DE2107148A1 - Verfahren zur Herstellung von Polynucleo tiden auf mikrobiologischem Wege - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Polynucleo tiden auf mikrobiologischem WegeInfo
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Description
11 .Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden auf mikrobiologischem
Wege "
Priorität: 16, Februar 1970, Japan, Nr. 12 630/1970
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden
aus ITucleosiddiphosphaten unter der Einwirkung der
Polynucleotide-phosphorylase (liucleosiddiphosphat:Polynueleotidyltransferase)
eines Mikroorganismus der Gattungen Pseudomona-s,
Proteus, Bacillus, Aerobacter, Brevibacterium, Xanthomonaa oder
Serratiä. _
Polynucleotide wurden 1955 VQn S. Ochoa st al. dargestellt. Seit
dieser Zeit wurden verschiedene biochemische Wirkungen dieser Verbindungen
beobachtet j innbesondere lässt die Interferoninduzierende
Aktivität dieser Verbindungen eine Verwendung als Arzneistoffe erwarten. Die wirtschaftliche Herstellung von Polynucleotiden
in grossem Maßstab war jedoch recht schwierig, da die
Polynucleotide auf Grund ihrer komplizierten Struktur nicht auf
chemischem Wege hergestellt werden können. Obwohl es bekannt ist, dass Polynucleotide aus Nucleosiddiphosphaten unter der Einv/ir-
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kung gereinigter Polynucleotid-phosphorylase hergestellt werden
können, und dass dieses Enzym in vielen Mikroorganismen vorkommt,
war bisher dieses Verfahren zur Herstellung γοη Polynucleotiden
in grossem Maßstab nicht geeignet.
Me bisher beschriebenen Polynucleotid-phosphorylasen sind intrazelluläre Enzyme, und es war nicht möglich, sie in grossem Maßstab wirtschaftlieh aus den Zellen zu extrahieren. Darüberhinaus
konnten verunreinigte Polynucleotid-phosphorylase-LÖsungen
ohne weitere Reinigung nicht zur Herstellung von Polynucleotiden verwendet werden, da die verunreinigten PolynuclwOuid-phosphoryilase-Lösungen
verschiedene Enzyme enthalten, die Hucleosiddiphosphate
und/oder Polynucleotide abbauen. So enthalten z.B. Extrakte aus Escheriehia coli und Azotobacter vinelandü, die als Quelle
for Polynucleotid-Phosphorylase bekannt sind, grosse Mengen an
Nucleasen und an Nucleosiddiphosphat-abbauenden Enzymen* Wenn mit
Hilfe dieser Extrakte Polynucleotide in guter Ausbeute hergestellt v/erden sollen, müssen die Extrakte vorher intensiv gereinigt
werden. Selbst die käufliche, gereinigte Polynücleotidphosphorylase-Präparati
on aus Micrococcus lysodeikticus (hergestellt
von der Firma P.L. Biochemicals) nuss zur Herabsetzung :
der Aktivität von in der Präparation enthaltenen iiucleasen vor!
der Verwendung zur Herstellung von Polynueleotiden einer .Vorbehandlung unterzogen werden; vergl, P. Rottman und K.L. Johnson j
Biochemistry, Band 8 (1969), Seite 4354» '\
Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Herstellung
von Polynucleotiden auf mikrobiologischem Wege· zur Verfügung zu stellen, das die genannten Nachteile nicht aufweist und zur wirt-
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■ 21Q7H8
schaftlichen Herstellung von Polynucleotiden in grossem Maßstab
verwendet werden kann. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung
gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Polynucl-eotiden-rsmf mikrobiologischem Wege, das dadurch gekennzeichnet
ist, dass man einen Mikroorganismus der Gattungen Pseudomonas, Proteus, Bacillus, Aerobacter, Brevibacterium,
Xanthomonas, oder Serratia entweder
a) in Gegenwart mindestens eines Nucleosiddiphosphats und {
zweiwertiger Metallkationen fermentiert oder
b) in üblicher Weise fermentiert, die Zellmasse von der Kulturbrühe
abtrennt, in einer Inkubationslösung suspendiert und die Suspension in Gegenwart zweiwertiger Metallkationen und
mindestens eines Nucleosiddiphosphats inkubiert oder
c) in üblicher Weise fermentiert, die Zellmasse von der Kulturbrühe
abtrennt, die Zellen aufbricht, die aufgebrochenen Zellen oder daraus hergestellte Präparationen in einer Inkubationslösung
suspendiert und die Suspension in Gegenwart *
zweiwertiger Metallkationen und mindestens eines Nucleosiddiphosphats inkubiert und
das nach a), b) oder c) entstandene Polynucleotid nach üblichen
Methoden isoliert.
