CH629253A5 - Process for preparing neothramycin - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Neothramycin-A und -B, zwei neue Antibiotika, welche beide eine stark hemmende Wirkung auf das Wachstum von Leukämiezellen ausüben und als Antitumormit-tel wirksam sind, jedoch nur eine schwache antibakterielle Wirkung aufweisen.

Sofern nicht ausdrücklich anders vermerkt, ist im folgenden unter der Bezeichnung «Neothramycin» entweder Neothramy-cin-A oder Neothramycin-B oder deren Gemisch zu verstehen.

Einige Antibiotika, welche als Antitumormittel für die therapeutische Behandlung von Leukämie nützlich sind, sind z. B. Daunomycin, Adriamycin usw. Im Bestreben, weitere neue Antitumormittel mit antibiotischem Charakter zu entwickeln wurden verschiedene Erdproben gesammelt, Mikroorganismen daraus isoliert und die Stoffwechselprodukte untersucht, welche bei der aeroben Züchtung der isolierten Mikroorganismen gebildet werden. Auf diese Weise wurde ein neuer Mikroorganismus aus einer Erdprobe isoliert, welche im Gebiet von Biseibutsu Kagaku Kenkyosho, in Shinagawa-ku, Tokyo, Japan, entnommen wurde, und dieser neue Mikroorganismus wurde mit der Bezeichnung MC916-C4-Stamm versehen. Es konnte bestätigt werden, dass dieser MC916-C4-Stamm zur Gattung Streptomyces gehört. Es wurde gefunden, dass zwei neue Antibiotika, welche eine niedere antibakterielle Wirksamkeit, aber eine stark hemmende Wirkung auf das Wachstum von Leukämie-L-1210-Zellen bei Mäusen und auf das Wachstum einer gewissen Art von Tumorzellen ausüben, in der Kulturbrühe des MC916-C4-Stammes erzeugt und angereichert werden. Es ist nun gelungen, diese neuen Antibiotika aus

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der Kulturbrühe zu isolieren, und sie wurden als Neothramycin-A bzw. Neothramycin-B bezeichnet.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Beschaffung einer neuen Substanz, nämlich Neothramycin, der Formel I:

(I)

in welcher R und R' Wasserstoff oder Hydroxyl bedeuten, unter der Bedingung, dass ein Paar R und R' ein Paar Hydroxyl und Wasserstoff oder ein Paar Wasserstoff und Hydroxyl bedeuten, sowie ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon. Das Neothramycin der obigen Formel umfasst: (1) Neothramycin-A der Formel IA:

. -N.

(IA)

und ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, sowie (2) Neothramycin-B der Formel IB:

OH (IB)

und ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.

Geeignete Beispiele von pharmazeutisch annehmbaren Salzen von Neothramycin umfassen nicht-toxische Metallsalze, wie Natrium-, Kalium-, Calcium- und Aluminiumsalze, das Ammoniumsalz und substituierte Ammoniumsalze, z. B. Salze von nicht-toxischen Aminen, wie Trialkylamine, einschliesslich Triäthylamin, Procain, Dibenzylamin, N-Benzylbeta-phenäthyl-amin, l-Ephenamin,N,N'-Dibenzyläthylendiamin, Dehydro-abietylamin, N,N'-Bis-dehydroabietyläthylendiamin, N-(Nie-der>alkyl-piperidin, z. B. N-Äthylpiperidin sowie andere Amine, welche bisher verwendet wurden, um Salze mit Benzylpenicillin zu bilden.

Die vorliegende Erfindung umfasst die Herstellung von Neothramycin-A-Neothramycin-B-Substanzen, entweder allein oder im Gemisch, welche als gereinigte Feststoffe, als freie Säuren und in Form von Salzen mit einem Metall oder einem organischen Amin vorliegen können. Neothramycin-A wurde als farbloses Pulver enthalten, welches keinen bestimmten Schmelzpunkt aufweist, allmählich gegen 105 °C schmilzt und sich bei 132 bis 147 °C unter Schäumen zersetzt und eine spezifische optische Drehung [a]D26 = + 272° (c 0,52, Dioxan) aufweist. Die Elementaranalyse von Neothramycin-A ist die folgende:

s gefunden: C 57,46, H 5,76, N 9,84,0 26,94 %

berechnet für CijHhNzO«- Vi HzO: C 57,56, H 5,57, N 10,33,0 26,54%

Neothramycin-A weist ein Molekulargewicht von 250 bis 300, gemessen nach der Barger-Akiya-Methode, auf. Aus den io Resultaten der Elementaranalyse und der Bestimmung des Molekulargewichtes ergibt sich, dass Neothramycin-A wahrscheinlich die empyrische Formel ChHmNîO^ Vï H2O besitzt. Diese Formel wurde durch Massenspektrometrie bestätigt: gefunden: m/e 262.0934,

15 berechnetes Molekulargewicht für C13H14N2O4:262.0952.

Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Neothramycin-A in einer alkalischen Lösung ergibt eine Verschiebung gegen die längere Wellenlängen, wie aus Fig. 3 ersichtlich. Wie in Tabelle I dargestellt, weist das NMR-Spektrum von Neothra-20 mycin-A die Gegenwart von 14 Protonen auf.

Neothramycin-B ist in seinen Eigenschaften sehr ähnlich dem Neothramycin-A und wurde als farbloses Pulver erhalten, welches keinen bestimmten Schmelzpunkt aufweist, sich bei 144 °C unter Schäumen zu zersetzen beginnt und bei 151 °C 25 vollständig schmilzt und eine spezifische optische Drehung [a]D26 = +314° (c 0,48 Dioxan) aufweist. Die Elementaranalyse von Neothramycin-B ist die folgende:

gefunden: C 57,00, H 5,58, N 9,75,0 27,67%

berechnet für C13H14N2O4. Vi HzO: C 57,56, H 5,57, N 10,33,0 30 26,54%

Aus dem Resultat der Elementaranalyse und der Bestimmung des Molekulargewichtes ergibt sich als wahrscheinlich, dass Neothramycin-B die ähnliche empirische Formel C13H14N2O4 • Vi H2O besitzt. Diese empirische Formel wurde 35 durch Massenspektrometrie mit hoher Auflösung bestätigt (gefunden: m/e 262.0939, berechnetes Molekulargewicht für C13H14N2O4 262.0952). Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Neothramycin-B in einer alkalischen Lösung zeigt eine Verschiebung gegen die längere Wellenlänge, wie aus Fig. 4 40 ersichtlich ist. Wie in Tabelle I dargestellt, zeigt das NMR-Spektrum von Neothramycin-B die Gegenwart von 14 Protonen, ähnlich wie Neothramycin-A. Neothramycin-A und -B sind während etwa einem Monat oder länger stabil, wenn sie in Form eines festen Pulvers in einem Exsiccator aus braunem 45 Glas bei 5 °C aufbewahrt werden.

Neothramycin-A und -B sind jedoch nicht stabil in 50%igem wässerigem Äthanol bei pH 2,5, und ihre Wirksamkeit wird auf 25 beziehungsweise 22% herabgesetzt bei Zimmertemperatur im Laufe von 16 Stunden. In 50%igem wässerigem Äthanol 50 vom pH 6,5 oder pH 8,0 bei Zimmertemperatur während 16 Stunden verbleiben 80 bis 90% der Aktivität von Neothramycin-A und 70 bis 80% Aktivität von Neothramycin-B, doch erweist sich durch Dünnschichtchromatographie eine Gleichgewichtsumwandlung von Neothramycin-A zu -B oder -B zu -A. 55 Neothramycin-A und Neothramycin-B sind ähnlich, indem sie eine hemmende Wirkung auf das Wachstum von Leukämie-L-1210-ZeIlen bei Mäusen und eine schwach antibakterielle Wirksamkeit aufweisen, indem sie eine saure Funktion im Molekül besitzen, indem sie in Methanol, Äthanol, Propanol, 60 Chloroform und Dioxan löslich sind und schwach löslich in Wasser, aber kaum löslich oder praktisch unlöslich in Äthyläther und n-Hexan, indem sie eine positive Rydon-Smith-Reak-tion und eine rote Tetrazolium-Reaktion ergeben, schwach positiv bei der Ninhydrin-Reaktion, aber negativ auf die Ehrlich-65 Reaktion und Sakaguchi-Reaktion reagieren, indem sie bei der Elementaranalyse im wesentlichen nur Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff ergeben und indem sie eine relative Mobilität gegenüber Alanin (1,0) von 0,17 bei der Hoch-

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spannungs-Filterpapierelektrophorese (3500 Volt, 35 Minuten) unter Verwendung von Ameisensäure-Essigsäure-Wasser (25:75:900 Volumenverhältnis) als elektrolytische Lösung ergeben.

