Kulturfiltrat durch Ionenaustausch extrahiert und anschliessend auf Sephadex chromatographiert wurde, wurde als Standard bezeichnet. Die Aktivität wurde durch das Gewicht des Standards ausgedrückt.
Der Bleomycin erzeugende Stamm wurde zuerst in Schüttelkultur im folgenden Medium erzeugt. Das Medium bestand aus 1,0 % Glucose, 1,0 % Stärke, 0,75 0/o Fleischextrakt, 0,75 0/o Pepton und 0,3 0/o Natriumchlorid. Das ursprüngliche pH wurde auf 7,0 eingestellt. Eine 4-tägige Kultur wies ein pH der Kulturflüssigkeit von 7,3 auf. Diese Kulturflüssigkeit wies eine Inhibitionszone von 30 mm in der Zylinderplattenmethode auf.
Das erzeugte Bleomycin wurde in einem aus verschiedenen Arten von Kohlenstoff-und Stickstoffquellen bestehenden Medium in der Schüttelkultur geprüft.
Die Ergebnisse der Erzeugung von Bleomycin und das pH der Kulturflüssigkeit sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
1) Test von Kohlenstoffquellen
Grundmedium bestehend aus 0,75 % Fleischextrakt, 0,75 % Pepton, 0, 3 % NaCl.
Tage Med. Kohlenstoffquellen 2. Tag 3. Tag 4. Tag 5. Tag Nr. pH mcg/ml pH mcg/ml pH mcg/ml pH mcg/ml 1 1 % Glucose 7.8 0.25 6.2 0. 37 7.4 0.36 7.8 0. 38
1% Stärke 2 2% Glucose 7.0 0.29 6.8 0. 34 7.4 0. 38 7.6 0.37 3 2 % Stärke 5.4 0.07 5.4 0.10 7.0 0. 36 7.6 0.47 4 2% Lactose 8.2 0.27 8.0 0.25 8.6 0.32 8.8 0.11 5 2% Saccharose 8.0 0.32 8.2 0.17 8.2 0.
17 8.2 0.14 6 2% Maltose 8.2 0.26 6.6 0.10 4.8 0.37 5.0 0.37 7 2% Dextrin 5.8 0.05 6.6 0.35 7.2 0.44 7.6 0.38 8 2% Glycerin 6.8 0 6.4 0 6.2 0.07 6.4 0.18
2) Test von Stickstoffquellen
Grundmedium bestehend aus 1 % Glucose, 1 % Stärke und 0,3 % NaCI.
Medium Nr. 7 enthielt 2,0% Stärke
Tage
Med. Stickstoffquellen 2. Tag 3. Tag 4. Tag 5. Tag 6. Tag Nr. und Salze pH mcg/ml pH mcg/ml pH mcg/ml pH mcg/ml pH mcg/ml
1 0,75% Fleisch- 6.4 0.27 7.0 1,23 7.2 1.41 7.4 0.5 0.8 0.24 extrakt
0,75% Pepton 2 1,5 % Sojabohnen-6,4 0 6.4 0.06 6.6 0.41 7.0 1.40 7.8 0.90 mehl
0,1 % K2HPO4
0,05 % MgSO4 3 1 % Sojabohnen-6.8 0.03 7.2 0.06 7.0 0.38 7.4 0.45 8.6 0.29 mehl
0,1 % K2HPO4
0,05 % MgSO4
0,5 % Maisein weichflüss, 4 0,75 % Fleisch- 7.2 0.25 7.6 1.35 7.6 1.00 8.2 0.43 8.2 0.39 extrakt
0,75 % Pepton
0,3 % Hefe 5 2 % Maisein- 6.8 0 6.8 0.06 6.8 0,.22 6.8 0.06 7.2 0.06 weichflüss.
6 1,5 % Sojabohnen-6.6 0 6.6 0. 13 6.4 0.31 7.2 1.19 8.2 0.20 mehl
0,3 % Hefe 7 0,75 % Fleisch- 7.0 0.09 6.6 0.79 7.2 1.17 7.4 1.47 8.0 1.44 extrakt
0,755 Pepton
Die obigen Resultate sind Beispiele von Testversuchen. Stärke, Dextrin, Glucose, Lactose und Maltose sind Beispiele von Kohlenstoffquellen, welche für die Erzeugung von Bleomycin verwendet werden können.
Sojabohnenmehl, Fleischextrakt, Pepton und Hefe sind Beispiele von Stickstoffquellen, welche für die Erzeugung von Bleomycin geeignet sind.
Ein Medium bestehend aus 2,5 % Stärke, 0,5 /o Glucose, 3,5% Sojabohnenmehl, 0,1 % K2HPO4, 0,05 % Zinksulfat und 0,01 % CuSO4 . H2O (pH 7,0) ist ein Beispiel eines für die Erzeugung von Bleomycin verwendbaren Mediums.
Ein Stamm, welcher aus der ursprünglichen Kultur des Stammes Nr. B80-Z2 durch Einzelkolonieselektion ausgewählt worden war, wurde in Schüttelkultur im obigen Medium gezüchtet und ergab 100 mcg/ml Bleomycin nach 7 bis 10-tägiger Schüttelkultur. Bei der maximalen Produktion betrug das pH der Kulturflüssigkeit 8,0 bis 8,2. Es ist allgemein bekannt, dass Zusammensetzungen von Medien mit hohen Ausbeuten für die Erzeugung eines Antibioticums variieren je nach den Stämmen, selbst wenn sie von demselben ursprünglichen Stamm abgeleitet sind. Dasselbe scheint im Fall der Bleomycin erzeugenden Stämme vorzuliegen.
Die für die Bleomycinerzeugung geeigneten Zusammensetzungen des Mediums müssen variiert werden je nach den Stämmen, die durch Monosporen-Selektion oder durch Behandlung mit Ultraviolettbestrahlung o. dgl. erhalten werden. Eine hohe Ausbeute an Bleomycin kann mit bekannten Verfahren erhalten werden, z. B. durch Verbesserung des Stammes durch Monosporen Selektion, die Behandlung mit Ultraviolettlicht, X-Strahlen oder anderen Mutagenen und durch Selektion der für die Bleomycinproduktion mit jedem verbesserten Stamm geeigneten Medien.
