DE2107148B2

DE2107148B2 - Verfahren zur Herstellung von Polynucleotide!! durch enzymatische Polymerisation von Nucleosiddiphosphaten

Info

Publication number: DE2107148B2
Application number: DE2107148A
Authority: DE
Inventors: Yoshiki Katoh; Akira Kuninaka; Hiroshi Yoshino
Original assignee: Yamasa Shoyu Kk Choshi Chiba (japan)
Current assignee: Yamasa Shoyu Kk Choshi Chiba (japan)
Priority date: 1970-02-16
Filing date: 1971-02-15
Publication date: 1974-05-30
Also published as: DE2107148A1; CA933102A; US3779867A; NL7101818A; CH517177A; BE763048A; JPS4940954B1; NL152931B; GB1322622A; ES388725A1; DE2107148C3; FR2078534A5; SE393631B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden durch Polymerisation von Nucleosiddiphosphaten mit Hilfe der Polynucieotid-Phosphorylase (Nucleosiddiphosphat : Polynudeotidyltransf erase).

Polynucleotide wurden 1955 von S. O c h ο a und M. Grunberg — Manago (vgl. Fed. Proc, 14, 221, 1955) dargestellt. Seit dieser Zeit wurden verschiedene biochemische Wirkungen dieser Verbindungen beobachtet; insbesondere läßt die interferoninduzierende Aktivität dieser Verbindungen eine Verwendung als Arzneistoffe erwarten. Die wirtschaftliche Herstellung von Polynucleotiden in großem Maßstab war jedoch recht schwierig, da die Polynucleotide auf Grund ihrer komplizierten Struktur nicht auf chemischem Wege hergestellt werden können. Obwohl es bekannt ist, daß Polynucleotide aus Nucleosiddiphosphaten mit Hilfe gereinigter Polynucieotid-Phosphorylase hergestellt werden können und daß dieses Enzym in vielen Mikroorganismen vorkommt (vgl. z. B. Progress in Nucleic Acid Research, 1963, Bd. 1, S. 93 bis 133), war bisher dieses Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden in großem Maßstab nicht geeignet.

Die bisher beschriebenen Polynucleotid-Phosphorylasen sind intrazelluläre Enzyme, und es war nicht möglich, sie in großem Maßstab wirtschaftlich aus den Zellen zu extrahieren. Darüber hinaus konnten verunreinigte Polynucleotid - Phosphorylase - Lösungen ohne weitere Reinigung nicht zur Herstellung von Polynucleotiden verwendet werden, da die verunreinigten Polynucleotid-Phosphorylase-Lösungen verschiedene Enzyme enthalten, die Nucleosiddiphosphate und/oder Polynucleotide abbauen. So enthalten z. B.

Extrakte aus Escherichia coli und Azotobacter vinelandii, die als Quelle für Polynucieotid-Phosphorylase bekannt sind, große Mengen an Nucleasen und an Nucleosiddiphosphat abbauenden Enzymen. Wenn mit Hilfe dieser Extrakte Polynucleotide in guter Ausbeute hergestellt werden sollen, müssen die Extrakte vorher intensiv gereinigt werden. Selbst die käufliche, gereinigte Polynucleotid-Phosphorylase-Präparation aus Micrococcus lysodeikticus muß zur Herabsetzung

ίο der Aktivität von in der Präparation enthaltenen Nucleasen vor der Verwendung zur Herstellung von Polynucleotiden einer Vorbehandlung unterzogen werden (vgl. F. Rottman und K. L. Johnson; Biochemistry, Bd. 8 [1969], S. 4354).