Neothramycin-A zeichnet sich ferner dadurch aus, dass es ein Infrarot-Absorptionsspektrum in Kaliumbromidtabletten, wie in Fig. 1 dargestellt, aufweist und Absorptionsspitzen bei 3450,2950,1630 (Schulter), 1600,1510,1460,1440,1410,1280, 1200,1180,1120,1080,1010,870,790 und 760 cm"1 ergibt, dass es Ultraviolett-Absorptionsspektren, wie in Fig. 3 dargestellt,

10

15

aufweist mit Absorptionsmaxima bei 223 nm (Et cm,% 855), 240 nm (Schulter), 265 nm (Ei ctn1% 290) und 318 nm (Ei cm1% 156) in einer Lösung in 10% Wasser-Methanol, mit Absorptionsmaxima bei 223 nm (Et cm1% 885), 240 nm (Schulter), 265 nm (E( cm,% 290) und 320 nm (Et cm1% 139) in einer Lösung in N/10 HCl-Me-thanol (1:9) sowie Absorptionsmaxima bei 228 nm (Ei cm1% 635), 254 nm (E, cml%566),291 nm (E, cm1%422) und 324 nm(E, cml% 412) in einer Lösung in N/10 NaOH-Methanol (1:9). Ferner ergibt es einen RrWert von 0,57 bei der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel mit Chloroform-Methanol (10:1 Volumteile) als Entwicklungslösungsmittel. 20

Neothramycin-B zeichnet sich ferner aus durch ein Infrarot-Absorptionsspektrum, in Kaliumbromid tablettiert, wie in Fig. 2 dargestellt, mit Absorptionsspitzen bei 3400,2960,1630 (Schulter), 1600,1510,1440,1400,1280,1200,1120,1080,1010, 990,940,870,790 und 760 cm-1, durch Ultraviolett-Absorptions- 25 spektren, wie aus Fig. 4 ersichtlich, mit Absorptionsmaxima bei 224 nm (E|Cm'°/o 935), 240 nm (Schulter), 265 nm (Schulter) und 318 nm (Ei cm1% 167) in einer Lösung in 10% Wasser-Methanol ( 1:9), Absorptionsmaxima bei 224 nm (E, cm,% 1000), 240 nm (Schulter), 265 nm (Schulter) und 320 nm (Ei cmI% 156) in einer 30 Lösung in N/10 HCI-Methanol (1:9) sowie Absorptionsmaxima bei 228 nm (E, cm1% 800), 254 nm (E, cm1% 725), 291 nm (E, cm1% 456) und 324 nm (Ei cm1% 466) in einer Lösung in N/10 NaOH-Methanol (1:9). Es ergibt einen RrWert von 0,50 bei der Dünnschichtchromatographie auf Silicagel mit Chloroform-Metha- 35 noi (10:1 Volumverhältnis) als Entwicklungslösungsmittel.

Neothramycin-A oder -B wird leicht in ein Gemisch von Methylneothramycin-A (Rf 0,71 auf Silicagel-Dünnschichtchro-matogramm mit Chloroform-Methanol (10:1 Volumverhältnis) und Methylneothramycin-B (Rf 0,61 auf demselben Dünn-schichtchromatogramm) in wasserfreiem Methanol bei Zimmertemperatur während 16 Stunden umgewandelt. Methylneo-thramycin-A kristallisiert aus einem Gemisch von Aceton und Benzol zu farblosen Mikrokristallen, Schmelzpunkt 137 bis 140 °C (Zersetzung); [a]D26 + 640° (c, 0,24, Dioxan), MS, m/e 276.1089 (berechnetes Mokeluargewicht für C14H16N2O4, 276,1108). Methylneothramycin-B wird als farbloses Pulver erhalten, vom Schmelzpunkt 61 bis 69 °C (Zersetzung); [a]D26 + 778° (c, 0,22, Dioxan), MS, m/e 276,1071. Die UV-Spektren von Methylneothramycinen sind ähnlich wie diejenigen der Neo-thramycine und die chemischen Verschiebungen im PMR sind in Tabelle I zusammengestellt. Eine milde Hydrolyse von Me-thyineothramycin-A oder-B in 0,01N HCI-Dioxan(l :1 Volumverhältnis) bei Zimmertemperatur während 1 Stunde, gefolgt von einer Säulenchromatographie auf Silicagel ergibt Neothra-mycine-A und -B in einer guten Ausbeute.

Demzufolge kann Methylneothramycin-A nützlich sein als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Neothramycin-A durch milde Hydrolyse, während Methylneothramycin-B nützlich sein kann als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Neothramycin-B. Methylneothramycin-A weist die folgende Formel auf

40

45

0 CH3°

Methylneothramycin-B entspricht der Formel

N«

HO-

H (IIA)

(HB)

OCH,

Aus diesen Daten ergibt sich, dass Neothramycine-A und -B isomer sind, von denen jedes in das andere übergeführt werden kann, und welche zu der Anthramycin-Gruppe von Antibiotika gehören, die eine Benzodiazepinstruktur aufweisen. Sie unterscheiden sich von Anthramycin, Dextrochrysin und Sibiromy-cin durch ihre UV-Spektren. Die UV-Spektren von Tomaymy-cin und Neothramycinen sind ähnlich, doch sind sie verschieden in ihrer Molekularformel und in anderen Spektren.

Tabelle I

Chemische Verschiebungen im PMR von Neothramycinen und ihren Methylderivaten Proton Neothramycin-A Neothramycin-B Methylneothramycin-A

Methylneothramycin-B

CHzx2

1,7-2,5

1,7-2,5

1,8-2,6

1,8-2,6

OCHs

3,28 s

3,44 s

CH

3,80 m

3,78 m

3,72 m

3,80 dd arom. OCH3

3,90 s

3,88 s

3,90 s

3,88 s

OH

5,00 d

5,10 d

CH

5,69 dd

5,78 m

5,56 d

5,35 dd arom. H

6,70 s

6,69 s

6,75 s

6,64 s arom. H

7,43 s

7,40 s

7,48 s

7,36 s

CH

7,62 d

7,70 d

7,73 d

7,54 d

Phenol-OH

8,00 s

7,98 s

8,04 s

7,94 s

Chemische Verschiebungen, 5 (ppm) wurden in Deutero-dioxan gemessen unter Verwendung von TMS als interne Referenz.

5

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Die folgenden Strukturen können zur allgemeinen Darstellung von Neothramycin-A (R1 = OH, R2 = H), Neothramycin-B (R1 = H, R2 = OH), Methylneothramycin-A (R1 = OCH3, R2 = H) und Methylneothramycin-B (R1 = H, R2 = OCH3) gegeben werden:

10

20

In den beiliegenden Zeichnungen zeigt:

Fig. 1 eine Kurve des Infrarot-Absorptionsspektrums einer authentisch reinen Probe von Neothramycin-A in Kaliumbro-mid tablettiert,

Fig. 2 eine Kurve Infrarot-Absorptionsspektrums einer authentisch reinen Probe von Neothramycin-B, inKaliumbro-mid tablettiert,

Fig. 3 Proben des Ultraviolett-Absorptionsspektrums einer authentisch reinen Probe von Neothramycin-A gelöst in 10% Wasser-Methanol, in N/10 NaOH-Methanol (1:9) und in N/10 HCl-Methanol (1:9),

Fig. 4 Kurven des Ultraviolett-Absorptionsspektrums einer authentisch reinen Probe von Neothramycin-B, gelöst in 10% Wasser-Methanol, in N/10 NaOH-Methanol (1:9) und in N/10 HCl-Methanol (1:9).

Das Neothramycin-A und Neothramycin-B weisen eine niedere antibakterielle und pilzbekämpfende Wirksamkeit auf, wie aus den antibakteriellen Spektren dieser Substanzen in Tabelle II hervorgeht. Die minimalen hemmenden Konzentrationen 35 (mcg/ml) von Neothramycin-A und -B gegen verschiedene Bakterien wurden auf Nähragarplatten, welche bei einer Temperatur von 37 °C während 17 Stunden inkubiert wurden, bestimmt. Die minimalen hemmenden Konzentrationen gegenüber verschiedenen Pilzen wurden auf Nähragarplatten bestimmt, 40 welche 1% Glukose enthielten, nach Inkubation bei 27 °C während 40 Stunden.

Wie oben erwähnt weisen Neothramycin-A und -B eine stark hemmende Wirksamkeit gegen das Wachstum von Leukämiezellen auf und werden voraussichtlich nützlich sein als Mittel zur therapeutischen Behandlung eines lebenden Körpers, welcher an Leukämie erkrankt ist. Chemotherapeutische Wirkungen von Neothramycin-A und -B gegen Leukämie-L-1210 bei Mäusen wurden auf folgende Weise untersucht. Leu-kämie-L-1210-Zellen (105 Zellen/Maus) wurden intraperitoneal an Mäuse vom Stamm CDF1 injiziert, welche 19 bis 22 g wogen. Für die Behandlung der derart erzeugten Leukämie erfolgte die Verabreichung der Neothramycin-A und -B unmittelbar nach der Inokulierung des Tumors. Die leukämischen Mäuse wurden in Gruppen von je vier Stück für jede Dosis verwendet. Bei Verabreichung von 300 bzw. 150,75,37,5 und 18,7 mcg/Maus/Tag Neothramycin-A und -B durch intraperitoneale Injektion einmal täglich während 10 Tagen wurden die äusserst günstigen Wirkungen auf die Anzahl überlebender Tiere (in Prozent) beobachtet, wie aus den Resultaten von der folgenden Tabelle III ersichtlich ist.

