CH629253A5

CH629253A5 - Process for preparing neothramycin

Info

Publication number: CH629253A5
Application number: CH1310176A
Authority: CH
Inventors: Hamao Umezawa; Tomio Takeuchi; Masa Hamada; Shinichi Kondo; Masaaki Ishizuka; Hiroshi Naganawa
Original assignee: Microbial Chem Res Found
Priority date: 1975-10-15
Filing date: 1976-10-15
Publication date: 1982-04-15
Also published as: JPS5247992A; ES452443A1; SE432443B; ATA527178A; SE7611320L; AT358172B; ATA764076A; JPS5444759B2; NL175198C; NL7611211A; NL175198B; BE847372A; CA1056748A; AU1811676A; FR2351659A1; AU505643B2; DE2645528C3; DE2645528B2; GB1557271A; AT349630B

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Neothramycin-A und -B, zwei neue Antibiotika, welche beide eine stark hemmende Wirkung auf das Wachstum von Leukämiezellen ausüben und als Antitumormit-tel wirksam sind, jedoch nur eine schwache antibakterielle Wirkung aufweisen. The present invention relates to a process for the production of neothramycin-A and -B, two new antibiotics, both of which have a strong inhibitory effect on the growth of leukemia cells and are effective as anti-tumor agents, but have only a weak antibacterial effect.

Sofern nicht ausdrücklich anders vermerkt, ist im folgenden unter der Bezeichnung «Neothramycin» entweder Neothramy-cin-A oder Neothramycin-B oder deren Gemisch zu verstehen. Unless expressly stated otherwise, the term “neothramycin” in the following means either Neothramy-cin-A or Neothramycin-B or a mixture thereof.

Einige Antibiotika, welche als Antitumormittel für die therapeutische Behandlung von Leukämie nützlich sind, sind z. B. Daunomycin, Adriamycin usw. Im Bestreben, weitere neue Antitumormittel mit antibiotischem Charakter zu entwickeln wurden verschiedene Erdproben gesammelt, Mikroorganismen daraus isoliert und die Stoffwechselprodukte untersucht, welche bei der aeroben Züchtung der isolierten Mikroorganismen gebildet werden. Auf diese Weise wurde ein neuer Mikroorganismus aus einer Erdprobe isoliert, welche im Gebiet von Biseibutsu Kagaku Kenkyosho, in Shinagawa-ku, Tokyo, Japan, entnommen wurde, und dieser neue Mikroorganismus wurde mit der Bezeichnung MC916-C4-Stamm versehen. Es konnte bestätigt werden, dass dieser MC916-C4-Stamm zur Gattung Streptomyces gehört. Es wurde gefunden, dass zwei neue Antibiotika, welche eine niedere antibakterielle Wirksamkeit, aber eine stark hemmende Wirkung auf das Wachstum von Leukämie-L-1210-Zellen bei Mäusen und auf das Wachstum einer gewissen Art von Tumorzellen ausüben, in der Kulturbrühe des MC916-C4-Stammes erzeugt und angereichert werden. Es ist nun gelungen, diese neuen Antibiotika aus Some antibiotics which are useful as anti-tumor agents for the therapeutic treatment of leukemia are e.g. B. Daunomycin, Adriamycin, etc. In an effort to develop further new anti-tumor agents with an antibiotic character, various soil samples were collected, microorganisms isolated therefrom and the metabolic products which are formed in the aerobic cultivation of the isolated microorganisms examined. In this way, a new microorganism was isolated from a soil sample taken in the Biseibutsu Kagaku Kenkyosho area of Shinagawa-ku, Tokyo, Japan, and this new microorganism was named MC916-C4 strain. It could be confirmed that this MC916-C4 strain belongs to the genus Streptomyces. It was found that two new antibiotics, which have a low antibacterial activity but a strong inhibitory effect on the growth of leukemia L-1210 cells in mice and on the growth of a certain type of tumor cells, were found in the culture broth of the MC916- C4 strain are generated and enriched. It has now succeeded in taking out these new antibiotics

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

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3 3rd

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der Kulturbrühe zu isolieren, und sie wurden als Neothramycin-A bzw. Neothramycin-B bezeichnet. the culture broth, and they were referred to as Neothramycin-A and Neothramycin-B, respectively.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Beschaffung einer neuen Substanz, nämlich Neothramycin, der Formel I: The present invention relates to the procurement of a new substance, namely neothramycin, of the formula I:

(I) (I)

in welcher R und R' Wasserstoff oder Hydroxyl bedeuten, unter der Bedingung, dass ein Paar R und R' ein Paar Hydroxyl und Wasserstoff oder ein Paar Wasserstoff und Hydroxyl bedeuten, sowie ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon. Das Neothramycin der obigen Formel umfasst: (1) Neothramycin-A der Formel IA: in which R and R 'represent hydrogen or hydroxyl, provided that a pair of R and R' represent a pair of hydroxyl and hydrogen or a pair of hydrogen and hydroxyl, and a pharmaceutically acceptable salt thereof. The neothramycin of the above formula comprises: (1) Neothramycin-A of the formula IA:

. -N. . -N.

(IA) (IA)

und ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, sowie (2) Neothramycin-B der Formel IB: and a pharmaceutically acceptable salt thereof, and (2) neothramycin B of formula IB:

OH (IB) OH (IB)

und ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon. and a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Geeignete Beispiele von pharmazeutisch annehmbaren Salzen von Neothramycin umfassen nicht-toxische Metallsalze, wie Natrium-, Kalium-, Calcium- und Aluminiumsalze, das Ammoniumsalz und substituierte Ammoniumsalze, z. B. Salze von nicht-toxischen Aminen, wie Trialkylamine, einschliesslich Triäthylamin, Procain, Dibenzylamin, N-Benzylbeta-phenäthyl-amin, l-Ephenamin,N,N'-Dibenzyläthylendiamin, Dehydro-abietylamin, N,N'-Bis-dehydroabietyläthylendiamin, N-(Nie-der>alkyl-piperidin, z. B. N-Äthylpiperidin sowie andere Amine, welche bisher verwendet wurden, um Salze mit Benzylpenicillin zu bilden. Suitable examples of pharmaceutically acceptable salts of neothramycin include non-toxic metal salts such as sodium, potassium, calcium and aluminum salts, the ammonium salt and substituted ammonium salts, e.g. B. Salts of non-toxic amines such as trialkylamines, including triethylamine, procain, dibenzylamine, N-benzylbeta-phenethyl-amine, l-ephenamine, N, N'-dibenzylethylenediamine, dehydro-abietylamine, N, N'-bis-dehydroabietylethylenediamine , N- (never-der> alkyl-piperidine, for example N-ethylpiperidine and other amines which have hitherto been used to form salts with benzylpenicillin.

Die vorliegende Erfindung umfasst die Herstellung von Neothramycin-A-Neothramycin-B-Substanzen, entweder allein oder im Gemisch, welche als gereinigte Feststoffe, als freie Säuren und in Form von Salzen mit einem Metall oder einem organischen Amin vorliegen können. Neothramycin-A wurde als farbloses Pulver enthalten, welches keinen bestimmten Schmelzpunkt aufweist, allmählich gegen 105 °C schmilzt und sich bei 132 bis 147 °C unter Schäumen zersetzt und eine spezifische optische Drehung [a]D26 = + 272° (c 0,52, Dioxan) aufweist. Die Elementaranalyse von Neothramycin-A ist die folgende: The present invention includes the preparation of neothramycin-A-neothramycin-B substances, either alone or in a mixture, which can be present as purified solids, as free acids and in the form of salts with a metal or an organic amine. Neothramycin-A was contained as a colorless powder, which has no specific melting point, gradually melts towards 105 ° C and decomposes at 132 to 147 ° C with foaming and a specific optical rotation [a] D26 = + 272 ° (c 0.52 , Dioxane). The elemental analysis of neothramycin-A is the following:

s gefunden: C 57,46, H 5,76, N 9,84,0 26,94 % s found: C 57.46, H 5.76, N 9.84.0 26.94%

berechnet für CijHhNzO«- Vi HzO: C 57,56, H 5,57, N 10,33,0 26,54% calculated for CijHhNzO «- Vi HzO: C 57.56, H 5.57, N 10.33.0 26.54%

Neothramycin-A weist ein Molekulargewicht von 250 bis 300, gemessen nach der Barger-Akiya-Methode, auf. Aus den io Resultaten der Elementaranalyse und der Bestimmung des Molekulargewichtes ergibt sich, dass Neothramycin-A wahrscheinlich die empyrische Formel ChHmNîO^ Vï H2O besitzt. Diese Formel wurde durch Massenspektrometrie bestätigt: gefunden: m/e 262.0934, Neothramycin-A has a molecular weight of 250 to 300, measured according to the Barger-Akiya method. From the results of the elementary analysis and the determination of the molecular weight it follows that neothramycin-A probably has the empyric formula ChHmNîO ^ Vï H2O. This formula was confirmed by mass spectrometry: found: m / e 262.0934,

15 berechnetes Molekulargewicht für C13H14N2O4:262.0952. 15 calculated molecular weight for C13H14N2O4: 262.0952.

Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Neothramycin-A in einer alkalischen Lösung ergibt eine Verschiebung gegen die längere Wellenlängen, wie aus Fig. 3 ersichtlich. Wie in Tabelle I dargestellt, weist das NMR-Spektrum von Neothra-20 mycin-A die Gegenwart von 14 Protonen auf. The ultraviolet absorption spectrum of neothramycin-A in an alkaline solution results in a shift towards the longer wavelengths, as can be seen from FIG. 3. As shown in Table I, the NMR spectrum of Neothra-20 mycin-A shows the presence of 14 protons.

Neothramycin-B ist in seinen Eigenschaften sehr ähnlich dem Neothramycin-A und wurde als farbloses Pulver erhalten, welches keinen bestimmten Schmelzpunkt aufweist, sich bei 144 °C unter Schäumen zu zersetzen beginnt und bei 151 °C 25 vollständig schmilzt und eine spezifische optische Drehung [a]D26 = +314° (c 0,48 Dioxan) aufweist. Die Elementaranalyse von Neothramycin-B ist die folgende: Neothramycin-B is very similar in properties to neothramycin-A and was obtained as a colorless powder which has no specific melting point, begins to decompose under foaming at 144 ° C and completely melts at 151 ° C 25 and has a specific optical rotation [ a] D26 = + 314 ° (c 0.48 dioxane). The elemental analysis of neothramycin-B is the following:

gefunden: C 57,00, H 5,58, N 9,75,0 27,67% found: C 57.00, H 5.58, N 9.75.0 27.67%

berechnet für C13H14N2O4. Vi HzO: C 57,56, H 5,57, N 10,33,0 30 26,54% calculated for C13H14N2O4. Vi HzO: C 57.56, H 5.57, N 10.33.0 30 26.54%

Aus dem Resultat der Elementaranalyse und der Bestimmung des Molekulargewichtes ergibt sich als wahrscheinlich, dass Neothramycin-B die ähnliche empirische Formel C13H14N2O4 • Vi H2O besitzt. Diese empirische Formel wurde 35 durch Massenspektrometrie mit hoher Auflösung bestätigt (gefunden: m/e 262.0939, berechnetes Molekulargewicht für C13H14N2O4 262.0952). Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Neothramycin-B in einer alkalischen Lösung zeigt eine Verschiebung gegen die längere Wellenlänge, wie aus Fig. 4 40 ersichtlich ist. Wie in Tabelle I dargestellt, zeigt das NMR-Spektrum von Neothramycin-B die Gegenwart von 14 Protonen, ähnlich wie Neothramycin-A. Neothramycin-A und -B sind während etwa einem Monat oder länger stabil, wenn sie in Form eines festen Pulvers in einem Exsiccator aus braunem 45 Glas bei 5 °C aufbewahrt werden. From the result of the elementary analysis and the determination of the molecular weight it is likely that neothramycin-B has the similar empirical formula C13H14N2O4 • Vi H2O. This empirical formula was confirmed by high resolution mass spectrometry (found: m / e 262.0939, calculated molecular weight for C13H14N2O4 262.0952). The ultraviolet absorption spectrum of neothramycin-B in an alkaline solution shows a shift against the longer wavelength, as can be seen from FIG. 4 40. As shown in Table I, the NMR spectrum of neothramycin-B shows the presence of 14 protons, similar to neothramycin-A. Neothramycin-A and -B are stable for about a month or longer when stored in the form of a solid powder in a brown glass desiccator at 5 ° C.

Neothramycin-A und -B sind jedoch nicht stabil in 50%igem wässerigem Äthanol bei pH 2,5, und ihre Wirksamkeit wird auf 25 beziehungsweise 22% herabgesetzt bei Zimmertemperatur im Laufe von 16 Stunden. In 50%igem wässerigem Äthanol 50 vom pH 6,5 oder pH 8,0 bei Zimmertemperatur während 16 Stunden verbleiben 80 bis 90% der Aktivität von Neothramycin-A und 70 bis 80% Aktivität von Neothramycin-B, doch erweist sich durch Dünnschichtchromatographie eine Gleichgewichtsumwandlung von Neothramycin-A zu -B oder -B zu -A. 55 Neothramycin-A und Neothramycin-B sind ähnlich, indem sie eine hemmende Wirkung auf das Wachstum von Leukämie-L-1210-ZeIlen bei Mäusen und eine schwach antibakterielle Wirksamkeit aufweisen, indem sie eine saure Funktion im Molekül besitzen, indem sie in Methanol, Äthanol, Propanol, 60 Chloroform und Dioxan löslich sind und schwach löslich in Wasser, aber kaum löslich oder praktisch unlöslich in Äthyläther und n-Hexan, indem sie eine positive Rydon-Smith-Reak-tion und eine rote Tetrazolium-Reaktion ergeben, schwach positiv bei der Ninhydrin-Reaktion, aber negativ auf die Ehrlich-65 Reaktion und Sakaguchi-Reaktion reagieren, indem sie bei der Elementaranalyse im wesentlichen nur Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff ergeben und indem sie eine relative Mobilität gegenüber Alanin (1,0) von 0,17 bei der Hoch- However, neothramycin A and B are not stable in 50% aqueous ethanol at pH 2.5 and their effectiveness is reduced to 25 and 22% respectively at room temperature over 16 hours. In 50% aqueous ethanol 50 of pH 6.5 or pH 8.0 at room temperature for 16 hours, 80 to 90% of the activity of neothramycin-A and 70 to 80% of activity of neothramycin-B remain, but one proves by thin layer chromatography Equilibrium conversion from neothramycin-A to -B or -B to -A. 55 Neothramycin-A and Neothramycin-B are similar in that they have an inhibitory effect on the growth of leukemia L-1210 cells in mice and a weak antibacterial activity in that they have an acidic function in the molecule by being in methanol, Ethanol, propanol, 60 chloroform and dioxane are soluble and slightly soluble in water, but hardly soluble or practically insoluble in ethyl ether and n-hexane by giving a positive Rydon-Smith reaction and a red tetrazolium reaction, slightly positive in the ninhydrin reaction, but react negatively to the Ehrlich-65 reaction and Sakaguchi reaction by giving essentially only carbon, hydrogen, nitrogen and oxygen in the elemental analysis and by having a relative mobility to alanine (1.0) of 0.17 at high

629253 629253

spannungs-Filterpapierelektrophorese (3500 Volt, 35 Minuten) unter Verwendung von Ameisensäure-Essigsäure-Wasser (25:75:900 Volumenverhältnis) als elektrolytische Lösung ergeben. voltage filter paper electrophoresis (3500 volts, 35 minutes) using formic acid-acetic acid-water (25: 75: 900 volume ratio) as the electrolytic solution.

