DE2107148C3 - Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden durch enzymatische Polymerisation von Nucleosiddiphosphaten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden durch Polymerisation von Nucleosiddiphosphaten mit Hilfe der Polynucleotid-Phosphorylase (Nucleosiddiphosphat : Polynucleotidyltransferase).

Polynucleotide wurden 1955 von S. O c h ο a und M. Grunberg — Manago (vgl. Fed. Proc, 14, 221, 1955) dargestellt. Seit dieser Zeit wurden verschiedene biochemische Wirkungen diieser Verbindungen beobachtet; insbesondere läßt die interferoninduzierende Aktivität dieser Verbindungen eine Verweildung als Arzneistoffe erwarten. Die wirtschaftliche Herstellung von Polynucleotiden in großem Maßstab war jedoch recht schwierig, da die Polynucleotide auf Grund ihrer komplizierten Struktur nicht auf chemischem Wege hergestellt werden können. Obwohl es bekannt ist, daß Polynucleotide aus Nucleosiddiphosphaten mit Hilfe gereinigter Polynucleotid-Phosphorylase hergestellt werden können und daß dieses Enzym in vielen Mikroorganismen vorkommt (vgl. z. B. Progress in Nucleic Acid Research, 1963, Bd. 1, S. 93 bis 133), war bisher dieses Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden in großem Maßstab nicht geeignet.

Die bisher beschriebenen Polynucleotid-Phosphorylasen sind intrazelluläre Enzyme, und es war nicht möglich, sie in großem Maßstab wirtschaftlich aus den Zelten zu extrahieren. Darüber hinaus konnten verunreinigte Polynucleotid - Phosphorylase - Lösungen ohne weitere Reinigung nicht zur Herstellung von Polynucleotiden verwendet werden, da die verunreitilgten PoIyrtUcleotid'Phosphorylase-Lösungen verschiedene Enzyme enthalten, die Nuclcosiddiphosphate und/oder Polynucleotide abbauen. So enthalten ζ. B.

Pseudomonas convexa
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas R-399
Aerobacter aerogenes
Proteus vulgaris
Bacillus subtilis
Bacillus cereus
Serratia marcescens
Xanthomonas campestris

ATCC 9979
ATCC 21636
ATCC 21637
ATCC 21638
ATCC 7256
ATCC 21635
ATCC 14593
ATCC 21634
ATCC 21639
ATCC 7381

einsetzt.

Hit Hilfe des Verfahrens der Erfindung gelingt es, Polynucleotide auf relativ einfache Weise in hoher Ausbeute herzustellen.

Zur Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe wurde ein screening auf Mikroorganismen durchgeführt, die zur Herstellung von Polynucleotiden in großem Maßstab geeignet sind. Ferner wurden die für die Herstellung von Polynucleotiden günstigen Bedingungen untersucht. Diese Untersuchungen ergaben, daß die obengenannten Mikroorganismen eine hohe PoIynucleotid-Phosphorylase-Aktivität aufweisen und daß dieses Enzym leicht aus deren Zellen extrahiert werden kann. Darüber hinaus enthalten solche Extrakte nur wenig Nucleasen und Nucleosiddiphosphat abbauende Enzyme. Diese Untersuchungen ergaben weiter, daß Polynucleotide wirtschaftlich aus mindestens einem Nucleosiddiphosphat und in Gegenwart von zweiwertigen Metallkationen bei der Fermentation von Stämmen der genannten Mikroorganismen, bei der Inkubation von Zellsuspensionen und von aus den aufgebrochenen Zellen hergestellten Präparationen hergestellt werden können. Das Verfahren erlaubt sowohl die Herstellung einheitlicher als auch gemisch'

6$ ter Polynucleotide.

