DE1944043A1 - Verfahren zur Herstellung von Asparaginase mit Antitumor-Aktivitaet - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Asparaginase mit Antitumor-AktivitaetInfo
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Description
• MONCHENlS · 8 I EQ E8 ST RA88E 2· ■ TELEFON 84ICIiT · TELEQRAMM-ADKE88E: IN VE NT/M O NCHEN
TELEX E 29 888
29.
u.Z.: E 682 (J/we)
TAHABE SEIYAKÜ GQ. Ltd.
Osaka, Japan
Osaka, Japan
" Verfahren zur Herstellung von Asparaginase mit Antitunior-Aktivität
"
Prioritäten: 31= August 1968, Japan, Nr. 62 674/1968
9. November 1968, Japan, Nr. 82 001/1968
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
von Asparaginase mit Antituiaor-Akti/ität.
Es ist an sich bekannt, daß Asparaginase ein Enzym ist, welches
als Katalysator bei der Hydrolyse von Asparagin wirkt, wobei sich
Asparaginsäure und Ammoniak bildet, und daß dieses Enzym durch die verschiedensten Bakterienarten gebildet wird, beispielsweise
Escheriehia coli, Bacillus, Pseudomonas, Salmonella, Aerobacter
aerogenee, Bacterium cadaveris, Brucella abortus, Leuconostoc
mesenteroider., Pasteurella tularensis und Serratia marcescens.
Von der durch Escherichla coli oder Serratia marcescens erzeugten
Asparaginase ist bekannt, daß sie Antitumor-Aktivität auf-
009810/1558
weist (vgl. Arch.Biochem.Biophye., 1Oj>. 450 (1964); Cancer Research,
26, 2213 (1966); Proe.Kat.Acad.Sci., §β, 1516 (1966);
Biochemistry, 6>, 721 (1967); Biochem.Biophy8.Ree.Comm«, _28,
(1967); Trans.H.Y.Acad.Sei., 20, 690 (1968)). Eine langer dauernde
Verabreichung einer solchen proteinhaltigen Asparaginase
ruft jedoch im lebenden Organismus die Bildung von Antikörpern hervor« Infolgedessen wäre es außerordentlich erwünscht, eine
. neue Asparaginase mit Antitumor-Aktivität zur Verfügung zu haben, welche sich von der bekannten Asparaginase unterscheidet.
überraschenderweise wurde nunmehr gefunden, daß bestimmte Bakterienarten Asparaginase mit einer hohen Anti tumor- Aktivität
in einer für industrielle Zwecke ausreichend hohen Ausbeute bilden,
wenn sie unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium gezüchtet werden. Diese Tatsache ist außerordentlich überraschend,
weil bei der Züchtung bekannter Asparaginase erzeugender Mikroorganismen mit Antitumor-Aktivitat, beispielsweise von Escheri-
Ϊ ehia coil und Setrratla marcescena, unter aeroben Bedingungen
zwar das Wachstum der Mikroorganismen selbst begünstigt, aber
gleichzeitig die Asparaginasebildung unterdrückt wird. Daher
ist die Züchtung dieser bekannten Mikroorganismen für die Zwekke der Asparaginaseerzeugung bisher nur unter anaerobischen Bedingungen
durchgeführt worden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Asparaginase
mit Antitumor-Aktivität ist dadurch gekennzeichnet» daß ein zur
Species Aehromobaeter, AlcaÜgenes, Microooccus■",. Proteus oder
Bacterium gehörender Asparaginase erzeugender Mikroorganismus
,0,0 38 10/ 15 58
unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium gezüchtet wird,
und daß die gebildete Asparaginase anschließend aus dem Nährmedium abgetrennt wird.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignete Mikroorganismen sind beispielsweise Achromobacter candicans OUT (Faculty
of Engineering, Osaka University, Japan) Nr. 8005· Alcaligenes faecalis OUT Nr. 8027» Microcoecus ureae IFO (Institute for
Fermentation, Osaka, Japan) Nr* 3767, Proteus vulgaris OUT Nr.