Neothramycin-A zeichnet sich ferner dadurch aus, dass es ein Infrarot-Absorptionsspektrum in Kaliumbromidtabletten, wie in Fig. 1 dargestellt, aufweist und Absorptionsspitzen bei 3450,2950,1630 (Schulter), 1600,1510,1460,1440,1410,1280, 1200,1180,1120,1080,1010,870,790 und 760 cm"1 ergibt, dass es Ultraviolett-Absorptionsspektren, wie in Fig. 3 dargestellt, Neothramycin-A is further distinguished by the fact that it has an infrared absorption spectrum in potassium bromide tablets, as shown in FIG. 1, and absorption peaks at 3450, 2950, 1630 (shoulder), 1600, 1510, 1460, 1440, 1410, 1280, 1200,1180,1120,1080,1010,870,790 and 760 cm "1 reveals that there are ultraviolet absorption spectra as shown in Fig. 3

10 10th

15 15

aufweist mit Absorptionsmaxima bei 223 nm (Et cm,% 855), 240 nm (Schulter), 265 nm (Ei ctn1% 290) und 318 nm (Ei cm1% 156) in einer Lösung in 10% Wasser-Methanol, mit Absorptionsmaxima bei 223 nm (Et cm1% 885), 240 nm (Schulter), 265 nm (E( cm,% 290) und 320 nm (Et cm1% 139) in einer Lösung in N/10 HCl-Me-thanol (1:9) sowie Absorptionsmaxima bei 228 nm (Ei cm1% 635), 254 nm (E, cml%566),291 nm (E, cm1%422) und 324 nm(E, cml% 412) in einer Lösung in N/10 NaOH-Methanol (1:9). Ferner ergibt es einen RrWert von 0,57 bei der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel mit Chloroform-Methanol (10:1 Volumteile) als Entwicklungslösungsmittel. 20 has with absorption maxima at 223 nm (Et cm,% 855), 240 nm (shoulder), 265 nm (Ei ctn1% 290) and 318 nm (Ei cm1% 156) in a solution in 10% water-methanol, with absorption maxima at 223 nm (Et cm1% 885), 240 nm (shoulder), 265 nm (E (cm,% 290) and 320 nm (Et cm1% 139) in a solution in N / 10 HCl-methanol (1: 9 ) and absorption maxima at 228 nm (Ei cm1% 635), 254 nm (E, cml% 566), 291 nm (E, cm1% 422) and 324 nm (E, cml% 412) in a solution in N / 10 NaOH -Methanol (1: 9) and gives an Rr of 0.57 in thin layer chromatography on silica gel with chloroform-methanol (10: 1 parts by volume) as the developing solvent

Neothramycin-B zeichnet sich ferner aus durch ein Infrarot-Absorptionsspektrum, in Kaliumbromid tablettiert, wie in Fig. 2 dargestellt, mit Absorptionsspitzen bei 3400,2960,1630 (Schulter), 1600,1510,1440,1400,1280,1200,1120,1080,1010, 990,940,870,790 und 760 cm-1, durch Ultraviolett-Absorptions- 25 spektren, wie aus Fig. 4 ersichtlich, mit Absorptionsmaxima bei 224 nm (E|Cm'°/o 935), 240 nm (Schulter), 265 nm (Schulter) und 318 nm (Ei cm1% 167) in einer Lösung in 10% Wasser-Methanol ( 1:9), Absorptionsmaxima bei 224 nm (E, cm,% 1000), 240 nm (Schulter), 265 nm (Schulter) und 320 nm (Ei cmI% 156) in einer 30 Lösung in N/10 HCI-Methanol (1:9) sowie Absorptionsmaxima bei 228 nm (E, cm1% 800), 254 nm (E, cm1% 725), 291 nm (E, cm1% 456) und 324 nm (Ei cm1% 466) in einer Lösung in N/10 NaOH-Methanol (1:9). Es ergibt einen RrWert von 0,50 bei der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel mit Chloroform-Metha- 35 noi (10:1 Volumverhältnis) als Entwicklungslösungsmittel. Neothramycin-B is further characterized by an infrared absorption spectrum, tableted in potassium bromide, as shown in FIG. 2, with absorption peaks at 3400, 2960, 1630 (shoulder), 1600, 1510, 1440, 1400, 1280, 1200, 120, 1080, 1010, 990, 940, 870, 790 and 760 cm-1, by ultraviolet absorption spectra, as can be seen in FIG. 4, with absorption maxima at 224 nm (E | Cm '° / o 935), 240 nm (shoulder), 265 nm (Shoulder) and 318 nm (egg cm1% 167) in a solution in 10% water-methanol (1: 9), absorption maxima at 224 nm (E, cm,% 1000), 240 nm (shoulder), 265 nm (shoulder ) and 320 nm (Ei cmI% 156) in a 30 solution in N / 10 HCl-methanol (1: 9) and absorption maxima at 228 nm (E, cm1% 800), 254 nm (E, cm1% 725), 291 nm (E, cm1% 456) and 324 nm (Ei cm1% 466) in a solution in N / 10 NaOH-methanol (1: 9). It gives an Rr value of 0.50 in thin layer chromatography on silica gel with chloroform-methano 35 noi (10: 1 volume ratio) as the developing solvent.

Neothramycin-A oder -B wird leicht in ein Gemisch von Methylneothramycin-A (Rf 0,71 auf Silicagel-Dünnschichtchro-matogramm mit Chloroform-Methanol (10:1 Volumverhältnis) und Methylneothramycin-B (Rf 0,61 auf demselben Dünn-schichtchromatogramm) in wasserfreiem Methanol bei Zimmertemperatur während 16 Stunden umgewandelt. Methylneo-thramycin-A kristallisiert aus einem Gemisch von Aceton und Benzol zu farblosen Mikrokristallen, Schmelzpunkt 137 bis 140 °C (Zersetzung); [a]D26 + 640° (c, 0,24, Dioxan), MS, m/e 276.1089 (berechnetes Mokeluargewicht für C14H16N2O4, 276,1108). Methylneothramycin-B wird als farbloses Pulver erhalten, vom Schmelzpunkt 61 bis 69 °C (Zersetzung); [a]D26 + 778° (c, 0,22, Dioxan), MS, m/e 276,1071. Die UV-Spektren von Methylneothramycinen sind ähnlich wie diejenigen der Neo-thramycine und die chemischen Verschiebungen im PMR sind in Tabelle I zusammengestellt. Eine milde Hydrolyse von Me-thyineothramycin-A oder-B in 0,01N HCI-Dioxan(l :1 Volumverhältnis) bei Zimmertemperatur während 1 Stunde, gefolgt von einer Säulenchromatographie auf Silicagel ergibt Neothra-mycine-A und -B in einer guten Ausbeute. Neothramycin-A or -B is easily mixed into a mixture of methylneothramycin-A (Rf 0.71 on silica gel thin layer chromatogram with chloroform-methanol (10: 1 volume ratio) and methylneothramycin-B (Rf 0.61 on the same thin layer chromatogram ) converted into anhydrous methanol at room temperature for 16 hours. Methylneothramycin-A crystallizes from a mixture of acetone and benzene to form colorless microcrystals, melting point 137 to 140 ° C (decomposition); [a] D26 + 640 ° (c, 0, 24, dioxane), MS, m / e 276.1089 (calculated Mokeluar weight for C14H16N2O4, 276.1108) Methylneothramycin-B is obtained as a colorless powder, melting point 61 to 69 ° C (decomposition); [a] D26 + 778 ° ( c, 0.22, dioxane), MS, m / e 276.1071 The UV spectra of methylneothramycins are similar to those of the neo-thramycins and the chemical shifts in the PMR are summarized in Table I. A mild hydrolysis of Me- thyineothramycin-A or-B in 0.01N HCl dioxane (1: 1 volume ratio) at room Heating for 1 hour followed by column chromatography on silica gel gives Neothra-mycine-A and -B in good yield.

Demzufolge kann Methylneothramycin-A nützlich sein als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Neothramycin-A durch milde Hydrolyse, während Methylneothramycin-B nützlich sein kann als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Neothramycin-B. Methylneothramycin-A weist die folgende Formel auf Accordingly, methylneothramycin-A may be useful as a starting material for the production of neothramycin-A by mild hydrolysis, while methylneothramycin-B may be useful as a starting material for the production of neothramycin-B. Methylneothramycin-A has the following formula

40 40

45 45

0 CH3° 0 CH3 °

Methylneothramycin-B entspricht der Formel Methylneothramycin-B corresponds to the formula

N« N «

HO- HO-

H (IIA) H (IIA)

(HB) (HB)

OCH, OCH,

Aus diesen Daten ergibt sich, dass Neothramycine-A und -B isomer sind, von denen jedes in das andere übergeführt werden kann, und welche zu der Anthramycin-Gruppe von Antibiotika gehören, die eine Benzodiazepinstruktur aufweisen. Sie unterscheiden sich von Anthramycin, Dextrochrysin und Sibiromy-cin durch ihre UV-Spektren. Die UV-Spektren von Tomaymy-cin und Neothramycinen sind ähnlich, doch sind sie verschieden in ihrer Molekularformel und in anderen Spektren. From these data, it can be seen that neothramycins A and B are isomeric, each of which can be converted to the other, and which belong to the anthramycin group of antibiotics which have a benzodiazepine structure. They differ from anthramycin, dextrochrysin and sibiromy-cin by their UV spectra. The UV spectra of Tomaymy-cin and neothramycins are similar, but they are different in their molecular formula and in other spectra.

Tabelle I Table I

Chemische Verschiebungen im PMR von Neothramycinen und ihren Methylderivaten Proton Neothramycin-A Neothramycin-B Methylneothramycin-A Chemical shifts in the PMR of neothramycins and their methyl derivatives proton neothramycin-A neothramycin-B methylneothramycin-A

Methylneothramycin-B Methylneothramycin-B

CHzx2 CHzx2

1,7-2,5 1.7-2.5

1,8-2,6 1.8-2.6

OCHs OCHs

3,28 s 3.28 s

3,44 s 3.44 s

CH CH

3,80 m 3.80 m

3,78 m 3.78 m

3,72 m 3.72 m

3,80 dd arom. OCH3 3.80 dd aroma OCH3

3,90 s 3.90 s

3,88 s 3.88 s

3,90 s 3.90 s

3,88 s 3.88 s

OH OH

5,00 d 5.00 d

5,10 d 5.10 d

CH CH

5,69 dd 5.69 dd

5,78 m 5.78 m

5,56 d 5.56 d

5,35 dd arom. H 5.35 dd aroma H

6,70 s 6.70 s

6,69 s 6.69 s

6,75 s 6.75 s

6,64 s arom. H 6.64 s aroma H

7,43 s 7.43 s

7,40 s 7.40 s

7,48 s 7.48 s

7,36 s 7.36 s

CH CH

7,62 d 7.62 d

7,70 d 7.70 d

7,73 d 7.73 d

7,54 d 7.54 d

Phenol-OH Phenol OH

8,00 s 8.00 s

7,98 s 7.98 s

8,04 s 8.04 s

7,94 s 7.94 s

Chemische Verschiebungen, 5 (ppm) wurden in Deutero-dioxan gemessen unter Verwendung von TMS als interne Referenz. Chemical shifts, 5 (ppm) were measured in deutero-dioxane using TMS as an internal reference.

5 5

629253 629253

Die folgenden Strukturen können zur allgemeinen Darstellung von Neothramycin-A (R1 = OH, R2 = H), Neothramycin-B (R1 = H, R2 = OH), Methylneothramycin-A (R1 = OCH3, R2 = H) und Methylneothramycin-B (R1 = H, R2 = OCH3) gegeben werden: The following structures can be used for general representation of neothramycin-A (R1 = OH, R2 = H), neothramycin-B (R1 = H, R2 = OH), methylneothramycin-A (R1 = OCH3, R2 = H) and methylneothramycin-B (R1 = H, R2 = OCH3) are given:

10 10th

20 20th

In den beiliegenden Zeichnungen zeigt: In the accompanying drawings:

Fig. 1 eine Kurve des Infrarot-Absorptionsspektrums einer authentisch reinen Probe von Neothramycin-A in Kaliumbro-mid tablettiert, 1 is a curve of the infrared absorption spectrum of an authentically pure sample of neothramycin-A tableted in potassium bromide,

Fig. 2 eine Kurve Infrarot-Absorptionsspektrums einer authentisch reinen Probe von Neothramycin-B, inKaliumbro-mid tablettiert, 2 shows a curve of infrared absorption spectrum of an authentically pure sample of neothramycin-B, tableted in potassium bro-mid,

Fig. 3 Proben des Ultraviolett-Absorptionsspektrums einer authentisch reinen Probe von Neothramycin-A gelöst in 10% Wasser-Methanol, in N/10 NaOH-Methanol (1:9) und in N/10 HCl-Methanol (1:9), 3 samples of the ultraviolet absorption spectrum of an authentically pure sample of neothramycin-A dissolved in 10% water-methanol, in N / 10 NaOH-methanol (1: 9) and in N / 10 HCl-methanol (1: 9),

Fig. 4 Kurven des Ultraviolett-Absorptionsspektrums einer authentisch reinen Probe von Neothramycin-B, gelöst in 10% Wasser-Methanol, in N/10 NaOH-Methanol (1:9) und in N/10 HCl-Methanol (1:9). 4 curves of the ultraviolet absorption spectrum of an authentically pure sample of neothramycin-B, dissolved in 10% water-methanol, in N / 10 NaOH-methanol (1: 9) and in N / 10 HCl-methanol (1: 9) .

Das Neothramycin-A und Neothramycin-B weisen eine niedere antibakterielle und pilzbekämpfende Wirksamkeit auf, wie aus den antibakteriellen Spektren dieser Substanzen in Tabelle II hervorgeht. Die minimalen hemmenden Konzentrationen 35 (mcg/ml) von Neothramycin-A und -B gegen verschiedene Bakterien wurden auf Nähragarplatten, welche bei einer Temperatur von 37 °C während 17 Stunden inkubiert wurden, bestimmt. Die minimalen hemmenden Konzentrationen gegenüber verschiedenen Pilzen wurden auf Nähragarplatten bestimmt, 40 welche 1% Glukose enthielten, nach Inkubation bei 27 °C während 40 Stunden. The neothramycin-A and neothramycin-B have a lower antibacterial and antifungal activity, as can be seen from the antibacterial spectra of these substances in Table II. The minimum inhibitory concentrations 35 (mcg / ml) of neothramycin-A and -B against various bacteria were determined on nutrient agar plates which were incubated at a temperature of 37 ° C. for 17 hours. The minimum inhibitory concentrations against various fungi were determined on nutrient agar plates containing 40% 1% glucose after incubation at 27 ° C for 40 hours.