Der Stamm Pseüdomortas R-399 ATCC 21638 wurde von den Erfindern isoliert. Die Merkmale dieses Stammes sind nachfolgend angegeben:

⁰ 3 4

1. Mikroskopisches Erscheinungsbild Wenn man Polynucleotide bei der Fermentation

a) Einzeln oder paarweise auftretende Stäbchen mit ^c'^meI Mikroorganismus herstellt, so wird der wacheiner Länge von 1,0 bis 1,8 μ und einer Dicke ^senden ™^m _t H¹'^"⁸ ein Nucieosiddiphosphat von 0,3 bis 0,5 μ; und gegebenenfalls mindestens ein zweiwertiges Metall-

b) beweglich, polar begeißelt · ^{s kation} zugesetzt. Bei der weiteren Fermentation wird

c) gram-negativ. ' ^{das bzw}·^die zugesetzten Nucleosiddiphosphate in ein

entsprechendes Polynucleotid umgewandelt. Gewöhn-

2. Eigenschaften der Kultur lieh wird die wachsende Kultur zu einem bestimmten

β) Gelaöne-Näbrboden: kreisförmige, gelbliche Ko- iff'¹?¹"*¹™'*^{1 de}/ &^{esamten M}.enge ^{des bzw}· ^der

loniea; die Gelatine wird rasch verflüssigt; " Nucleosjddiphosphate versetzt; die portionsweise Zu-

b) Agar-Scbrägröhrchen: gutes Wachstum, gelbliche f ^{be d}" .^bzw;.^der Nucl^s.dd.phosphate zu versch.e-Kolonien* denen Zeiten liefert jedoch ebenfalls zufriedenstellende

c) flüssiges Nährmedium: beträchtliche Trübung Ergebnisse. ,...,,.,· _A dünnes gelbliches Häutchen auf der Oberfläche' ₇ ^{Wenn man} P°^Hfl«*«>e ^durch Inkubation der gräuliches Sediment; fluoreszierend; ^{l5 Zetaasse} «™? Mikroorganismus herstellen will,

d) Gelatine-Stichkultur: trichterförmige Verflüssi- T ^{man d}* ^Z*"f" einer Kultur durch Zentngung der Gelatine, graues Sediment mit weiß- ^f"?f^ⁿ· ™"ⁿ die Polynucleot.d-Phosphorylase-Akt^- lichem bis rötlichem Stich; ^{Vltat der}.^Zellen !,^hr Maximum erreicht hat. Die ab-

e) Kartoffel-Nährboden: dichtes, sich abreitendes ^zentnfugierte Ze !masse wird in einem gepufferten, Wachstum; gräulichgelbe Kolonien, die später ^{ao mindestens ein} Nuc!eos,dd»phosphatun« mindestens leicht sepia-braun werden. ^em ™e.wert.ges Metallation enthaltenden Inkuba-

tionsmedium suspendiert. Die Suspension wird an-

3. Physiologische Eigenschaften schließend unter für die Herstellung von Polynucleo-

a) Lackmus-Milch: keine Koaeulation alkalische tiden günstigen Bedingungen inkubiert

Reaktion· 25 Polynucleotide können nach dem Verfahren der

b) Indolbildung: keine; Erfindung auch unter Verwendung aufgebrochener

c) Nitrat-Reduktion: Nitrat wird zu Nitrit und ^Zellen,', ^ΖεΙ?^Γ°^η-™<«^εη °^{der da}""^s hergestellten _Ämm ·. . · . partiell gereinigten Prdparationen erhalten werden. Die Ammoniak reduziert; %, „ ... η j t_ m , „, , ,,

d) Sauerstoffbedarf: aerob; £f^lle" tonnen z. B. durch Ultraschallbehandlung

e) Temperaturoptimum: 20 bis 25° C; ³° ^D,^urchP^ressen. ^dur^^{h e}»^{ie en}8^e .^Du«. ²^⁶'¹*⁶" ^mit ^₇.¹ ·: c- I, · -, A uminiumoxid oder Quarzsand, durch Behandlung Π Zuckerverwertu,g: Saureproduktion aus Olucose, _{{ einef} , _ierenden verbindung oder durch Behänd

Mannose, Fructose, Xylose und Arab.nose. ,_{ung mit} *_{einer hochkonze}ntrierten Natriumchlorid-

Die meisten der obengenannten Merkmale ähneln lösung aufgebrochen werden.