Bleomycin findet sich hauptsächlich im flüssigen Teil der Fermentierbrühe. Der Bleomycin enthaltende flüssige Teil kann von der festen Masse der Kulturbrühe auf bekannte Weise abgetrennt werden, z. B. durch Filtration oder Zentrifugation. Wie später beschrieben, kann Bleomycin an ein Ionenaustauschharz absorbiert werden, vorteilhafterweise nach Entfernung der festen Masse aus der Kulturbrühe. Die Ionenaustauschmethode kann jedoch auch zur Adsorption des Bleomycins direkt aus der Kulturbrühe nach Entfernung der grossen Partikel durch ein geeignetes Sieb verwendet werden. Bleomycin ist in der Kulturbrühe oder im Filtrat stabil genug für die Verdampfung im Vakuum oder die Sprühtrocknung. Das getrocknete Material, welches auf diese Weise erhalten wird, kann für landwirtschaftliche Zwecke verwendet werden.
Bleomycin wird praktisch nicht aus wässriger Lösung in Lösungsmittel wie Butanol, Äthylacetat, Äther oder Benzol übertragen. Die Lösungsmittelextraktion kann daher, falls notwendig, zur Eliminierung gewisser Verunreinigungen verwendet werden.
Die wässrige, Bleomycin enthaltende Lösung kann durch Destillation im Vakuum konzentriert und anschliessend getrocknet werden. Während diesem Ver fahrensschritt ist es empfehlenswert, das pH bei 6 bis 7 zu halten, da Bleomycin in diesem pH-Bereich am stabilsten ist. Das Waschen des getrockneten Materials mit Lösungsmittel, wie Aceton, Butanol, Äthanol, oder Äthylacetat, in welchen Bleomycin praktisch unlöslich ist, ist nützlich, um Verunreinigungen, die in den verwendeten Lösungsmitteln löslich sind, zu entfernen.
Das im getrockneten Material befindliche Bleomycin kann in Wasser oder Methanol gelöst werden. In Wasser oder Methanol gelöstes Bleomycin kann mit Lösungsmitteln, in welchen Bleomycin unlöslich ist und welche mit Wasser oder Methanol mischbar sind, ausgefällt werden.
Bleomycin kann in wässriger Lösung oder in der Kulturbrühe an Aktivkohle adsorbiert und von der Kohle im sauren Bereich, z. B. mittels wässrigem Methanol, wässrigem Äthanol, wässrigem Aceton oder mit wassergesättigtem Butanol eluiert werden. Die Ausbeute an Bleomycin bei diesem Verfahren ist üblicherweise geringer als diejenige, welche durch ein Ionenaustauschverfahren erhalten werden kann, das weiter unten näher beschrieben wird.
Bleomycin ist basisch und wasserlöslich, so dass ein Ionenaustauschharzverfahren für die Extraktion und die Reinigung von Bleomycin unter Erzielung hoher Ausbeuten verwendet werden kann. Ionenaustauschharze, welche Carboxyl-oder Phenolreste aufweisen, sind im Stande, Bleomycin infolge seiner basischen Natur und infolge der Van-der-Waalschen Kräfte zu adsorbieren. Kationenaustauschharze vom Carboxyltypus und Carboxymethylcellulose bilden geeignete Adsorbenten für die Extraktion und Reinigung von Bleomycin. Beispielsweise wird Bleomycin an ein Kationenaustauschharz aus Amberite IRC-50 (Markenprodukt) adsorbiert. Die Verwendung dieses Harzes in H-Form ist empfehlenswerter als in Na-Form.
Dieses Harz kann in eine Kolonne gegeben und in die H-Form übergeführt werden und vorzugsweise wie folgt verwendet werden: Die wässrige Lösung, welche Bleomycin enthält, z. B. das auf ein pH von 4 bis 6,5 eingestellte Kulturfiltrat wird durch die Kolonne abgeleitet.
Anschliessend wird die Kolonne mit Wasser gewaschen.
Die Eluierung erfolgt mittels verdünnter Salzsäure. Das derart erhaltene Eluat von Bleomycin wird auf pH 5 bis 7 gebracht und lyophilisiert oder im Vakuum getrocknet. Das im Eluat befindliche Bleomycin kann durch Zusatz von Lösungsmitteln, z. B. Aceton in 10facher Volumenmenge, in welchen Bleomycin unlöslich ist, ausgefällt, und der Niederschlag getrocknet werden.
Bleomycin im trockenen Pulver ist in Methanol löslich. Aus der Methanollösung kann Bleomycin durch Zusatz von Aceton, Äther usw. ausgefällt werden. Das Waschen des Bleomycin enthaltenden Pulvers mit Methanol ist nützlich, um Verunreinigungen zu entfernen.
Auf Grund der Molekulargrösse von Bleomycin können Verfahren zur Trennung von Substanzen auf Grund ihrer Molekulargrössen, wie z. B. unter Verwendung von Sephadex zur Reinigung von Bleomycin Verwendung finden. Eine wässrige Bleomycinlösung wird z. B. auf eine Sephadex -G-25-Kolonne verbracht und das aktive Eluat im Vakuum konzentriert oder lyophilisiert. Auf diese Weise kann Bleomycin gereinigt werden. Mit Hilfe der Sephadex -Kolon- nenchromatographie konnte Bleomycin in Bleomycin A mit einem Rf-Wert von 0,94 bis 0,88 und Bleomycin B mit einem Rf-Wert von 0,70 bis 0,66 getrennt werden. Dieser Rf-Wert wurde durch Papierchromatographie unter Verwendung von 10 O/o-igem Ammoniumchlorid festgestellt.
Ausser dieser beiden Hauptkomponenten des Bleomycins konnten 2 oder 3 weitere antibakteriell wirkende Substanzen in sehr kleinen Mengen nachgewiesen werden. Das derart erhaltene gereinigte Bleomycin A und B ist weiss oder weiss mit hellgrüner bis bläulicher Färbung.