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden durch Polymerisation von Nucleosiddiphosphaten zur Verfügung zu stellen, das die genannten Nachteile nicht aufweist und zur wirtschaftlichen Herstellung von Polynucleotiden in großem Maßstab verwendet werden kann. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden durch Polymerisation von Nucleosiddiphosphaten mit Hilfe von aus Mikroorganismen gewonnener Polynucieotid-Phosphorylase in Gegenwart zweiwertiger Metallkationen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polynucleotid-Phosphorylase-Präparation nach üblichen Methoden erhaltene Kulturmedien oder Zellextrakte von

Pseudomonas convexa ATCC 9979

Pseudomonas aeruginosa ATCC 21636

Pseudomonas fluorescens ATCC 21637

Pseudomonas R-399 ATCC 21638

Aerobacter aerogenes ATCC 7256

Proteus vulgaris ATCC 21635

Bacillus subtilis ATCC 14593

Bacillus cereus ATCC 21634

Serratia marcescens ATCC 21639

Xanthomonas campestris ATCC 7381
40

einsetzt.

Hit Hilfe des Verfahrens der Erfindung gelingt es, Polynucleotide auf relativ einfache Weise in hoher Ausbeute herzustellen.

Zur Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe wurde ein screening auf Mikroorganismen durchgeführt, die zur Herstellung von Polynucleotiden in großem Maßstab geeignet sind. Ferner wurden die für die Herstellung von Polynucleotiden günstigen Bedingungen untersucht. Diese Untersuchungen ergaben, daß die obengenannten Mikroorganismen eine hohe PoIynucleotid-Phosphorylase-Aktivität aufweisen und daß dieses Enzym leicht aus deren Zellen extrahiert werden kann. Darüber hinaus enthalten solche Extrakte nur wenig Nucleasen und Nucleosiddiphosphat abbauende Enzyme. Diese Untersuchungen ergaben weiter, daß Polynucleotide wirtschaftlich aus mindestens einem Nucleosiddiphosphat und in Gegenwart von zweiwertigen Metallkationen bei der Fermentation von Stämmen der genannten Mikroorganismen, bei der Inkubation von Zellsuspensionen und von aus den aufgebrochenen Zellen hergestellten Präparationen hergestellt werden können. Das Verfahren erlaubt sowohl die Herstellung einheitlicher als auch gemischter Polynucleotide.

Der Stamm Pseudomonas R-399 ATCC 21638 wurde von den Erfindern isoliert. Die Merkmale dieses Stammes sind nachfolgend angegeben:

3 4

1. Mikroskopisches Erscheinungsbild Wenn man Polynucleotide bei der Fermentation a) Einzeln oder paarweise auftretende Stäbchen mit ^{eines Mikro}°rganismus herstellt, so wird der wacheiner Länge von 1,0 bis 1,8 μ und einer Dicke ^{en Kultur} mindestens em Nucleosiddiphosphat von 0,3 bis 0,5 μ; ^un<* gegebenenfalls mindestens ein zweiwertiges Metallic beweglich, polar begeißelt; ⁵ Cation zugesetzt. Bei der weiteren Fermentation wird c) gram-negativ. ' das ^^zw· die zugesetzten Nucleosiddiphosphate in ein

entsprechendes Polynucleotid umgewandelt. Gewöhn-

2. Eigenschaften der Kultur lieh wird die wachsende Kultur zu einem bestimmten

a) Gelatine-Nährboden: kreisförmige, gebliche Ko- ^ZeilP^unkt mit der gesamten Menge des bzw. der lonien; die Gelatine wird rasch verflüssigt· ^{10 Nucl}eosiddiphosphate versetzt; die portionsweise Zu-

b) Agar-Schrägröhrchen: gutes Wachstum, gelbliche f ^{be d}f ^bzw:. ^der Nuckosiddiphosphate zu verschie-Kolonien; denen Zeiten liefert jedoch ebenfalls zufriedenstellende

c) flüssiges Nährmedium: beträchtliche Trübung Ergebnisse. . _T , ,· j
dünnes gelbliches Häutchen auf de. Oberfläche , ^{Wenn man} Polynucleotide durch Inkubation der gräuliches Sediment; fluoreszierend; ' ^I5 ^¹^^ ^eines Mikroorganismus herstelle^ will,