sehr den Merkmalen von Pseudom..nas fluorescens 35 Die Extraktion der Polynucleotid-Phosphorylase in (vgl. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, großem Maßstab läßt sich besonders wirksam mit 7. Auflage [1957], S. 105). Der oben beschriebene einer hochkonzentrierten Natriumchloridlösung durch-Stamm unterscheidet sich jedoch von der bekannten führen. Zu diesem Zweck wird die abzentrifugierte Art Pseudomonas fluorescens durch seine Fähigkeit, Zellmasse in einer hochkonzentrierten, gewöhnlich in verschiedene Zucker zu verwerten. Der oben beschrie- 40 einer gesättigten Natriumchloridlösung suspendiert, bene Stamm wird deshalb als Varietät von Pseudo- Die Suspension wird einige Zeit, im allgemeinen etwa monas fluorescens betrachtet. 15 Stunden stehengelassen. Die Suspension wird an-Im Verfahren der Erfindung können Polynucleotide, schließend zentrifugiert, und die abzentrifugierte z. B. Polyinosinsäure, Polyguanylsäure, Polycytidyl- Masse wird in einer Pufferlösung oder in Wasser säure, Polyadenylsäure und Polyuridylsäure (nach- 45 suspendiert. Dabei wird die Polynucleotid-Phosphofolgcnd als Poly I, Poly G, Poly C, Poly A und Poly U rylase aus den aufgebrochenen Zellen mit guten Erbezeichnet) hergestellt werden. Als Nucleosiddiphos- gebnissen extrahiert. Die Extraktion läßt sich noch phate können im Verfahren der Erfindung z. B. Inosin- wirksamer durchführen, wenn man die aufgebrochenen, diphosphat, Guanosindiphosphat, Cytidindiphosphat, mit Natriumchlorid behandelten Zellen der Dialyse Adenosindiphosphat und Uridindiphosphat (nach- 50 unterwirft. Dazu werden die aufgebrochenen Zellen folgend als IDP, GDP_: CDP, ADP und LJDP be- mit oder ohne einen geringen Zusatz von Wasser oder zeichnet) verwendet werden. Wird im Verfahren der einer Pufferlösung in einen Dialysierschlauch einge-Erfindung ein Gemisch mehrerer Nucleodisdiphos- bracht. Der Dialysierschlauch wird in ein großes phate eingesetzt, so entstehen gemischte Polynucleo- Volumen einer Pufferlösung oder in Wasser eingetide. Setzt man z. B. als Ausgangsverbindung IDP ein, 55 taucht. Nach erfolgter Dialyse wird die im Dialysierso entsteht PoIyI; wird ein Gemisch aus GDP und schlauch befindliche Lösung zentrifugiert. Der nach CDP eingesetzt, so entsteht das gemischte Poly G-C. der Zentrifugation erhaltene, von den Zelltrümmern In letzterem Fall werden die als Ausgangsverbindungen befreite Zeilrohextrakt enthält die Polynucleotidverwendeten Nucleosiddiphosphate so vermischt, daß Phosphorylase-Aktivität. Dieser Zeilrohextrakt kann das Verhältnis der Nucleosiddiphosphate dem ge· 60 ζ, B. durch Behandeln mit Dihydrostreptaitiycin zur wünschten Verhältnis der Basen im Polynucleotid Entfernung von Nucleinsäuren, durch fraktioniertes entspricht Aussalzen mit Ammoniumsulfat und durch Säulen*

Die Fermentation der angegebenen Mikroorganis- Chromatographie gereinigt werden,

men wird in üblicher Weise in einem Kohlenstoff- und Die optimalen Bedingungen zur Herstellung von

Stickstoffquellen, anorganische Bestandteile und Spu- 65 Polynucleotide!) hängen von den Eigenschaften des

ren wichtiger Nährstoffe enthaltenden Nährmedium verwendeten Mikroorganismus und der jeweiligen

durchgeführt. Die pH-, Belüftungs- und Temperatur- Polynucleotid-Phosphorylase ab.

optima werden für jeden Stamm entsprechend gewählt. Gewöhnlich arbeitet man bei Temperaturen von

Q bis 60⁰C und bei pH-Werten von 4 bis 10. Die bei der Fermentation bzw. bei der Inkubation nicht

blichen Metboden aus der K-ulturbrtthe bzw. aus dem Inkubationsgeroiwh zurückgewonnen und bei weiteren Umsetzungen erneut als Ausgangsverbmdungen eingesetzt werden, ^ _J