Mit Hilfe des Verfahrens der Erfindung gelingt es, Polynucleotide
auf relativ einfache Weise in hoher Ausbeute herzustellen.
Zur Lösung der erfindungsgemas.seη Aufgabe wurde ein Screening
auf. Mikroorganismen durchgeführt, -die zur Herstellung von PoIy-
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2107H8
nucleotiden in grossem Maßstab geeignet sind. Ferner wurden die für die Herstellung von Polynucleotiden günstigen Bedingungen
untersucht. Diese Untersuchungen ergaben, dass Mikroorganismen
der oben genannten Gattungen eine hohe Polynucleotid-phosphorylase-Aktivität
aufweisen und dass dieses Enzym leicht aus den Zellen extrahiert v/erden kann. Darüberhinaus enthalten solche
Extrakte nur wenig Nucleasen und Nucleosiddiphosphat-abbauende
Enzyme. Diese Untersuchungen ergaben weiter, dass Polynucleotide
wirtschaftlich aus mindestens einem NucIeοsiddiphosphat und in
Gegenwart von zweiwertigen Metallkationen bei der Fermentation von Stämmen der genannten Mikroorganismen, bei der Inkubation
von Zellsuspensionen und von aus den aufgebrochenen Zellen hergestellten Präparationen hergestellt werden können. Das Verfahren
erlaubt sowohl die Herstellung einheitlicher als auch gemischter Polynucleotide.
Das Screening ergab, dass das. Verfahren der Erfindung z.B. mit
Hilfe der nachstehend aufgeführten Stämme durchgeführt werden
kann* · —"
Pseudomonas convexa . (4TCC 9979)
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 21636)
Pseudomonas fluorescens (ATCC 21637)
Pseudomonas R-399 (ATCC 21638)
Aerobacter aerogenes (ATCC 7256)
Proteus vulgaris (ATCC 21635)
Bacillus subtilis (ATCC 14-593)
Bacillus cereuE (ATCC 21634)
Serratia marcescens (ATCC 21639)
Xanthomonas campestris (ATCC 7381)
Brevibacterium divariticum (ATCC 2311)
10983 B /0954
■ — 5 —*
Der Stamm Pseudomonas R-399 (ATCC 2X638) wurde von den Erfindern
isoliert. Die Merkmale dieses Stammes sind nachfolgend angegeben:
1) Mikroskopisches Erscheinungsbild;
a) Einzeln oder paarweise auftretende Stäbchen mit einer Länge
von 1,0 bis 1,8 μ und einer Dicke Von 0,3 bis 0,5 JLi;
b) beweglich, polar begeisselt;
c) gram-negativ.
2) Eigenschaften der Kultur;
a) Gelatine-Nährboden: kreisförmige, gelbliche Kolonien;
die Gelatine wird rasch verflüssigt;
b) Agar-Schrägröhrchen: gutes Wachstum, gelbliche Kolonien;
c) flüssiges Nährmedium: beträchtliche Trübung, dünnes
gelbliches Häutchen auf der Ober-. fläche, gräuliches Sediment;
fluoreszierend;
d) Gelatine-Stichkultur: trichterförmige Verflüssigung der
Gelatine, graues Sediment mit weisslichera bis rötlichem Stich;
e) Kartoffel-Nährboden: dichtes, sich ausbreitendes Wachs
tum; gräulich-gelbe Kolonien, die später leicht aepia-braun werden.