Tabelle III

Durchschnittliche Überlebensquote (Prozent) Dosis (mcg/Maus/Tag) Neothramycin-A

Neothramycin-B

25

30

300

Tod (toxische

Tod (toxische

Dosis)

Dosis)

150

200

192

75

167

154

37,5

154

128

18,7

122

103

Die Überlebensquote (Prozent) wurde berechnet durch Dividieren der Anzahl Überlebenstage der behandelten Tiere (z. B. 10) durch die Anzahl Überlebenstage der Kontrolliere (z. B. 8) und Multiplizieren mit 100, z. B. l%x 100 = 125. Grössere Quoten als 125 werden im allgemeinen als beträchtlich betrachtet.

Eine wirksame Verlängerung in der Überlebensquote (Prozent) von Mäusen, die mit Leukämie-L-1210 inokuliert wurden, wurde auch beobachtet bei der Behandlung mit Methylneo-thramycin-A oder Methylneothramycin-B, wie in der folgenden Tabelle IV ersichtlich.

Tabelle II

45

Tabelle IV

Test-Organismen

Minimale hemmende Konzentrationen (mcg/ml)

Neothra- Neothramycin-A mycin-B

Durchschnittliche Überlebensquote (Prozent)

Dosis (mcg/Maus/Tag) Methylneothramycin-A Methylneothramycin-B

Staphylococcus aureaus Smith

50

100

Staphylococcus aureus 209P

>100

>100

Klebsiella pneumoniae PC 602

50

100

Escherichia coli NIHJ

100

100

Escherichia coli K-12

>100

>100

Pseudomonas aeruginosa No. 12

100

>100

Bacillus subtilis PCI 219

100

100

Escherichia coli W67

50

>100

Escherichia coli JR66/W677

100

100

Aeromonas salmoecida ATCC14174

25

50

Vibrio anguillarum NCBM 6

50

100

Saccharomyces cerevisiae

50

>100

Candida albicans 3147

>100

>100

Aspergillus niger

100

>100

Piricularia oryzae

50

>100

Xanthomonas citri

>100

>100

Xanthomonas oryzae

50

100

50

55

200

toxisch toxisch

100

128

154

50

103

147

25

-

115

12,5

-

103

Das Neothramycin-A und -B weisen eine niedere Toxizität für Tiere und Menschen auf, was durch die Tatsache erwiesen ist, dass die Neothramycine-A und -B beide LDso-Werte von 20 bis 30 mg/kg bei Mäusen aufweisen, wenn eine Lösung von 0,25 60 bis 0,5 Gewichtsprozent Neothramycin-A oder -B in 10% Dimethylsulfoxid-Wasser intraperitoneal den Mäusen injiziert wird, um die akute Toxizität dieser Substanzen festzustellen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für die Herstellung von Neothramycin-A und Neothramycin-B, 65 welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Neothramycin erzeugenden Stamm der Gattung Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält,

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während genügend langer Zeit kultiviert, um Neothramycin-A Die Rückseite des Wachstums ist dunkelgelblich-braun gefärbt,

und Neothramycin-B im Kulturmedium zu erzeugen und anzu- (8) Auf Hafermehl-Agar (ISP No. 3 Medium, inkubiert bei reichern, und ein Gemisch von Neothramycin-A und Neothra- 27 °C): Rötlichgelb bis dunkelgelb-orange [4pe, Orange Rust]

mycin-B aus dem Kulturgemisch gewinnt, und anschliessend, gefärbtes Wachstum mit Luftfäden von hellgrauer [5fe, Ashes]

gegebenenfalls das erhaltene Gemisch in die isolierten Formen 5 bis bräunlich-grauer [3ih, Beige Gray] Farbe. Lösliches Pigment von Neothramycin-A und Neothramycin-B aufspaltet. Für die ist gelb getönt.

Erzeugung von Neothramycin nach dem erfindungsgemässen (9) Auf Glycerin-Nitrat-Agar (inkubiert bei 27 °C) :

Verfahren kann ein Stamm der Gattung Streptomyces verwen- Schwachgelb bis rötlich-gelb [3pc, Amber] gefärbtes Wachs-

det werden, solange dieser Stamm Neothramycin erzeugt. Ein tum trägt schwach entwickelte Luftfäden von bräunlich-weis-

geeignetes Beispiel eines solchen Stammes ist der oben bereits io ser bis hellbräunlich-grauer Farbe. Lösliches Pigment ist erwähnte Streptomyces-Stamm MC916-C4. Dieser MC916-C4- schwach mit gelb getönt.

Stamm wurde am 2. Februar 1974 im «Fermentation Research (10) Auf Stärke-Agar (inkubiert bei 27 °C): Das Wachstum

Institute, Agency of Industriai Science and Technology», Inage, ist dumpf gelb bis gelblich-braun [2pi, Mustard Brown] gefärbt

Chiba-City, Japan, unter der Nummer FERM-P 2452 hinterlegt, und entwickelt keine Luftfäden oder nur selten weisse Luftfä-

Dieser MC916-C4-Stamm wurde ebenfalls am 15. Februar 1975 is den. Lösliches Pigment ist schwach braun getönt.

in der American Type Culture Collection, Washington, D.C. (11) Auf Calciummalat-Agar (inkubiert bei 27 °C): Das

USA, unter der A.T.C.C. Nummer 31123 deponiert. Wachstum ist hellgelb bis helloliv gefärbt und entwickelt eine

Die kulturellen und taxonomischen Eigenschaften des oder nur wenige weisse Luftfäden. Lösliches Pigment ist

MC916-C4-Stammes sind die folgenden: schwach gelb gefärbt.

20 (12) Auf Zellulose (inkubiert bei 27 °C): Farbloses Wachs-

1. Mikroskopische Morphologie tum ohne Luftfäden. Kein lösliches Pigment wird erzeugt.

Der MC916-C4-Stamm besitzt verzweigte Substratmyce- (13) Auf Gelatineeinstich: Auf leeren Gelatinemedium lien, von welchen sich Luftfäden in Form von Haken oder offe- (inkubiert bei 20 °C) ist das Wachstum farblos bis dumpf gelb nen Spiralen entwickeln. Es sind keine wirbelförmien Abzwei- gefärbt ohne Entwicklung von Luftfäden und unter Erzeugung gungen sichtbar. Reife Sporenketten enthalten im allgemeinen 25 eines löslichen Pigmentes von schwach gelber Farbe. Auf Glumehr als 10 konidale Sporen. Die Sporen weisen eine Grösse cose-Pepton-Gelatinemedium (inkubiert bei 27 °C) ist das von etwa 0,6 bis 0,8 auf 1,0 bis 1,2 Mikron auf und besitzen eine Wachstum hellgelb bis dumpf gelb gefärbt. Luftfäden werden glatte Oberfläche. zu Beginn nicht entwickelt, jedoch später solche von gräulich-

weisser Farbe. Kein Erzeugung von löslichem Pigment.

2. Wachstumseigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien 30 (14) Auf entrahmter Milch (inkubiert bei 37 °C): Das Wachs-

Die Bezeichnung von Farben in Klammern □ in den folgen- tum ist hellgelb bis hellorange gefärbt und entwickelt keine 1

den Ausführungen entspricht dem Farbstandard aus «Color Luftfäden. Das lösliche Pigment ist schwach orange getönt. Harmony Manual», herausgegeben von Container Corporation of America. 3) Physiologische Eigenschaften

(1) Auf Saccharose-Nitrat-Agar (inkubiert bei 27 °C): 35 (1) Temperatur für das Wachstum:

Schwachgelb bis rötlichgelb [3 pc, Amber] gefärbtes Wachs- Das Wachstum auf Glucose-Asparagin-Agar wurde bei tum trägt dünne Luftfäden von hellbräulich-grauer bis hell- 20 °C, 24 °C, 27 °C, 30 °C, 37 °C und 50 °C untersucht. Der grauer Farbe. Lösliches Pigment ist schwachgelb gefärbt. MC916-C4-Stamm entwickelte sich bei allen untersuchten Tem-

(2) Auf Glukose-Aspargin-Agar (inkubiert bei 27 °C) : peraturen, ausgenommen bei 50 °C. Die optimale Temperatur Dumpfgelb-orange [3nc, Amber ibs 4pe, Orange Rust] gefärb- 40 für gutes Wachstum wurde in der Nähe von 30 °C beobachtet, tes Wachstum entwickelt Luftfäden von hellgrauer bis hell- (2) Verflüssigung von Gelatine:

bräunlich-grauer Farbe [2ih, DK Co vert Gray]. Flüssiges Pig- Leeres Gelatinemedium ( 15%) begann nicht vom fünften ment ist schwachgelb gefärbt. Tag der Inkubation bei 20 °C an zu verflüssigen. Der Grad der

(3) Auf Glycerin-Aspargin-Agar (ISP No. 5 Medium, inku- Verflüssigung war mittel. Die Gelatine (15%) in Glucose-Pep-biert bei 27 °C): Dunkelgelb-orange bis gelblich-braun [3pi, Gol- 45 ton-Gelatin-Medium begann sich vom zweiten Tag der Inkuba-den Brown] gefärbtes Wachstum entwickelt Luftfäden von tion an zu verflüssigen, wenn bei 27 °C inkubiert wurde, und der bräunlich-grauer [3ih, Beige Gray] bis grauer [5ih, Shadow Gray] Grad der Verflüssigung war dann mittel bis stark.