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

?oH 9 0) ld

Pseudomonas R-399 ATCC 21638 wird zur Gewinnung eines Anzuchtstammes 24 Stunden bei 37 Cm 1600 M Nährmedium, das 20 g Liter Ρ*™«**» Fleischextrakt enthält, schüttelnd mkubiert. Mit dieser Kultur wird ein 30 Liter Näbrraedium enthaltender Fermenter beimpft. Die Fermentation wird 7 Stunden bei 30⁰C unter starker Belüftung durchgeführt, wobei der pH-Wert zwischen 6 und 8,5 gehalten wr-M-schließend wird der Fermenterinhalt aufgearbeitet. Es werden 140 g feuchte Zellmasse erhalten. Die Zeil- *o ,nasse wird in 14 Liter gesättigter Natriumchloridlösung suspendiert und 15 Stunden stehengelassen Anschüeßend wird die Suspension zentrifugiert Das erhaltene Sediment wird in 700 ml 0,01 m-Tns-HCl-Pufferlösung (pH 7,6) suspendiert. Diese Suspension a₅ wird 24 Stunden gegen 10 Liter derselben P"^fferlos"ⁿg dialysiert. Nach dieser Zeit wird das Dialysierbad durch 10 Liter frischer Pufferlösung ersetzt^ und die Suspension weitere 24 Stunden dialysiert. Die >n der Di^yseeinrichtung zurückbleibende Suspension wird unter Rühren tropfenweise mit 100 ml einer lOprozentigen Dihydrostreptomycinsulfat-Lösung mit einem pH-Wert von 7,6 versetzt. Der gebildete Niederschlag

rÄ»ÄÄ rs „ fermentiert, die in Beispiel 1 Aufarbeitung wird gemäß Beiwobei 3OmJ einer die PoIyenthaltenden Lö-

rNstriumsalz und 250 mg Mangan(JI)-verden in 30 ml 0,1 m-Tris-HCl-Pufferlosung gelöst und mit 30 ro! der obengenannten, die ^B .. „. ._u__.i_ni.».Aktivität enthaltenden

rd 15 Stunden bei rüt 60 ml Äthanol

Poly C wird nach üblichen Methoden aus Niederschlag isoliert und gereinigt. Es Poly C erhalten.

Beispiel 3

Pseudomonas aeruginosa ATCC 21636 wird gemäß Beispiel 1 fermentiert und aufgearbeitet. Dabe. werden 5 einer die Polynucleotid-Phosphorykse-Atovitat enthaltenden Lösung erhalten, die mit 5 g ADP-Natriumsalz gemäß Beisr:12
entstandene PoIyA wird is
werden 3 g gereinigtes Poly /

Beispiel 4

Aus Proteus vulgaris ATCC 21635 wird gemäß Beisn£l 1 eine die Polynucleotid-Phosphorylase-AkUvitat en haltende Lösung hergestellt und mit CDP-Natnumsalz gemäß Beispiel 2 inkubiert, wobei 2 g PoIyC erhalten werden.

Beispiel 5 aerogenes ATCC 7256 wird gemäß

Polynudeotid-Phosphorylase-Aktivität und wird zur Herst ellung von Polynucleotiden verwendet. 100gCDP-Natriumsaizund34gMagnes,umchl_Or.d4o Poly C erhalten

B e 1 s ρ 1 e 1 6 _Xanthomonas campestris ATCC7381 wird

Viskosität des Reaktionsgemisches steigt mit der Zeit an was darauf hinweist, daß hochmolekulares Poly C gebildet wurde. Nach Beendigung der Inkubation werden.