5) Physiologische Eigenschaften:
a) Lackmus-Milch: keine Koagulation, alkalische
Reaktion;
b) Indolbildung: keine;
c) Nitrate-Reduktion: Nitrat wird zu Nitrit und Ammoniak
reduziert;
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•d) Sauerstoffbedarf: aerob;
e) Temperaturoptimum: 20 bis 25°C;
f) Zuckerverwertung: Säureproduktion aus Glucose, -
Mannose, Fructose, Xylose und Arabinose.
Die meisten der oben genannten Merkmale ähneln sehr den Merkmalen von Pseudomonas fluorescens; vergl. Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology, 7. Auflage (1957), Seite 105. Der oben beschriebene Stamm unterscheidet sich jedoch von der bekannten
Art Pseudomonas fluorescens durch seine Fähigkeit, verschiedene Zucker zu verwerfen« Der oben beschriebene Stamm wird
deshalb als Varietät 7on Pseudomonas fluorescens betrachtet.
Im Verfahren der Erfindung können Polynucleotide, z.B. Polyinosinsäure,
Polyguanylsäure, Polycytidylsäure, Polyadenylsäure und
Polyuridylsäure (nachfolgend als Poly I, Poly G, Poly C, Poly A und Poly U bezeichnet) hergestellt werden. Als Nucleosiddiphos- ·
phate können im Verfahren der Erfindung z.B. Inosindiphosphat» Guanosindiphosphat, Cytidindiphosphat, Adenosindiptiosphat und
Uridindiphosphat (nachfolgend aid IDP, GDP, CDP, ADP und UDP
bezeichnet) verwendet werden. Wird im Verfahren der Erfindung ein Gemisch mehrerer Nucleosiddiphosphate eingesetzt, so entstehen gemischte Polynucleotide. Setzt man z.B. als Ausgangsverbindung
IDP ein, so entsteht Poly I; wird ein Gemisch aus GDP und GDP eingesetzt, so entsteht das gemischte Poly G-C. In letzterem
Fall werden die als Ausgangsverbindungen verwendeten Fuclqosiddiphosphate
so vermischt, dass das Verhältnis der Nucleosiddiphosphate dem gewünschten Verhältnis der Basen im Polynuclear
tid entspricht.
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Zur Hersteilung von Polynucleotiden kann im Verfahren der Erfindung
jeder Mikroorganismus verwendet werden, der eine hohe und
leicht extrahierbare Polynucleotid-phosphorylase-Äktivität aufweist
und einen niedrigen Gehalt "an liucleasen und ITucleosiddiphosphat-abbauenden
Enzymen hat; unwesentlich ist dabei die taxonomische Stellung des Mikroorganismus. Zur Erreichung des erfind
ungsgemässen Zwecks haben sich Mikroorganismen der Gattung
Pseudomonas als besonders vorteilhaft erwiesen.
Die Fermentation der Mikroorganismen wird in üblicher Weise in einem Kohlenstoff- und cclckstoffquellen, anorganische Bestand-teile
und Spuren wichtiger Nährstoffe enthaltenden Bährmedium
durchgeführt. Die Pu·-* Belüftungs- und Temperaturoptima werden
für jeden Stamm entsprechend gewählt.
Wenn man Polynucleotide bei der Fermentation eines Mikr.oOrganismus
herstellt, so wird der wachsenden Kultur mindestens ein NucleosiddxOhosphat und gegebenenfalls mindestens ein zweiwerti-
-kation ·
ges Metall/ zugesetzt. Bei der weiteren Fermentation wird das
bzw. die zugesetzten Nucleosiddiphosphate in ein~~entsprechendes M
Polynucleotid umgewandelt. Gewöhnlich wird die wachsende Kultur
zu einem bestimmten Zeitpunkt mit der gesamten Menge des bzw. der Uucleosiddiphosphate versetzt; die portionsweise Zugabe des bzw,
"der Wucleosiddiphosphate zu verschiedenen Zeiten liefert jedoch
ebenfalls zufriedenstellende Ergebnisse.