Farbe. Lösliches Pigment mit gelblicher Färbung bis gelblich- (3) Hydrolyse von Stärke:

brauner Färbung wird erzeugt. Stärke in anorganischen Salzen-Stärke-Agar-Medium und

(4) Auf anorganischen Salzen-Stärke-Agar (ISP No. 4 so in Stärke-Agar-Medium wurde vom fünften Tag der Inkubation Medium, inkubiert bei 27 °C): Hellgelblich-braun bis gelblich- an hydrolysiert, wenn bei 27 °C inkubiert wurde. Der Grad an braun [3pi, Golden Brown] gefärbtes Wachstum entwickelt Hydrolyse war mittel bis stark.

Luftfäden von hellbräunlich-grauer [3fe, Silver Gray] Farbe. (4) Koagulation und Peptonisierung von entrahmter Milch:

Lösliches Pigment ist braun gefärbt. Die Rückseite des Wachs- Bei einer Inkubierung bei 37 °C begann die Koagulation tums ist dunkelgelblich-braun. 55 von entrahmter Milch am vierten Tag der Inkubation und die

(5) Auf Tyrosin-Agar (ISP No. 7 Medium, inkubiert bei Peptonisierung wurde vom fünften Tag der Inkubation an 27 °C): Dunkelgelb bis gelblich-braun [4pg, Dark Luggage Tan] beobachtet, nachdem die Koagulation vollendet war. Die gefärbtes Wachstum trägt Luftfäden von hellbräunlich-grauer Grade an Koagulation und Peptonisierung waren mittel bis Farbe. Lösliches Pigment ist dunkelgelb gelblich-braun gefärbt, stark.

(6) Auf Nähragar (inkubiert bei 27 °C): Das Wachstum ist 60 (5) Bildung von Melanoidpigmenten:

hellgelblich-braun bis hellbraun gefärbt, ohne Luftfäden. Lösli- Es wurde keine Pigmentierung beobachtet weder auf Tryp-

ches Pigment ist schwach braun getönt. ton-Hefeextraktbrühe (ISP No. 1 Medium), noch auf Pepton-

(7) Auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP No. 2 Medium, Hefeextrakt-Eisen-Agar (ISP No. 6 Medium), noch auf Tyrosin-inkubiert bei 27 °C): Gelblich-braun [4pg, Dark Luggage Tan] Agar (ISP No. 7 Medium) bei einer Inkubation bei 27 °C.

bis gelb-orange [4pe, Orange Rust] gefärbtes Wachstum ent- 65 (6) Verwertung von Kohlenstoffquellen für das Wachstum:

wickelt Luftfäden von hellgrauer [2fe, Covert Gray] bis hell- Die Verwertung der folgenden Kohlenhydrate wurde in bräunlich-grauer [2ih, Dark Covert Gray] Farbe. Lösliches Pig- Pridham-Gottlieb-Agar-Medium (ISP No. 9 Medium), inkubiert ment von gelblich-brauner bis brauner Farbe werden erzeugt. bei 27 °C, untersucht.

Glucose und L-Rhamnose wurden für das Wachstum verwertet. L-Arabinose, D-Fructose, Sacharose, Inosit und D-Man-nit wurden nicht verwertet. Die Verwertung von D-Xylose war zweifelhaft. Raffinose wurde manchmal verwertet, in anderen Fällen nicht.

(7) Verflüssigung von Calciummalat:

Calciummalat in Calciummalat-Agar-Medium wurde um das Wachstum herum verflüssigt vom neunten Tag der Inkubation an, bei einer Inkubationstemperatur von 27 °C. Der Grad der Verflüssigung war mittel bis stark.

(8) Reduktion von Nitrat:

Die Reduktion von Nitrat wurde in wässerigen Peptonlö-sungen, welche 1,0% Natriumnitrat enthielt (ISP No. 8 Medium), inkubiert bei 27 °C, beobachtet.

Unter Zusammenfassung der oben erwähnten Eigenschaften des MC916-C4-Stammes kann festgestellt werden, dass der Stamm zu der Gattung Streptomyces gehört und dass die Luftfäden offene Spiralen bilden, aber keine Schlingen entwickeln. Die Oberfläche der Sporen ist glatt bei mikroskopischer Beobachtung. Auf verschiedenen Medien weist das Wachstum eine Farbe von gelb-orange bis gelblich-braun auf und entwickelt Luftfäden von hellbräunlich-grauer bis bräunlich-grauer Farbe. Das lösliche Pigment ist gelb bis braun oder gelblich-braun getönt. Es wird kein Melanoidpigment erzeugt. Die Proteolyse und die Stärkehydrolyse sind von mittlerem bis starkem Grad.

Aufgrund der oben erwähnten Eigenschaften wurde der MC916-C4-Stamm mit bekannten analogen Arten von Streptomyces verglichen, unter Bezugnahme auf Beschreibungen des International Streptomyces Project (ISP). Es wurde gefunden,

dass der MC916-C4-Stamm dem Streptomyces naraensis gleicht (siehe «International Journal of Systematic Bacterio-logy», Volumen 22, Seite 323 [1972]). Es wurde jedoch festgestellt, dass der MC916-C4-Stamm verschieden ist von Strepto-s myces naraensis ISP 5508 in bezug auf die Verwertung von Kohlenstoffquellen. Streptomyces naraensis erzeugt Cyclohe-ximid, ähnlich wie MC916-C4-Stamm. Ferner wurde gefunden, dass unter dem Cycloheximid erzeugenden Stämmen die Stämme der Gruppe C, welche analog dem Streptomyces gri-io seolus sind, wie in einem Artikel von T. Furumai und Mitarbeitern, «On cycloheximide-producing microrganisms» (siehe «Journal of Antibiotics», Ser.B., Volumen 17, No. 4, Seite 181 [1964]) sehr ähnlich dem MC916-C4-Stamm sind.

Der MC916-C4-Stamm ist in mancher Beziehung mit den 15 Stämmen dieser Gruppe C übereinstimmend, doch wurde der MC916-C4-Stamm nicht auf die Eigenschaften der Hemolyse, Verflüssigung von Serum und Verwertung von Galactose und Lactose untersucht, welche bei den Stämmen der Gruppe C vorhanden sind. Diese Stämme der Gruppe C waren jedoch 20 nicht erhältlich, da sie bereits tot waren. In dieser Situation wurde der Vergleich des MC916-C4-Stammes mit Streptomyces sp. IFO 3300 durchgeführt, welcher bekanntlich Fermicidin erzeugt, ein antibiotisches Analogon von Cycloheximid, und im oben genannten Artikel von T. Furumai und Mitarbeitern als 25 gut übereinstimmend mit den Stellen der Gruppe C genannt wird. Die Vergleichsresultate sind in der folgenden Tabelle V zusammengestellt, unter Bezugnahme auf die Beschreibungen des «Journal of Antibiotics».

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Tabelle V

Eigenschaften

MC916-C4-Stamm

Streptomyces sp. IFO Beschreibung von 330 (Analogen zu Streptomyces sp. IFO Streptomyces griseolus) 330 aus der Literatur*

Beschreibung der Stämme der Gruppe C aus der Literatur

Bildung von Spiralen Sporenoberfläche Farbe der Luftfäden

Farbe des Wachstums Lösliches Pigment

+ glatt

± (+) hellbräunlich-grau bis glatt**

Bildung von melaninartigem Pigment auf ISP No. 1 Medium -

auf ISP No. 6 Medium -

auf ISP No. 7 Medium -

Hydrolyse von Stärke +

Koagulation von Milch +

Peptonisierung von Milch +

Verflüssigung von Gelatine in leerem + Gelatinemedium in Glucose-Pepton-Gelatine-Medium + Reduktion von Nitrat +

Verwertung von Kohlenstoffquellen Glukose +

L-Arabinose -

D-Xylose ±

D-Fractose -

Saccharose -

Inosit -

L-Rhamnose Raffinose D-Mannit

Erzeugte Antibiotika hellbräunlich-grau bis bräunlich-grau bräunlich-grau gelb-orange bis farblos bis schwach gelblich-braun gelblich-braun gelb bis brauner Ton keines oder mit oder gelblich-braun brauner Tönung

+ + + + + +

+ +

(+) + ± ±

Cycloheximid und Neothramycin-A und grau crèmeartig bis braun getönt keines oder mit brauner Tönung

_** _**

+

glatt bräunlich-grau schwach verflüssigt, +

+ + + +

in gewissen Fällen +, in anderen Fällen -

in gewissen Fällen +, in anderen Fällen -

Fermicidin (Antibiotikum analog zu Cycloheximid)

Cycloheximid

Anmerkung:

Literatur * bedeutet «Journal of Antibiotics», Ser. B, Volumen 7, No. 7, Seite 221 (1954).

Literatur **bedeutet «Journal of Antibiotics», Ser. B, Volumen 17, No. 4, Seite 181 (1964).

Bezüglich der Verwertung von Kohlenstoffquellen: Das Symbol ± bedeutet: wahrscheinlich keine Verwertung.

Das Symbol (+) bedeutet) wahrscheinliche Verwertung.