8220, Bacterium cadaveris ATCC (American Type Culture Collection, U.S.A.) Nr. 9760. Alle diese Mikroorganismen sind für die Öffentlichkeit in den vorstehend genannten Hinterlegungsstellen zugänglich.
Das Nährmedium enthält Kohlenstofflieferanten,wie Glukose, Fructose, Maltose, Lactose, Citronensäure und Fumarsäure, ferner
Stickstoff !Lieferanten, wie Maieweichwasser, Hefeextrakt, Pe pt on,
Polypeptont Gaseinhydrolysat und Aminosäuren,sowie anorganische
Salze, z.B. Natriumchlorid, Kaliumphosphat und Magnesiumsulfat.
Man kann daher in Rahmen der Erfindung ein Nährmedium verwenden,
wie es üblicherweiße für die Züchtung von Bakterien eingesetzt
Um/,
wird/ die Ausbeute an Asparaginase zu erhöhen, wird empfohlen,
auch eine Aminosäure^ wie Asparagin- oder Glutaminsäure, mitzuverwenden.
Die Züchturg des Mikroorganismus kann während etwa 15 bis 72
Stunden unter aerob!sehen Bedingungen bei einer'Temperatur 5sa
Bereich VOi ο tv α 25 bis" 400C und bei/ eiiies pH--Wert in Bereich
. Π 0 9 8 1 0 /-:
1344043
von 5 bis 9 unter ständigem Schütteln oder unter Tauchbedingun^
; gen erfolgen. Die optimalen Bedingungen für die Zusammensetzung
des Mhrmediums, die Ztichtungstemperatur, die Züchtungszeit und
andere Verfahrensbedingungen hängen von der Art des eingesetzten Mikroorganismus ab.
j Infolge der angewendeten Züchtungsbedingungen sammelt sich die
ν Asparaginase im Gärnedium und insbesondere in den Bakterienzellen
an. Um das Enzym aus den Bakterienzellen zu gewinnen, können
die üblichen Maßnahmen angewendet werden, wie sie auch sonst für
-\ die Isolierung von Enzymen, aus Mikroorganismen bekannt sind.
Beispielsweise kann man die Bakterienzellen mit Quarzsand vermahlen
und die zerbrochenen Zellen mit Wasser oder einer wässrigen Salzlösung extrahieren. Eine andere Möglichkeit besteht
j darin, die Bakterienzellen einer Ultraschallbehandlung zu unterwerfen.
Auch kann man die Bakterienzellen mit einem bakteriö-Iytischen
Enzym, wie Lysozym, behandeln und anschließend die
Zellen mit Wasser oder einer wässrigen Salzlösung in Anwesenheit
eines oberflächenaktiven Mittels extrahieren. Eine andere Arbeitsmethode
besteht darin, die Bakterienzellen einzufrieren
und wiederaufzutauen und die so aufgebrochenen Zellen ansohliessend
mit Wasser oder einer wässrigen Salzlösung zu extrahieren.
Die auf diese Weise erhaltene Asparaginaselösung wird dann gereinigt, wie es auch sonst für Enzyme Üblich ist. Geeignete
Reinigungsmethoden bestehen z.B. darin, das Enzym mit Ammoniumsulfat
,.auszusalzen, oder das Enzym mit einem organischen LÖ-•
sungsmittel, wie Alkohol oder Aceton auszufällen.. Auch kann man
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die Hukleinsäure mittels Protamin, Streptomycin oder Magnesiumionen
abtrennen. Weiterhin kann man die Enzymlösung unter Verwendung eines lonenaustauschinaterials, wie eines Ionen austauschendes
Harzes oder Ionen austauschender Cellulose, in einer Chromatographiersäule behandeln. Außerdem eignen sich für die
Reinigung eine Gelfiltration unter Verwendung von Dextran oder Polyacrylamid sowie eine Elektrophorese.
