DE2627156A1

DE2627156A1 - Purinzuckerderivate, verfahren zu ihrer herstellung und sie enthaltende pharmazeutische zubereitungen

Info

Publication number: DE2627156A1
Application number: DE19762627156
Authority: DE
Inventors: Gertrude Belle Elion; Richard Lee Miller; Geb Litster Janet Eliz Rideout
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1975-06-17
Filing date: 1976-06-16
Publication date: 1977-01-13
Also published as: US4136175A; SE429656B; JPS52295A; SE7606913L; FR2361901A1; CS191976B2; HU176046B; NL7606576A; ZA763611B; AU1500476A; BE843082A; CS192000B2; AU507515B2; DK139727B; FI61315C; CH632771A5; CA1052309A; FR2361901B1; DK139727C; IL49822A

Description

DR. BERG DIPL.-ING. STAP5 DIPL.-ING. SCHWABE DR. DR. SANDMAIR

PATENTANWÄLTE 8 MÜNCHEN 86, POSTFACH 86 0245 2627156

Dr. Berg Dipl.-Ing. Stapfund Partner, 8 MUnchen 86, P. O Box 860245

Ihr Zeichen Unser Zeichen 8 MÜNCHEN

Yourref. Our ref. Mauerkircherstraße 45 J _

⁷ 6. JUHl 1976

Anwaltsakte 27 156 3e/Ro

The 7/ellcome Foundation Ltd. London / England

"Purinzuckerderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische

Zubereitungen"

Diese Erfindung betrifft Purinzuckerderivate, die als Mittel gegen Viren geeignet sind.

Die Verbindungen dieser Erfindung sind 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-purin-5*-phosphate der allgemeinen Formel (i)

Telegramme: BERGSTAPFPATENT MUnchen Banken: Bayerische Vereinsbar.k München 453100 TELEX: 0524560 BERG d Hypo-Bank MUnchen 3892623 Postscheck MUnchen 65343-808

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O Il

OH

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1 2
worin die Reste R und R gleich oder verschieden sind und jeder eine Amin- oder Hydroxylgruppe ist.

Die Verbindungen dieser Erfindung können ebenso als Salze hergestellt und für pharmakologische und medizinische Zwecke als pharmazeutisch verträgliche Salze verwendet werden, obgleich darauf hinzuweisen ist, daß die Aktivität irgendeines verabfolgten oder medizinisch verwendeten Salzes auf dem Nukleotidtel beruht. Weiterhin kennen toxische Dalze hergestellt und entweder in das saure Nukleotid oder in pharmazeutisch verträgliche Salze mittels Standardabbauoder -austauschverfahren umgewandelt werden.

Salze, die besonders für therapeutische Zwecke bevorzugt werden, sind die pharmazeutisch verträglichen Salze der Nukleotide der allgemeinen Formel I mit organischen oder anorganischen Basen, die pharmazeutisch verträgliche Kationen, wie Natrium-, Kalium-, Kalzium-, letraalkylammonium-,

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z.B. Tetramethylammoniumkationen und dergleichen enthalten.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I und ihre pharmazeutisch -verträglichen Salze sind besonders geeignet zur Behandlung von Vireninfektionen, die von DNA-Viren herrühren, wie beispielsweise Vaccinia- und Herpesviren.

Bei Vireninfektionen der Augen oder anderer äußerer Gewebe, wie sie durch die oben angegebenen Viren verursacht werden, können die Verbindungen der Formel I oder ihre pharmazeutisch verträglichen Salze vorzugsweise auf dem infizierten Teil des Körpers des Patienten als Lösung oder örtlich wirkende Salbe angewendet werden. Die Verbindungen dieser Erfindung sind ebenso geeignet zur Behandlung systemischer Vireninfektionen von Vaccinia- und Herpesviren und für diesen Zweck werden die Verbindungen vorzugsweise oral oder parenteral verabfolgt.

Die Verbindungen dieser Erfindung werden vorzugsweise innerlich (oral oder parenteral) zur Behandlung von Vireninfektionen mit Dosen (als Uukleotid) von ungefähr 1 - 100mg/kg Körpergewicht des Säugers, Z₀B. von Mäusen oder Menschen und vorzugsweise bei Menschen in Form von Dosierungseinheiten (verabfolgt mehrmals täglich) in Mengen von 10 bis 250mg pro Dosierungseinheit, je nach dem zu behandelnden Patienten, verabfolgt . Zur Verwendung als Salbe oder Creme können die Verbindungen in einer wasserlöslichen Salbenbasis oder

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in einer ul-in-Y'aoser-CramenaF-ie in einer Konzentrat!«:.!' vüx. 0,1 bis 10 i° Gew./Vol. dargeboten werden.