Bei der papierchromatographischen Untersuchung unter Verwendung von 10 O/o-igem Ammoniumchlorid ergab die Kulturbrühe und der unter Verwendung von Amberite IRC-50 aus der Kulturbrühe erhaltene Extrakt im allgemeinen 2 grosse Flecken und 2 bis 3 kleine Flecken, welche antibakterielle Wirksamkeit gegen Mycobacterium phlei aufwiesen. Als Bleomycin wird im vorliegenden Patent jede Substanz bezeichnet, welche 2 Hauptflecken aufweist oder Gemische solcher Substanzen. Mit anderen Worten, das Gemisch dieser beiden Hauptsubstanzen oder jede dieser Substanzen wird Bleomycin genannt, sofern nichts anderes vermerkt ist. Von diesen Substanzen wird die Substanz mit Rf 0,94 bis 0,88 als Bleomycin A und diejenige mit Rf 0,70 bis 0,66 als Bleomycin B bezeichnet.
Mit Ausnahme der Unterschiede in den Rf-Werten sind Bleomycin A und B einander sehr ähnlich.
Die Eigenschaften von Bleomycin sind die folgenden: Bleomycin ist ein hellgriinliches oder bläulichweisses Pulver. Ein scharfer Schmelzpunkt kann nicht beobachtet werden, doch zersetzt sich das getrennte Pulver von Bleomycin A und Bleomycin B über 196 C.
Bleomycin und sein Hydroclorid sind wasserlöslich, löslich in Methanol, etwas löslich in Äthanol und schwer löslich in Aceton, Äthylacetat, Butylacetat, Äther.
Bleomycin wird an Kationenaustauschharze adsorbiert und mit wässrigen anorganischen Säuren eluiert.
Die Absorptionsspektra von Bleomycin A und B sind in Fig. 1 dargestellt, wobei die Absorption bei 243 bis 244 m und ein Maximum bei 290 bis 295 m angegeben sind.
Das Infrarotspektrum von Bleomycin A und B in KBr-Tabletten sind in Fig. 2 dargestellt, wobei maximale Absorption bei Wellenzahlen (cm-t von 3380W 3220, 2940, 1715 (sh), 1650, 1635-1605, 1560-1540, 1510, 1450-1440, 1380-1365, 1250, 1090-1045 und 1010 (sh), dargestellt sind.
Bleomycin ergibt positive Pauly-, Ehrlich-, Dragendorf- und Permanganatreaktionen, jedoch negative Molish-, Biuret-, Elson-Morgan- und Maltolreaktionen.
Wie weiter unten beschrieben, kann Bleomycin A weiter in 6 Komponenten getrennt werden, welche alle eine negative Sakaguchi-Reaktion ergeben. Bleomycin Al, A2 und A3 ergeben negative Ninhydrinreaktion und A4, A5 und A6 ergeben positive Ninhydrinreaktion.
Bleomycin B kann in 5 Komponenten getrennt werden, welche alle nagative Ninhydrin- und positive Sakaguchireaktionen ergeben. So ergeben Bleomycin, Bleomycin A und B positive oder negative Ninhydrin- und Sakaguchireaktionen je nach der Menge der einzelnen Komponenten.
Bei dem mit 10 % Ammoniumchlorid entwickelten Papierchromatogramm erscheint Bleomycin A bei Rf 0,94 bis 0,88 und Bleomycin B bei Rf 0,70 bis 0,66 Auf dem Papierchromatogramm, welches mit n-Propanol: Pyridin:Essigsäure:Wasser (15:10:3:12) entwickelt wurde, befindet sich Bleomycin A bei Rf 0,50-0,42 und Bleomycin B bei Rf 0,57-0,54. Auf einem Papierchromatogramm. welches unter Verwendung von mit Wasser gesättigtem n-Butanol mit einem Gehalt von 2 % p-Toluolsulfonsäure erhalten wurde, wandern sowohl Bleomycin A wie B nicht von Rf 0 selbst nach 72-stündiger Entwicklung.
Die wässrige Lösung von Bleomycin absorbiert die D-Linie, und es ist schwer, seine optische Drehung zu bestimmen.
Da Bleomycin nicht in Kristallform erhalten werden konnte, ist es schwierig, seine molekulare Formel zu bestimmen, bevor die Struktur bestimmt worden ist.
Ebenso ist es schwierig, die vollständige Reinigung von Bleomycin A und B zu erzielen. Ein H
Minimale hemmende
Konzentration (mcg/cc) Organismus Bleo- Bleo mycin A mycin B Salmonella paratyphi 1.6-0.8 1.6
A1015 Salmonella paratyphi 1.6-0.8 3.125-1.6
B 8006 Salmonella paratyphi C 0.8 0.2
Hirschfeld S-33 Salmonella cholerac suis 0.84).4 0.4-0.2
1348 Shigella dysenteriae 0.2 0.4-0.2
2-1684 Shigella dysenteriae 50-25 12.5
Ohara Shigella flexneri 1a-1701 0.2 0.4-0.2 Shigella boydii 1-65 1.64)
8 8 0.80.4 Shigella sonnei 1-1196 1.60.8 0.4 Proteus vulgaris OX-19 0.4 0.2 Pseudomonas pyogenes A3 > 100 > 100 Corynebacterium xerosis 0.1-0.05 0.2-0.1 Mycobacterium phlei 0.0004- 0.0004 0.0002 0.0002 Mycobacterium 607 0.
2 0.4 Mycobacterium 0.1-0.05 0.1 (Streptomycin-fest) Mycobacterium 0.1-0.05 0.2-0.1 (Kanamycin-fest) Cladosporium 50 100 sphaersperum Colletrichum phonmides 25 50 Corticium centrifugus 1.6 3.2 Fusarium lini 25 > 100 Fusarium oxysporum 50 > 100 Fusarium roseum 1.6 6.2 Gibberellafujikuroi > 100 > 100 Gibberella saubinetii > 100 > 100 Gloeosporium kaki 0.8 1.6 Glomerella laginarium 1.6 6.2 Helminthosporium seanum 0.4 0.8 Oiricularia grisea 50 100 Piricularia oryzae > 100 > 100 Selerotium roefsii 0.2 1.8 Pseudomonas
solanacearum 100 > 100 Xanthomanas oryzae 0,4 0.8 Aspergillus niger > 100 > 100 Candida albicans 3417 > 100 > 100 Candida albicans > 100 > 100
YU-1200 Cryptococcus 6.2 100 neoformans 7496 Histoplasma capsulatum 0.4 1.6
4206 Trichophyton > 100 > 100 mentagrophytes 640 Botritis bassiana > 100 > 100 Saccharomyces 25 100 cervisiae 11299 Saccharomyces 12.5 25 cervisiae, petit.