Die erfindungsgemäß herstellbare Asparaginase weist eine hohe
Aktivität bezüglich der Unterdrückung des Tumorwachstums auf· Diese Tatsache ergibt sich ganz klar aus den nachstehend beschriebenen Versuchsergebnissen.
Versuchstieren (C3H-Mäuse, welche in 3 Gruppen von jeweils 9
Versuchstieren zusammengefaßt sind) werden intraperitoneal
10 000 000 Tumorzellen (6C3HED) implantiert. Nach 24 Stunden
werden diese Mäuse mit Asparaginase (6,7 I.E.) in einer wässrigen Lösung von Natriumbioarbonat behandelt· Die Überlebenszeit der behandelten Versuchstiere im Vergleich zu derjenigen von Mäusen, die nur mit einer wässrigen Lösung von Natriumbicarbonat behandelt worden sind, wird beobachtet. Die hierbei
erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I zusammengefaßt.
Versuchstieren zusammengefaßt sind) werden intraperitoneal
10 000 000 Tumorzellen (6C3HED) implantiert. Nach 24 Stunden
werden diese Mäuse mit Asparaginase (6,7 I.E.) in einer wässrigen Lösung von Natriumbioarbonat behandelt· Die Überlebenszeit der behandelten Versuchstiere im Vergleich zu derjenigen von Mäusen, die nur mit einer wässrigen Lösung von Natriumbicarbonat behandelt worden sind, wird beobachtet. Die hierbei
erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I zusammengefaßt.
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| Anzahl der ¥@3rsucii8t£ere |
Uberlebenszeit (Tage) | |
| iControllgruppe | 9 | 12, 12. 12, 12, 12, ; 12, 12. 13. 13 : |
| Kit Asparaginase aus Bacterium ca- daveris behandelte Tiere |
9 - - |
I 16, 25, >18Q, >180, ; >180, >180, >180» ί >180, >180 |
| Nit Asparaginase aus Proteus vul- garis behandelte Piere |
- 9 I |
■ 1 19, 30, 43, >180 >180, >Ϊ80, >180, >180f>180 |
- Aus dieser Tabelle ist klar ersichtlich, daß die mit der erfin-
: dungägemäß hergestellten Asparaginase behandelten Versuchstiere
r sehr viel langer lebten als die betreffenden Kontrolltiere.
ί Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher erläutert,
wobei sich die Prozentangaben auf Gewicht/Volumen beziehen.
. . .
200 ml eines wässrigen Hährmediums (pH 7,0), welches 1 Ί»
Fleischextrakt, 1 ^ Polypepton, 1,25 ^ Hefeextrakt, 1 i» Glukose,
0,5 $ Natriumchlorid und 0,2 # L-Asparagin enthält, werden mit
Asparaginase erzeugenden Mikroorganismen beimpft, und dann führt
man die Züchtung 16 Stunden lang unter ständigem Schütteln'bei einer. Temperatur von 300C durch. Das Gärmedium wird anschliessend
zentrifugiert und die Bakterienzellen abgetrennt. Diese Zellen werden in 40 ml destilliertem Wasser suspendiert und dann
10 Minuten lang einer Ultraschallbehandlung bei 10 kHz
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unterworfen, !fach dem Zentrifugieren der behandelten Suspension
erhält man eine Asparaginase enthaltende überstehende Flüssigkeit.