Wie aus der obigen Tabelle ersichtlich, ist der MC916-C4- von Nitrat und vom Stamm ISP 5067 in bezug auf die Bildung Stamm übereinstimmend mit dem Stamm der Gruppe C, wel- von Spiralen, die Verwertung der Kohlenstoffquellen und die eher in der oben erwähnten Literatur beschrieben ist, jedoch so Reduktion von Nitrat.

verschieden von Streptomyces sp. Stamm IFO 3300 in bezug Mutationen von Actinomyceten treten oft auf sowohl unter auf die Koagulation und die Peptonisierung von Milch. künstlichen wie unter spontanen Bedingungen. Die vorliegende

Ferner unterscheidet sich der Stamm MC916-C4 von Strep- Erfindung umfasst daher die Verwendung des Stammes tomyces griseolus (siehe «International Journal of Systematic MC916-C4 sowie dessen Mutanten. Mit anderen Worteii, Bacteriology», Volumen 18, Seite 122 [1968]), welcher als ähn- ss umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung aller lieh dem genannten Stamm IFO 3300 beschrieben wurde, in Stämme der Gattung Streptomyces, welche Neothramycin dem Streptomyces griseolus keine offenen Spiralen in den Luft- erzeugen.

fäden bildet und etwas verschieden vom Stamm MC916-C4 in Neothramycin kann erhalten werden durch aerobe Kulti-

bezug auf die Verwertung der Kohlenstoffquellen ist. Weitere vierung von Sporen oder Mycelien eines Neothramycin erzeu-Vergleiche des Stammes MC916-C4 mit Streptomyces sp. IFO 60 genden Stammes der Gattung Streptomyces, wie z. B. Strepto-3300, Streptomyces griseolus ISP 5067 und Streptomyces nara- myces sp. Stamm MC916-C4 (identifiziert als A.T.C.C. 31123). ensis ISP 5508 wurden aufgeführt. Es wurde gefunden, dass der Bei der Durchführung des Verfahrens wird eine Menge Sporen Stamm MC916-C4 mit Streptomyces Sp. IFO 3300 und Strepto- oder Mycelien eines Neothramycin erzeugenden Stammes in myces naraensis ISP 5508 und den meisten früheren Stämmen ein dafür geeignetes Kulturmedium, welches Nährquellen entverwandt ist. Der Stamm IFO 3300 ist etwas verschieden vom 65 hält, geimpft und anschliessend unter aeroben Bedingungen Stamm MC916-C4, indem er einen Strich orange in der Farbe und vorzugsweise unter submersen aeroben Bedingungen, des Wachstums aufweist. Der Stamm MC916-C4 unterscheidet bebrütet, so dass eine Kulturbrühe erhalten wird, welche Neo-sich klar vom Stamm ISP 5508 in bezug auf die Reduzierung thramyein enthält. Im allgemeinen können die üblicherweise

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für die Kultivierung gewöhnlicher Actinomyceten verwendeten Bestandteile von Kulturmedien für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel kann im Handel erhältliches Sojamehl, Erdnusspulver, Baumwollsamenpulver, getrocknete Hefe, Pepton, Fleischextrakt, Casein, 5 Maiseinweichflüssigkeit, N-Z-Amin, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und dergleichen als Stickstoffquelle verwendet werden. Im Handel erhältliche Kohlenhydrate, wie Glukose,

Stärke, Glycerin, Maltose, Dextrin, Saccharose, Lactose, Melassen und dergleichen sowie Fett oder Öl sind nützlich als 10 Kohlenstoffquelle. Ausserdem können Natriumchlorid, Kalzi-umcarbonat, Magnesiumsulfat, Manganchlorid, Natriumphosphat oder andere anorganische Salze als Salzzusatz im Kulturmedium verwendet werden. Verschiedene Schwermetallsalze können ebenfalls in Spuren zugesetzt werden, falls erforderlich. 15 Alle Nährstoffe, welche für die Züchtung von Actinomyceten bekannt sind, können im vorliegenden Verfahren verwendet werden, solange sie vom Neothramycin erzeugenden Stamm für die Erzeugung von Neothramycin assimiliert werden können. 20

Für die Erzeugung von Neothramycin in grösserem Massstab wird die flüssige Kultivierung bevorzugt. Jede Temperatur, bei welcher der Neothramycin erzeugende Stamm fähig ist zu wachsen und das Neothramycin zu erzeugen, kann für die Kultivierung verwendet werden, doch liegt eine bevorzugte Kulti- 25 vierungstemperatur im Bereich von 25 bis 35 °C. Die Kultivierung wird während genügend langer Zeit fortgesetzt, um eine genügende Menge an Neothramycinen-A und -B im Kulturmedium zu erzeugen und anzusammeln. Beispielsweise wurde ein Kulturmedium, welches 2% Glukose, 2% Glycerin, 1,2% Soja- 30 bohnenmehl, 1,0% Baumwollsamenmehl, 0,32% Kalziumcarbo-nat, 0,5% Natriumchlorid und 0,0005% Manganchlorid-Tetrahydrat enthielt, zubereitet und bei pH 6,8 sterilisiert. Dieses Medium wurde sodann mit Sporen oder Mycelien beimpft, welche aus einer Schrägkultur des Stammes MC916-C4 gewon- 35 nen worden waren. In einer aeroben Schüttelkultur bei 28 °C erreichte die Erzeugung und Ansammlung von Neothramycin im Kulturmedium ein Maximum am Ende der Inkubation von 3 bis 5 Tagen.

Die Prüfung von Neothramycin kann unter Verwendung 40 von Staphylococcus aureus oder Escherichia coli als Testorganismen nach einer Standard-Plattenmethode durchgeführt werden, welche üblicherweise für die Prüfung bekannter Antibiotika verwendet wurde. Ein authentisch reines Neothramycin-A, welches aus dem später beschriebenen Beispiel 4 erhalten 45 wurde, kann als Standard-Probe verwendet werden, welche eine Potenz von 1000 Einheiten pro Milligramm aufweist. Falls die anderen antibiotischen Substanzen, wie Cycloheximid, gleichzeitig in der Kulturbrühe des Stammes MC916-C4 zusätzlich zu den Neothramycin erzeugt werden, kann die Kultur- 50 brühe mit Äthylacetat oder einem anderen geeigneten organischen Lösungsmittel gewaschen werden, um derartige andere antibiotische Substanzen durch Extraktion zu entfernen. Die verbleibende wässrige Phase kann dann für die Prüfung des Gehaltes an Neothramycin-A und -B nach der oben genannten 55 Methode verwendet werden.

Für die Gewinnung des Neothramycin aus dem Kulturmedium kann die Kulturbrühe des Neothramycin erzeugenden Stammes entweder mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie n-Butanol, behandelt werden, um einen 60 Extrakt des Neothramycins in diesem Lösungsmittel zu ergeben, oder mit einem geeigneten Adsorbens, wie z. B. Aktivkohle, behandelt werden, um das Neothramycin durch das Adsorptionsmittel zu adsorbieren. Die Verteilung des Neothra-mycin-A oder Neothramycin-B zwischen n-Butanol und Wasser 65 wurde geprüft, und es wurde gefunden, dass der Verteilungskoeffizient des Neothramycins in n-Butanol/Wasser grösser als 5 ist bei einem pH-Wert von 2 bis 7. Das Neothramycin kann

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daher mit n-Butanol aus der wässerigen Kulturbrühe, welche auf einem pH-Wert von2 bis 7 und vorzugsweise von etwa 6 eingestellt wurde, extrahiert werden. Das Neothramycin ist mit Äthylacetat oder Chloroform aus dem flüssigen Teil der Kulturbrühe praktisch nicht extrahierbar. Falls erforderlich, ist es daher möglich, die Kulturbrühe mit Äthylacetat oder Chloroform für die Extraktion zu behandeln, um die löslichen Verunreinigungen aus der Kulturbrühe zu entfernen. Um das Neothramycin aus der Kulturbrühe abzutrennen, wird bevorzugt, die Kulturbrühe mit Aktivkohle als Adsorptionsmittel zu behandeln. Das Neothramycin, welches durch Aktivkohle adsorbiert wurde, kann daraus mit Hilfe von Methanol und Wasser, eines Gemisches von Propanol und Wasser oder eines Gemisches von Aceton und Wasser usw. eluiert werden. Die Wirksamkeit der Eluierung kann verbessert werden, wenn die Eluierung unter schwach alkalischen Bedingungen erfolgt. Die Reinigung des Neothramycins kann unter Anwendung der oben erwähnten Extraktionsmethode und Adsorptions-Eluie-rungsmethode in geeigneter Kombination oder auf wiederholte Weise erfolgen. Eine weitere Reinigung kann durch eine übliche Säulenchromatographie an «Sephadex LH-20» (ein Handelsprodukt der Pharmacia Co., Schweden) oder an Silicagel erzielt werden. Das bekannte antibiotische Cycloheximid, welches oft in der Kulturbrühe des Stammes MC916-C4 gleichzeitig auftritt, kann leicht vom Neothramycin getrennt werden durch Extrahieren mit Äthylacetat oder durch Chromatographie an «Sephadex LH-20».

Um das Neothramycin-A vom Neothramycin-B zu trennen, kann ein Gemisch von Neothramycin-A und Neothramycin-B einer Säulenchromatographie an Silicagel mit Chloroform-Methanol (30:1 Volumverhältnis) als Entwickler unterworfen werden. Das isolierte Neothramycin-A oder das isolierte Neothramycin-B kann durch Säulenchromatographie auf Silicagel unter Anwendung eines geeigneten Gemisches organischer Lösungsmittel als Entwickler gereinigt werden.