Die Toxität von Bleomycin war niedrig und die intravenöse Injektion von 8 mg/Maus erzeugte keinen Todesfall.
Bleomycin hemmte experimentelle tierische Tumore wie z. B. Sarcoma 180, Ehrlich-Tumor bei Mäusen bei einer täglichen Injektion von 25 mcg/Maus während 10 Tagen. HeLa-Zellen in Gewebekulturen wurden bei 25 bis 12,5 mcg/cm3 gehemmt, während Yoshide-Sarcoma-Zellen in Gewebekultur bei 10 mcg/ cm3 nicht gehemmt wurden. Bleomycin A wies eine stärkere Aktivität als Bleomycin B gegen Ehrlich-Carcinom und Sarcoma-180 auf.
Um zu bestätigen, dass Bleomycin eine neue Substanz ist, kann Bleomycin mit bekannten Antibiotika wie folgt verglichen werden: Von den bekannten Antibiotika, welche Gram-positive und Gram-negative Bakterien hindern, unterscheiden sich Streptomycin, Kanamycin und Paromomycin leicht von Bleomycin in bezug auf die Papierchromatographie unter Verwendung von mit Wasser gesättigtem Butanol, welches p-Toluolsulfonsäure enthält, Hemmung ihrer resistenten Organismen, das antibakterielle Spektrum und die Antitumoraktivität. Da Bleomycin durch einen wirbelbildenden Streptomyces erzeugt wird, ist es von Interesse, Bleomycin mit Actinospectacin oder Phleomycin zu vergleichen, welche ebenfalls durch wirbelbildende Streptomycetes erzeugt werden.
Actinospectacin unterscheidet sich durch die Tatsache, dass Actinospectacin Staphylococci bei 10 bis 100 mcg/cc hemmt und gegen Sarcoma 180 bei Mäusen nicht hemmend wirkt.
Phleomycin weist hemmende Aktivität gegen Gram-positive und Gram-negative Bakterien, Ehrlich Carcinom und Sarcoma 180 bei Mäusen auf, und der Phleomycin erzeugende Stamm weist zahlreiche gemeinsame Charakteristiken mit dem Bleomycin erzeugenden Stamm auf. Es ist daher von Vorteil, Bleomycin sorgfältig mit Phleomycin zu vergleichen. Beim Vergleich ihrer antibakteriellen Wirksamkeiten ergaben sich die folgenden wesentlichen Unterschiede:
Minimale hemmende Konzentration mcg/cc Test-Organismus Bleo- Bleo- Phleomycin mycin A mycin B Staphylococcus 01.8 1.6 0.025 aureus FT > A
209P Bacillus subtilis 0.025 0.1 0.0001 PCI 219 Escherichia coli 3.125-1.6 0.8-0.4 0.1 NIHW.
Klebsiella 3.i25-1.6 1. 6 0. 8 0.4 pneumoniae PCI602 Salmonella typhi 63 3.125-1.6 1.6 1.6 Mycobacterium 0.0004- 0.0004- 0.0004 phlei 0.0002 0.0002 Mycobacterium 607 0.2 0.4 0.0125 Selerotium roefsii 0.2 1.8 50
Bleomycin kann ferner auch bezüglich der Stabilität in saurem und alkalischem Zustand von Phleomycin unterschieden werden. Die wässrige Lösung von Bleomycin A und B mit 100 mcg/cc wurde auf pH 2 und 9 gebracht und bei Zimmertemperatur gehalten.
Nach dem Aufbewahren während einiger Stunden wurde ein Teil der entsprechenden Lösungen herausgenommen und ihre Aktiviät gegenüber Mycobacterium phlei gemessen. Das Resultat ist in der folgenden Tabelle dargestellt, wobei Bleomycin sich als wesentlich stabiler gegen Säure und Alkali als Phleomycin erwies.
Restaktivität (O/o) nach Lagerung währ. pH Substanzen 0 15 30 60 120 240 min. min. min. min. min. min.
Bleomycin A 100 100 87 85 59 53 2 BleomycinB 100 100 80 84 63 46
Phleomycin 89 85 53 39 21 20
Bleomycin A 100 100 74 65 48 20 9 BleomycinB 78 61 49 37 33 20 Phleomydn 8 8 8 8 2 1
Bleomycin und Phleomycin können ferner durch ein Papierchromatogramm, das mit 10 O/o Ammoniumchlorid entwickelt wurde, unterschieden werden. Bleomycin A ergibt Rf 0,94 bis 0,88, während Phleomycin 2 bis 6 Flecken bei Rf unter 0,81 aufweist.
Bleomycin B kann nicht leicht von Phleomycin mittels Papierchromatographie unterschieden werden, doch unterscheiden sie sich durch den Unterschied in den Ultraviolett absorptionsspektren Phleomycin weist 2 Absorptionsmaxima bei 244-246 und 301m auf, während Bleomycin B Absorption bei 243-244m, u und maximale Absorption bei 291-195 m aufweist, von welchen E1cm1% grösser ist als dasjenige von Phleomycin bei 301 m .
Eigenschaften von Bleomycin Bleomycin A und Bleomycin B, welche aus der Kulturbrühe durch Ionenaustauschharz und Sephadex G25-Chromatographie erhalten werden können, wurden bereits beschrieben, und sie unterscheiden das Bleomycin genügend von den bekannten Antibiotika. Die Dünnschichtchromatographie und Bleomycin unter Verwendung von Silikagel G und 10 0/o Ammoniumacetat Methanol (1:1) zeigen Al, A2, A3, A4, A5, A6 in Bleomycin A und B1, B2, B3, B4, B5 in Bleomycin B.
Bleomycin A und B weisen die Eigenschaft auf, mit Kupfer ein Chelat zu bilden und sie konnten leichter in ihren kupferhaltigen Formen gereinigt werden. Die weitere Reinigung, d. h. die Trennung der einzelnen Komponenten wurde daher in der kupferhaltigen Form vorgenommen. Die Aluminiumoxydchromatographie erwies sich jedenfalls als hilfreich für die Reinigung, und, obwohl eine Erhöhung der Toxizität durch dieses Verfahren befürchtet wurde, wurde zwecks Abklärung der physiko-chemischen Eigenschaften jeder einzelnen Komponente des Bleomycins, die Aluminiumoxydchromatographie angewandt.