0,5 ml der überstehenden Flüssigkeit werden mit 1 ml M/20-Boratpuffer
(pH 8,4) oder M/20-Acetatpuffer (pH 5,0) sowie 0,5 ml
einer 0,04 M-Asparaginlösung 30 Minuten bei 370C inkubiert, und
mittels der Inöophenolmethode wird die duroh eine solche Mischung
freigesetzte Ammoniummenge bestimmt. Wenn man die enzymatisch^
Aktivität definiert durch die internationale Einheit (Erzeugung
von 1 mI4ol Ammoniak je· Minute), so ergeben sich die in der. nachstehenden
Tabelle II aufgezeigten Ergebnisse.
fabelle II
| Mikroorgaiiisnius | Ä.sparaginase-Aktivität (I.E./200 ml Gärmedium) |
pH 5,0 |
| pH 8,4 | 2,2 | |
| Achromobacter candioans OUT Nr. 8005 |
33,8 | 0,6 |
| Alealigenes faecalis OUT Hr. 8027 |
67,0 - |
|
| fliörococcus ureae IPO Hr. 3767 |
36,0 | 50,8 |
| proteus vulgaris pUi Nr. 8226 |
72,0 |
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Bacterium cadaveris ATCC Hr. 9760 wird in 200 ml eines wässrigen
Nährmediums (pH 7,0) bei einer Temperatur von 300G unter aeroben
Bedingungen und unter Schütteln 16 bis 48 Stunden lang gezüchtet. Anschließend werden die Bakterienzellen abzentrifugiert.,
in 40 nil destilliertem Wasser suspendiert und 10 Minuten lang bei
10 kHz mit Ultraschall behandelt. Die durch Zentrifugieren erhaltene Überstehende Flüssigkeit wird wie in Beispiel 1
bezüglich der enzyraatischen Aktivität untersucht. Die dabei erhaltenen
Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle III zusammengefaßt, wobei die Sauerstoffabsorptionsgeschwindlgkeit
ausgedrückt wird durch die von 1 Liter Nährmedium je Minute absorbierte Anzahl Millimole Sauerstoff.
| SuBammensetzung ies Kährmediuma |
Seschwindigkeit ler Sauerstoff absorption (Millimol) |
Pepton, 2$ Jatriumglutamat, 0,5^ |
0,5 | Züchtungs zeit h |
Aspäraginase- Aktivität (I.E./20Ö ώ Gärmediura) , |
| Fleischextrakt,!^ Pepton, Ai> tefeextrakt, 1,25$ iatriumchlorid,0,5$ »lukose, Ig D-Asparagin, 0,2$ |
.0 | |lefeextrakt, 2^ | 0,5 | 24 | 11.6 t |
| 0,5 | iiaisweichwasser, 5/' I |
0,5 | 16 24 48 |
61,4 83,2 94.2 ( |
|
| 1,0 | 24 | 86,8 | |||
| 1,4 | 16 24 48 |
98,6 , 82,4 82,4 ; |
|||
| 2,0 | 24 | 90,0 | |||
| 24 | 20,0 | ||||
| 24 | 55,4 | ||||
| 24 | 33,6 |
0 0 9810/1558
19Λ4043
Ein Rüttelfermentor wird mit 10 1 eines Nähraiediums (pH 7,0)
beschickt, welches 100 g Fleischextrakt, 100 g Polypepton,
125 g Hefeextrakt, 100 g Glukose, 50 g Natriumchlorid, 20 g !-Asparagin und 5 g Natriumhydroxid enthält. Nach dem Sterilisieren
wird das Nähriaedium mit Alcaligenes faecalis OUT Nr.8027
beimpft, und dann wird die Fermentation 18 Stunden lang bei einer
Temperatur von 300C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10' 1/
Minute unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 300 U.p.M.
durchgeführt. Durch Zentrifugieren des Gärmediums isoliert man
die Bakterienzellen. Diese Zellen werden dann in 1 Liter destilliertem Wasser suspendiert und 1 Stunde lang bei 20 kHz mit Ultraschall
behandelt. Die behandelte Suspension wird abzentrifugiert,
und man setzt dann 50 ral einer 1 M-ManganchloridlÖsung
zu der überstehenden Flüssigkeit hinzu, welche 17 200 I.E. Asparaginase
(bei einem pH-Wert von 8,4) enthält. Der sich bildende Niederschlag wird abzentrifugiert. Zu der überstehenden Flüssigkeit
setzt man 304 g Ammoniumsulfat hinzu und trennt den sich
bildenden Niederschlag wiederum ab. Der Niederschlag wird in destilliertem Wasser gelöst und 24 Stunden lang dialysiert. An-
in schließend wird das erhaltene Dialysat durch Behandeln/einer
mit DEAE-Cellulose gefüllten Chromatographiersäule gereinigt.