Die Gewinnung des Neothramycin-A und Neothramycm-B kann z. B. auf folgende Weise durchgeführt werden: Die Kulturbrühe, welche das Neothramycin enthält, wird zuerst filtriert oder zentrifugiert, um die Feststoffe zusammen mit dem Mycélium zu entfernen. Das Filtrat wird sodann mit Aktivkohle behandelt, um das Neothramycin daraus zu adsorbieren. Die Aktivkohle, welche das adsorbierte Neothramycin trägt, wird mit 50% Aceton-Wasser (ein Gemisch von Aceton und Wasser in einem Volumverhältnis von 1:1) bei pH 8,0 eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen gesammelt und die aktiven Fraktionen werden vereint und unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von bis zu 40 °C zur Trockene verdampft oder aber gefriergetrocknet, um ein rohes Neothramycin enthaltendes Pulver zu ergeben. Dieses rohe Pulver wird mit wässerigem Äthanol extrahiert, so dass ein grösserer Teil der aktiven Komponenten im erhaltenen Extrakt abgetrennt wird. Dieser Extrakt wird unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von bis zu 40 °C zur Trockene verdampft oder gefriergetrocknet, um ein zweites rohes Pulver zu ergeben. Eine Lösung dieses rohen Pulvers in Methanol wird durch eine Säule von «Sephadex LH-20» geleitet, welche anschliessend mit Methanol entwickelt wird. Während dieses chromatographischen Verfahrens wird das gegebenenfalls vorhandene Cycloheximid in Fraktionen eluiert, welche in der ersten Phase des Verfahrens auslaufen, während das Gemisch von Neothramycin-A und -B in Fraktionen eluiert wird, welche in einer späteren Phase der Eluierung auslaufen.

Die aktiven Fraktionen, welche das Neothramycin-A und -B enthalten, werden vereint und sodann unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 °C zur Trockene verdampft, um ein rohes Puler zu ergeben. Dieses Pulver wird in einem kleinen Volumen Methanol aufgenommen und die methanolische Lösung gleichmässig mit einer gewissen Menge an

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neutralem Silicagel vermischt. Das Gemisch wird zur Trockene Trockene verdampft, wodurch ein authentish reines, farbloses verdampft und anschliessend auf den Kopf einer Säule aus Pulver von Neothramycin-B erhalten wird, welches eine Zer-

einer weiteren Menge dieses neutralen Silicagels verbracht, setzungstemperatur von 144 bis 151 °C und eine spezifische welche mit einem Gemisch von Chloroform und Äthanol (30:1 optische Drehung [a]D26 = +314° (c 0,48, Dioxan) aufweist. Volumverhältnis) imprägniert wurde. Die Silicagelsäule wird 5 im Hinblick auf die oben genannten Eigenschaften von anschliessend mit Chloroform-Äthanol (30:1 Volumverhältnis) Neothramycin-A und Neothramycin-B wurde bestätigt, dass entwickelt. Während dieses Chromatographieverfahrens wird diese Substanzen neue Antibiotika sind, welche sich von allen das Neothramycin-A in die aktiven Fraktionen eluiert, welche in bekannten Antibiotika unterscheiden. Diese neuen Verbindun-der ersten Phase des Verfahrens auslaufen, während das Neo- gen können zur therapeutischen Behandlung eines lebenden thramycin-B in aktiven Fraktionen eluiert wird, welche in der io tierischen oder menschlichen Körpers, welcher an Leukämie späteren Phase des Verfahrens auslaufen. Die aktiven Fraktio- leidet, verwendet werden. Zu diesem Zweck kann ein pharma-nen, welche das Neothramycin-A enthalten, und die aktiven zeutisches Präparat hergestellt werden, welches mindestens Fraktionen, welche das Neothramycin-B enthalten, werden eine der Verbindungen Neothramycin-A, Neothramycin-B, unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 °C Methylneothramycin-A und Methylneothramycin-B, sowie zur Trockene verdampft, um ein rohes Pulver zu ergeben, wel- 15 deren pharmazeutisch annehmbare Salze in genügender ches das Neothramycin-A enthält, sowie ein rohes Pulver, wel- Menge enthält, um die Leukämie in vivo herabzusetzen, wobei ches das Neothramycin-B enthält. der aktive Bestandteil mit einem pharmazeutisch annehmaren

Das derart erhaltene rohe Pulver, welches das Neothramy- Träger kombiniert ist.

cin-A enthält, wird in einer entsprechenden Menge Chloroform Die bevorzugten Mengen des verwendeten Neothramycins aufgenommen und die Lösung durch eine Säule aus neutralen 20 variieren je nach der verwendeten Verbindung, der Zusammen-Silicagel, welche mit Chloroform imprägniert wurde, hindurch- setzung des pharmazeutischen Präparates, der Art der Anwen-geführt. Die Silicagelsäule wird mit Chloroform gewaschen dung und dem zu behandelnden Organismus. Viele Faktoren, und anschliessend bei 5 °C mit Chloroform-Äthanol (60:1 welche die Wirkung des Heilmittels modifizieren, müssen vom

Volumverhältnis) entwickelt. Das Eluat wird in Fraktionen Fachmann berücksichtigt werden, wie z. B. Alter, Körperge-gesammelt, und die gewünschten Aktivfraktionen, welche nur 25 wicht, Geschlecht, Diät, Verabreichungszeit, Verabreichungs-Neothramycin-A enthalten, durch die Testresultate biologi- weg, Geschwindigkeit der Ausscheidung, Kombination von scher Untersuchungen und der Dünnschichtchromatographie Heilmitteln, Empfindlichkeiten auf die Reaktion und Grad der jeder Fraktion festgestellt. Die derart ausgewählten, erwünsch- Erkrankung. Optimale Verabreichungsbedingungen für eine ten aktiven Fraktionen werden vereint und unter verminder- gegebene Kombination von Bedingungen können vom Fach-tem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 °C zur Trockene ver- 30 mann auf bekannte Weise aufgestellt werden.

dampft, um ein farbloses Pulver zu ergeben, welches Neothra-mycin-A enthält. Dieses Pulver kann weiter bis zu einem farblo- Beispiel 1

sen, Neothramycin-A enthaltenden Pulver mit einer Zerset- Eine Öse voll Streptomyces sp. MC916-C4 (identifizierte als zungstemperatur von 110 bis 122 °C gereinigt werden, indem A.T.C.C. 31123), welches in einem Schrägagarmedium inkubiert das oben beschriebene Silicagelchromatographieverfahren 35 worden war, wurde in ein steriles flüssiges Kulturmedium (pH wiederholt wird oder indem das farblose Pulver in einem klei- 7,0,125 ml) geimpft, welches 2,5% Maltose, 0,75% Pepton, 0,75% nen Volumen Chloroform aufgelöst wird, worauf die Chloro- Fleischextrakt, 0,3% Hefeextrakt, 0,3% Natriumchlorid und formlösung mit Äthyläther versetzt und der ausgeschiedene 0,1% Magnesiumsulfat (7H2O) enthielt. Das geimpfte Medium Niederschlag abfiltriert und getrocknet wird. Ein farbloses Pul- wurde einer Schüttelkultur bei 28 °C während 48 Stunden ver, welches Neothramycin-B enthält und eine Zersetzungs- 40 unterworfen, um eine primäre Impfkultur zu ergeben. Diese pri-temperatur von 139 bis 163 °C aufweist, kann aus dem oben märe Impfkultur wurde in einem Impfverhältnis von 0,48 genannten rohen Pulver, welches das Neothramycin-B enthält, Volumprozent auf 50 Liter eines sterilisierten flüssigen Kulturerhalten werden durch Reinigung auf dieselbe Weise wie für médiums (pH 7,0) geimpft, welches 3,5% Stärkesirup, 0,75% Neothramycin-A beschrieben. Es wird dann jedoch vorgezo- Pepton, 0,75% Fleischextrakt, 0,3% Hefeextrakt, 0,3% Natri-gen, die Säulenchromatographie auf Silicagel unter Verwen- 45 umchlorid und 0,1% Magnesiumsulfat (7H2O) enthielt und in dung eines Gemisches von Chloroform und Äthanol (100:1 einem rostfreien Fermentiertank mit einem Fassungsvermögen

Volumverhältnis) als Entwickler durchzuführen. von 130 Litern enthalten war. Das geimpfte Medium wurde bei

Das oben genannte farblose Pulver, welches Neothramy- 28 °C während 24 Stunden unter Belüftung und Bewegung kul-cin-A enthält und eine Zersetzungstemperatur von 110 bis tiviert, um eine sekundäre Impfkultur zu ergeben. Diese sekun-