Wenn Bleomycin in Methanol aufgelöst wurde und mit Aluminiumoxydchromatographie unter Verwendung von Methanol behandelt wurde, erhöhte sich die Toxizität des Bleomycins gegenüber Mäusen (3 bis 4-mal) und der therapeutische Index des derart behandelten Bleomycins wurde 3- bis 4-mal kleiner als derjenige des Bleomycins vor der Behandlung. Es ist daher anzunehmen, dass eine geringe strukturelle Veränderung während dieses Verfahrens auftritt. Aus Gründen der Bequemlichkeit wurden die mit Aluminiumoxydchromatographie behandelten Bleomycine A und B als Bleomycin At und Bt bezeichnet. Das kupferhaltige At und Bt wurden mit Cu-At und Cu-Bt bezeichnet und sie wurden durch Zusatz von Kupferchlorid erhalten.
Cu-At und Cu-Bt konnten weiter durch gradiente Säulenchromatographie unter Verwendung vom CM Sephadex C25 (Markenprodukt) und wässrigem Ammoniumformat, dessen Konzentration von 0,1 M bis 1,0M anstieg, gereinigt werden. Cu-At wurde in sechs aktive Komponenten getrennt, welche mit Cu-At1, Cu-At2, Cu-At3, Cu-At4, Cu-At5 und Cu-At6 bezeichnet wurden. Cu-Bt wurde in 5 Komponenten aufgeteilt, welche mit Cu-Btl, Cu Bt2, Cu-Bt3, Cu-Bt4 und Cu-Bt5 bezeichnet wurden.
Im allgemeinen waren Cu-At2, und Cu-At5 die Hauptkomponenten von Cu-At, und Cu-Bt2 und Cu-Bt4 die Hauptkomponenten von Cu-Bt. Die Konzentrationen von Ammoniumformat, mit welchen jede dieser Komponenten eluiert wurde, das Rf jeder Komponente bei der Papierchromatographie unter Verwendung von 10 0/o NH4C1 (PPC), die Rf-Werte bei der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silikagel G und 10 0/o Ammoniumacetat-Methanol (1:1) (TLC) und die relative Mobilität (Rm) bei der Hochspannungselektrophorese unter Verwendung von Ameisensäure-Essigsäure-Wasser (25:75:900 Volumteile, pH 1,8) unter 2000 V und 25 mA (HVE) sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt. Die Rm-Werte wurden berechnet, wobei l-Alanin als Standard (Rm 1,0) gewählt wurde.
Cu-At Konzentration und des Formiates Rf bei Rf bei Rf bei Cu-Bt in M PPC TLC HVE Cu-Atl 0.10-0.15 0. 92 0.74 0.66 Cu-Btl 0.10.15 0.71 0.75 0.58 Cu-At2 0.15-0.20 0.83 0. 40 0.79 Cu-Bt2 0.20-0.25 0.72 0. 68 0.74 Cu-At3 0.20-0.25 0.85 0.13 0.91 Cu-At4 0.30-0.35 0.85 0.49 0.92 Cu-Bt3 0.30-0.35 0.71 0.68 0.80 Cu-At5 0.35-0.40 0.86 0.51 0.84 Cu-Bt4 0. 404. 45 0. 72 0.
60 0.78 Cu-Bt5 0.550.60 0.70 0.52 0.86 Cu-At6 0.55-0.60 0.88 0.30 0.84
Bei der Papierchromatographie unter Verwendung von 10% Ammoniumchlorid wiesen alle Cu-At-Fraktionen des Bleomycins Rf-Werte von 0,83 bis 0,92 und alle Cu-Bt-Fraktionen Rf-Werte von 0,70 bis 0,72 auf.
Alle Cu-At- und Cu-Bt-Fraktionen wiesen positive Pauly-, Ehrlich-, Dragendorf-und Permanganat-Reaktionen auf. Cu-Atl, Cu-At2 und Cu-At3 ergaben negative Ninhydrinreaktion. Cu-At4, Cu-At5 und Cu-At6 ergaben positive Ninhydrinreaktion. Alle Cu-Bt-Fraktionen ergaben negative Ninhydrinreaktionen. Alle Cu-At-Fraktionen ergaben positive Sakaguchi-Reaktioneu. Alle Cu-At-und Cu-Bet-Fraktionen ergaben negative Tollens-, Ferrichlorid-, Fehling- und Molish Reaktionen. Alle Cu-At- und Cu-Bt-Fraktionen wiesen den ähnlichen Typus von Ultraviolettspektra mit Maxima bei 244 m und 295 m auf, und die Spektren von Cu-At2 und Cu-Bt2 sind in Fig. 3 dargestellt.
Die Infrarotspektren von Cu-At2 und Cu-Bt2 sind in Fig. 4 gezeigt. Die Elementaranalyse von Cu-At2 ergab folgende Resultate:
C 41,52, H 5,83, N 14,02, O 26,52, Cu 4,54, S 6,02, Cu-At und Cu-Bt konnten in die kupferfreie Form übergeführt werden durch Behandlung mit 8-Hydroxychinolin oder mit Dithizon und Säure. Der Vergleich der Antitumorwirksamkeit zeigte, dass Cu-At2 und Cu-At5 den höheren therapeutischen Index aufweisen als Cu-Bt2 und Cu-Bt4. Den höchsten therapeutischen Index wies Cu-At5 auf.
Der genauere Vergleich von Bleomycin mit Phleomycin kann durch Vergleich von jeder Komponente des Bleomycins mit jeder Komponente von Phleomycin durchgeführt werden. Ein blaues Pulver aus Phleomycin, welches 4,38 % Kupfer enthält und durch Ionenaustausch, gefolgt von Aluminiumoxydchromatographie, erhalten wurde, wurde weiter durch schrittweise Eluierung aus einer CM-Sephadex-C25 -Säule unter Verwendung von Ammoniumformiat (1% bis 5 0/o) gereinigt, d. h. mit demselben Verfahren wie bei Bleomycin verwendet. Dann wurde das Phleomycin in Phleomycin A, B, C, D1, D2, E, F, G, H, I getrennt.