Wie oben erwähnt weisen Neothramycin-A und -B eine stark hemmende Wirksamkeit gegen das Wachstum von Leukämiezellen auf und werden voraussichtlich nützlich sein als Mittel zur therapeutischen Behandlung eines lebenden Körpers, welcher an Leukämie erkrankt ist. Chemotherapeutische Wirkungen von Neothramycin-A und -B gegen Leukämie-L-1210 bei Mäusen wurden auf folgende Weise untersucht. Leu-kämie-L-1210-Zellen (105 Zellen/Maus) wurden intraperitoneal an Mäuse vom Stamm CDF1 injiziert, welche 19 bis 22 g wogen. Für die Behandlung der derart erzeugten Leukämie erfolgte die Verabreichung der Neothramycin-A und -B unmittelbar nach der Inokulierung des Tumors. Die leukämischen Mäuse wurden in Gruppen von je vier Stück für jede Dosis verwendet. Bei Verabreichung von 300 bzw. 150,75,37,5 und 18,7 mcg/Maus/Tag Neothramycin-A und -B durch intraperitoneale Injektion einmal täglich während 10 Tagen wurden die äusserst günstigen Wirkungen auf die Anzahl überlebender Tiere (in Prozent) beobachtet, wie aus den Resultaten von der folgenden Tabelle III ersichtlich ist. As mentioned above, neothramycin A and B have a potent inhibitory activity against the growth of leukemia cells and are expected to be useful as a therapeutic agent for a living body suffering from leukemia. Chemotherapy effects of neothramycin A and B against leukemia L-1210 in mice were examined in the following manner. Leukemia L-1210 cells (105 cells / mouse) were injected intraperitoneally into mice from strain CDF1, which weighed 19 to 22 g. For the treatment of the leukemia thus produced, the neothramycin A and B were administered immediately after the tumor was inoculated. The leukaemic mice were used in groups of four for each dose. When 300, 150, 75, 37, 5 and 18.7 mcg / mouse / day of neothramycin A and B were administered by intraperitoneal injection once a day for 10 days, the extremely favorable effects on the number of surviving animals (in percent) observed, as can be seen from the results in Table III below.

Tabelle III Table III

Durchschnittliche Überlebensquote (Prozent) Dosis (mcg/Maus/Tag) Neothramycin-A Average survival (percent) dose (mcg / mouse / day) Neothramycin-A

Neothramycin-B Neothramycin-B

25 25th

30 30th

300 300

Tod (toxische Death (toxic

Dosis) Dose)

150 150

200 200

192 192

75 75

167 167

154 154

37,5 37.5

154 154

128 128

18,7 18.7

122 122

103 103

Die Überlebensquote (Prozent) wurde berechnet durch Dividieren der Anzahl Überlebenstage der behandelten Tiere (z. B. 10) durch die Anzahl Überlebenstage der Kontrolliere (z. B. 8) und Multiplizieren mit 100, z. B. l%x 100 = 125. Grössere Quoten als 125 werden im allgemeinen als beträchtlich betrachtet. The survival rate (percent) was calculated by dividing the number of survival days of the treated animals (e.g. 10) by the number of survival days of the controls (e.g. 8) and multiplying by 100, e.g. B. 1% x 100 = 125. Larger quotas than 125 are generally considered significant.

Eine wirksame Verlängerung in der Überlebensquote (Prozent) von Mäusen, die mit Leukämie-L-1210 inokuliert wurden, wurde auch beobachtet bei der Behandlung mit Methylneo-thramycin-A oder Methylneothramycin-B, wie in der folgenden Tabelle IV ersichtlich. Effective prolongation in percent survival of mice inoculated with leukemia-L-1210 was also observed when treated with methylneothramycin-A or methylneothramycin-B, as shown in Table IV below.

Tabelle II Table II

45 45

Tabelle IV Table IV

Test-Organismen Test organisms

Minimale hemmende Konzentrationen (mcg/ml) Minimum inhibitory concentrations (mcg / ml)

Neothra- Neothramycin-A mycin-B Neothra-Neothramycin-A mycin-B

Durchschnittliche Überlebensquote (Prozent) Average survival rate (percent)

Dosis (mcg/Maus/Tag) Methylneothramycin-A Methylneothramycin-B Dose (mcg / mouse / day) Methylneothramycin-A Methylneothramycin-B

Staphylococcus aureaus Smith Staphylococcus aureaus Smith

50 50

100 100

Staphylococcus aureus 209P Staphylococcus aureus 209P

>100 > 100

Klebsiella pneumoniae PC 602 Klebsiella pneumoniae PC 602

50 50

100 100

Escherichia coli NIHJ Escherichia coli NIHJ

100 100

Escherichia coli K-12 Escherichia coli K-12

>100 > 100

Pseudomonas aeruginosa No. 12 Pseudomonas aeruginosa No. 12

100 100

>100 > 100

Bacillus subtilis PCI 219 Bacillus subtilis PCI 219

100 100

Escherichia coli W67 Escherichia coli W67

50 50

>100 > 100

Escherichia coli JR66/W677 Escherichia coli JR66 / W677

100 100

Aeromonas salmoecida ATCC14174 Aeromonas salmoecida ATCC14174

25 25th

50 50

Vibrio anguillarum NCBM 6 Vibrio anguillarum NCBM 6

50 50

100 100

Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

50 50

>100 > 100

Candida albicans 3147 Candida albicans 3147

>100 > 100

Aspergillus niger Aspergillus niger

100 100

>100 > 100

Piricularia oryzae Piricularia oryzae

50 50

>100 > 100

Xanthomonas citri Xanthomonas citri

>100 > 100

Xanthomonas oryzae Xanthomonas oryzae

50 50

100 100

50 50

55 55

200 200

toxisch toxisch toxic toxic

100 100

128 128

154 154

50 50

103 103

147 147

25 25th

- -

115 115

12,5 12.5

- -

103 103

Das Neothramycin-A und -B weisen eine niedere Toxizität für Tiere und Menschen auf, was durch die Tatsache erwiesen ist, dass die Neothramycine-A und -B beide LDso-Werte von 20 bis 30 mg/kg bei Mäusen aufweisen, wenn eine Lösung von 0,25 60 bis 0,5 Gewichtsprozent Neothramycin-A oder -B in 10% Dimethylsulfoxid-Wasser intraperitoneal den Mäusen injiziert wird, um die akute Toxizität dieser Substanzen festzustellen. The neothramycin A and B have low toxicity to animals and humans, which is evidenced by the fact that the neothramycin A and B both have LDso values of 20 to 30 mg / kg in mice when a solution from 0.25 60 to 0.5 weight percent neothramycin-A or -B in 10% dimethyl sulfoxide water is injected intraperitoneally into the mice to determine the acute toxicity of these substances.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für die Herstellung von Neothramycin-A und Neothramycin-B, 65 welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Neothramycin erzeugenden Stamm der Gattung Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, The present invention relates to a process for the preparation of neothramycin-A and neothramycin-B, 65 which is characterized in that a neothramycin-producing strain of the genus Streptomyces is aerobically treated in a suitable culture medium which contains assimilable carbon and nitrogen sources.

629253 6 629 253 6

während genügend langer Zeit kultiviert, um Neothramycin-A Die Rückseite des Wachstums ist dunkelgelblich-braun gefärbt, cultured for a long enough time to Neothramycin-A The back of the growth is colored dark yellowish brown,

und Neothramycin-B im Kulturmedium zu erzeugen und anzu- (8) Auf Hafermehl-Agar (ISP No. 3 Medium, inkubiert bei reichern, und ein Gemisch von Neothramycin-A und Neothra- 27 °C): Rötlichgelb bis dunkelgelb-orange [4pe, Orange Rust] and Neothramycin-B in the culture medium and to- (8) on oatmeal agar (ISP No. 3 medium, incubated at rich and a mixture of Neothramycin-A and Neothra- 27 ° C): reddish yellow to dark yellow-orange [ 4pe, Orange Rust]

mycin-B aus dem Kulturgemisch gewinnt, und anschliessend, gefärbtes Wachstum mit Luftfäden von hellgrauer [5fe, Ashes] mycin-B gains from the cultural mixture, and then colored growth with air threads of light gray [5fe, Ashes]

gegebenenfalls das erhaltene Gemisch in die isolierten Formen 5 bis bräunlich-grauer [3ih, Beige Gray] Farbe. Lösliches Pigment von Neothramycin-A und Neothramycin-B aufspaltet. Für die ist gelb getönt. optionally the mixture obtained in the isolated forms 5 to brownish-gray [3ih, beige gray] color. Neothramycin-A and Neothramycin-B dissolve soluble pigment. For them is tinted yellow.

Erzeugung von Neothramycin nach dem erfindungsgemässen (9) Auf Glycerin-Nitrat-Agar (inkubiert bei 27 °C) : Generation of neothramycin according to the (9) on glycerol nitrate agar (incubated at 27 ° C.):

Verfahren kann ein Stamm der Gattung Streptomyces verwen- Schwachgelb bis rötlich-gelb [3pc, Amber] gefärbtes Wachs- A strain of the genus Streptomyces can be used. Pale yellow to reddish-yellow [3pc, amber] colored wax-

det werden, solange dieser Stamm Neothramycin erzeugt. Ein tum trägt schwach entwickelte Luftfäden von bräunlich-weis- be detected as long as this strain produces neothramycin. A tum carries weakly developed air threads of brownish-white

geeignetes Beispiel eines solchen Stammes ist der oben bereits io ser bis hellbräunlich-grauer Farbe. Lösliches Pigment ist erwähnte Streptomyces-Stamm MC916-C4. Dieser MC916-C4- schwach mit gelb getönt. A suitable example of such a strain is the color already from above to light brown-gray color. Soluble pigment is mentioned Streptomyces strain MC916-C4. This MC916-C4- faintly tinted with yellow.

Stamm wurde am 2. Februar 1974 im «Fermentation Research (10) Auf Stärke-Agar (inkubiert bei 27 °C): Das Wachstum Strain was on February 2, 1974 in "Fermentation Research (10) on starch agar (incubated at 27 ° C): The growth

Institute, Agency of Industriai Science and Technology», Inage, ist dumpf gelb bis gelblich-braun [2pi, Mustard Brown] gefärbt Institute, Agency of Industry Science and Technology », Inage, is dull yellow to yellowish brown in color [2pi, Mustard Brown]

Chiba-City, Japan, unter der Nummer FERM-P 2452 hinterlegt, und entwickelt keine Luftfäden oder nur selten weisse Luftfä- Chiba-City, Japan, filed under number FERM-P 2452, and does not develop air threads or only rarely white air threads.

Dieser MC916-C4-Stamm wurde ebenfalls am 15. Februar 1975 is den. Lösliches Pigment ist schwach braun getönt. This MC916-C4 strain was also born on February 15, 1975. Soluble pigment is tinted slightly brown.

in der American Type Culture Collection, Washington, D.C. (11) Auf Calciummalat-Agar (inkubiert bei 27 °C): Das in the American Type Culture Collection, Washington, D.C. (11) On calcium malate agar (incubated at 27 ° C): The

USA, unter der A.T.C.C. Nummer 31123 deponiert. Wachstum ist hellgelb bis helloliv gefärbt und entwickelt eine USA, under the A.T.C.C. Number 31123 deposited. Growth is light yellow to light olive colored and develops one

Die kulturellen und taxonomischen Eigenschaften des oder nur wenige weisse Luftfäden. Lösliches Pigment ist The cultural and taxonomic properties of or only a few white threads of air. Soluble pigment is

MC916-C4-Stammes sind die folgenden: schwach gelb gefärbt. MC916-C4 strain are the following: faintly yellow colored.

20 (12) Auf Zellulose (inkubiert bei 27 °C): Farbloses Wachs- 20 (12) On cellulose (incubated at 27 ° C): Colorless wax

1. Mikroskopische Morphologie tum ohne Luftfäden. Kein lösliches Pigment wird erzeugt. 1. Microscopic morphology tum without air threads. No soluble pigment is generated.

Der MC916-C4-Stamm besitzt verzweigte Substratmyce- (13) Auf Gelatineeinstich: Auf leeren Gelatinemedium lien, von welchen sich Luftfäden in Form von Haken oder offe- (inkubiert bei 20 °C) ist das Wachstum farblos bis dumpf gelb nen Spiralen entwickeln. Es sind keine wirbelförmien Abzwei- gefärbt ohne Entwicklung von Luftfäden und unter Erzeugung gungen sichtbar. Reife Sporenketten enthalten im allgemeinen 25 eines löslichen Pigmentes von schwach gelber Farbe. Auf Glumehr als 10 konidale Sporen. Die Sporen weisen eine Grösse cose-Pepton-Gelatinemedium (inkubiert bei 27 °C) ist das von etwa 0,6 bis 0,8 auf 1,0 bis 1,2 Mikron auf und besitzen eine Wachstum hellgelb bis dumpf gelb gefärbt. Luftfäden werden glatte Oberfläche. zu Beginn nicht entwickelt, jedoch später solche von gräulich- The MC916-C4 strain has branched substrate myce- (13) On gelatin puncture: On empty gelatin medium, from which air filaments in the form of hooks or open (incubated at 20 ° C) the growth is colorless to dull yellow spirals. No vortex-shaped branches are visible without the development of air threads and with generation. Mature spore chains generally contain 25 of a soluble pigment of a pale yellow color. More than 10 conidal spores. The spores have a size of cose-peptone gelatin medium (incubated at 27 ° C.), that is from about 0.6 to 0.8 to 1.0 to 1.2 microns and have a light yellow to dull yellow growth. Air threads become a smooth surface. not developed at the beginning, but later those of grayish

weisser Farbe. Kein Erzeugung von löslichem Pigment. white color. No generation of soluble pigment.

2. Wachstumseigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien 30 (14) Auf entrahmter Milch (inkubiert bei 37 °C): Das Wachs- 2. Growth properties on different culture media 30 (14) On skimmed milk (incubated at 37 ° C): The wax

Die Bezeichnung von Farben in Klammern □ in den folgen- tum ist hellgelb bis hellorange gefärbt und entwickelt keine 1 The designation of colors in brackets □ in the following is colored light yellow to light orange and does not develop 1

den Ausführungen entspricht dem Farbstandard aus «Color Luftfäden. Das lösliche Pigment ist schwach orange getönt. Harmony Manual», herausgegeben von Container Corporation of America. 3) Physiologische Eigenschaften the designs correspond to the color standard from «Color air threads. The soluble pigment has a faint orange tint. Harmony Manual », published by Container Corporation of America. 3) Physiological properties

(1) Auf Saccharose-Nitrat-Agar (inkubiert bei 27 °C): 35 (1) Temperatur für das Wachstum: (1) On sucrose nitrate agar (incubated at 27 ° C): 35 (1) Temperature for growth:

Schwachgelb bis rötlichgelb [3 pc, Amber] gefärbtes Wachs- Das Wachstum auf Glucose-Asparagin-Agar wurde bei tum trägt dünne Luftfäden von hellbräulich-grauer bis hell- 20 °C, 24 °C, 27 °C, 30 °C, 37 °C und 50 °C untersucht. Der grauer Farbe. Lösliches Pigment ist schwachgelb gefärbt. MC916-C4-Stamm entwickelte sich bei allen untersuchten Tem- Pale yellow to reddish yellow [3 pc, amber] colored wax- The growth on glucose-asparagine agar was carried out with thin air threads from light brownish-gray to light- 20 ° C, 24 ° C, 27 ° C, 30 ° C, 37 ° C and 50 ° C examined. The gray color. Soluble pigment is pale yellow in color. MC916-C4 strain developed in all examined tem-

(2) Auf Glukose-Aspargin-Agar (inkubiert bei 27 °C) : peraturen, ausgenommen bei 50 °C. Die optimale Temperatur Dumpfgelb-orange [3nc, Amber ibs 4pe, Orange Rust] gefärb- 40 für gutes Wachstum wurde in der Nähe von 30 °C beobachtet, tes Wachstum entwickelt Luftfäden von hellgrauer bis hell- (2) Verflüssigung von Gelatine: (2) On glucose-asparagine agar (incubated at 27 ° C): temperatures, except at 50 ° C. The optimal temperature dull yellow-orange [3nc, Amber ibs 4pe, Orange Rust] colored- 40 for good growth was observed near 30 ° C, t growth developed air threads from light gray to light- (2) liquefaction of gelatin:

bräunlich-grauer Farbe [2ih, DK Co vert Gray]. Flüssiges Pig- Leeres Gelatinemedium ( 15%) begann nicht vom fünften ment ist schwachgelb gefärbt. Tag der Inkubation bei 20 °C an zu verflüssigen. Der Grad der brownish-gray color [2ih, DK Co vert Gray]. Liquid Pig- Empty gelatin medium (15%) did not start from the fifth ment is colored pale yellow. Liquefy the day of incubation at 20 ° C. The degree of

(3) Auf Glycerin-Aspargin-Agar (ISP No. 5 Medium, inku- Verflüssigung war mittel. Die Gelatine (15%) in Glucose-Pep-biert bei 27 °C): Dunkelgelb-orange bis gelblich-braun [3pi, Gol- 45 ton-Gelatin-Medium begann sich vom zweiten Tag der Inkuba-den Brown] gefärbtes Wachstum entwickelt Luftfäden von tion an zu verflüssigen, wenn bei 27 °C inkubiert wurde, und der bräunlich-grauer [3ih, Beige Gray] bis grauer [5ih, Shadow Gray] Grad der Verflüssigung war dann mittel bis stark. (3) On glycerol-asparagine agar (ISP No. 5 medium, inku liquefaction was medium. The gelatin (15%) in glucose-pep-biert at 27 ° C): dark yellow-orange to yellowish-brown [3pi, Gold 45 ton gelatin medium began to liquefy air filaments from tion onwards when incubated at 27 ° C, and the brownish gray [3ih, beige gray] to gray from the second day of Incuba's brown] colored growth [5ih, Shadow Gray] The degree of liquefaction was then medium to strong.