Die Fraktionen mit Asparaginase-Aktlvität werden gesammelt, 48 Stunden lang dialysiert und dann lyophilisiert. Man erhält so
7 120 I.E0 gereinigte Asparaginase (pH 8,4).
Beisgi£l_4 . : .. -.- ■ ,.-■-:-. : ■
Ein iMfctelfermentor wird mit 10 1 des gleiohen Nährmedlums wie
00 98 10/1558
in Beispiel 3 beschickt. Nach dsm Sterilisieren beimpft man das
Nährmedium mit Proteus vulgaries OUT Hr. 8226 und fermentiert
20 Stunden lang bei einer Temperatur von 300C mit einer Belüf-'
. tungsgeschwindigkeit von 10 l/Minute und rührt rait 300 U.p0M.
Das Gärmedium wird anschließend zentrifugiert und die abgetrennten
Bakterienzellen werden in 1 Liter destillierten Wasser suspendiert, worauf man diese Suspension 1 Stunde lang bei 10 kHz
schallbehandelt und dann die Suspension zentrifugiert. Zu der
ι abgetrennten überstehenden Flüssigkeit, welche 5 200 I.E. Asparaginase
bei pH 8,4 und 3 500 I.E. Asparaginase bei pH 5,0 ehthält,
setzt man 50 ml 1 M~Manganchloridlösung hinzu. Der sich
bildende Niederschlag wird abzentrifugiert. Zu der überstehen- ; den Flüssigkeit setzt man 418 gAmmoniuinsulfat hinzu und entfernt den gebildeten niederschlag- wiederum durch Zentrifugieren»
Zu der so erhaltenen überstehenden Flüssigkeit setzt man nochmais
ein 190 g Ammoniumsulfat hinzu und trennt den gebildeten
Niederschlag durch Zentrifugieren ab. Der Niederschlag wird dann in destilliertem Wasser gelöst und.24 Stunden lang dialysierto
Das Dialysat wird in einer mit DEAE-Cellulose gefüllten Chromatographiersäule
gereinigt. Die Praktionen mit Asparaginase-Ak- ; tivität werden gesaramelt, 48 Stunden lang dialysiert und dann
lyophilisiert. Man erhält so 2 340 IpE. gereinigte Asparaginase
(pH 8,4)ο
Ein Rüttelfermentor wird mit 10 1 des gleichen Nährmediums wie
in Beispiel 3 beschickt,, Nach dem Sterilisieren beimpft man das
Nährmedium mit Bacterium cadaveris ATCC Nr. 9760 und fermentiert
00981071558 '
■ - 11 - 19U043
24 Stunden lang bei einer Temperatur von 3O0C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 l/Minute und rührt mit 300 U.p.M. Das
Gärmedium wird anschließend zentrifugiert, und die abgetrennten Bakterienzellen werden in 1 Liter destilliertem Wasser suspendiert· Diese Suspension wird 1 Stunde bei 20 kHz ultraschallbehandelt und dann zentrifugiert. Zu der so gewonnenen überstehenden Flüssigkeit, welche 4 500 I.E. Asparaginase (pH 8,4) enthält, setzt man 50 ml 1 M-Manganchloridlösung hinzu und trennt den sich bildenden Niederschlag durch Zentrifugieren ab. Zu der · überstehenden Flüssigkeit werden 304 g Ammoniumsulfat hinzuge- \ setzt und der sich bildende Niederschlag abzentrifugiert. Zu
der so erhaltenen überstehenden Flüssigkeit werden nochmals
304 g Ammoniurasulfat hinzugesetzt und der sich bildende Nieder- , schlag wird gleichfalls abzentrifugiert. Der Niederschlag wird dann in destilliertem Wasser gelöst und 24 Stunden lang dialysiert. Das Dialysat wird in einer mit DEAE-Cellulose gefüllten Chromatographiersäule gereinigt. Die Fraktionen mit Asparaginase- \ Aktivität werden gesammelt, 48 Stunden lang dialysiert und anschließend lyophilisiert. Man erhält so 2 160 I.E. gereinigte