Die Konzentrationen des zur Eluierung jeder einzelnen Komponente verwendeten Ammoniumformiats waren die folgenden: A und B 0,79M, C 0,16M, D1 und D2 0,24M, E 0,32M, F 0,395M, C 0,47M, H 0,63M, I 0,71 M. Alle Phleomycine unterschieden sich von allen Bleomycin-Cu-At-Fraktionen in der Papierchromatographie unter Verwendung von 10% NH4C1 und durch die Sakaguchi-Reaktion. Alle Phleomycine wiesen Rf-Werte unter 0,80 auf und ergaben eine positive Sakaguchi-Reaktion. Alle Phleomycine ausser C, D2, und F wiesen Maxima bei 244 m (E1cm1% 120-140) und 301 m (E1cm1% 40-50) auf und unterschieden sich von allen Bleomycinen Cu-At und Cu-Bt.
Phleomycin C, D2 und F wiesen Maxima bei 244 m (E1cm1% 120-145) und 295 m (E1cm1% 90-115) auf, und dieses Ultraviolettspektrum war ähnlich wie dasjenige von Cu-At und Cu-Bt des Bleomycins. Aus diesem Grunde wurden die Fraktionen C, D2 und F sorgfältig mit der Cu-Bt-Fraktion des Bleomycins verglichen. Bleomycin Cu-Bt2 und Cu-BtS unterschieden sich nicht von Phleomycin C und F. Andere unterschieden sich in der Dünnschichtchromatographie. Alle Bleomycinfraktionen ausser Cu-Bt2 und Cu-BtS unterschieden sich von allen Phleomycinfraktionen. Die Phleomycine ergaben positive Ehrlich-, Dragendorfund Sakaguchi-Reaktionen, jedoch negative Ninhydrinreaktionen.
Das Bleomycin verspricht wertvoll zu sein in der Therapie gegen Infektionskrankheiten von Menschen, Tieren oder Pflanzen und insbesondere zur Therapie bösartiger Tumore infolge seiner verhältnismässig niederen Toxizität, seiner starken antimikrobiellen Aktivität und seiner starken Antitumoraktivität.
Beispiel 1
Der Stamm B80-Z2 wurde in einer Schüttelkultur in einem Medium bestehend aus 1% Glucose, 1 0/0 Stärke, 0,750/0 Fleischextrakt, 0,75 0/o Pepton und 0,3 O/o NaC1 (ursprüngliches pH 7,0) bei 27 bis 28 C während 5 Tagen gezüchtet. Die Myceliummasse wurde von der Kulturbrühe abfiltriert, und das Filtrat von 3,4 1 enthielt 1,23 mg Bleomycin. Das Filtrat (pH 7,8) wurde auf pH 6,4 eingestellt und durch eine Säule von 300 cc IRC-50 (H-Typus) (2,8 cm Durchmesser) geführt. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 10 cc/Min.
Nach dem Durchlauf des Brühefiltrats wurde die Säule mit destilliertem Wasser gewaschen. Der Ausfluss und das Waschwasser wiesen keine Potenz auf, woraus die Adsorption des Bleomycins abgeleitet werden kann. Die Säule wurde sodann mit 0,2 NHC1 bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 cc/Min. beschickt und das Eluat in 50 cc-Portionen fraktioniert.
Die Fraktionen bis zur 12 Fraktionen wiesen ein pH von 5,4 bis 4,8 auf und enthielten kein Bleomycin. Bei der 13. Fraktion und den folgenden fiel das pH auf 2,0. Bei der 14. Fraktion fiel der pH-Wert auf unter 1.
Das Bleomycin befand sich in 450 cc der 13. bis 21. Fraktion. Diese Fraktionen wurden mit Amberite IR-4B (OH-Typus) unmittelbar nach der Eluierung neutralisiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereint und lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver wurde mit Methanol (30 cc) extrahiert und vom Rückstand abgetrennt. Der Rückstand wurde zweimal mit je 10 cc Methanol extrahiert. Diese Methanolextrakte wurden vereint und tropfenweise in 500 cc Äthyläther eingeführt. Der entstandene Niederschlag wurde durch Zentrifugierung gesammelt und im Vakuum bei Zimmertemperatur getrocknet, wobei 1,808 g eines bräunlich gefärbten Pulvers erhalten wurden. Dieses Pulver enthielt 1,2 mg Bleomycin und 1 mg dieses Pulvers enthielt 0,67 mcg Bleomycin.
Von dem erhaltenen Pulver aus Bleomycin-hydrochlorid, welches eine Aktivität von 0,67 mcg/mg aufweist, wurden 1,7 g genommen und mit 25 cc Äthanol extrahiert. Das in Äthanol unlösliche Pulver wurde in Methanol gelöst und diese Methanollösung durch eine Säule (1,3 cm Durchmesser) von 5 g Aluminiumoxyd (Qualität 1) geführt. Diese Säule wurde sodann zuerst mit Methanol, dann mit 10 o/o-igem wässrigem Methanol und schliesslich mit 20 O/o-igem wässrigem Methanol eluiert. Das Bleomycin wurde durch absolutes Methanol und 10 0/o-iges wässriges Methanol eluiert.
Dieses Bleomycin enthaltende Eluat wurde im Vakuum konzentriert und getrocknet und ergab 550 mg bräunlich gefärbtes Pulver, welches 1,7 mcg/mg Bleomycinhydrochlorid enthielt.
Beispiel 2
Je 10 Liter eines Mediums bestehend aus 3,5O/o Sojabohnenmehl, 2,5 % Stärke, 0,5 % Glucose, 0,3 % NaCl, 0,1 % K2HPO4, 0,05 % Zinksulfat und 0,01 % CuSO4 (ursprüngliches pH 7,0) wurde in zwei Topf- fermentatoren aus rostfreiem Stahl (30 1 Volumen) eingefüllt und sterilisiert. Dieses Medium wurde mit 600 cc einer zweitägigen Schüttelkulturbrühe des Stammes B80-Z2 im selben Medium geimpft. Die Fermentierung erfolgte unter Belüftung mit 10 1 Luft pro Minute und Rühren mit 500 U/Min. bei 27-29 C.