Farbe. Lösliches Pigment mit gelblicher Färbung bis gelblich- (3) Hydrolyse von Stärke: Colour. Soluble pigment with yellowish color to yellowish- (3) hydrolysis of starch:

brauner Färbung wird erzeugt. Stärke in anorganischen Salzen-Stärke-Agar-Medium und brown color is generated. Starch in inorganic salts, starch agar medium and

(4) Auf anorganischen Salzen-Stärke-Agar (ISP No. 4 so in Stärke-Agar-Medium wurde vom fünften Tag der Inkubation Medium, inkubiert bei 27 °C): Hellgelblich-braun bis gelblich- an hydrolysiert, wenn bei 27 °C inkubiert wurde. Der Grad an braun [3pi, Golden Brown] gefärbtes Wachstum entwickelt Hydrolyse war mittel bis stark. (4) On inorganic salt-starch agar (ISP No. 4 so in starch agar medium was incubated from the fifth day of the incubation medium, incubated at 27 ° C.): pale yellowish-brown to yellowish when hydrated at 27 ° C was incubated. The degree of brown [3pi, Golden Brown] growth developing hydrolysis was medium to strong.

Luftfäden von hellbräunlich-grauer [3fe, Silver Gray] Farbe. (4) Koagulation und Peptonisierung von entrahmter Milch: Air threads of light brownish-gray [3fe, silver gray] color. (4) Coagulation and peptonization of skimmed milk:

Lösliches Pigment ist braun gefärbt. Die Rückseite des Wachs- Bei einer Inkubierung bei 37 °C begann die Koagulation tums ist dunkelgelblich-braun. 55 von entrahmter Milch am vierten Tag der Inkubation und die Soluble pigment is colored brown. The back of the wax- When incubated at 37 ° C the coagulation started is dark yellowish brown. 55 of skimmed milk on the fourth day of incubation and the

(5) Auf Tyrosin-Agar (ISP No. 7 Medium, inkubiert bei Peptonisierung wurde vom fünften Tag der Inkubation an 27 °C): Dunkelgelb bis gelblich-braun [4pg, Dark Luggage Tan] beobachtet, nachdem die Koagulation vollendet war. Die gefärbtes Wachstum trägt Luftfäden von hellbräunlich-grauer Grade an Koagulation und Peptonisierung waren mittel bis Farbe. Lösliches Pigment ist dunkelgelb gelblich-braun gefärbt, stark. (5) On tyrosine agar (ISP No. 7 medium, incubated with peptonization was observed from the fifth day of incubation at 27 ° C.): dark yellow to yellowish brown [4pg, dark luggage tan] after coagulation was complete. The colored growth carries aerial threads of light brownish-gray degrees of coagulation and peptonization were medium to color. Soluble pigment is dark yellow, yellowish-brown in color, strong.

(6) Auf Nähragar (inkubiert bei 27 °C): Das Wachstum ist 60 (5) Bildung von Melanoidpigmenten: (6) On nutrient agar (incubated at 27 ° C): the growth is 60 (5) formation of melanoid pigments:

hellgelblich-braun bis hellbraun gefärbt, ohne Luftfäden. Lösli- Es wurde keine Pigmentierung beobachtet weder auf Tryp- light yellowish brown to light brown colored, without air threads. Soluble- No pigmentation was observed neither on tryp-

ches Pigment ist schwach braun getönt. ton-Hefeextraktbrühe (ISP No. 1 Medium), noch auf Pepton- The pigment is tinted slightly brown. clay yeast extract broth (ISP No. 1 medium), still on peptone

(7) Auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP No. 2 Medium, Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP No. 6 Medium), noch auf Tyrosin-inkubiert bei 27 °C): Gelblich-braun [4pg, Dark Luggage Tan] Agar (ISP No. 7 Medium) bei einer Inkubation bei 27 °C. (7) On yeast extract-malt extract agar (ISP No. 2 medium, yeast extract iron agar (ISP No. 6 medium), still on tyrosine incubated at 27 ° C): yellowish brown [4pg, dark luggage tan] Agar (ISP No. 7 Medium) when incubated at 27 ° C.

bis gelb-orange [4pe, Orange Rust] gefärbtes Wachstum ent- 65 (6) Verwertung von Kohlenstoffquellen für das Wachstum: to yellow-orange [4pe, Orange Rust] colored growth - 65 (6) utilization of carbon sources for growth:

wickelt Luftfäden von hellgrauer [2fe, Covert Gray] bis hell- Die Verwertung der folgenden Kohlenhydrate wurde in bräunlich-grauer [2ih, Dark Covert Gray] Farbe. Lösliches Pig- Pridham-Gottlieb-Agar-Medium (ISP No. 9 Medium), inkubiert ment von gelblich-brauner bis brauner Farbe werden erzeugt. bei 27 °C, untersucht. winds air threads from light gray [2fe, Covert Gray] to light- The utilization of the following carbohydrates was in brownish-gray [2ih, Dark Covert Gray] color. Soluble Pig-Pridham-Gottlieb agar medium (ISP No. 9 medium), incubated ment of yellowish-brown to brown color are generated. at 27 ° C, examined.

Glucose und L-Rhamnose wurden für das Wachstum verwertet. L-Arabinose, D-Fructose, Sacharose, Inosit und D-Man-nit wurden nicht verwertet. Die Verwertung von D-Xylose war zweifelhaft. Raffinose wurde manchmal verwertet, in anderen Fällen nicht. Glucose and L-rhamnose were used for growth. L-arabinose, D-fructose, sucrose, inositol and D-man-nit were not used. The utilization of D-xylose was doubtful. Raffinose was sometimes used, in other cases not.

(7) Verflüssigung von Calciummalat: (7) Liquefaction of calcium malate:

Calciummalat in Calciummalat-Agar-Medium wurde um das Wachstum herum verflüssigt vom neunten Tag der Inkubation an, bei einer Inkubationstemperatur von 27 °C. Der Grad der Verflüssigung war mittel bis stark. Calcium malate in calcium malate agar medium was liquefied around the growth from the ninth day of incubation, at an incubation temperature of 27 ° C. The degree of liquefaction was medium to strong.

(8) Reduktion von Nitrat: (8) Reduction of nitrate:

Die Reduktion von Nitrat wurde in wässerigen Peptonlö-sungen, welche 1,0% Natriumnitrat enthielt (ISP No. 8 Medium), inkubiert bei 27 °C, beobachtet. The reduction of nitrate was observed in aqueous peptone solutions containing 1.0% sodium nitrate (ISP No. 8 medium), incubated at 27 ° C.

Unter Zusammenfassung der oben erwähnten Eigenschaften des MC916-C4-Stammes kann festgestellt werden, dass der Stamm zu der Gattung Streptomyces gehört und dass die Luftfäden offene Spiralen bilden, aber keine Schlingen entwickeln. Die Oberfläche der Sporen ist glatt bei mikroskopischer Beobachtung. Auf verschiedenen Medien weist das Wachstum eine Farbe von gelb-orange bis gelblich-braun auf und entwickelt Luftfäden von hellbräunlich-grauer bis bräunlich-grauer Farbe. Das lösliche Pigment ist gelb bis braun oder gelblich-braun getönt. Es wird kein Melanoidpigment erzeugt. Die Proteolyse und die Stärkehydrolyse sind von mittlerem bis starkem Grad. In summary of the properties of the MC916-C4 strain mentioned above, it can be said that the strain belongs to the genus Streptomyces and that the air threads form open spirals but do not develop loops. The surface of the spores is smooth when viewed microscopically. On different media, the growth has a color from yellow-orange to yellowish-brown and develops air threads from light brownish-gray to brownish-gray color. The soluble pigment is tinted yellow to brown or yellowish brown. No melanoid pigment is produced. Proteolysis and starch hydrolysis are of medium to strong degree.

Aufgrund der oben erwähnten Eigenschaften wurde der MC916-C4-Stamm mit bekannten analogen Arten von Streptomyces verglichen, unter Bezugnahme auf Beschreibungen des International Streptomyces Project (ISP). Es wurde gefunden, Because of the properties mentioned above, the MC916-C4 strain was compared to known analog types of Streptomyces, with reference to descriptions by the International Streptomyces Project (ISP). It was found,

dass der MC916-C4-Stamm dem Streptomyces naraensis gleicht (siehe «International Journal of Systematic Bacterio-logy», Volumen 22, Seite 323 [1972]). Es wurde jedoch festgestellt, dass der MC916-C4-Stamm verschieden ist von Strepto-s myces naraensis ISP 5508 in bezug auf die Verwertung von Kohlenstoffquellen. Streptomyces naraensis erzeugt Cyclohe-ximid, ähnlich wie MC916-C4-Stamm. Ferner wurde gefunden, dass unter dem Cycloheximid erzeugenden Stämmen die Stämme der Gruppe C, welche analog dem Streptomyces gri-io seolus sind, wie in einem Artikel von T. Furumai und Mitarbeitern, «On cycloheximide-producing microrganisms» (siehe «Journal of Antibiotics», Ser.B., Volumen 17, No. 4, Seite 181 [1964]) sehr ähnlich dem MC916-C4-Stamm sind. that the MC916-C4 strain is similar to Streptomyces naraensis (see “International Journal of Systematic Bacterio-logy”, volume 22, page 323 [1972]). However, the MC916-C4 strain was found to be different from Strepto-s myces naraensis ISP 5508 in terms of carbon source utilization. Streptomyces naraensis produces cycloheximide, similar to MC916-C4 strain. It was also found that among the strains producing cycloheximide, the strains of group C, which are analogous to Streptomyces gri-io seolus, as in an article by T. Furumai and co-workers, “On cycloheximide-producing microrganisms” (see “Journal of Antibiotics », Ser.B., Volume 17, No. 4, page 181 [1964]) are very similar to the MC916-C4 strain.

Der MC916-C4-Stamm ist in mancher Beziehung mit den 15 Stämmen dieser Gruppe C übereinstimmend, doch wurde der MC916-C4-Stamm nicht auf die Eigenschaften der Hemolyse, Verflüssigung von Serum und Verwertung von Galactose und Lactose untersucht, welche bei den Stämmen der Gruppe C vorhanden sind. Diese Stämme der Gruppe C waren jedoch 20 nicht erhältlich, da sie bereits tot waren. In dieser Situation wurde der Vergleich des MC916-C4-Stammes mit Streptomyces sp. IFO 3300 durchgeführt, welcher bekanntlich Fermicidin erzeugt, ein antibiotisches Analogon von Cycloheximid, und im oben genannten Artikel von T. Furumai und Mitarbeitern als 25 gut übereinstimmend mit den Stellen der Gruppe C genannt wird. Die Vergleichsresultate sind in der folgenden Tabelle V zusammengestellt, unter Bezugnahme auf die Beschreibungen des «Journal of Antibiotics». The MC916-C4 strain is consistent in some respects with the 15 strains of this Group C, but the MC916-C4 strain has not been tested for the properties of hemolysis, liquefaction of serum, and utilization of galactose and lactose, which were found in the strains of Group C are present. However, these Group C strains were not available 20 because they were already dead. In this situation the comparison of the MC916-C4 strain with Streptomyces sp. IFO 3300 carried out, which is known to produce fermicidin, an antibiotic analogue of cycloheximide, and is mentioned in the above article by T. Furumai and coworkers as 25 in good agreement with the positions of group C. The comparison results are summarized in Table V below, with reference to the descriptions of the "Journal of Antibiotics".

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8 8th

Tabelle V Table V

Eigenschaften properties

MC916-C4-Stamm MC916-C4 strain

Streptomyces sp. IFO Beschreibung von 330 (Analogen zu Streptomyces sp. IFO Streptomyces griseolus) 330 aus der Literatur* Streptomyces sp. IFO description of 330 (analogs to Streptomyces sp. IFO Streptomyces griseolus) 330 from the literature *

Beschreibung der Stämme der Gruppe C aus der Literatur Description of the strains of group C from the literature

Bildung von Spiralen Sporenoberfläche Farbe der Luftfäden Formation of spirals Spore surface Color of the air threads

Farbe des Wachstums Lösliches Pigment Color of growth Soluble pigment

+ glatt + smooth

± (+) hellbräunlich-grau bis glatt** ± (+) light brown-gray to smooth **

Bildung von melaninartigem Pigment auf ISP No. 1 Medium - Formation of melanin-like pigment on ISP No. 1 medium -

auf ISP No. 6 Medium - on ISP No. 6 medium -

auf ISP No. 7 Medium - on ISP No. 7 medium -

Hydrolyse von Stärke + Hydrolysis of starch +

Koagulation von Milch + Coagulation of milk +

Peptonisierung von Milch + Peptonization of milk +

Verflüssigung von Gelatine in leerem + Gelatinemedium in Glucose-Pepton-Gelatine-Medium + Reduktion von Nitrat + Liquefaction of gelatin in empty + gelatin medium in glucose-peptone-gelatin medium + reduction of nitrate +

Verwertung von Kohlenstoffquellen Glukose + Utilization of carbon sources glucose +

L-Arabinose - L-arabinose -

D-Xylose ± D-xylose ±

D-Fractose - D-Fractose -

Saccharose - Sucrose -

Inosit - Inositol -

L-Rhamnose Raffinose D-Mannit L-rhamnose raffinose D-mannitol

Erzeugte Antibiotika hellbräunlich-grau bis bräunlich-grau bräunlich-grau gelb-orange bis farblos bis schwach gelblich-braun gelblich-braun gelb bis brauner Ton keines oder mit oder gelblich-braun brauner Tönung Antibiotics produced light brownish-gray to brownish-gray brownish-gray yellow-orange to colorless to slightly yellowish-brown yellowish-brown yellow to brown tone none or with or with yellowish-brown brown tint

+ + + + + + + + + + + +

+ + + +

(+) + ± ± (+) + ± ±

Cycloheximid und Neothramycin-A und grau crèmeartig bis braun getönt keines oder mit brauner Tönung Cycloheximide and Neothramycin-A and gray creamy to brown tinted none or with a brown tint

_** _** _ ** _ **

+ +

glatt bräunlich-grau schwach verflüssigt, + smooth brownish-gray slightly liquefied, +

+ + + + + + + +

in gewissen Fällen +, in anderen Fällen - in some cases +, in other cases -

Fermicidin (Antibiotikum analog zu Cycloheximid) Fermicidin (antibiotic analogous to cycloheximide)

Cycloheximid Cycloheximide

Anmerkung: Annotation:

Literatur * bedeutet «Journal of Antibiotics», Ser. B, Volumen 7, No. 7, Seite 221 (1954). Literature * means "Journal of Antibiotics", Ser. B, volume 7, No. 7, page 221 (1954).