d) Gelatine-Stichkultur: trichterförmige Verflüssi- I⁸⁰V*" ^{man d}* ^Zf fⁿ ^a?".f^^r ί"^Κϊ ^" gung der Gelatine, graues Sediment mit weiß- ^ⁿ· ^"ⁿ die Polynucleotid-Phosphorylase-Aktilichem bis rötlichem Stich; vitat der Zellen ihr Maximum erreicht hat. Die ab-

e) Kartoffel-Nährboden: dichtes, sich ausbreitendes ^ze.^ntn^fuS>^erte. ^"T^Tu ·\^einem S^eP^ufrten, Wachstum; gräulichgelbe Kolonien, die später ²° ™^{ndestens e}!ⁿ Nudeosidd.phosphat und mindestens leicht sepia-braun werden ^em ^«wertiges Metallkation enthaltenden Inkubationsmedium suspendiert. Die Suspension wird an-

3. Physiologische Eigenschaften schließend unter für die Herstellung von Polynucleo-

a) Lackmus-Milch: keine Koagulation, alkalische tiden günstigen Bedingungen inkubiert

Reaktion· 25 Polynucleotide können nach dem Verfahren der

b) Indolbildung: keine; Erfindung ai-: unter Verwendung aufgebrochener

c) Nitrat-Reduktion: Nitrat wird zu Nitrit und ^Ztü™\ ^{Zel r}?^h _f ^extr _D ^a^n oder daraus hergestellten Ammoniak reduziert· partiell gereinigten Praparationen erhalten werden. Die

d) Sauerstoffbedarf: aerob; ^Zelle" ^könnei\ ^z' ?' ^durch Ultraschallbehandlung e Temperaturoptimum: 20 bis 25°C; ³° Durchpressen durch eine enge Düse, Zerreiben mit f Zuckerverwertung: Säureproduktion aus Glucose Aluminiumoxid oder Quarzsand, durch Behandlung

\λ ~ JT,,^ Vi ι"'öua uiuwubc, mit einer lysierenden Verbindung oder durch Behand-

Mannose, Fructose, Xylose und Arab.nose. _{mng mit} ^ _hochkonzentri_erte_n Natriumchlorid-

Die meisten der obengenannten Merkmale ähneln lösung aufgebrochen werden.

sehr den Merkmalen von Pseudomonas fluorescens 35 Die Extraktion der Polynucleotid-Phosphorylase in

(vgl. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, großem Maßstab läßt sich besonders wirksam mit

7. Auflage [1957], S. 105). Der oben beschriebene einer hochkonzentrierten Natriumchloridlösung durch-

Stamm unterscheidet sich jedoch von der bekannten führen. Zu diesem Zweck vird die abzentrifugierte

Art Pseudomonas fluorescens durch seine Fähigkeit, Zellmasse in einer hochkonzentrierten, gewöhnlich in

verschiedene Zucker zu verwerten. Der oben beschrie- 40 einer gesättigten Natriumchloridlösung suspendiert,

bene Stamm wird deshalb als Varietät von Pseudo- Die Suspension wird einige Zeit, im allgemeinen etwa