Vor Beginn der Fermentierung wurden 0,0033 O/o Silikonöl als Antischaummittel zum Medium zugesetzt und während der Fermentierung total 50 cc Sojabohnenöl zugefügt. Je 10 cc der Brühe wurden an verschiedenen Tagen der Fermentation und bei verschie denen pH entnommen und der Gehalt an Bleomycin war der folgende: Fermentor Tage
2 3 4 5 6 8 9 10 Nr. 1 pH 5.8 5.8 6.4 6.4 6.2 5.4 5.7 6.2 mcg/cc - - - - 4.5 5.8 18.2 80.0 Nr. 2 pH 5.8 5.8 5.4 5.8 5.0 5.0 5.8 6.0 mcg/cc - 4. 5 4.5 5.1 13.7 29.5
Nach 10-tägiger Fermentierung wurde die Brühe der beiden Fermentatoren gekühlt und mit HC1 auf ein pH von 4,6 gebracht.
Das Mycelium wurde durch kontinuierliches Zentrifugieren in der Kälte entfernt und durch Filterpapier filtriert, wobei ein klares Filtrat erhalten wurde. Die derart erhaltenen 11 Liter Filtrat enthielten 358,5 mg Bleomycin. Dieses Filtrat wurde durch eine Säule (5,5 cm Durchmesser) von Amberlite IRC-50 (1750 cc) geführt. Nach dem Waschen dieser Säule in destilliertem Wasser erfolgte die Eluierung mit 0,2 NHC1.
Das im Eluat befindliche Bleomycin ist aus der folgenden Tabelle ersichtlich.
Fraktion Volumen Bleomycin-Gehalt Nr. cc pH mcg/cc mg 1 580 4.8 0 0 2 1830 4.8 1. 62 2.9 3 480 2.0 145.5 69.5 4 650 1.0 387.5 252.5 5 550 1.0 62.5 24. 4 6 430 1.0 34.5 14.6
Die Fraktionen Nr. 3 bis 6 wurden vereint und mittels Amberite IR-4B (OH-Typus) neutralisiert.
Das neutrale Eluat wurde im Vakuum konzentriert.
Die konzentrierte Lösung wurde mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das derart erhaltene bräunliche Pulver wurde mit Methanol (150 cc) extrahiert. Der in Methanol unlösliche Teil (11,59 g) enthielt 57,5 mg Bleomycin (4,98 mcg/mg.) Die Methanollösung wurde destilliert und zu Pulver getrocknet. Dieses Pulver wurde mit 100 cc Äthanol extrahiert. Das in Äthanol unlösliche Pulver (4,038 g) enthielt 283 mcg Bleomycin (72,5 mcg/mg). Dieses gräuliche Pulver wurde in 5 cc destilliertem Wasser gelöst und über eine Säule von Sephadex G-25 (200 cc, 2,0 cm Durchmesser) geleitet. Anschliessend erfolgte die Eluierung mittels destilliertem Wasser. Das Eluat wurde in Frak tionen von je 5 cc aufgeteilt und jede Fraktion lyophi lisiert.
Effluat Lyophilisiert. Pulver
Bleomycingehalt Bleomycingehalt Fraktion Nr. Farbe mcg/cc mg Gewicht mg mcg/mg mg
1-10 farblos 0 0 - - 11-13 Hellbraun - - 62.3 01.24 0.15 14 Hellbraun - - - 29.5 5.6 0.17 15 Hellbraun 0.02 0.11 36. 4 3.49 0.13 16 Hellbraun 0.084 0.42 45.1 2.84 0.13 17 Hellbraun 0.184 0.92 53.0 16.50 0.88 18 Hellbraun 0.256 1.26 30.6 70.00 2.14 19 Braun 0.555 2.78 68.0 76.00 5.15 20 Braun 0.21 1.53 115.0 30.60 3.53 21 Braun 0.21 1.04 86.2 21.35 1.83 22 Grünlichbraun 12.9 64.5 160.4 275.00 44.0 23 Grün 14.0 69.
5 233.3 339.00 49.5 24 Grün 11.4 57.0 244.6 310.00 76.0 25 Grün 8.05 40.3 249.5 332.00 82.5 26 Hellgelbgrün 6.23 31.3 270.5 192.00 52.0 27 Hellgelbgrün 1.56 7.75 331.9 51.00 26.9 28 Hellgelb 0. 78 3.91 371.4 12.20 4. 60 29-32 Hellgelb 0.29 5.75 1192.5 5
Die Bleomycin enthaltenden Fraktionen wurden der Papierchromatographie unter Verwendung von Toyo -Filterpapier Nr. 51 unterworfen und mit 10 % Ammoniumchloridlösung nach der aufsteigenden Methode entwickelt. Nach 3- bis 4-stündigem Entwikkeln floss das Lösungsmittel etwa 30 cm und das Filterpapier wurde an der Luft getrocknet. Die Bioautographie des Papierchromatogramms wurde gegen Mycobacterium phlei vorgenommen.
Hierbei zeigen die Fraktionen Nr. 13 bis 15 eine geringe Hemmungszone bei Rf 0,51 bis 0,57, die Fraktionen Nr. 16 bis 23 eine grosse Inhibitionszone bei 0,94 bis 0,88 (Bleomycin A) und Nr. 24 bis 29 bei 0,70-0,66 (Bleomycin B).
In den der 30. Fraktion folgenden Fraktionen wurde eine andere Substanz festgestellt ausser Bleomycin B bei Rf 0,70-0,66, welche eine partielle Inhibition bei Rf 0,83 aufwies.
Die Fraktion Nr. 24 der obigen Sephadex G-25 -Chromatographie ergab 244,6 mg Bleomycinpulver (enthaltend 76 mg Bleomycin, 310 mcg/mg), und dieses Pulver wurde in 20 cc Methanol in der Wärme aufgelöst. Nach dem Abkühlen wurden 35,5 mg unlös liches Pulver (enthaltend 1,49 mg Bleomycin, 42 mcg/ mg) abfiltriert, und der Methanollösung 20 cc Äthanol zugesetzt, wobei ein feines Pulver ausfiel. Diese 46,9 mg Pulver (enthaltend 1,87 mg Bleomycin, 39,8 mcg/mg) wurden abfiltriert, und das Filtrat ergab bei Zusatz von 70 ml Äthanol keinen Niederschlag mehr. Diese Lösung wurde im Vakuum abdestilliert und ergab einen praktisch farblosen Niederschlag von Bleomycin.