Literatur **bedeutet «Journal of Antibiotics», Ser. B, Volumen 17, No. 4, Seite 181 (1964). Literature ** means "Journal of Antibiotics", Ser. B, volume 17, No. 4, page 181 (1964).

Bezüglich der Verwertung von Kohlenstoffquellen: Das Symbol ± bedeutet: wahrscheinlich keine Verwertung. Regarding the recycling of carbon sources: The symbol ± means: probably no recycling.

Das Symbol (+) bedeutet) wahrscheinliche Verwertung. The symbol (+) means) probable recovery.

Wie aus der obigen Tabelle ersichtlich, ist der MC916-C4- von Nitrat und vom Stamm ISP 5067 in bezug auf die Bildung Stamm übereinstimmend mit dem Stamm der Gruppe C, wel- von Spiralen, die Verwertung der Kohlenstoffquellen und die eher in der oben erwähnten Literatur beschrieben ist, jedoch so Reduktion von Nitrat. As can be seen from the above table, the MC916-C4- of nitrate and of the ISP 5067 strain is consistent in formation strain with the group C strain, which of spirals, the utilization of carbon sources, and the ones mentioned earlier Literature is described, however, so reduction of nitrate.

verschieden von Streptomyces sp. Stamm IFO 3300 in bezug Mutationen von Actinomyceten treten oft auf sowohl unter auf die Koagulation und die Peptonisierung von Milch. künstlichen wie unter spontanen Bedingungen. Die vorliegende different from Streptomyces sp. IFO 3300 strain related to mutations of Actinomycetes often occur under both the coagulation and peptonization of milk. artificial as well as under spontaneous conditions. The present

Ferner unterscheidet sich der Stamm MC916-C4 von Strep- Erfindung umfasst daher die Verwendung des Stammes tomyces griseolus (siehe «International Journal of Systematic MC916-C4 sowie dessen Mutanten. Mit anderen Worteii, Bacteriology», Volumen 18, Seite 122 [1968]), welcher als ähn- ss umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung aller lieh dem genannten Stamm IFO 3300 beschrieben wurde, in Stämme der Gattung Streptomyces, welche Neothramycin dem Streptomyces griseolus keine offenen Spiralen in den Luft- erzeugen. Furthermore, the MC916-C4 strain differs from Strep; the invention therefore includes the use of the tomyces griseolus strain (see “International Journal of Systematic MC916-C4 and its mutants. In other words III, Bacteriology”, volume 18, page 122 [1968]) which, as a similar, comprises the present invention has described the use of all the strains mentioned IFO 3300 in strains of the genus Streptomyces which neothramycin to Streptomyces griseolus do not produce open spirals in the air.

fäden bildet und etwas verschieden vom Stamm MC916-C4 in Neothramycin kann erhalten werden durch aerobe Kulti- threads and somewhat different from the MC916-C4 strain in neothramycin can be obtained by aerobic cultivation

bezug auf die Verwertung der Kohlenstoffquellen ist. Weitere vierung von Sporen oder Mycelien eines Neothramycin erzeu-Vergleiche des Stammes MC916-C4 mit Streptomyces sp. IFO 60 genden Stammes der Gattung Streptomyces, wie z. B. Strepto-3300, Streptomyces griseolus ISP 5067 und Streptomyces nara- myces sp. Stamm MC916-C4 (identifiziert als A.T.C.C. 31123). ensis ISP 5508 wurden aufgeführt. Es wurde gefunden, dass der Bei der Durchführung des Verfahrens wird eine Menge Sporen Stamm MC916-C4 mit Streptomyces Sp. IFO 3300 und Strepto- oder Mycelien eines Neothramycin erzeugenden Stammes in myces naraensis ISP 5508 und den meisten früheren Stämmen ein dafür geeignetes Kulturmedium, welches Nährquellen entverwandt ist. Der Stamm IFO 3300 ist etwas verschieden vom 65 hält, geimpft und anschliessend unter aeroben Bedingungen Stamm MC916-C4, indem er einen Strich orange in der Farbe und vorzugsweise unter submersen aeroben Bedingungen, des Wachstums aufweist. Der Stamm MC916-C4 unterscheidet bebrütet, so dass eine Kulturbrühe erhalten wird, welche Neo-sich klar vom Stamm ISP 5508 in bezug auf die Reduzierung thramyein enthält. Im allgemeinen können die üblicherweise with regard to the utilization of carbon sources. Further crossing of spores or mycelia of a neothramycin - comparisons of the MC916-C4 strain with Streptomyces sp. IFO 60 gene strain of the genus Streptomyces, such as. B. Strepto-3300, Streptomyces griseolus ISP 5067 and Streptomyces narmyces sp. MC916-C4 strain (identified as A.T.C.C. 31123). ensis ISP 5508 were listed. It was found that when carrying out the method, a lot of spores strain MC916-C4 with Streptomyces Sp. IFO 3300 and strepto- or mycelia of a neothramycin-producing strain in myces naraensis ISP 5508 and most previous strains became a suitable culture medium, which was Nutrient sources is related. The strain IFO 3300 is slightly different from 65, vaccinated and then under aerobic conditions strain MC916-C4 by having a dash of orange in color and preferably under submerged aerobic conditions of growth. The MC916-C4 strain is incubated differently so that a culture broth is obtained which contains Neo-clear from the ISP 5508 strain in terms of thramyein reduction. In general, they can usually

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für die Kultivierung gewöhnlicher Actinomyceten verwendeten Bestandteile von Kulturmedien für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel kann im Handel erhältliches Sojamehl, Erdnusspulver, Baumwollsamenpulver, getrocknete Hefe, Pepton, Fleischextrakt, Casein, 5 Maiseinweichflüssigkeit, N-Z-Amin, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und dergleichen als Stickstoffquelle verwendet werden. Im Handel erhältliche Kohlenhydrate, wie Glukose, components of culture media used for the cultivation of ordinary actinomycetes can be used for the purposes of the present invention. For example, commercially available soy flour, peanut powder, cottonseed powder, dried yeast, peptone, meat extract, casein, corn steep liquor, N-Z amine, ammonium nitrate, ammonium sulfate and the like can be used as a nitrogen source. Commercially available carbohydrates, such as glucose,

Stärke, Glycerin, Maltose, Dextrin, Saccharose, Lactose, Melassen und dergleichen sowie Fett oder Öl sind nützlich als 10 Kohlenstoffquelle. Ausserdem können Natriumchlorid, Kalzi-umcarbonat, Magnesiumsulfat, Manganchlorid, Natriumphosphat oder andere anorganische Salze als Salzzusatz im Kulturmedium verwendet werden. Verschiedene Schwermetallsalze können ebenfalls in Spuren zugesetzt werden, falls erforderlich. 15 Alle Nährstoffe, welche für die Züchtung von Actinomyceten bekannt sind, können im vorliegenden Verfahren verwendet werden, solange sie vom Neothramycin erzeugenden Stamm für die Erzeugung von Neothramycin assimiliert werden können. 20 Starch, glycerin, maltose, dextrin, sucrose, lactose, molasses and the like, and fat or oil are useful as a carbon source. In addition, sodium chloride, calcium carbonate, magnesium sulfate, manganese chloride, sodium phosphate or other inorganic salts can be used as a salt additive in the culture medium. Various traces of heavy metal salts can also be added if necessary. 15 All nutrients known for the cultivation of Actinomycetes can be used in the present method as long as they can be assimilated by the neothramycin-producing strain to produce neothramycin. 20th

Für die Erzeugung von Neothramycin in grösserem Massstab wird die flüssige Kultivierung bevorzugt. Jede Temperatur, bei welcher der Neothramycin erzeugende Stamm fähig ist zu wachsen und das Neothramycin zu erzeugen, kann für die Kultivierung verwendet werden, doch liegt eine bevorzugte Kulti- 25 vierungstemperatur im Bereich von 25 bis 35 °C. Die Kultivierung wird während genügend langer Zeit fortgesetzt, um eine genügende Menge an Neothramycinen-A und -B im Kulturmedium zu erzeugen und anzusammeln. Beispielsweise wurde ein Kulturmedium, welches 2% Glukose, 2% Glycerin, 1,2% Soja- 30 bohnenmehl, 1,0% Baumwollsamenmehl, 0,32% Kalziumcarbo-nat, 0,5% Natriumchlorid und 0,0005% Manganchlorid-Tetrahydrat enthielt, zubereitet und bei pH 6,8 sterilisiert. Dieses Medium wurde sodann mit Sporen oder Mycelien beimpft, welche aus einer Schrägkultur des Stammes MC916-C4 gewon- 35 nen worden waren. In einer aeroben Schüttelkultur bei 28 °C erreichte die Erzeugung und Ansammlung von Neothramycin im Kulturmedium ein Maximum am Ende der Inkubation von 3 bis 5 Tagen. Liquid cultivation is preferred for the production of neothramycin on a larger scale. Any temperature at which the neothramycin-producing strain is capable of growing and producing the neothramycin can be used for the cultivation, but a preferred cultivation temperature is in the range of 25 to 35 ° C. Cultivation is continued for a sufficient period of time to generate and accumulate a sufficient amount of neothramycin A and B in the culture medium. For example, a culture medium containing 2% glucose, 2% glycerin, 1.2% soybean meal, 1.0% cottonseed meal, 0.32% calcium carbonate, 0.5% sodium chloride and 0.0005% manganese chloride tetrahydrate contained, prepared and sterilized at pH 6.8. This medium was then inoculated with spores or mycelia, which had been obtained from an oblique culture of the MC916-C4 strain. In an aerobic shake culture at 28 ° C, the generation and accumulation of neothramycin in the culture medium reached a maximum of 3 to 5 days at the end of the incubation.

Die Prüfung von Neothramycin kann unter Verwendung 40 von Staphylococcus aureus oder Escherichia coli als Testorganismen nach einer Standard-Plattenmethode durchgeführt werden, welche üblicherweise für die Prüfung bekannter Antibiotika verwendet wurde. Ein authentisch reines Neothramycin-A, welches aus dem später beschriebenen Beispiel 4 erhalten 45 wurde, kann als Standard-Probe verwendet werden, welche eine Potenz von 1000 Einheiten pro Milligramm aufweist. Falls die anderen antibiotischen Substanzen, wie Cycloheximid, gleichzeitig in der Kulturbrühe des Stammes MC916-C4 zusätzlich zu den Neothramycin erzeugt werden, kann die Kultur- 50 brühe mit Äthylacetat oder einem anderen geeigneten organischen Lösungsmittel gewaschen werden, um derartige andere antibiotische Substanzen durch Extraktion zu entfernen. Die verbleibende wässrige Phase kann dann für die Prüfung des Gehaltes an Neothramycin-A und -B nach der oben genannten 55 Methode verwendet werden. Neothramycin testing can be performed using Staphylococcus aureus or Escherichia coli as test organisms using a standard plate method commonly used for testing known antibiotics. An authentically pure neothramycin-A obtained from Example 4 described later 45 can be used as a standard sample which has a potency of 1000 units per milligram. If the other antibiotic substances such as cycloheximide are simultaneously produced in the culture broth of the MC916-C4 strain in addition to the neothramycin, the culture broth can be washed with ethyl acetate or another suitable organic solvent to extract such other antibiotic substances remove. The remaining aqueous phase can then be used for testing the content of neothramycin A and B according to the 55 method mentioned above.

Für die Gewinnung des Neothramycin aus dem Kulturmedium kann die Kulturbrühe des Neothramycin erzeugenden Stammes entweder mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie n-Butanol, behandelt werden, um einen 60 Extrakt des Neothramycins in diesem Lösungsmittel zu ergeben, oder mit einem geeigneten Adsorbens, wie z. B. Aktivkohle, behandelt werden, um das Neothramycin durch das Adsorptionsmittel zu adsorbieren. Die Verteilung des Neothra-mycin-A oder Neothramycin-B zwischen n-Butanol und Wasser 65 wurde geprüft, und es wurde gefunden, dass der Verteilungskoeffizient des Neothramycins in n-Butanol/Wasser grösser als 5 ist bei einem pH-Wert von 2 bis 7. Das Neothramycin kann For the recovery of the neothramycin from the culture medium, the culture broth of the neothramycin-producing strain can either be treated with a suitable organic solvent, such as n-butanol, to give an extract of the neothramycin in this solvent, or with a suitable adsorbent, e.g. . B. activated carbon, can be treated to adsorb the neothramycin by the adsorbent. The distribution of neothra-mycin-A or neothramycin-B between n-butanol and water 65 was checked, and it was found that the distribution coefficient of the neothramycin in n-butanol / water was greater than 5 at a pH of 2 to 7. The neothramycin can

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daher mit n-Butanol aus der wässerigen Kulturbrühe, welche auf einem pH-Wert von2 bis 7 und vorzugsweise von etwa 6 eingestellt wurde, extrahiert werden. Das Neothramycin ist mit Äthylacetat oder Chloroform aus dem flüssigen Teil der Kulturbrühe praktisch nicht extrahierbar. Falls erforderlich, ist es daher möglich, die Kulturbrühe mit Äthylacetat oder Chloroform für die Extraktion zu behandeln, um die löslichen Verunreinigungen aus der Kulturbrühe zu entfernen. Um das Neothramycin aus der Kulturbrühe abzutrennen, wird bevorzugt, die Kulturbrühe mit Aktivkohle als Adsorptionsmittel zu behandeln. Das Neothramycin, welches durch Aktivkohle adsorbiert wurde, kann daraus mit Hilfe von Methanol und Wasser, eines Gemisches von Propanol und Wasser oder eines Gemisches von Aceton und Wasser usw. eluiert werden. Die Wirksamkeit der Eluierung kann verbessert werden, wenn die Eluierung unter schwach alkalischen Bedingungen erfolgt. Die Reinigung des Neothramycins kann unter Anwendung der oben erwähnten Extraktionsmethode und Adsorptions-Eluie-rungsmethode in geeigneter Kombination oder auf wiederholte Weise erfolgen. Eine weitere Reinigung kann durch eine übliche Säulenchromatographie an «Sephadex LH-20» (ein Handelsprodukt der Pharmacia Co., Schweden) oder an Silicagel erzielt werden. Das bekannte antibiotische Cycloheximid, welches oft in der Kulturbrühe des Stammes MC916-C4 gleichzeitig auftritt, kann leicht vom Neothramycin getrennt werden durch Extrahieren mit Äthylacetat oder durch Chromatographie an «Sephadex LH-20». therefore extracted with n-butanol from the aqueous culture broth, which has been adjusted to a pH of 2 to 7 and preferably of about 6. The neothramycin is practically not extractable from the liquid part of the culture broth with ethyl acetate or chloroform. Therefore, if necessary, it is possible to treat the culture broth with ethyl acetate or chloroform for extraction to remove the soluble impurities from the culture broth. In order to separate the neothramycin from the culture broth, it is preferred to treat the culture broth with activated carbon as an adsorbent. The neothramycin adsorbed by activated carbon can be eluted therefrom with the help of methanol and water, a mixture of propanol and water or a mixture of acetone and water, etc. The effectiveness of the elution can be improved if the elution is carried out under weakly alkaline conditions. The purification of the neothramycin can be carried out in a suitable combination or in a repeated manner using the extraction method and adsorption elution method mentioned above. Further purification can be achieved by conventional column chromatography on “Sephadex LH-20” (a commercial product from Pharmacia Co., Sweden) or on silica gel. The well-known antibiotic cycloheximide, which often occurs simultaneously in the culture broth of the MC916-C4 strain, can easily be separated from the neothramycin by extraction with ethyl acetate or by chromatography on «Sephadex LH-20».