man Polynucleotide durch Inkubation der Zellmasse eines
Mikroorganismus herstellen will, isoliert man die Zellen einer
Kultur durch Zentrifugieren, wenn die Polynucleotid-phosphorylase-Äktivität
der Zellen ihr Maximum erreicht hat. Die abzentri-. . 1098 3 6/095U
fugierte Zellmasse wird in einem gepufferten, mindestens ein
Nueleosiddiphosphat und mindestens ein zweiwertiges Metallkation enthaltenden Inkubationsmedium suspendiert. Die Suspension wird
anschliessend unter für die Herstellung von Polynucleotiden günstigen Bedingungen inkubiert.
Polynucleotide können nach dem Verfahren der Erfindung auch unter Verwendung aufgebrochener Zellen, Zeilrohextrakten oder
daraus hergestellten partiell gereinigten Präparationen erhalten werden. Die Zellen können z.B. durch Ultraschallbehandlung,
Durchpressen durch eine enge Düse, Zerreiben r.i:- Aluminiumoxid
oder Quarzsand, durch Behandlung mit einer lysierenden Verbindung oder durch Behandlung, mit einer hochkonzentrierten Natriumchloridlösung
aufgebrochen werden.
Die Extraktion der Polynucleotid-phosphorylase in grossem Maßstab
lässt sich besonders wirksam mit einer hochkonzentrierten Natriumchloridlösung durchführen. Zu diesem Zweck wird die abzentrifugierte
Zellmasse in einer hochkonzentrierten, gewöhnlich
gesättigten Natriumchloridlösung suspendiert. Die Suspension wird einige Zeit, im allgemeinen etwa, 15 Stunden stehengelassen.
Die Suspension wird anschliessend zentrifugiert, und die abzentrifugierte Masse v/ird in einer Pufferlösung oder in
V/asser suspendiert. Dabei v/ird die Polynucleotid-phosphorylase
aus den aufgebrochenen Zellen mit guten Ergebnissen extrahiert. Die Extraktion lässt sich noch wirksamer durchfahren, wenn man
die aufgebrochenen, mit Natriumchlorid behandelten Zellen der Dialyse unterwirft. Dazu werden die aufgebrochenen Zellen mit
oder ohne einen geringen Zusatz von Wasser oder einer Pufferlö-
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sung in einen Dialysierschlauch eingebracht. Der Dialysierschlauch
wird in ein grosses Volumen einer Pufferlösung oder in Wasser eingetaucht. Nach erfolgter Dialyse wird die .im Dialysiersehlauch
befindliche Lösung zentrifugiert. l>ex nach der Zentrifugati
on erhaltene, von den Zelltrümmern befreite Zellrohextrakt enthält die Polynucleοtid-phosphoryläse-Aktivität. Dieser
Zeilrohextrakt kann z.B. durch Behandeln mit Streptomycin zur
Entfernung von Nucleinsäuren, durch fraktioniertes Aussalzen mit Ammoniumsulfat und durch Säulenchromatographie gereinigt
werden. . -
Die optimalen Bedingungen zur Herstellung von Polynucleοtiden
hängen von den Eigenschaften des verwendeten Mikroorganismus ab. Gewöhnlich arbeitet man bei Temperaturen von 0 bis 6O0C und bei
Pjj-Werten von 4 bis 10« Die bei der Fermentation bzw. bei der In
kubation nicht umgesetzten Nucleosiddiphosphate können leicht nach üblichen Methoden aus de-r Kulturbrühe bzw. aus dem Inku-"bationsgemisch
zurückgewonnen und bei weiteren Umsetzungen erneut als Ausgangsverbindungen eingesetzt werden. —
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Pseudomonas R—399 (ATCC 21638) wird zur Gewinnung eines Anzuchtatammes