122 °C aufweist, wird in einem kleinen Volumen Äthanol aufge- 50 däre Impfkultur wurde in einem Impfverhältnis von 2 Volumlöst und wiederum über eine Säule aus neutralem Silicagel prozent (6 Liter) in ein flüssiges Kulturmedium (pH 6,8,300 chromatographiert, unter Verwendung von mit Wasser gesät- Liter) geimpft, welches 2% Glukose, 2% Glycerin, 1,2% Soja-tigtem Äthylacetat als Entwickler. Das Eluat wird in Fraktio- bohnenmehl, 1,0% Baumwollsamenpulver, 0,32% Kalziumcar-nen gesammelt, und diejenigen Fraktionen, welche Neothramy- bonat, 0,5% Natriumchlorid und 0,0005% Manganchlorid cin-A enthalten, werden vereint und unter vermindertem 55 (4HzO) enthielt und während 30 Minuten bei 120 °C sterilisiert Druck bei einer Temperatur bis zu 40 °C zur Trockene ver- worden war. Die Kultivierung erfolgte bei 28 °C während 92 dampft, wodurch ein authentisch reines, farbloses Pulver von Stunden unter Belüftung und Bewegung (250 Touren pro Neothramycin-A erhalten wird, welches eine Zersetzungstempe- |Minute), wobei die Belüftungsmenge 150 Liter pro Minute wäh-ratur von 132 bis 147 °C und eine spezifische optische Drehung rend der ersten 24 Stunden betrug und anschliessend auf 300 [a]D26 = + 272° (c 0,52, Dioxan) aufweist. Das oben erwähnte 6o Liter pro Minute während der folgenden 24 bis 92 Stunden der farblose Pulver, welches Neothramycin-B enthält und eine Zer- Kultivation erhöht wurde.

setzungstemperatur von 139 bis 163 °C aufweist, wird in einem Die erhaltene Kulturbrühe (pH 7,3,300 Liter, Potenz 88 Einkleinen Volumen Methanol aufgelöst und wiederum über eine heiten pro Milliliter) wurde mit 24 kg eines Filterhilfsmittels Säule aus neutralem Silicagel chromatographiert unter Ver- (Diatomäenerde, im Handel erhältlich unter der Marke «Hyflo-wendung von wasser-gesättigtem Äthylacetat als Entwickler. 55 Supercel») vermischt und das Gemisch wurde mit einer Filter-Das Eluat wird in Fraktionen gesammelt und die Fraktionen, presse filtriert, um 300 Liter des Brühenfiltrates zu ergeben, welche Neothramycin-B enthalten, werden vereint und unter Das Brühenfiltrat wurde gut mit 3 kg Aktivkohle bei Zimmervermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 °C zur temperatur während 1 Stunde unter Rühren vermischt, so dass

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die Antibiotika von der Kohle adsorbiert wurde. gewaschen und anschliessend mit Chloroform-Äthanol (60:1

Die Aktivkohle wurde durch Zentrifugieren gesammelt und Volumverhältnis) entwickelt. Das Eluat wurde in 8-ml-Fraktio-dann mit 150 Liter Wasser gewaschen. Die gewaschene Kohle nen gesammelt und es wurde gefunden, dass das Neothramy-wurde mit 70 Liter 45%igem Aceton-Wasser (pH 8,0) während cin-A in den Fraktionen No. 13 bis 27 eluiert war. Die vereinten

I Stunde unter Rühren vermischt, so dass die Antibiotika vom 5 Fraktionen No. 12 bis 27 wurden unter vermindertem Druck Lösungsmittel extrahiert wurde. Diese Extraktion wurde zwei- bei einer Temperatur bis zu 40 °C zur Trockene verdampft und mal durchgeführt und die erhaltenen Extrakte wurden zu einem ergaben 320 mg eines schwach gelb gefärbten Pulvers. Dieses Volumen von 118 Liter vereint. Die Extraktlösung wurde unter Pulver wurde in einem minimalen Volumen Chloroform aufge-vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 °C kon- nommen, und zu dieser Lösung wurde Äthyläther zugesetzt, bis zentriert und die konzentrierte Lösung (2,6 Liter) gefrierge- io sich der gebildete Niederschlag nicht weiter setzte. Der trocknet zu 565 g eines braungefärbten Pulvers (Potenz 35 Ein- Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet, wobei 183 mg heiten pro Milligramm), welches das Neothramycin-A und -B eines farblosen Pulvers, welches Neothramycin-A enthielt und enthielt. Dieses braungefärbte Pulver wurde mit 11,6 Litern eine Zersetzungstemperatur von 110 bis 122 °C aufwies, 80%igem Äthanol-Wasser extrahiert. Die unlöslichen Stoffe, gewonnen wurden (Potenz 1000 Einheiten pro Milligramm), welche keine antibakterielle Wirksamkeit aufwiesen, wurden 15 Ausbeute 35%.

abfiltriert, und es wurden 11,2 Liter eines äthanolischen Extraktes gewonnen. Dieser Extrakt wurde unter vermindertem Beispiel 4

Druck bei einer Temperatur bis zu 40 °C auf einem Volumen Das in Beispiel 3 erhaltene farblose Pulver, welches Neo-

von 800 ml eingeengt und die konzentrierte Lösung gefrierge- thramycin-A enthielt ( 153 mg) wurde in einem kleinen Volumen trocknet, wobei 218,5 g eines rohen Pulvers mit einer Potenz 20 Äthanol aufgenommen und nochmals über eine Säule aus von 53 Einheiten pro Milligramm erhalten wurden. Dieses rohe einem neutralen Silicagel (4,07 g) derselben Qualität wie in BeiPulver wurde in fünf gleiche Teile geteilt, und jeder Teil wurde spiel 2 verwendet, chromatographiert und mit Wasser gesättig-in 20 ml Methanol aufgelöst. Die Methanollösung wurde durch tem Äthylacetat bei 5 °C entwickelt. Das Eluat wurde in Frak-eine Säule (90 mm Durchmesser) aus 4 Liter «Sephadex LH-20» tionen von 0,6 ml gesammelt. Die Fraktionen No. 55 bis 95, geleitet, welche anschliessend mit Methanol entwickelt wurde. 25 welche Neothramycin-A enthielten, wurden vereint und unter Das Eluat wurde in Fraktionen von 200 ml gesammelt, und es vermindertem Druck bei einer Temperatur von bis zu 40 °C zur wurde gefunden, dass Cycloheximid in den Fraktionen No. 9 bis Trockene verdampft, wobei 53 mg eines farblosen Pulvers aus

II eluiert worden war, während ein Gemisch von Neothramy- authentisch reinem Neothramycin-A gewonnen wurden, wel-cin-A und -B in den Fraktionen No. 12 bis 14 enthalten war. Die ches eine Zersetzungstemperatur von 132 bis 147 °C aufwies Fraktionen No. 12 bis 14 wurden vereint und unter verminder- 30 (Potenz 1000 Einheiten pro Milligramm). [a]D26 = +272° (c 0,52, tem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 °C zur Trockene ver- Dioxan). Ausbeute 35%.

dampft, wobei 47 g eines rohen Pulvers (Potenz 160 Einheiten pro Milligramm) erhalten wurden, welche die Neothramycin-A Beispiel 5

und -B gemischt enthielten. Ausbeute 28%, berechnet auf den Das in Beispiel 2 erhaltene gelbliche rohe Pulver, welches

Neothramycingehalt der Kulturbrühe. 35 das Neothramycin-B enthielt (810 mg) wurde in 16 ml Chloro form aufgenommen und die Lösung bei 5 °C über eine Säule (13 Beispiel 2 mm Durchmesser) aus 16 g neutralem Silicagel von derselben

Das rohe, in Beispiel 1 erhaltene Pulver (33 g), welches die Qualität wie in Beispiel 2 verwendet, welches mit Chloroform Neothramycin-A und -B gemischt enthält, wurde in einem klei- imprägniert worden war, geleitet. Die Säule wurde mit 320 ml nen Volumen Methanol aufgenommen und die Lösung gleich- 40 Chloroform gewaschen und anschliessend mit Chloroform-mässig mit 60 g eines neutralen Silicagels vermischt und Äthanol (100:1 Volumverhältnis) entwickelt. Das Eluat wurde anschliessend unter vermindertem Druck getrocknet. Die der- in Fraktionen von 6,4 ml gesammelt, und es wurde gefunden, art erhaltene trockene Masse wurde auf den Kopf einer Säule dass das Neothramycin-B in den Fraktionen No. 34 bis 70 eluiert (60 mm Durchmesser) aus 660 g des neutralen Silicagels ver- war. Die vereinten Fraktionen No. 34 bis 70 wurden unter verbracht, welches mit Chloroform-Methanol (30:1 Volumverhält- 45 mindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 °C zur Trok-nis) imprägniert worden war. Diese Silicagelsäule wurde bei kene verdampft und ergaben 160 mg eines schwach gelb 5 °C mit Chloroform-Methanol (30:1 Volumverhältnis) entwik- gefärbten Pulvers. Dieses Pulver wurde in einem minimalen kelt. Das Eluat wurde in Fraktionen zu 130 ml gesammelt, und Volumen Chloroform aufgenommen und Äthyläther zu dieser es wurde gefunden, dass das Neothramycin-A in den Fraktio- Lösung zugesetzt, bis der Niederschlag nicht weiter abgeschienen No. 23 bis 31 eluiert worden war, während das Neothramy- den wurde. Der Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet, cin-B in den Fraktionen No. 35 bis 49 eluiert worden war. Die wobei 85 mg eines farblosen Pulvers, welches Neothramycin-B vereinten aktiven Fraktionen No. 23 bis 31 wurden unter ver- enthielt und eine Zersetzungstemperatur von 139 bis 163 °C mindertem Druck einer Temperatur von bis zu 40 °C zur Trok- aufwies, erhalten wurden (Potenz 620 Einheiten pro Milli-kene verdampft und ergaben 1,47 g eines gelblichen rohen Pul- gramm). Ausbeute 14,6%.