Nach Konzentrieren auf 20 cc Volumen wurde die Lösung bei 0 bis 5 C während 6 Std. stehen gelassen und man erhielt 95 mg eines hellblauen Pulvers nach Filtration und Trocknen. Dieses Pulver zersetzte sich bei 192-196 C auf dem Mikroblock und enthielt 742,5 mcg Bleomycinhydrochlorid in einem mg. Die Elementaranalyse ergab C 42,43 0/o; H 6,72 0/o; N 14,57 0/o; 0 22,99 0/o; C1 10,06 0/o; S 2,22 % und Cu 0,81 %. (Die Asche wurde als Kupfer berechnet.) Durch die mit Ammoniumchlorid entwikkelte Papierchromatographie konnte nachgewiesen werden, dass dieses Pulver zur Hauptsache Bleomycin B enthielt.
Anderseits wurden 100 mg der Fraktion Nr. 22 (enthaltend 27,5 mg Bleomycin, 275 mcg/mg) auf dieselbe Weise wie oben beschrieben behandelt und man erhielt schliesslich das gereinigte weisse Pulver im Gewicht von 27,9 mg. Die Elementaranalyse dieses gereinigten Pulvers von Bleomycin-hydroclorid ergab die folgenden Resultate: C 44,60 0/o; H 7,33 0/o; N 15,61 %; 0 23,09 %; C1 7,39 0/0; S 2,55 /o und Cu 0,15 %.
Beispiel 3
6,33 mg eines nach Beispiel 1 oder 2 erhaltenen Pulvers, enthaltend 0,65 mg Bleomycin (1,03 mcg/mg) wurden auf einer Säule (1 cm Durchmesser) aus 10 g Cellulosepulver geleitet, welche mit einem Gemisch von n-Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (15:10:3:2) Volumverhältnis) behandelt worden waren. Die Partitionschromatographie wurde mit demselben Lösungsmittelgemisch durchgeführt. Das ganze Bleomycin wurde in den Fraktionen 6 bis 16 gefunden, wenn das Eluat alle 5 cc fraktioniert wurde. Diese aktiven Fraktionen wurden gesammelt und auf etwa 5 cc konzentriert. 50 cc Äthyläther wurden zu diesen 5 cc zugesetzt und ergaben einen Niederschlag von Bleomycin. Nach dem Trocknen dieses Niederschlags erfolgte das Waschen mit Äthanol und der in Methanol unlösliche Teil wurde entfernt.
Der in Methanol lösliche Teil wurde im 10-fachen Volumen Äthyläther eingetropft und ergab 36,27 mg des Pulvers (enthaltend 0,62 mg Bleomycin; 1,7 mcg/mg).
Beispiel 4
1980 g braunes Pulver, welches die Aktivität von 3, ag/mg aufweist, nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 oder 2 erhalten und mittels IRC-50-Harz aus dem Kulturfiltrat gewonnen wurde, wurde in Methanol gelöst im Verhältnis 4 cc/g. Die unlöslichen Teile wurden verworfen. Die Methanollösung wurde im Vakuum bei 20 bis 300 C fast zur Trockne konzentriert und 2 cc Äthanol pro g zugesetzt. Das Äthanol wurde entfernt. Das derart erhaltene trockene Pulver enthielt Bleomycin und wurde zweimal auf dieselbe Weise behandelt, d. h. in Methanol gelöst (4 cc/g), im Vakuum konzentriert, Äthanol zugesetzt (2 cc/g).
Dann erhielt man 58,1 g eines bräunlichen Pulvers, welches die Aktivität von 93 mg aufwies. 34 g dieses Pulvers wurden in 170 cc Methanol gelöst und dieser Methanollösung 27,2 cc 5 5%iges Kupferchlorid in Methanol zugesetzt. Diese Menge an Kupferchloridlösung wurde durch Ausprobieren der für die Chelatbildung benötigten Menge ermittelt, was durch Bestimmung der optischen Dichte bei 620 m erfolgte. Die Lösung wurde während 30 Minuten bei Zimmertemperatur gelassen und anschliessend filtriert. Das Filtrat wurde über eine Aluminiumoxydsäule (340 g Aluminiumoxyd in Methanol) geleitet. Weiteres Methanol wurde durchgelassen und das aus dem blauen Ring erhaltene Eluat im Vakuum verdampft, wobei 7,9 g eines blauen, Bleomycin Cu-At und Cu-Bt enthaltenden Pulvers erhalten wurde.
Verglichen mit dem Arbeitsstandard von Bleomycin wies dieses Produkt eine Aktivität von 215 g/mg auf. 4 g dieses Pulvers wurden in destilliertem Wasser gelöst und diese Lösung über eine Sephadex 625 -Säule (4 mal 80 cm) geleitet. Die Durchflussgeschwindigkeit betrug 0,5 cc/m. Als das blaue Band aus der Säule herunterkam, wurde das blaue Eluat in 3 Teile aufgeteilt auf Grund der in der papierchromatographischen Analyse erzielten Resultate. Aus dem ersten Teil wurden 517 mg des blauen Pulvers mit einer Aktivität von 506 m /mg erhalten. Das Papierchromatogramm unter Verwendung von 100/o NH4CI zeigte, dass es Bleomycin Cu-At (Rf 0,85 bis 0,95) enthielt. Der zweite Teil ergab 166 mg eines blauen Pulvers, welches die Aktivität von 520 ag/mg aufwies und Cu-At und Cu-Bt enthielt.
Der dritte Teil ergab 3154 mg eines blauen Pulvers mit der Aktivität 111,6 lt g/mg und enthielt Cu-Bt (Rf 0,70-0,75). Auf ähnliche Weise wurde aus einem anderen Kulturfiltrat 1,903 g des blauen Pulvers von Cu-At erhalten, welches eine Aktivität von 269 ist g/mg aufwies. Dieses Pulver wurde in 0,1M Ammoniumformiat (pH 6,4) gelöst und über eine CM-Sephadex-C25 -Säule (2x25 cm) geleitet. Diese gradiente Eluierung wurde durchgeführt durch Erhöhung der Konzentration des Ammoniumformiats von 0,1M bis 1,0M. Die optische Dichte des Effluates wurde kontinuierlich bei 253 m abgelesen und die eine einzige Substanz enthaltenden Fraktionen vereint und lyophilisiert. Auf diese Weise wurden folgende Kompon