monas fluorescens betrachtet. 15 Stunden stehengelassen. Die Suspension wird an-

Im Verfahren der Erfindung können Polynucleotide, schließend zentrifugiert, und die abzentrifugierte z. B. Polyinosinsäure, Polyguanylsäure, Polycytidyl- Masse wird in einer Pufferlösung oder in Wasser säure, Polyadenylsäure und Polyuridylsäure (nach- 45 suspendiert. Dabei wird die Polynucleotid-Phosphofolgend als Poly I, Poly G, Poly C, Poly A und Poly U rylase aus den aufgebrochenen Zellen mit guten Erbezeichnet) hergestellt werden. Als Nucleosiddiphos- gebnissen extrahiert. Die Extraktion läßt sich noch phate können im Verfahren der Erfindung z. B. Inosin- wirksamer durchführen, wenn man die aufgebrochenen, diphosphat, Guanosindiphosphat, Cytidindiphosphat, mit Natriumchlorid behandelten Zellen der Dialyse Adenosindiphosphai und Uridindiphosphat (nach- 50 unterwirft. Dazu werden die aufgebrochenen Zellen folgend als IDP, GDP, CDP, ADP und UDP be- mit oder ohne einen geringen Zusatz von Wasser oder zeichnet) verwendet werden. Wird im Verfahren der einer Pufferlösung in einen Dialysierschlauch einge-Erfindung ein Gemisch mehrerer Nucleodisdiphos- bracht. Der Dialysierschlauch wird in ein großes phate eingesetzt, so entstehen gemischte Polynucleo- Volumen einer Pufferlösung oder in Wasser eingetide. Setzt man z. B. als Ausgangsverbindung IDP ein, 55 taucht. Nach erfolgter Dialyse wird die im Dialysierso entsteht Poly I; wird ein Gemisch aus GDP und schlauch befindliche Lösung zentrifugiert. Der nach CDP eingesetzt, so entsteht das gemischte Poly G-C. der Zentrifugation erhaltene, von den Zelltrümmern In letzterem Fall werden die als Ausgangsverbindungen befreite Zellrohextrakt enthält die Polynucleotidverwendeten Nucleosiddiphosphate so vermischt, daß Phosphorylase-Aktivität. Dieser Zellrohextrakt kann das Verhältnis der Nucleosiddiphosphate dem ge- 60 ζ. B. durch Behandeln mit Dihydrostreptamycin zur wünschten Verhältnis der Basen im Polynucleotid Entfernung von Nucleinsäuren, durch fraktioniertes entspricht. Aussalzen mit Ammoniumsulfat und durch Säulen-

Die Fermentation der angegebenen Mikroorganis- Chromatographie gereinigt werden,

men wird in üblicher Weise in einem Kohlenstoff- und Die optimalen Bedingungen zur Herstellung von

Stickstoffquellen, anorganische Bestandteile und Spu- 65 Polynucleotiden hängen von den Eigenschaften des

ren wichtiger Nährstoffe enthaltenden Nährmedium verwendeten Mikroorganismus und der jeweiligen

durchgeführt. Die pH-, Belüftungs- und Temperatur- Polynucleotid-Phosphorylase ab.

optima werden für jeden Stamm entsprechend gewählt. Gewöhnlich arbeitet man bei Temperaturen von

O bis 60⁰C und bei pH-Werten von 4 bis 10. Die bei denselben Bedingungen fennenüeri, <J«ii

der Fermentation bzw. bei der Inkubation nicht beschrieben sind. Uie Auiaroeiuuig wuu scindtaei-

umgesetzten Nucleosiddiphosphate können leicht nach spiel 1 durchgeführt wobei 30 ml einer d,_e P₀Iy-

äbüchen Methoden aus der Kulturbrühe bzw. aus dem nucleotid-Phosphorylase-Aktmtat enthaltenden Lo-

Inkubationsgemisch zurückgewonnen und bei wci- 5 sung erhalten werden.

teren Umsetzungen erneut als Ausgangsverbindungen 5 g CDP-Natnumsalz und 250 mg Mangan(II)-

eingesetzt werde! chlorid werden in 30 ml 0,1 m-Tns-HCl-Pufferlosung

Die Beispiele erläutern die Erflndunf. (pH 9,0) gelöst und mit 30 ml der obengenannten die

^ Polynucleotid-Phosphorylase-Aktivitat enthaltenden

B e i s ρ i e 1 1 ₁₀ Lösung vermischt. Das Gemisch wird 15 Stunden bei

Pseudomonas R-399 ATCC 21638 wird zur Gewin- 50°C inkubiert und anschließend mit 60 ml Äthanol nung eines Anzuchtstammes 24 Stunden bei 37°C in versetzt. PoIyC wird nach ubhchen Methoden aus 600 ml Nährmedium, das 20 g/Liter pulverisierten dem gebildeten Niederschlag isohert und gereinigt. Es Fleischextrakt enthält, schüttelnd inkubiert. Mit dieser werden 2 g gereinigtes Poly C erhalten.
Kultur wird ein 30 Liter Nährmedium enthaltender 15 ....