vers, welches das Neothramycin-A enthielt (Potenz 520 Einhei- 55 ten pro Milligramm). Ausbeute 14%. Die vereinten Fraktionen Beispiel 6

No. 35 bis 49 wurden auf dieselbe Weise zur Trockene ver- Das in Beispiel 5 erhaltene farblose Pulver, welches Neo-

dampft und ergaben 1,03 g eines gelblichen rohen Pulvers, wel- thramycin-B enthielt (74 mg) wurde über ein neutrales Silicagel ches das Neothramycin-B enthielt (Potenz 450 Einheiten pro (2,53 g) nochmals chromatographiert und mit Äthylacetat Milligramm). Ausbeute 9%. 60 gesättigtem Wasser auf dieselbe Weise wie in Beipsiel 4 entwik-

kelt. Das Eluat wurde in Fraktionen von 0,35 ml gesammelt. Die Beispiel 3 Neothramycin-B enthaltenden Fraktionen No. 75 bis 157 wur-

Das in Beispiel 2 erhaltene gelbliche rohe Pulver, welches den vereint und unter vermindertem Druck bei einer Temperadas Neothramycin-A enthielt (1 g) wurde in 20 ml Chloroform tur von bis zu 40 °C zur Trockene verdampft, wobei 36 mg eines gelöst und die Lösung bei 5 °C durch eine Säule (13 mm Durch- es farblosen Pulvers aus authentisch reinem Neothramycin-B mit messer) von 20 g eines neutralen Silicagels derselben Qualität einer Zersetzungstemperatur von 144 bis 151 °C erhalten wur-wie in Beispiel 2, welches mit Chloroform imprägniert worden den (Potenz 835 Einheiten pro Milligramm), war, hindurchgeführt. Die Säule wurde mit 400 ml Chloroform [a]D26 =+314° (0,48, Dioxan). Ausbeute 65%.

629253

12

io

15

Beispiel 7

Eine primäre Impfkultur (je 0,5 ml) von Streptomyces sp. MC916-4, welche auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 erhalten worden war, wurde in je 30 ml eines sterilisierten flüssigen Kulturmediums (pH 6,8) geimpft, welches 2% Glucose, 2% Glycerin, 1,2% Sojabohnenmehl, 1,0% Baumwollsamenpulver, 0,32% Kalziumcarbonat, 0,5% Natriumchlorid und 0,0005% Manganchlorid (4HîO) enthielt, und in vier Erlenmeyer-Kolben eingefüllt war. Das geimpfte Medium wurde bei 28 °C während 92 Stunden au einer rotierenden Schüttelapparatur (200 Touren pro Minute) kultiviert. Die erhaltene Kulturbrühe (pH 6,5,90 ml, Potenz 780 Einheiten pro Milliliter) wurde mit 90 ml Buta-nol unter Eiskühlung extrahiert. Der Butanolextrakt wurde unter vermindertem Druck bei einer Temperatur bis zu 40 °C zur Trockene verdampft, wobei 242 mg eines bräunlichen Sirups erhalten wurde, welche Neothramycin-A und -B enthielt (Potenz 100 Einheiten pro Milligramm). Ausbeute 44%.

Beispiel 8

Ein gelbliches rohes Pulver (1,0 g, Potenz 750 Einheiten/pro 20 Milligramm), welches Neothramycin-A und -B enthielt und auf ähnliche Weise wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben erhalten worden war, wurde in 20 ml Methanol gelöst. Die Methanollösung wurde während 16 Stunden auf 25 °C gehalten und unter vermindertem Druck zur Trockene verdampft, wobei 1,0 g eines Gemisches von Methylneothramycin-A und -B erhalten wurde. Das Gemisch wurde über eine Säule aus Silicagel (50 g, «Wako-gel C-200», Wako Chemicals, Osaka) chromatographiert und mit einem Gemisch von Benzol und Methanol (20:1 Volumverhältnis) entwickelt. Das Eluat wurde in Fraktionen von 12,5 ml aufgeteilt. Die Fraktionen No. 19 bis 25, welche Methylneothramycin-A enthielten, und die Fraktionen No. 26 bis 38, welche ein Gemisch von Methylneothramycin-A und -B enthielten, erhalten. Die Fraktionen No. 26 bis 38 wurden zur Trockene verdampft, und der Rückstand über eine Säule von Silicagel (18 g) auf dieselbe Weise wie oben beschrieben noch-

30

35

mais chromatographiert. Die Fraktionen, welche Methylneothramycin-A enthielten und die oben erwähnten Fraktionen, welche Neothramycin-A enthielten, wurden vereint und zur Trockene verdampft, wobei ein farbloses Pulver erhalten wurde (299 mg). Das Pulver wurde aus einem Gemisch von Aceton und Benzol kristallisiert und ergab 240 mg farblose Kristalle von Methylneothramycin-A. Die Fraktionen, welche Me-thylneothramicin-B enthielten, wurden vereint und zur Trok-kene verdampft, wobei 175 mg eines farbloses Pulers von reinem Methylneothramycin-B erhalten wurden.

Beispiel 9

Kristallines Methylneothramycin-A (225 mg), welches wie in Beispiel 8 erhalten worden war, wurde in 45 ml 0,01 N HC1-Dioxan (1:1 Volumverhältnis) gelöst und die Lösung während 1 Stunde bei Zimmertemperatur (22 °C) gehalten. Die Lösung wurde mit 1 N NaOH auf pH 6,0 eingestellt und unter vermindertem Druck zur Trockene verdampft, wobei 216 mg eines farblosen Pulvers erhalten wurden, welches die Neothramycin-A und -B enthielt. Das Pulver wurde über eine Säule aus Silicagel (20 g) auf ähnliche Weise wie in Beispiel 2 chromatographiert. Reines Neothramycin-A (87 mg) und Neothramycin-B (69 mg) wurden erhalten.

Die Hydrolyse von Methylneothramycin-B (100 mg) in 20 ml 0,01 N HCl-Dioxan (1:1 Volumverhältnis) bei Zimmertemperatur während 1 Stunde auf dieselbe Weise wie oben beschrieben ergab 95 mg eines farblosen Pulvers, welches Neothramycin-A und -B enthielt.

Das in dem vorstehenden Beispiel verwendete «Sephadex LH-20» kann durch andere ähnliche Gelfiltriermittel ersetzt werden, z. B. «Sephadex G25» bis «G200», «Seprose 4B» und «6B» (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) und «Bio-Gel A1.5m» (Bio Rad Co.). Bevorzugte Gelfiltrationsmittel umfassen die carboxymethylsubstituierten vernetzten Dextrangele, welche in Kolonne 3 und 4 des US-Patentes No. 3 819 836 beschrieben sind.

4 Blatt Zeichnunger

Claims (7)

1. 629253
2. 2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Neothramycin erzeugende Stamm von Streptomyces, welcher die identifizierten Kennzeichen von ATCC

   31123 aufweist, unter submersen aeroben Bedingungen in einem Nährmedium gezüchtet wird, welches eine Kohlenstoffquelle und einen stickstoffhaltigen Nährstoff enthält, bis eine beträchliche Menge an Neothramycin durch diesen Organismus im Nährmedium erzeugt ist.

   2

   PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von Neothramycin-A und Neothramycin-B der Formel IA bzw. IB

   HO,

   HO

   bzw.

   HO.

   CH

   OH

   und deren pharmazeutisch annehmbaren Salzen, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Neothramycin erzeugenden Stamm der Gattung Streptomyces unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, während genügend langer Zeit kultiviert, um Neothramycin-A und Neothramycin-B im Kulturmedium zu erzeugen und anzusammeln, und ein Gemisch der Neothramycine-A und -B aus dem Kulturmedium gewinnt und anschliessend gegebenenfalls das erhaltene Gemisch in Neothramycin-A und Neothramycin-B in isolierter Form auftrennt.
3. 3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm von Streptomyces in einem Nährmedium bei einer Temperatur im Bereich von 24 bis 35 °C gezüchtet wird.
4. 4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm von Streptomyces in einem Nährmedium bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 29 °C bei einem pH zwischen 6 und 8 gezüchtet wird.
5. 5. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das in der Kulturbrühe erzeugte Neothramycin durch Extraktion gewonnen und durch ein Verfahren gereinigt wird, welches mindestens eines der folgenden Verfahren umfasst: Aussalzen, Lösungsmittelausfällung, Butanolextraktion, Dialyse, Ultrafiltration, isoelektrische Ausfällung, Gelfiltration, Elektrophorese, Elektrofokussierung und Adsorption, gefolgt von einer Eluierung aus einem Ionenaustauscherharz.
6. 6. Verfahren zur Herstellung von Methylneothramycin-A der Formel IIA

   HO.

   CH,0 H [IIA]

   und Methylneothramycin-B der Formel IIB

   HO

   OCH

   [IIB]

   sowie deren pharmazeutisch annehmbaren Salzen, dadurch gekennzeichnet, dass man nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 1 hergestelltes Neothramycin-A oder -B mit Methanol zu einem Gemisch von Methylneothramycin-A und -B umsetzt.
7. 7. Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man das erhaltene Gemisch von Methylneothramycin-A und -B in die einzelnen Komponenten auftrennt.