Um das Neothramycin-A vom Neothramycin-B zu trennen, kann ein Gemisch von Neothramycin-A und Neothramycin-B einer Säulenchromatographie an Silicagel mit Chloroform-Methanol (30:1 Volumverhältnis) als Entwickler unterworfen werden. Das isolierte Neothramycin-A oder das isolierte Neothramycin-B kann durch Säulenchromatographie auf Silicagel unter Anwendung eines geeigneten Gemisches organischer Lösungsmittel als Entwickler gereinigt werden. In order to separate neothramycin-A from neothramycin-B, a mixture of neothramycin-A and neothramycin-B can be subjected to column chromatography on silica gel with chloroform-methanol (30: 1 volume ratio) as developer. The isolated neothramycin-A or the isolated neothramycin-B can be purified by column chromatography on silica gel using a suitable mixture of organic solvents as a developer.

Die Gewinnung des Neothramycin-A und Neothramycm-B kann z. B. auf folgende Weise durchgeführt werden: Die Kulturbrühe, welche das Neothramycin enthält, wird zuerst filtriert oder zentrifugiert, um die Feststoffe zusammen mit dem Mycélium zu entfernen. Das Filtrat wird sodann mit Aktivkohle behandelt, um das Neothramycin daraus zu adsorbieren. Die Aktivkohle, welche das adsorbierte Neothramycin trägt, wird mit 50% Aceton-Wasser (ein Gemisch von Aceton und Wasser in einem Volumverhältnis von 1:1) bei pH 8,0 eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen gesammelt und die aktiven Fraktionen werden vereint und unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von bis zu 40 °C zur Trockene verdampft oder aber gefriergetrocknet, um ein rohes Neothramycin enthaltendes Pulver zu ergeben. Dieses rohe Pulver wird mit wässerigem Äthanol extrahiert, so dass ein grösserer Teil der aktiven Komponenten im erhaltenen Extrakt abgetrennt wird. Dieser Extrakt wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von bis zu 40 °C zur Trockene verdampft oder gefriergetrocknet, um ein zweites rohes Pulver zu ergeben. Eine Lösung dieses rohen Pulvers in Methanol wird durch eine Säule von «Sephadex LH-20» geleitet, welche anschliessend mit Methanol entwickelt wird. Während dieses chromatographischen Verfahrens wird das gegebenenfalls vorhandene Cycloheximid in Fraktionen eluiert, welche in der ersten Phase des Verfahrens auslaufen, während das Gemisch von Neothramycin-A und -B in Fraktionen eluiert wird, welche in einer späteren Phase der Eluierung auslaufen. The extraction of Neothramycin-A and Neothramycm-B can e.g. The culture broth containing the neothramycin is first filtered or centrifuged to remove the solids together with the mycelium. The filtrate is then treated with activated carbon to adsorb the neothramycin therefrom. The activated carbon, which carries the adsorbed neothramycin, is eluted with 50% acetone-water (a mixture of acetone and water in a volume ratio of 1: 1) at pH 8.0. The eluate is collected in fractions and the active fractions are combined and evaporated to dryness under reduced pressure at a temperature of up to 40 ° C or freeze-dried to give a crude powder containing neothramycin. This raw powder is extracted with aqueous ethanol, so that a larger part of the active components in the extract obtained is separated. This extract is evaporated to dryness or freeze-dried under reduced pressure at a temperature of up to 40 ° C to give a second raw powder. A solution of this raw powder in methanol is passed through a column of «Sephadex LH-20», which is then developed with methanol. During this chromatographic process, the cycloheximide, if present, is eluted in fractions which expire in the first phase of the process, while the mixture of neothramycin A and -B is eluted in fractions which expire in a later phase of the elution.

Die aktiven Fraktionen, welche das Neothramycin-A und -B enthalten, werden vereint und sodann unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 °C zur Trockene verdampft, um ein rohes Puler zu ergeben. Dieses Pulver wird in einem kleinen Volumen Methanol aufgenommen und die methanolische Lösung gleichmässig mit einer gewissen Menge an The active fractions containing the neothramycin A and B are combined and then evaporated to dryness under reduced pressure at a temperature up to 40 ° C to give a crude powder. This powder is taken up in a small volume of methanol and the methanolic solution evenly with a certain amount of

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neutralem Silicagel vermischt. Das Gemisch wird zur Trockene Trockene verdampft, wodurch ein authentish reines, farbloses verdampft und anschliessend auf den Kopf einer Säule aus Pulver von Neothramycin-B erhalten wird, welches eine Zer- neutral silica gel mixed. The mixture is evaporated to dryness, which vaporizes an authentically pure, colorless and is then obtained on the top of a column of powder of neothramycin-B, which contains a

einer weiteren Menge dieses neutralen Silicagels verbracht, setzungstemperatur von 144 bis 151 °C und eine spezifische welche mit einem Gemisch von Chloroform und Äthanol (30:1 optische Drehung [a]D26 = +314° (c 0,48, Dioxan) aufweist. Volumverhältnis) imprägniert wurde. Die Silicagelsäule wird 5 im Hinblick auf die oben genannten Eigenschaften von anschliessend mit Chloroform-Äthanol (30:1 Volumverhältnis) Neothramycin-A und Neothramycin-B wurde bestätigt, dass entwickelt. Während dieses Chromatographieverfahrens wird diese Substanzen neue Antibiotika sind, welche sich von allen das Neothramycin-A in die aktiven Fraktionen eluiert, welche in bekannten Antibiotika unterscheiden. Diese neuen Verbindun-der ersten Phase des Verfahrens auslaufen, während das Neo- gen können zur therapeutischen Behandlung eines lebenden thramycin-B in aktiven Fraktionen eluiert wird, welche in der io tierischen oder menschlichen Körpers, welcher an Leukämie späteren Phase des Verfahrens auslaufen. Die aktiven Fraktio- leidet, verwendet werden. Zu diesem Zweck kann ein pharma-nen, welche das Neothramycin-A enthalten, und die aktiven zeutisches Präparat hergestellt werden, welches mindestens Fraktionen, welche das Neothramycin-B enthalten, werden eine der Verbindungen Neothramycin-A, Neothramycin-B, unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 °C Methylneothramycin-A und Methylneothramycin-B, sowie zur Trockene verdampft, um ein rohes Pulver zu ergeben, wel- 15 deren pharmazeutisch annehmbare Salze in genügender ches das Neothramycin-A enthält, sowie ein rohes Pulver, wel- Menge enthält, um die Leukämie in vivo herabzusetzen, wobei ches das Neothramycin-B enthält. der aktive Bestandteil mit einem pharmazeutisch annehmaren another amount of this neutral silica gel, set temperature of 144 to 151 ° C and a specific which with a mixture of chloroform and ethanol (30: 1 optical rotation [a] D26 = + 314 ° (c 0.48, dioxane). Volume ratio) was impregnated. The silica gel column was developed 5 in view of the above-mentioned properties of subsequently using chloroform-ethanol (30: 1 volume ratio) neothramycin-A and neothramycin-B. During this chromatography process, these substances will be new antibiotics that will elute from all of the neothramycin-A into the active fractions that differ in known antibiotics. These new compounds expire the first phase of the process, while the neogen can be eluted for the therapeutic treatment of a living thramycin-B in active fractions which are in the animal or human body, which expire later in the process from leukemia. The active fraction suffers to be used. For this purpose, a pharmaceutical containing the neothramycin-A and the active somatic preparation can be prepared which at least fractions containing the neothramycin-B become one of the compounds neothramycin-A, neothramycin-B, under reduced pressure at a temperature up to 40 ° C methylneothramycin-A and methylneothramycin-B, and evaporated to dryness to give a crude powder, the pharmaceutically acceptable salts of which sufficiently contain the neothramycin-A, and a crude powder, wel - Contains amount to reduce leukemia in vivo, with ches containing neothramycin-B. the active ingredient with a pharmaceutically acceptable

Das derart erhaltene rohe Pulver, welches das Neothramy- Träger kombiniert ist. The raw powder thus obtained, which is combined with the neothramy carrier.

cin-A enthält, wird in einer entsprechenden Menge Chloroform Die bevorzugten Mengen des verwendeten Neothramycins aufgenommen und die Lösung durch eine Säule aus neutralen 20 variieren je nach der verwendeten Verbindung, der Zusammen-Silicagel, welche mit Chloroform imprägniert wurde, hindurch- setzung des pharmazeutischen Präparates, der Art der Anwen-geführt. Die Silicagelsäule wird mit Chloroform gewaschen dung und dem zu behandelnden Organismus. Viele Faktoren, und anschliessend bei 5 °C mit Chloroform-Äthanol (60:1 welche die Wirkung des Heilmittels modifizieren, müssen vom cin-A, is taken up in an appropriate amount of chloroform. The preferred amounts of the neothramycin used and the solution through a column of neutral 20 vary depending on the compound used, the composite silica gel which has been impregnated with chloroform, the pharmaceutical Preparation, the type of user-led. The silica gel column is washed with chloroform and the organism to be treated. Many factors, and then at 5 ° C with chloroform-ethanol (60: 1) which modify the effect of the remedy, must be dated

Volumverhältnis) entwickelt. Das Eluat wird in Fraktionen Fachmann berücksichtigt werden, wie z. B. Alter, Körperge-gesammelt, und die gewünschten Aktivfraktionen, welche nur 25 wicht, Geschlecht, Diät, Verabreichungszeit, Verabreichungs-Neothramycin-A enthalten, durch die Testresultate biologi- weg, Geschwindigkeit der Ausscheidung, Kombination von scher Untersuchungen und der Dünnschichtchromatographie Heilmitteln, Empfindlichkeiten auf die Reaktion und Grad der jeder Fraktion festgestellt. Die derart ausgewählten, erwünsch- Erkrankung. Optimale Verabreichungsbedingungen für eine ten aktiven Fraktionen werden vereint und unter verminder- gegebene Kombination von Bedingungen können vom Fach-tem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 °C zur Trockene ver- 30 mann auf bekannte Weise aufgestellt werden. Volume ratio) developed. The eluate will be considered in expert fractions, such as: B. age, body-collected, and the desired active fractions, which contain only 25 weight, gender, diet, administration time, administration neothramycin-A, through the test results biologically, speed of excretion, combination of shear tests and thin-layer chromatography remedies , Sensitivities to the reaction and degree of each fraction were noted. The desired disease so selected. Optimal administration conditions for a th active fractions are combined and under reduced combination of conditions can be set up in a known manner from specialist pressure at a temperature up to 40 ° C to dryness.

dampft, um ein farbloses Pulver zu ergeben, welches Neothra-mycin-A enthält. Dieses Pulver kann weiter bis zu einem farblo- Beispiel 1 vapors to give a colorless powder containing Neothra-mycin-A. This powder can continue up to a colorless example 1

sen, Neothramycin-A enthaltenden Pulver mit einer Zerset- Eine Öse voll Streptomyces sp. MC916-C4 (identifizierte als zungstemperatur von 110 bis 122 °C gereinigt werden, indem A.T.C.C. 31123), welches in einem Schrägagarmedium inkubiert das oben beschriebene Silicagelchromatographieverfahren 35 worden war, wurde in ein steriles flüssiges Kulturmedium (pH wiederholt wird oder indem das farblose Pulver in einem klei- 7,0,125 ml) geimpft, welches 2,5% Maltose, 0,75% Pepton, 0,75% nen Volumen Chloroform aufgelöst wird, worauf die Chloro- Fleischextrakt, 0,3% Hefeextrakt, 0,3% Natriumchlorid und formlösung mit Äthyläther versetzt und der ausgeschiedene 0,1% Magnesiumsulfat (7H2O) enthielt. Das geimpfte Medium Niederschlag abfiltriert und getrocknet wird. Ein farbloses Pul- wurde einer Schüttelkultur bei 28 °C während 48 Stunden ver, welches Neothramycin-B enthält und eine Zersetzungs- 40 unterworfen, um eine primäre Impfkultur zu ergeben. Diese pri-temperatur von 139 bis 163 °C aufweist, kann aus dem oben märe Impfkultur wurde in einem Impfverhältnis von 0,48 genannten rohen Pulver, welches das Neothramycin-B enthält, Volumprozent auf 50 Liter eines sterilisierten flüssigen Kulturerhalten werden durch Reinigung auf dieselbe Weise wie für médiums (pH 7,0) geimpft, welches 3,5% Stärkesirup, 0,75% Neothramycin-A beschrieben. Es wird dann jedoch vorgezo- Pepton, 0,75% Fleischextrakt, 0,3% Hefeextrakt, 0,3% Natri-gen, die Säulenchromatographie auf Silicagel unter Verwen- 45 umchlorid und 0,1% Magnesiumsulfat (7H2O) enthielt und in dung eines Gemisches von Chloroform und Äthanol (100:1 einem rostfreien Fermentiertank mit einem Fassungsvermögen sen, Neothramycin-A containing powder with a decomposition- An eyelet full of Streptomyces sp. MC916-C4 (identified as the tongue temperature of 110 to 122 ° C by ATCC 31123), which had been incubated in an inclined agar medium using the silica gel chromatography method 35 described above, was placed in a sterile liquid culture medium (pH repeated or by repeating the colorless powder in a small 7.0.125 ml), which dissolves 2.5% maltose, 0.75% peptone, 0.75% volume of chloroform, followed by the chloro-meat extract, 0.3% yeast extract, 0.3% sodium chloride Ethyl ether was added to the molding solution and the solution contained 0.1% magnesium sulfate (7H2O). The vaccinated medium is filtered off and dried. A colorless pulp was subjected to a shaking culture at 28 ° C for 48 hours containing neothramycin-B and subjected to decomposition 40 to give a primary inoculum. This pri-temperature of 139-163 ° C can be obtained from the above-mentioned inoculum in an inoculation ratio of 0.48 crude powder containing the neothramycin-B, volume percent to 50 liters of a sterilized liquid culture can be obtained by cleaning it Way as inoculated for media (pH 7.0), which described 3.5% corn syrup, 0.75% neothramycin-A. However, it is then brought forward to peptone, 0.75% meat extract, 0.3% yeast extract, 0.3% sodium, which contained column chromatography on silica gel using 45 µm chloride and 0.1% magnesium sulfate (7H2O) and in manure a mixture of chloroform and ethanol (100: 1 a stainless fermentation tank with a capacity