Asparaginase (pH 8.4)*
Gärmedium wird anschließend zentrifugiert, und die abgetrennten Bakterienzellen werden in 1 Liter destilliertem Wasser suspendiert· Diese Suspension wird 1 Stunde bei 20 kHz ultraschallbehandelt und dann zentrifugiert. Zu der so gewonnenen überstehenden Flüssigkeit, welche 4 500 I.E. Asparaginase (pH 8,4) enthält, setzt man 50 ml 1 M-Manganchloridlösung hinzu und trennt den sich bildenden Niederschlag durch Zentrifugieren ab. Zu der · überstehenden Flüssigkeit werden 304 g Ammoniumsulfat hinzuge- \ setzt und der sich bildende Niederschlag abzentrifugiert. Zu
der so erhaltenen überstehenden Flüssigkeit werden nochmals
304 g Ammoniurasulfat hinzugesetzt und der sich bildende Nieder- , schlag wird gleichfalls abzentrifugiert. Der Niederschlag wird dann in destilliertem Wasser gelöst und 24 Stunden lang dialysiert. Das Dialysat wird in einer mit DEAE-Cellulose gefüllten Chromatographiersäule gereinigt. Die Fraktionen mit Asparaginase- \ Aktivität werden gesammelt, 48 Stunden lang dialysiert und anschließend lyophilisiert. Man erhält so 2 160 I.E. gereinigte
Asparaginase (pH 8.4)*
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Claims (6)
- P.&t en t^ a η a p_ r ti c h eο Verfahren zur Herstellung von Asparaginase mit Antitumor-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß ein zur Species Achromobacter, Alcaligenes, Micrococcus, Proteus oder Bacterium gehörender, Asparaginase erzeugender Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium gezüchtet wird und daß die gebildete Asparaginase anschließend aus dem Gär™ ψ medium abgetrennt wird.
- 2. Verfahren nach - Anspruch■1, dadurch gekennzeichnet, daÖ.die Züchtung etwa 15 biß 72 Stunden lang bei einer Temperatur von etwa 25 bis 4Q0C und einem pH-Wert in Bereich von 5 bis .durchgeführt wird. , .
- 3* Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Achromobacter candicans OUT Fr. 8005 verwendet wird.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1-, dadurch gekennzeichnet, daß Alcaligenes'faecalis OUT Nr. 8027 verwendet wird.
- 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß I'icrococcuß ureae IFO Nr. 3767'-verwendet wird.
- 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daÖ Proteus vulgaris OUT ITr. 8226 verwendet wird.7ο Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet/ daß Bacterium cadaveris ASCG Nr. 9760 verv;endet wird. .Ö0 9810/ f t>SB
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6267468 | 1968-08-31 | ||
| JP8200168 | 1968-11-09 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1944043A1 true DE1944043A1 (de) | 1970-03-05 |
| DE1944043B2 DE1944043B2 (de) | 1973-05-03 |
| DE1944043C3 DE1944043C3 (de) | 1973-11-29 |
Family
ID=26403721
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE1944043A Expired DE1944043C3 (de) | 1968-08-31 | 1969-08-29 | Biotechnisches Verfahren zur Her stellung von L Asparaginase mit Anti tumor Aktivität |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US3652402A (de) |
| DE (1) | DE1944043C3 (de) |
| FR (1) | FR2016724A1 (de) |
| GB (1) | GB1236670A (de) |
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