24 Stunden bei 37 C in 600 ml Nährmedium, das 20 g/Liter pulverisierten Fleischextrakt enthält, schüttelnd inkubiert,
Mit dieser Kultur wird ein 30 Liter Nährmedium enthaltender Fermenter
beimpft« Die Fermentation wird 7 Stunden bei 300C unter
starker Belüftung durchgeführt, wobei der p„-Wert zwischen 6 und
8,5 gehalten wird. Anschliessend wird der Fermenterinhalt aufge-
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arbeitet. Es werden 140 g feuchte Zellmasse erhalten. Die Zeilmasse
wird in 14 Liter gesättigter Natriunichloridlösung suspendiert
und 15 Stunden stehengelassen. Anschliessend ward die Suspension
zentrifugiert. Das erhaltene Sediment wird in 700 ml 0,01 m Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,6) suspendiert. Diese Suspension
wird 24 Stunden gegen 10 Liter derselben Pufferlösung dialy-
siert. Nach dieser Zeit wird das Dialysierbad durch 10 Liter und die Suspension weitere 24 Stunden dialysiert./
frischer Pufferlösung ersetzt, i/Die in der Dialysiereinrichtung
zurückbleibende Suspension wird unter Rühren tropfenweise mit 100 ml einer lOprozentigen Dihydrostreptomycinsulfat-Lösung mit
einem p^-Wert von 7,6 versetzt. Der gebildete Niederschlag wird
abzentrifugiert, und der Überstand wird gegen die obengenannte
Pufferlösung, dialysiert. Die in der Dialysiereinrichtung zurückbleibende
Lösung mit einem Volumen von etwa 1 Liter enthält eine beträchtliche Polynucleotid-phosphorylase-Aktivität und
wird zur Herstellung von Polynucleotiden verwendet.
100 g CDP-Ratriumsalz und 54 g Magnesiumchlorid werden in 500 ml
0,1 m Natriumchlorxctlösung (pH 9,0) gelöst, und mit 500. ml der
die PolynucleotJd-phosphorylase-Aktivität enthaltenden Lösung
vermischt. Das Gemisch wird 50 Stunden bei 37°G inkubiert. Die
Viskosität des Reaktionsgemisches steigt mit der Zeit an, was darauf hinweist, dass hochmolekulares Poly C gebildet v/urde.
Kaeh Beendigung der Inkubation wird das Gemisch unter Rühren
mit 1 Liter Äthanol versetzt. Der auftretende Niederschlag enthält das Poly C, das nach üblichen Methoden gereinigt wird. Es
werden 55 g gereinigtes Poly C erhalten. Dad im Reaktionsgemisch
nach der Inkubation zurückbleibende, nicht umgesetzte CDP v/ird nach üblichen Methoden zurückgewonnen.
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100 g IDP-Natriumsalz und 17 g Magnesiumchlorid v/erden in
500 ml 0,1 m Hatriumchloridlösung (pH-9,0) gelöst und mit 500 ml
der die Polynucleotid-phosphorylase-Aktivität enthaltenden Lösung,
vermischt . Nach lOOstündiger Inkubation wird das entstan- " dene Poly I durch Zugabe von 1 Liter Äthanol ausgefällt. Es v/erden
40 g gereinigtes Poly I erhalten. Das im Reaktionsgemisch zurückbleibende, nicht umgesetzte IDP wird nach üblichen Methoden
zurückgewonnen,
Pseudomonas convexa (üTCG 9979) wird in 1 Liter des in Beispiel "
1 angegebenen Uährmediums unter denselben Bedingungen fermentiert,
die in Beispiel 1 beschrieben sind. Die Aufarbeitung wird gemäss Beispiel 1 durchgeführt, wobei 30 ml einer die
Polynucleotid-phosphorylase-Aktivität enthaltenden Lösung erhalten
werden. .