Fermenter beimpft. Die Fermentation wird 7 Stunden Beispiel J

bei 30°C unter starker Belüftung durchgeführt, wobei -w/- imlic ■

der pH-Wert zwischen 6 und 8,5 gehalten wird. An- Pseudomonas aeruginosa ATCC 21636 wird gemäß

schließend wird der Fennenterinhalt aufgearbeitet. Es Beispiel 1 fermentiert und aufgearbeitet. Dabei werden werden 140 g feuchte Zellmasse erhalten. Die Zeil- ao 30 ml einer die Polynucleotid-Phospnorylase-Aktivirät masse wird in 14 Liter gesättigter Natriumchlorid- enthaltenden Lösung erhalten, die nut 5 g ADP-lösung suspendiert und 15 Stunden stehengelassen. Natriumsalz gemäß Beispiel 2 inkubiert wird. Das Anschließend wird die Suspension zentrifugiert. Das entstandene Poly A wird isohert und gereinigt. Es erhaltene Sediment wird in 700 ml 0,01 m-Tris-HCl- werden 3 g gereinigtes Poly A erhalten.
Pufferlösung (pH 7,6) suspendiert. Diese Suspension 25 B e i s ο i e 1 4

wird 24 Stunden gegen 10 Liter derselben Pufferlösung

dialysiert. Nach dieser Zeit wird das Dialysierbad Aus Proteus vulgaris ATCC 21635 wird gemäß Bei-

durch 10 Liter frischer Pufferlösung ersetzt, und die spiel 1 eine die Polynucleotid-Phosphorylase-Aktivität Suspension weitere 24 Stunden dialysiert. Die in der enthaltende Lösung hergestellt und mit CDP-Natnuin-Dialyseeinrichtung zurückbleibende Suspension wird 30 salz gemäß Beispiel 2 inkubiert, wobei 2 g Poly C unter Rühren tropfenweise mit 100 ml einer lOprozen- erhalten werden,
tigen Dihydrostreptomycinsulfat-Lösung mit einem B e i s D i e 1 5

pH-Wert von 7,6 versetzt. Der gebildete Niederschlag

wird abzentrifugiert, und der Überstand wird gegen Aus Aerobacter aerogenes ATCC 7256 wird gemäß

die obengenannte Pufferlösung dialysiert. Die in der 35 Beispiel 1 eine die Polynucleotid-Phosphorylase-Akti-Dialyserinrichtung zurückbleibende Lösung mit einem vität enthaltende Lösung hergestellt und mit CDP-Volumen von etwa 1 Liter enthält eine beträchtliche Natriumsalz gemäß Beispiel 2 inkubiert, wobei 2,5 g Polynucleotid-Phosphorylase-Aktivität und wird zur Poly C erhalten werden.
Herstellung von Polynucleotiden verwendet. _R . ; _e 1 fi

100 g CDP-Natriumsalz und 34 g Magnesiumchlorid 40

werdenin500ml0,lm-Natnumchloridlösung(pH9,0) Aus Xanthomonas campestris ATCC 7381 wird

gelöst und mit 500 ml der die Polynucleotid-Phospho- gemäß Beispiel 1 eine die Polynucleotid-Phosphorylaserylase-Aktivität enthaltenden Lösung vermischt. Das Aktivität enthaltende Lösung hergestellt und mit CDP-Gemisch wird 50 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Natriumsalz gemäß Beispiel 2 inkubiert, wobei 2,5 g Viskosität des Reaktionsgemisches steigt mit der Zeit 45 Poly C erhalten werden,
an, was darauf hinweist, daß hochmolekulares Poly C R ' ' 1 7