Volumverhältnis) als Entwickler durchzuführen. von 130 Litern enthalten war. Das geimpfte Medium wurde bei Volume ratio) as a developer. of 130 liters was included. The vaccinated medium was used

Das oben genannte farblose Pulver, welches Neothramy- 28 °C während 24 Stunden unter Belüftung und Bewegung kul-cin-A enthält und eine Zersetzungstemperatur von 110 bis tiviert, um eine sekundäre Impfkultur zu ergeben. Diese sekun- The above colorless powder containing kul-cin-A neothramy at 28 ° C for 24 hours with aeration and agitation and a decomposition temperature of 110 to 200 to give a secondary inoculum. These seconds

122 °C aufweist, wird in einem kleinen Volumen Äthanol aufge- 50 däre Impfkultur wurde in einem Impfverhältnis von 2 Volumlöst und wiederum über eine Säule aus neutralem Silicagel prozent (6 Liter) in ein flüssiges Kulturmedium (pH 6,8,300 chromatographiert, unter Verwendung von mit Wasser gesät- Liter) geimpft, welches 2% Glukose, 2% Glycerin, 1,2% Soja-tigtem Äthylacetat als Entwickler. Das Eluat wird in Fraktio- bohnenmehl, 1,0% Baumwollsamenpulver, 0,32% Kalziumcar-nen gesammelt, und diejenigen Fraktionen, welche Neothramy- bonat, 0,5% Natriumchlorid und 0,0005% Manganchlorid cin-A enthalten, werden vereint und unter vermindertem 55 (4HzO) enthielt und während 30 Minuten bei 120 °C sterilisiert Druck bei einer Temperatur bis zu 40 °C zur Trockene ver- worden war. Die Kultivierung erfolgte bei 28 °C während 92 dampft, wodurch ein authentisch reines, farbloses Pulver von Stunden unter Belüftung und Bewegung (250 Touren pro Neothramycin-A erhalten wird, welches eine Zersetzungstempe- |Minute), wobei die Belüftungsmenge 150 Liter pro Minute wäh-ratur von 132 bis 147 °C und eine spezifische optische Drehung rend der ersten 24 Stunden betrug und anschliessend auf 300 [a]D26 = + 272° (c 0,52, Dioxan) aufweist. Das oben erwähnte 6o Liter pro Minute während der folgenden 24 bis 92 Stunden der farblose Pulver, welches Neothramycin-B enthält und eine Zer- Kultivation erhöht wurde. 122 ° C, is dissolved in a small volume of ethanol. The inoculum was dissolved in an inoculation ratio of 2 volumes and again chromatographed over a column of neutral silica gel percent (6 liters) in a liquid culture medium (pH 6,8,300) sown with water - liter), which contains 2% glucose, 2% glycerin, 1.2% soybean ethyl acetate as developer. The eluate is collected in fraction bean meal, 1.0% cottonseed powder, 0.32% calcium carnene, and those fractions containing neothramybonate, 0.5% sodium chloride and 0.0005% manganese chloride cin-A are combined and contained under reduced 55 (4HzO) and sterilized for 30 minutes at 120 ° C pressure at a temperature up to 40 ° C to dryness. The cultivation was carried out at 28 ° C while 92 evaporated, whereby an authentically pure, colorless powder of hours with aeration and agitation (250 revolutions per neothramycin-A, which has a decomposition temperature | minute), the aeration amount being 150 liters per minute -rature from 132 to 147 ° C and a specific optical rotation during the first 24 hours and then to 300 [a] D26 = + 272 ° (c 0.52, dioxane). The above-mentioned 60 liters per minute during the following 24 to 92 hours of the colorless powder which contains neothramycin-B and which has been increased in cultivation.

setzungstemperatur von 139 bis 163 °C aufweist, wird in einem Die erhaltene Kulturbrühe (pH 7,3,300 Liter, Potenz 88 Einkleinen Volumen Methanol aufgelöst und wiederum über eine heiten pro Milliliter) wurde mit 24 kg eines Filterhilfsmittels Säule aus neutralem Silicagel chromatographiert unter Ver- (Diatomäenerde, im Handel erhältlich unter der Marke «Hyflo-wendung von wasser-gesättigtem Äthylacetat als Entwickler. 55 Supercel») vermischt und das Gemisch wurde mit einer Filter-Das Eluat wird in Fraktionen gesammelt und die Fraktionen, presse filtriert, um 300 Liter des Brühenfiltrates zu ergeben, welche Neothramycin-B enthalten, werden vereint und unter Das Brühenfiltrat wurde gut mit 3 kg Aktivkohle bei Zimmervermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 °C zur temperatur während 1 Stunde unter Rühren vermischt, so dass The culture broth obtained (pH 7.3.300 liters, potency 88 small volume of methanol and again over one unit per milliliter) was chromatographed with 24 kg of a filter aid column from neutral silica gel with ver (Diatomaceous earth, commercially available under the brand "Hyflo-application of water-saturated ethyl acetate as developer. 55 Supercel") and the mixture was mixed with a filter-The eluate is collected in fractions and the fractions, press filtered, around 300 liters of the broth filtrate, which contain neothramycin-B, are combined and the broth filtrate was mixed well with 3 kg of activated carbon at room pressure under a temperature of up to 40 ° C. to the temperature for 1 hour with stirring, so that

11 11

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die Antibiotika von der Kohle adsorbiert wurde. gewaschen und anschliessend mit Chloroform-Äthanol (60:1 the antibiotics were adsorbed by the coal. washed and then with chloroform-ethanol (60: 1

Die Aktivkohle wurde durch Zentrifugieren gesammelt und Volumverhältnis) entwickelt. Das Eluat wurde in 8-ml-Fraktio-dann mit 150 Liter Wasser gewaschen. Die gewaschene Kohle nen gesammelt und es wurde gefunden, dass das Neothramy-wurde mit 70 Liter 45%igem Aceton-Wasser (pH 8,0) während cin-A in den Fraktionen No. 13 bis 27 eluiert war. Die vereinten The activated carbon was collected by centrifugation and volume ratio developed. The eluate was washed in 8 ml fraction then with 150 liters of water. The washed coal was collected and it was found that the neothramy was treated with 70 liters of 45% acetone water (pH 8.0) while cin-A in fractions no. 13 to 27 was eluted. The united

I Stunde unter Rühren vermischt, so dass die Antibiotika vom 5 Fraktionen No. 12 bis 27 wurden unter vermindertem Druck Lösungsmittel extrahiert wurde. Diese Extraktion wurde zwei- bei einer Temperatur bis zu 40 °C zur Trockene verdampft und mal durchgeführt und die erhaltenen Extrakte wurden zu einem ergaben 320 mg eines schwach gelb gefärbten Pulvers. Dieses Volumen von 118 Liter vereint. Die Extraktlösung wurde unter Pulver wurde in einem minimalen Volumen Chloroform aufge-vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 °C kon- nommen, und zu dieser Lösung wurde Äthyläther zugesetzt, bis zentriert und die konzentrierte Lösung (2,6 Liter) gefrierge- io sich der gebildete Niederschlag nicht weiter setzte. Der trocknet zu 565 g eines braungefärbten Pulvers (Potenz 35 Ein- Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet, wobei 183 mg heiten pro Milligramm), welches das Neothramycin-A und -B eines farblosen Pulvers, welches Neothramycin-A enthielt und enthielt. Dieses braungefärbte Pulver wurde mit 11,6 Litern eine Zersetzungstemperatur von 110 bis 122 °C aufwies, 80%igem Äthanol-Wasser extrahiert. Die unlöslichen Stoffe, gewonnen wurden (Potenz 1000 Einheiten pro Milligramm), welche keine antibakterielle Wirksamkeit aufwiesen, wurden 15 Ausbeute 35%. Mixed for 1 hour with stirring so that the antibiotics from 5 fractions No. 12 to 27 were extracted under reduced pressure solvent. This extraction was evaporated to dryness two times at a temperature up to 40 ° C and carried out and the extracts obtained gave 320 mg of a slightly yellow colored powder. This volume of 118 liters combined. The extract solution was taken under powder in a minimal volume of chloroform under reduced pressure at a temperature up to 40 ° C, and to this solution was added ethyl ether until centered and the concentrated solution (2.6 liters) freeze-dried the precipitation formed did not continue. The dries to 565 g of a brown-colored powder (potency 35 A precipitate was filtered off and dried, where 183 mg units per milligram), which contains the neothramycin-A and -B of a colorless powder which contains and contains neothramycin-A. This brown-colored powder was 11.6 liters with a decomposition temperature of 110 to 122 ° C, 80% ethanol-water extracted. The insoluble substances obtained (potency 1000 units per milligram), which had no antibacterial activity, 15 yield 35%.

abfiltriert, und es wurden 11,2 Liter eines äthanolischen Extraktes gewonnen. Dieser Extrakt wurde unter vermindertem Beispiel 4 filtered off, and 11.2 liters of an ethanol extract were obtained. This extract was reduced under Example 4

Druck bei einer Temperatur bis zu 40 °C auf einem Volumen Das in Beispiel 3 erhaltene farblose Pulver, welches Neo- Pressure at a temperature up to 40 ° C on a volume The colorless powder obtained in Example 3, which neo-

von 800 ml eingeengt und die konzentrierte Lösung gefrierge- thramycin-A enthielt ( 153 mg) wurde in einem kleinen Volumen trocknet, wobei 218,5 g eines rohen Pulvers mit einer Potenz 20 Äthanol aufgenommen und nochmals über eine Säule aus von 53 Einheiten pro Milligramm erhalten wurden. Dieses rohe einem neutralen Silicagel (4,07 g) derselben Qualität wie in BeiPulver wurde in fünf gleiche Teile geteilt, und jeder Teil wurde spiel 2 verwendet, chromatographiert und mit Wasser gesättig-in 20 ml Methanol aufgelöst. Die Methanollösung wurde durch tem Äthylacetat bei 5 °C entwickelt. Das Eluat wurde in Frak-eine Säule (90 mm Durchmesser) aus 4 Liter «Sephadex LH-20» tionen von 0,6 ml gesammelt. Die Fraktionen No. 55 bis 95, geleitet, welche anschliessend mit Methanol entwickelt wurde. 25 welche Neothramycin-A enthielten, wurden vereint und unter Das Eluat wurde in Fraktionen von 200 ml gesammelt, und es vermindertem Druck bei einer Temperatur von bis zu 40 °C zur wurde gefunden, dass Cycloheximid in den Fraktionen No. 9 bis Trockene verdampft, wobei 53 mg eines farblosen Pulvers aus concentrated from 800 ml and the concentrated solution containing freeze-thramycin-A (153 mg) was dried in a small volume, taking up 218.5 g of a raw powder with a potency of 20 ethanol and again through a column of 53 units per milligram were obtained. This crude neutral silica gel (4.07 g) of the same quality as in BeiPowder was divided into five equal parts and each part was used in game 2, chromatographed and dissolved in water saturated in 20 ml of methanol. The methanol solution was developed by ethyl acetate at 5 ° C. The eluate was collected in a Frak column (90 mm in diameter) from 4 liters of “Sephadex LH-20” ions of 0.6 ml. Fractions No. 55 to 95, which was then developed with methanol. 25 which contained neothramycin-A were combined and taken under. The eluate was collected in 200 ml fractions, and it was found under reduced pressure at a temperature of up to 40 ° C. that cycloheximide was found in fractions no. Evaporated to dryness, leaving 53 mg of a colorless powder

II eluiert worden war, während ein Gemisch von Neothramy- authentisch reinem Neothramycin-A gewonnen wurden, wel-cin-A und -B in den Fraktionen No. 12 bis 14 enthalten war. Die ches eine Zersetzungstemperatur von 132 bis 147 °C aufwies Fraktionen No. 12 bis 14 wurden vereint und unter verminder- 30 (Potenz 1000 Einheiten pro Milligramm). [a]D26 = +272° (c 0,52, tem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 °C zur Trockene ver- Dioxan). Ausbeute 35%. II was eluted while a mixture of neothramy-authentically pure neothramycin-A was obtained, wel-cin-A and -B in fractions no. 12 to 14 was included. The ches had a decomposition temperature of 132 to 147 ° C fractions No. 12 to 14 were combined and less than 30 (power 1000 units per milligram). [a] D26 = + 272 ° (c 0.52, tem pressure at a temperature up to 40 ° C to dry ver dioxane). Yield 35%.

dampft, wobei 47 g eines rohen Pulvers (Potenz 160 Einheiten pro Milligramm) erhalten wurden, welche die Neothramycin-A Beispiel 5 vapors, whereby 47 g of a raw powder (potency 160 units per milligram) were obtained, which the Neothramycin-A Example 5

und -B gemischt enthielten. Ausbeute 28%, berechnet auf den Das in Beispiel 2 erhaltene gelbliche rohe Pulver, welches and -B contained mixed. Yield 28%, calculated on the yellowish raw powder obtained in Example 2, which

Neothramycingehalt der Kulturbrühe. 35 das Neothramycin-B enthielt (810 mg) wurde in 16 ml Chloro form aufgenommen und die Lösung bei 5 °C über eine Säule (13 Beispiel 2 mm Durchmesser) aus 16 g neutralem Silicagel von derselben Neothramycin content of the culture broth. 35 containing the neothramycin B (810 mg) was taken up in 16 ml of chloroform and the solution at 5 ° C. over a column (13 example 2 mm in diameter) of 16 g of neutral silica gel from the same