B e i s ρ 1 e 1 7

ATCC 21639 wird gemäß

Reaktionsgemisch nach der Inkubation zuruckbleibende, nicht umgesetzte CDP wird nach üblichen Methoden zurückgewonnen.

lOOgIDP-NatriumsalzundngMagnesmmchlond

werden in 500 ml0,1 m-Nalriumchloridlosung(pH 9,0) gelöst und mit 500 ml dar die !Olynucleotid-PhosphorVlas=-Aktivität enthaltenden Lösung vermischt. Nach lOQstündiger Inkubation wird das eiUsündene Poly durch Zugäbe voa 1 Liter Äthanol, ausgefallt.J5s werden 40 g gereinigtes Poly I erhaUen. Das m. Reaktionsgemisch zurückbUibsnde, nicht umgesetzte IDP wird nach üblichen Methoden zurückgewonnen,

Beispiel 2 «5

Pseudomonas convexa ATCC 9979 wird in 1 Liter des in Beispiel! angegebenen Nährmsdiums unter 15
das 20

erhalten werden.

Beispiele

R-399 ATCC 21638 wird etwa Jf ^™_n fo _ml eines Nährmediums, be. ^ _FIeischextrakt enthält,

P^u^^ve™ _d Fleischextrr.ktmediums ^^Znctokvto« beimpft. Das _{wird 7 stltnden} bei 30⁶C schüttelnd _{wifd anssh}H_eßend mit 2 g d 0,5 g festem Magnesium-X_Weiterer «stündiger Inkubation ^ifgha SSifuglert. Der Überstand wird mit 200 ml Äthanol versetzt. Das in dem entstandenen J|_{iederschlag entha}|_{tene Po}ly C wird nach Üblichen Methoden^reinig, Es werden 1,2 g geremigtes Poly C erhalten.

bp^

, ί

Beispiel 9

Zelten abzentrifugiert. Der überstand wird mit 200 ml Äthanol versetzt. Aus dem entstandenen Niederschlag Die in Beispiel 8 beschriebene Kultur wird mit 2 g wird Poly I nach üblichen Methoden isoliert und ge-

ADP-Natritimsalz und 0,5 g Magnesiumchlorid in reinigt. Es werden 1,2 g gereinigtes Poly I erhalten.

2ml Wasser versetzt. Nach weiterer 45stündiger 5 o-s-„;.t n

Inkubation wird Poly A isoliert und nach «»Ί< <^«.η

Inkubation wird PoIyA isoliert und nac Methoden gereinigt. Es werden 1,0 g gere.nigtes Poly A erhalten.

Beispiel 10

Gemäß Beispiel 8 wird eine Kultur-von P^udomon erueinosa ATCC 21636 hergestellt. Diese Kult 7Ä

Beispiel

Gemäß Beispiel 8 wird eine Kultur von Bacillus subtilis ATCC14593 hergestellt. Die Kultur wird gemäß Beispiel 9 mit CDP-Natriumsalz und Magnesiumchlorid versetzt. Nach weiterer 24stündigcr Inkubation wird das Poly C isoliert. Es werden 200 mg ii Pl C erhalten

lSpiei Ö WlIUUlK nuii.. imn».· _ _

.x,— ATCC 21636 hergestellt. Diese Kultur gereinigtes Poly C erhalten.

wiiu iitit einer Lösung von 3 g IDP-Natriumsalz und Die physikalischen Daten der in den Beispielen

150 mg Mangan(II)-chIorid in 10 ml Wasser versetzt. hergestellten Polynucleotide sind in der Tabelle zu-

Nach weiterer 24stundiger Inkubation werden die 15 sammengefaßt. Physikalische Daten der in den Beispielen hergestellten Polynucleotide

Herkunft des Enzyms (Mikroorganismus)

Pseudomonas R-399

ATCC 21638 Pseudomonas R-399

ATCC 21638 Pseudomonas convexa

ATCC 9979 Pseudomonas aeruginosa ATCC 2163b

Proteus vulgaris
ATCC 21635

Aerobacter aerogenes

ATCC 7256
Xanthamanas campestris ATCC 7381

Serratia marcescens
ATCC 21639

Pseudomonas R-399

ATCC 21638
Pseudomonas R-399

ATCC 21638
Pseudomonas aeruginosa

ATCC 21636

BaefHus subtüis
ATCC 14593

ft W./

nucleotide

Viskosität*)

PoIyC

PoIyI

PoIyC

PoIyA

PoIyC

PoIyC

PoIyC

PoIyC

PoIyC

PoIyA

PoIyI

PoIyC

D« relative y^~gJ&i£ÜS^

5,0	8,3
3,4	7,3
3,4	7,2
2,3	5,9
1,5	4,5
2,2	5,8
2,5	6,3
	5,3
3,1	6,9
3,7	7,5
2,0	5,7
1,1	3,6

⁺) Die relative Viskosität wurde mit einem Ubbelohde-Viskosimeter bei 25" C und einer Poljyiucieotidkonzentration tob 1,0 mg/ml in Wasser bestimmt.