gebildet wurde. Nach Beendigung der Inkubation e 1 s ρ 1

wird das Gemisch unter Rühren mit 1 Liter Äthanol Aus Serratia marcescens ATCC 21639 wird gemäß

versetzt. Der auftretende Niederschlag enthält das Beispiel 1 eine die Polynucleotid-Phosphoryiase-Akti-PoIy C, das nach üblichen Methoden gereinigt wird. 50 vität enthaltende Lösung hergestellt und mit CDP-Es werden 55 g gereinigtes Poly C erhalten. Das im Natriumsalz gemäß Beispiel 2 inkubiert, wobei 1,5 g Reaktionsgemisch nach der Inkubation zurückblei- Poly C erhalten werden,
bende, nicht umgesetzte CDP wird nach üblichen . 10

Methoden zurückgewonnen. Beispiel 8

100 g IDP-Natriumsalz und 17 g Magnesiumchlorid 55 Pseudomonas R-399 ATCC 21638 wird etwa werden in 50OmIO₅I m-Natriumchloridlösung (pH 9,0) 15 Stunden bei 30^cC in 10 ml eines Nährmediums, gelöst und mit 500 ml der die Polynucleotid-Phospho- das 20 g/Liter pulverisierten Fleischextrakt enthält, rylase-Aktivität enthaltenden Lösung vermischt. Nach schüttelnd inkubiert. 100 ml des Fleischextraktmediums lOOstündiger Inkubation wird das entstandene Poly I werden mit 1 ml der Anzuchtkultur beimpft. Das durch Zugabe von 1 Liter Äthanol ausgefällt, hs 60 beimpfte Medium wird 7 Stunden bei 3O⁰C schüttelnd werden 40 g gereinigtes Poly I erhalten. Das im Reak- inkubiert. Die Kultur wird anschließend mit 2 g tionsgemisch zurückbleibende, nicht umgesetzte IDP festem CDP-Natriumsalz und 0,5 g festem Magnesiumwird nach üblichen Methoden zurückgewonnen. chlorid versetzt. Nach weiterer 45stündiger Inkubation

werden die Zellen abzentrifugiert. Der Überstand wird

B e i s ρ i e 1 2 65 mit 200 ml Äthanol versetzt. Das in dem entstandenen

Niederschlag enthaltene Poly C wird nach üblichen

Pseudomonas convexa ATCC 9979 wird in 1 Liter Methoden gereinigt. Es werden 1,2 g gereinigtes des in Beispiel 1 angegebenen Nährmediums unter Poly C erhalten.

Beispiel 9

Die in Beispiel 8 beschriebene Kultur wird mit 2 g ADP-Natriumsalz und 0,5 g Magnesiumchlorid in 2 ml Wasser versetzt. Nach weiterer 45stündiger Inkubation wird Poly A isoliert und nach üblichen Meihoder. gereinigt. Es werden 1,0 g gereinigtes Poly Α erhalten.

Beispiel 10

Gemäß Beispiel 8 wird eine Kultur von Pseudomonas aeruginosa ATCC 21636 hergestellt. Diese Kultur wird mit einer Lösung von 3 g IDP-Natriumsalz und 150 mg Mangan(II)-chlorid in 10 ml Wasser versetzt. Nach weiterer 24stündiger Inkubation werden die

Zellen abzentrifugiert. Der Überstand wird mit 200 ml Äthanol versetzt. Aus dem entstandenen Niederschlag wird Poly I nach üblichen Methoden isoliert und gereinigt. Es werden 1,2 g gereinigtes Poly I erhalten. 5

Beispiel 11

Gemäß Beispiel 8 wird eine Kultur von Bacillus subtiiis ATCC14593 hergestellt. Die Kultur wird gemäß Beispiel 9 mit CDP-Natriumsalz und Magnesiumchlorid versetzt. Nach weiterer 24stündiger Inkubation wird das Poly C isoliert. Es werden 200 mg gereinigtes Poly C erhalten.