5 g CDP-Natriumsalz und 250 mg Hangar/chlorid werden in 30 ml
0,1 m Tris-HCl-Pufferlösung (pw'9.0) gelöst und mit 30 ml der
die Ά ~-
olDen genannten/ Dipolynucleotid-phosphorylase-Aktivitat enthaltenden
Lösung vermischt; Das Gemisch wird 15 Stunden bei 50 C
inkubiert und anschliessend mit 60 ml Äthanol versetzt. Poly C wird nach üblichen Methoden aus dem gebildeten niederschlag isoliert
und gereinigt. Ss werden 2g gereinigtes Poly C erhalten.
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 21636) wird gemäss Beispiel 2 fermentiert
und aufgearbeitet. Dabei werden 30 ml einer die PoIynucleotid-phosphorylase-Aktivität
enthaltenden Lösung erhalten, die mit 5 g ADP-Natriumsalz gemäss Beispiel 2 inkubiert wird.
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Das entstandene Poly A wird isoliert und gereinigt. Es werden
3 g gereinigtes Poly A erhalten.
Beispiel 4
Aus Proteus vulgaris (ATCC 21635) wird gemäss Beispiel 2 eine
die Polynucleotid-phosphorylase-Aktivität enthaltende Lösung hergestellt
und mit CDP-Eatriumsalζ gemäss Beispiel 2 inkubiert,
wobei 2 g Poly C erhalten werden.
Aus Aerobacter aerogenes (ATCC 7256) wird gemäss Beispiel 2 eine die Polynucleotid-phosphorylase-Aktivität enthaltende Lösung
hergestellt und mit CDP-Iiatriumsalz gemäss Beispiel 2 inkubiert,
wobei 2,5 g Poly C erhalten werden.
Aus Brevibacteriuni.divariticum (ATCC 2311) wird gemäss Beispiel
die .
2 eine/Dipolynucleotid-phosphOrylase-Aktivität enthaltende Lösung
hergestellt und mit CDP-Natriumsal3 gemäss Beispiel 2 inkubiert,
wobei 2 -g Poly C erhalten werden, ~~
Aus Xanthomonas campestris (ATCC 7381·) wird gemäss Beispiel 2
eine die Polynucleotid-phosphorylase—Aktivität enthaltende Lösung
hergestellt und mit CDP-Hatriumsala gemäss Beispiel 2 inkubiert,
wobei 2,5 g Poly C erhalten werden,
33 ei spiel 8
Aus Serratia mareoscens (ATCC 21639) wird gemäss Beispiel 2 fiine
die ' Polynucleotid-phosphorylase-Akti^ität enthaltende Lösung hcrgeste]3t und mit CDi'-Natriumsals gemäss Beispiel 2
109/ ■=■■;.. 5 4
2107U8
- 13 inkubiert, wobei 1,5 g Poly C erhalten werden.·
Beispiel 9
Pseudomonas R-399 (ATCC 21638) wird etwa 15 Stunden bei 300C
in 10 ml eines ITähr mediums, das 20 g/Liter pulverisierten
Fleischextrakt enthält, schüttelnd inkubiert. 100 ml des PleischextraJcfcmediums
werden mit 1 ml der Anzuchtkultur beimpft. Das
beimpfte Medium wird 7 Stunden bei 300C schüttelnd inkubiert.
Die Kultur wird anschliessend mit 2 g festem CDP-lvatriumsala
und 0,5 g festem Magnesiumchlorid versetzt. Nach weiterer 4-5- Λ
stündiger Inkubation werden die Zellen abzentrifugiert» Der
Überstand wird mit 200 ml Äthanol versetzt. Das in dem entstandenen niederschlag enthaltene Poly C wird nach üblichen Methoden
gereinigt. Es werden 1,2 g gereinigtes Poly C erhalten.