Das rohe, in Beispiel 1 erhaltene Pulver (33 g), welches die Qualität wie in Beispiel 2 verwendet, welches mit Chloroform Neothramycin-A und -B gemischt enthält, wurde in einem klei- imprägniert worden war, geleitet. Die Säule wurde mit 320 ml nen Volumen Methanol aufgenommen und die Lösung gleich- 40 Chloroform gewaschen und anschliessend mit Chloroform-mässig mit 60 g eines neutralen Silicagels vermischt und Äthanol (100:1 Volumverhältnis) entwickelt. Das Eluat wurde anschliessend unter vermindertem Druck getrocknet. Die der- in Fraktionen von 6,4 ml gesammelt, und es wurde gefunden, art erhaltene trockene Masse wurde auf den Kopf einer Säule dass das Neothramycin-B in den Fraktionen No. 34 bis 70 eluiert (60 mm Durchmesser) aus 660 g des neutralen Silicagels ver- war. Die vereinten Fraktionen No. 34 bis 70 wurden unter verbracht, welches mit Chloroform-Methanol (30:1 Volumverhält- 45 mindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 °C zur Trok-nis) imprägniert worden war. Diese Silicagelsäule wurde bei kene verdampft und ergaben 160 mg eines schwach gelb 5 °C mit Chloroform-Methanol (30:1 Volumverhältnis) entwik- gefärbten Pulvers. Dieses Pulver wurde in einem minimalen kelt. Das Eluat wurde in Fraktionen zu 130 ml gesammelt, und Volumen Chloroform aufgenommen und Äthyläther zu dieser es wurde gefunden, dass das Neothramycin-A in den Fraktio- Lösung zugesetzt, bis der Niederschlag nicht weiter abgeschienen No. 23 bis 31 eluiert worden war, während das Neothramy- den wurde. Der Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet, cin-B in den Fraktionen No. 35 bis 49 eluiert worden war. Die wobei 85 mg eines farblosen Pulvers, welches Neothramycin-B vereinten aktiven Fraktionen No. 23 bis 31 wurden unter ver- enthielt und eine Zersetzungstemperatur von 139 bis 163 °C mindertem Druck einer Temperatur von bis zu 40 °C zur Trok- aufwies, erhalten wurden (Potenz 620 Einheiten pro Milli-kene verdampft und ergaben 1,47 g eines gelblichen rohen Pul- gramm). Ausbeute 14,6%. The crude powder (33 g) obtained in Example 1, which uses the quality as in Example 2 and contains neothramycin-A and -B mixed with chloroform, was passed through in a small impregnation. The column was taken up with 320 ml of a volume of methanol and the solution was immediately washed with chloroform and then mixed with chloroform-like mixture with 60 g of a neutral silica gel and ethanol (100: 1 volume ratio) was developed. The eluate was then dried under reduced pressure. The der- collected in 6.4 ml fractions, and it was found that the dry mass obtained was placed on the top of a column that the neothramycin-B in fractions no. 34 to 70 eluted (60 mm diameter) from 660 g of the neutral silica gel. The united fractions No. 34 to 70 were placed under, which had been impregnated with chloroform-methanol (30: 1 by volume, 45 reduced pressure at a temperature up to 40 ° C. to the drying temperature). This silica gel column was evaporated at kene and gave 160 mg of a powder which had been destained from pale yellow at 5 ° C. with chloroform-methanol (30: 1 volume ratio). This powder was in a minimal celt. The eluate was collected in fractions of 130 ml, and volume of chloroform was added and ethyl ether was added to it. It was found that the neothramycin-A was added to the fraction solution until the precipitate no longer shed off. 23 to 31 had been eluted while the neothramyden was being. The precipitate was filtered off and dried, cin-B in the fractions No. 35 to 49 had been eluted. The active fractions no. 85 mg of a colorless powder which neothramycin B combined 23 to 31 were contained under and a decomposition temperature of 139 to 163 ° C had a reduced pressure of a temperature of up to 40 ° C to the troc, were obtained (potency 620 units per milli-kene evaporated and gave 1.47 g of one yellowish raw pulp). Yield 14.6%.

vers, welches das Neothramycin-A enthielt (Potenz 520 Einhei- 55 ten pro Milligramm). Ausbeute 14%. Die vereinten Fraktionen Beispiel 6 verse, which contained the Neothramycin-A (potency 520 units per milligram). Yield 14%. The combined fractions Example 6

No. 35 bis 49 wurden auf dieselbe Weise zur Trockene ver- Das in Beispiel 5 erhaltene farblose Pulver, welches Neo- No. 35 to 49 were dried in the same way. The colorless powder obtained in Example 5, which neo-

dampft und ergaben 1,03 g eines gelblichen rohen Pulvers, wel- thramycin-B enthielt (74 mg) wurde über ein neutrales Silicagel ches das Neothramycin-B enthielt (Potenz 450 Einheiten pro (2,53 g) nochmals chromatographiert und mit Äthylacetat Milligramm). Ausbeute 9%. 60 gesättigtem Wasser auf dieselbe Weise wie in Beipsiel 4 entwik- evaporated and yielded 1.03 g of a yellowish crude powder which contained thramycin-B (74 mg) was re-chromatographed on a neutral silica gel which contained neothramycin-B (potency 450 units per (2.53 g) and with ethyl acetate milligrams ). Yield 9%. 60 saturated water in the same way as in example 4

kelt. Das Eluat wurde in Fraktionen von 0,35 ml gesammelt. Die Beispiel 3 Neothramycin-B enthaltenden Fraktionen No. 75 bis 157 wur- celt. The eluate was collected in 0.35 ml fractions. Fractions No. 3 containing Neothramycin-B as Example 3 75 to 157 were

Das in Beispiel 2 erhaltene gelbliche rohe Pulver, welches den vereint und unter vermindertem Druck bei einer Temperadas Neothramycin-A enthielt (1 g) wurde in 20 ml Chloroform tur von bis zu 40 °C zur Trockene verdampft, wobei 36 mg eines gelöst und die Lösung bei 5 °C durch eine Säule (13 mm Durch- es farblosen Pulvers aus authentisch reinem Neothramycin-B mit messer) von 20 g eines neutralen Silicagels derselben Qualität einer Zersetzungstemperatur von 144 bis 151 °C erhalten wur-wie in Beispiel 2, welches mit Chloroform imprägniert worden den (Potenz 835 Einheiten pro Milligramm), war, hindurchgeführt. Die Säule wurde mit 400 ml Chloroform [a]D26 =+314° (0,48, Dioxan). Ausbeute 65%. The yellowish crude powder obtained in Example 2, which contained the combined and under reduced pressure at a Temperadas Neothramycin-A (1 g), was evaporated to dryness in 20 ml of chloroform at up to 40 ° C., 36 mg of one being dissolved and the Solution at 5 ° C. through a column (13 mm diameter of colorless powder made from authentically pure neothramycin B with a knife) of 20 g of a neutral silica gel of the same quality and a decomposition temperature of 144 to 151 ° C. was obtained as in Example 2, which impregnated with chloroform (potency 835 units per milligram). The column was washed with 400 ml of chloroform [a] D26 = + 314 ° (0.48, dioxane). Yield 65%.

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io io

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Beispiel 7 Example 7

Eine primäre Impfkultur (je 0,5 ml) von Streptomyces sp. MC916-4, welche auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 erhalten worden war, wurde in je 30 ml eines sterilisierten flüssigen Kulturmediums (pH 6,8) geimpft, welches 2% Glucose, 2% Glycerin, 1,2% Sojabohnenmehl, 1,0% Baumwollsamenpulver, 0,32% Kalziumcarbonat, 0,5% Natriumchlorid und 0,0005% Manganchlorid (4HîO) enthielt, und in vier Erlenmeyer-Kolben eingefüllt war. Das geimpfte Medium wurde bei 28 °C während 92 Stunden au einer rotierenden Schüttelapparatur (200 Touren pro Minute) kultiviert. Die erhaltene Kulturbrühe (pH 6,5,90 ml, Potenz 780 Einheiten pro Milliliter) wurde mit 90 ml Buta-nol unter Eiskühlung extrahiert. Der Butanolextrakt wurde unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 °C zur Trockene verdampft, wobei 242 mg eines bräunlichen Sirups erhalten wurde, welche Neothramycin-A und -B enthielt (Potenz 100 Einheiten pro Milligramm). Ausbeute 44%. A primary vaccine culture (0.5 ml each) of Streptomyces sp. MC916-4, which had been obtained in a similar manner as in Example 1, was inoculated in each case in 30 ml of a sterilized liquid culture medium (pH 6.8) which had 2% glucose, 2% glycerol, 1.2% soybean meal, 1, 0% cottonseed powder, 0.32% calcium carbonate, 0.5% sodium chloride and 0.0005% manganese chloride (4HîO), and was filled in four Erlenmeyer flasks. The inoculated medium was cultured at 28 ° C for 92 hours on a rotating shaker (200 revolutions per minute). The culture broth obtained (pH 6.5.90 ml, potency 780 units per milliliter) was extracted with 90 ml of butanol under ice cooling. The butanol extract was evaporated to dryness under reduced pressure at a temperature up to 40 ° C to give 242 mg of a brownish syrup containing neothramycin-A and -B (potency 100 units per milligram). Yield 44%.

Beispiel 8 Example 8

Ein gelbliches rohes Pulver (1,0 g, Potenz 750 Einheiten/pro 20 Milligramm), welches Neothramycin-A und -B enthielt und auf ähnliche Weise wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben erhalten worden war, wurde in 20 ml Methanol gelöst. Die Methanollösung wurde während 16 Stunden auf 25 °C gehalten und unter vermindertem Druck zur Trockene verdampft, wobei 1,0 g eines Gemisches von Methylneothramycin-A und -B erhalten wurde. Das Gemisch wurde über eine Säule aus Silicagel (50 g, «Wako-gel C-200», Wako Chemicals, Osaka) chromatographiert und mit einem Gemisch von Benzol und Methanol (20:1 Volumverhältnis) entwickelt. Das Eluat wurde in Fraktionen von 12,5 ml aufgeteilt. Die Fraktionen No. 19 bis 25, welche Methylneothramycin-A enthielten, und die Fraktionen No. 26 bis 38, welche ein Gemisch von Methylneothramycin-A und -B enthielten, erhalten. Die Fraktionen No. 26 bis 38 wurden zur Trockene verdampft, und der Rückstand über eine Säule von Silicagel (18 g) auf dieselbe Weise wie oben beschrieben noch- A yellowish crude powder (1.0 g, potency 750 units / per 20 milligrams) containing neothramycin A and B and obtained in a manner similar to that described in Examples 1 and 2 was dissolved in 20 ml of methanol. The methanol solution was kept at 25 ° C for 16 hours and evaporated to dryness under reduced pressure to obtain 1.0 g of a mixture of methylneothramycin-A and -B. The mixture was chromatographed on a column of silica gel (50 g, "Wako-gel C-200", Wako Chemicals, Osaka) and developed with a mixture of benzene and methanol (20: 1 volume ratio). The eluate was divided into 12.5 ml fractions. Fractions No. 19 to 25, which contained methylneothramycin-A, and fractions No. 26 to 38, which contained a mixture of methylneothramycin-A and -B. Fractions No. 26 to 38 were evaporated to dryness, and the residue passed through a column of silica gel (18 g) in the same manner as described above.

30 30th

35 35

mais chromatographiert. Die Fraktionen, welche Methylneothramycin-A enthielten und die oben erwähnten Fraktionen, welche Neothramycin-A enthielten, wurden vereint und zur Trockene verdampft, wobei ein farbloses Pulver erhalten wurde (299 mg). Das Pulver wurde aus einem Gemisch von Aceton und Benzol kristallisiert und ergab 240 mg farblose Kristalle von Methylneothramycin-A. Die Fraktionen, welche Me-thylneothramicin-B enthielten, wurden vereint und zur Trok-kene verdampft, wobei 175 mg eines farbloses Pulers von reinem Methylneothramycin-B erhalten wurden. corn chromatographed. The fractions containing methylneothramycin-A and the above-mentioned fractions containing neothramycin-A were combined and evaporated to dryness to give a colorless powder (299 mg). The powder was crystallized from a mixture of acetone and benzene to give 240 mg of colorless crystals of methylneothramycin-A. The fractions containing methylneothramicin-B were pooled and evaporated to dryness, giving 175 mg of a colorless powder of pure methylneothramycin-B.

Beispiel 9 Example 9

Kristallines Methylneothramycin-A (225 mg), welches wie in Beispiel 8 erhalten worden war, wurde in 45 ml 0,01 N HC1-Dioxan (1:1 Volumverhältnis) gelöst und die Lösung während 1 Stunde bei Zimmertemperatur (22 °C) gehalten. Die Lösung wurde mit 1 N NaOH auf pH 6,0 eingestellt und unter vermindertem Druck zur Trockene verdampft, wobei 216 mg eines farblosen Pulvers erhalten wurden, welches die Neothramycin-A und -B enthielt. Das Pulver wurde über eine Säule aus Silicagel (20 g) auf ähnliche Weise wie in Beispiel 2 chromatographiert. Reines Neothramycin-A (87 mg) und Neothramycin-B (69 mg) wurden erhalten. Crystalline methylneothramycin-A (225 mg), which had been obtained as in Example 8, was dissolved in 45 ml of 0.01 N HCl-dioxane (1: 1 volume ratio) and the solution was kept at room temperature (22 ° C.) for 1 hour . The solution was adjusted to pH 6.0 with 1N NaOH and evaporated to dryness under reduced pressure to give 216 mg of a colorless powder containing neothramycin A and -B. The powder was chromatographed on a silica gel column (20 g) in a manner similar to that of Example 2. Pure neothramycin-A (87 mg) and neothramycin-B (69 mg) were obtained.

Die Hydrolyse von Methylneothramycin-B (100 mg) in 20 ml 0,01 N HCl-Dioxan (1:1 Volumverhältnis) bei Zimmertemperatur während 1 Stunde auf dieselbe Weise wie oben beschrieben ergab 95 mg eines farblosen Pulvers, welches Neothramycin-A und -B enthielt. Hydrolysis of methylneothramycin-B (100 mg) in 20 ml of 0.01N HCl-dioxane (1: 1 volume ratio) at room temperature for 1 hour in the same manner as described above gave 95 mg of a colorless powder which contains neothramycin-A and - B contained.

Das in dem vorstehenden Beispiel verwendete «Sephadex LH-20» kann durch andere ähnliche Gelfiltriermittel ersetzt werden, z. B. «Sephadex G25» bis «G200», «Seprose 4B» und «6B» (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) und «Bio-Gel A1.5m» (Bio Rad Co.). Bevorzugte Gelfiltrationsmittel umfassen die carboxymethylsubstituierten vernetzten Dextrangele, welche in Kolonne 3 und 4 des US-Patentes No. 3 819 836 beschrieben sind. The "Sephadex LH-20" used in the previous example can be replaced by other similar gel filtering agents, e.g. B. "Sephadex G25" to "G200", "Seprose 4B" and "6B" (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden) and "Bio-Gel A1.5m" (Bio Rad Co.). Preferred gel filtration agents include the carboxymethyl substituted cross-linked dextran gels which are found in columns 3 and 4 of U.S. Patent No. 3,819,836.

4 Blatt Zeichnunger 4 sheets of drawings

Claims

629253

2. The method according to claim 1, characterized in that the neothramycin-producing strain of Streptomyces, which has the identified characteristics of ATCC

31123, is grown under submerged aerobic conditions in a nutrient medium containing a carbon source and a nitrogenous nutrient until a considerable amount of neothramycin is generated by this organism in the nutrient medium.

2nd

PATENT CLAIMS 1. Process for the preparation of neothramycin-A and neothramycin-B of formula IA and IB, respectively

HO,

HO

respectively.

HO.

CH

OH

and their pharmaceutically acceptable salts, characterized in that a neothramycin-producing strain of the genus Streptomyces is cultivated under aerobic conditions in a suitable culture medium which contains assimilable carbon and nitrogen sources for a sufficiently long period of time to obtain neothramycin-A and neothramycin-B in the culture medium to generate and collect, and a mixture of Neothramycine-A and -B from the culture medium and then optionally separates the resulting mixture into Neothramycin-A and Neothramycin-B in isolated form.

3. The method according to claim 1, characterized in that the strain of Streptomyces is grown in a nutrient medium at a temperature in the range from 24 to 35 ° C.

4. The method according to claim 1, characterized in that the strain of Streptomyces is grown in a nutrient medium at a temperature in the range from 25 to 29 ° C at a pH between 6 and 8.

5. The method according to claim 1, characterized in that the neothramycin produced in the culture broth is obtained by extraction and purified by a method which comprises at least one of the following methods: salting out, solvent precipitation, butanol extraction, dialysis, ultrafiltration, isoelectric precipitation, gel filtration, Electrophoresis, electrofocusing and adsorption, followed by elution from an ion exchange resin.

6. Process for the preparation of methylneothramycin-A of formula IIA

HO.

CH, 0 H [IIA]

and methylneothramycin-B of formula IIB

HO

OCH

[IIB]

and their pharmaceutically acceptable salts, characterized in that neothramycin-A or -B prepared by the process according to claim 1 is reacted with methanol to give a mixture of methylneothramycin-A and -B.

7. The method according to claim 6, characterized in that the mixture of methylneothramycin-A and -B obtained is separated into the individual components.