Die physikalischen Daten der in den Beispielen hergestellten Polynucleotide sind in der Tabelle zusammengefaßt.

Physikalische Daten der in den Beispielen hergestellten Polynucleotide

Bei spiel	Herkunft des Enzyms (Mikroorganismus)	Poly nucleotide	Viskosität+)	SV W++)	Molekular gewicht"¹"⁴"¹")	Spe in neutralen Amax, Πΐμ	ctren 1 Puffer++++) Äntn, Πΐμ
1	Pseudomonas R-399 ATCC 21638	Poly C	5,0	8,3	1,7 ■ 10^e	269	251
1	Pseudomcnas R-399 ATCC 21638	PoIyI	3,4	7,3	1,1 · 10^e	250	224
2	Pseudomonas convexa ATCC 9979	PoIyC	3,4	7,2	1,1 · 10^e	269	251
3	Pseudcmonas aeruginosa ATCC 21636	PoIyA	2,3	5,9	5,8 · 10^s	258	230,5
4	Proteus vulgaris ATCC 21635	PoIyC	1,5	4,5	2,4 · 10⁵	269	251
5	Aerobacter aerogenes ATCC 7256	Poly C	2,2	5,8	5,4 · 10⁵	269	251
6	Xanthamanas campestris ATCC 7381	PoIyC	2,5	6,3	7,1 ■ 10⁶	269	251
7	Serratia marcescens ATCC 21639	PoIyC	1,9	5,3	4,1 · 10^B	269	251
8	Pseudomonas R-399 ATCC 21638	PoIyC	3,1	6,9	9₅5 · 10⁵	269	251
9	Pseudomonas R-399 ATCC 21638	PoIyA	3,7	7,5	1,2 · 10«	258	230,5
10	Pseudomonas aeruginosa ATCC 21636	PoIyI	2,0	5,7	5,2 -10⁵	250	224
11	Bacillus subtiiis ATCC 14593	PoIyC	1,1	3,6	1,2 · 10^s	269	251

+) Die relative Viskosität wurde mit einem Ubbelohde-Viskosimeter bei 25° C und einer Polynucleotidkonzentration von 1,0 mg/ml in Wasser bestimmt. ++) Die Sedimentationskoeffizienten der Polynucleotide wurden nach herkömmlicher Weise in einer analytischen Ultrazentrifuge mit UV-Optik und Temperaturregler bestimmt Lösungsmittel war 0,1 m-NaCl/0,01 m-Tris-(hydroxyrnethyI)-aininomethan/HCl, pH 7,6. Die Sedimentationskoeffizienten wurden in bezug auf die Viskosität auf Wasser von 20°C korrigiert. +) Die Molekulargewichtsverteilung der Polynucleol wurde durch Chromatographie auf Agar oder 1 netztem Dextran bestimmt. Die Molekulargewic wurden mittels der Niblackschen Gleichung

log 5°.o,_w = 0,315 log (Mol-Gewicht) - 1,044 berechnet.

+) Die UV-Absorptionsspektren der Polynucleotide ν den in 1/30 m Phosphatpuffer, pH 7,0 gemesser..

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden durch Polymerisation von Nucleosiddiphosphaten mit Hilfe von aus Mikroorganismen gewonnener Polynucieotid-Phosphorylase in Gegenwart zweiwertiger Metallkationen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polynucleotid-Phosphorylase-Präparation nach üblichen Methoden erhaltene Kulturmedien oder Zellextrakte von

Pseudomonas convexa ATCC 9979
Pseudomonas aeruginosa ATCC 21636
Pseudomonas fiuorescens ATCC 21637
Pseudomonas R-399 ATCC 21638

Aerobacter aerogenes ATCC 7256
Proteus vulgaris ATCC 21635

Bacillus subtilis ATCC 14593

Bacillus cereus ■ ATCC 21634

Serratia marcescens ATCC 21639

Xanthomonas campestris ATCC 7381
einsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren in Gegenwart von Magnesium- oder Mangan(II)-Ionen durchführt.