B e i s ρ i e 1 10
Die in Beispiel 9 beschriebene Kultur wird mit 2 g ADP-Katriumsalz
und 0,5 g Magnesiumchlorid in 2 ml Wasser versetzt. Nach weiterer 45stündiger Inkubation v/ird Poly A isoliert und nach
üblichen Methoden gereinigt. Es werden 1,0g gereinigtes Poly A A
erhalten»
Gemass Beispiel 9 wird eine Kultur von Pseudomonas aeruginosa
(ATCC 21636) hergestellt. Diese Kultur wird mit einer Lösung
von 3 g IDP-Natriumsalz und 150 mg Mangan^hlorid in 10 ml Wasser
versetzt, liach weiterer 24stündiger Inkubation v/erden die
Zellen abzentrifugiert. Der Überstand w:.rd mit 200 ml Äthanol
versetzt. Aus dem entstandenen Niederschlag wird Poly I nach üblichen Methoden isoliert und gereinigt. Es werden 1,2 g gereinigtes
Poly I erhalten.
109836/095A
2107H8
Beispiel 12
Gemäss Beispiel 9 v/ird eine Kultur von Bacillus subtilis
(ATCC 14593) hergestellt. Die Kultur v/ird gomäss Beispiel 9 mit
CDP-Natriumsalz und Magnesiumchlorid versetzt. iiach v/eiterer
24stündiger Inkubation v/ird das Poly C isoliert. Es v/erden
200 rag gereinigtes Poly C erhalten.
109836/0954
-j "V--ν BAD ORtGWAL
Claims (10)
1. Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden auf mikrobiologischem
Wege, dadurch gekennzeichnet,
dass man einen Mikroorganismus der Gattungen Pseudomonas,
Proteus, Bacillus Aerobacter,'Brevi"bacterium, Xantheraonas oder
Serratia entweder
a) in Gegenwart mindestens eines Ilucleosiddiphosphats und
zweiwertiger Metallkationen fermentiert oder
b) in üblicher Weise fermentiert, die Zellmasse von der Kulturbrühe
abtrennt, in einer Inkubationslösung suspendiert und
die Suspension in Gegenwart zweiwertiger Metallkationen und mindestens eines Nucleosiddiphosphats inkubiert oder
c) in üblicher Weise fermentiert, die Zellmasse von der Kulturbrühe
abtrennt, die Zellen aufbricht, die aufgebrochenen Zellen oder daraus hergestellte Präparationen in einer Inkubationslösung
suspendiert und die Suspension in Gegenwart sv/e? -wertiger
Metallkationen und mindestens eines Nucleosiddiphosphats
inkubiHrt und —
das nach a), b) oder c) entstandene Polynuclcotid nach üblichen
Methoden isoliert«
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
man einen Stamm der Gattung Pseudomonas fermentiert,
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass iian
einen der nachstehend genannten Stämme fermentiert:
BAD OFiIGINAL
-2107H8 - 16 -
Pseudomonas convexa (ATCC 9979)
. Pseudomonas aeruginosa (ATCC 21636)
Pseudomonas fluorescens (ATCC 21637)
Pseüdomonas R-399 (ATCC 21638) Aerobacter aerogenes ' (ATCC 7256)
Proteus vulgaris (ATCC '21635)
Bacillus subtilis (ATCC 145930
Bacillus cereus (ATCC 21634)
Serratia marcescens (ATCC 21639)
Xanthomonas campestris (ATCC 7381)
Brevibaeterium divariticum (ATCC 2311).
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man Polynucleotide durch Fermentation eines Stammes der Gattung
Pseudomonas herstellt.
5. Verfahren nach Anspruch-1 und 2, dadurch gekennzeichnet,
dass man Polynucleotide durch Inkubation von in einem Inkubationsmedium suspendierten Zellen eines Stammes der-Gattung
Pseudomonas herstellt.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5,. dadurch gekennzeichnet, dass man das Verfahren in Gegenwart von Magnesium- oder
Mangan-(II)-Ionen durchführt.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3f dadurch gekennzeichnet,
dass man die Zellen mit einer hochkonzentrierten Natriumchlorid·
lösung aufbricht.
10 9 8 3 6/0954
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Zellen mit einer gesättigten Natriumchloridlösung aufbricht.
■ . '""".
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
dass man die Inkubation mit. einem .Zeilrohextrakt oder mit daraus hergestellten partiell gereinigten Präparationen durchführt
.
109836/0954
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