■ ··—«--«rfKrönten der Po "

von 20-C

-NaC» m-Tris-. pH 76. Die Sedi-Y be** «* * Molekulargewicht++')

1.7 · 10* 1,1 · 10« 1,1 · 10*

5.8 · 10^s 2,4 · 10^s

5.4 · 10^s 7,1 · 10^s

4.1 · 10^s

9.5 · 10^s

1.2 · 10" 5,2 · 10^s 1,2 -10⁶

Spektren in neutralem Puffer⁴⁺⁺⁺)

Am.« ήΐμ A_mln, ιημ

269

250

269

258 230,5

269

269

269

269

269

258 230,5

250

! 269 I

) Die Molekulargewichtsverteiiung der Polynucleotide wurde durch Chromatographie auf Agar oder vernetztem Dextran bestimmt Die Molekulargewichte wurden mittels der Niblackschcn Gleichung:

log 5°»,» = 0315 log (Mol-GewichO - 1,044 berechnet.

♦) Die UV-Absorptionsspektren deT Polynucleotide wurden in 1/30 m Phosphatpufier, pH 7,0 gemessen.

409683/166

Claims (2)

1. Patentansprüche:

   I, Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden durch Polymerisation von Nucleosiddiphosphaten mit Hilfe von aus Mikroorganismen gewonnener Polynucleotid-Phosphorylase in Gegenwart zweiwertiger Metallkationec, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polynucleotid-Phosphorylase-Präparation nach üblichen Methoden erhal- tene Kulturmedien oder Zellextrakte von

   Pseudomonas convexa ATCC 9979

   Pseudomonas aeruginosa ATCC 21636

   Pseudomonas fluorescens

   Pseudoraonas R-399

   Aerobacter aerogenes

   Proteus vulgaris

   Bacillus subtilis

   Bacillus cereus

   Serratia marcescens

   Xanthomonas campestris
   einsetzt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren in Gegenwart von Magnesium- oder Mangan(U)-Ionen durchführt.

   ATCC 21637
   ATCC 21638
   ATCC 7256
   ATCC 21635
   ATCC 14593
   ATCC 21634
   ATCC 21639
   ATCC 7381

   Extrakte aus Escherichia coü und Azotobacter vinelandii, die als Quelle für Polynucleotid'PhosphQrylase bekannt sind, große Mengen an Nucleasen und an Nucleosiddiphosphat abbauenden Enzymen. Wenn mit Hilfe dieser Extrakte Polynucleotide in guter Ausbeute hergestellt werden sollen, müssen die Extrakte vorher intensiv gereinigt werden. Selbst die käufliche, gereinigte Polynucleotid-Phosphorylase-Präparation aus Micrococcus lysodeikticus muß zur Herabsetzung der Aktivität von in der Präparation enthaltenen Nucleasen vor der Verwendung zur Herstellung von Polynucleotiden einer Vorbehandlung unterzogen werden (vgl. F. Rottman und K. L. Johnson; Biochemistry, Bd. 8 [1969], S. 4354).

   Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden durch Polymerisation von Nucleosiddiphosphaten zur Verfugung zu stellen, das die genannten Nachteile nicht aufweist und zur wirtschaftlichen Herstellung von Polynucleotiden in großem Maßstab verwendet werden kann. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

   Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden durch Polymerisation von Nucleosiddiphosphaten mit Hilfe von aus Mikroorganismen gewonnener Polynucleotid-Phosphorylase in Gegenwart zweiwertiger Metallkationen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polynucleotid-Phosphorylase-Präparation nach üblichen Methoden erhaltene Kulturmedien oder Zellextrakte von