Yon den Verbindungen der allgemeinen Formel I wird die

1 2 Verbindung, worin beide Reste R und R Aminogruppen sind, besonders bevorzugt, insbesondere wegen ihrer extrem hohen Wirksamkeit gegen Viren. Diese Verbindung 2,6-Diamino-9-(ß-D-arabinofuranosyl)-purin-5'-phosphat ist das Monophosphatnukleotid von 2,6-Diamino-9-(i3-D-arabinofuranosyl)-purin, wobei durch Untersuchungen festgestellt wurde, daß diese Verbindung als Mittel gegen Viren extrem wirksam ist, v.'ie beispielsweise gegen den Herpes-Virus. Im einzelnen überlebten 100 $ der Mäuse,die intrazerebral mit dem Herpes-Virus infiziert und mit 2,6-Diamino-9-(ß-D-arabinofuranosyl)-purin behandeljTwurden, im Vergleich zu fünf nicht behandelten Kontrollen, wenigstens fünf Tage ohne klinische Anzeichen der Infektion, während 60 $ der Kontrolltiere sofort und die beiden verbleibenden Kontrolltiere nach fünf !Tagen eingingen.

Die Verbindung 2,6-Diamino-9-(ß-D-arabinofuranosyl)-purin-5'-phosphat weist ebenso eine wesentliche und unerwartet hohe Wirksamkeit gegen den Herpes-Virus auf.

Die Nukleotide dieser Erfindung haben die erwünschte Wirksamkeit gegen Viren ihrer entsprechenden Nukleosiden. Diese Verbindungen können unverändert in die Zellmembranen

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eindringen oder sie können zu den entsprechenden wirksamen Nukleosiden durch Phosphatasen, die in den Zellmembranen von Säugern vorhanden sind, hydrolysiert v/erden. Weiterhin sind die Nukleotide in physiologisch verträglichen Lösungsmitteln und Körperflüssigkeiten löslicher, wodurch die Verabfolgung der Verbindungen vereinfacht und die Verteilung innerhalb des Körpers leichter wird. Es wird angenommen, daß auch andere Säugerenzyme als die Zellmembranphosphatasen die Nucleotide dieser Erfindung in situ unter Bildung der entsprechenden Eukleosiden bekannter Aktivität hydrolysieren können.

Zur Verwendung als Mittel gegen Viren können die Purinnukleotide dieser Erfindung oder ihre Salze parenteral (in einer injizierbaren Lösung),oral (als Tabletten oder Kapseln), als Suppositorien, als ophthalmische Lösung oder örtlich als Salbe, Creme, Pulver, usw. in Form pharmazeutischer Präparate entsprechend der bekannten medizinischen und veterinärmedizinischen Praxis verabfolgt werden. Die bevorzugte Verbindung v/ird vorzugsweise mit einer Dosierung von etwa 1 bis 100 mg/kg Säuger-Körpergewicht (d.h. Mäusen,Ratten, Hunden, Menschen) verabfolgt. Als Dosierungseinheit wird die Verbindung vorzugsweise mit einer Dosierung von etwa 10 - 250 mg/Dosierungseinheit verabfolgt, die vorzugsweise mehrmals (2- bis 4-mal) täglich verabfolgt oder verwendet werden kann. Zur äußeren Verwendung werden die Verbindungen in Form von Salben oder Cremes in einer

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Konzentration von 0,1 bis 10 fo Gew/Vol verwendet.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I können zweckmäßigerweise durch enzymatisch^ oder chemische Phosphorylierung der entsprechenden Nucleoside der Formel II

(II)

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worin die Reste R und R die oben definierte Bedeutung haben, hergestellt werden.

Die enzymatische Phosphorylierung der Nukleoside der Formel II kann in der Weise bewirkt v/erden, daß man ein Reaktionsgemisch, das das Nukleosidsubstrat und eine geeignete Phosphatquelle enthält, mit einem Phosphotransferaseenzym, das zur Phosphorylierung in der 5'-Stellung des Zuckerteils geeignet ist, bebrütet. Das Bebrüten wird im allgemeinen während etwa 2 bis 36 Stunden, vorzugsweise 18 bis 24 Stunden, bei !Temperaturen von 25 bis 45⁰C, vorzugsweise 35 bis 40 C und insbesondere etwa 57°C durchgeführt.

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Zu geeigneten Phosphatquellen gehören irgendwelche Nukleosid-5'-monophosphate und organische Phosphate, wie Phenylphosphat und p-Nitrophenylphosphat (im allgemeinen in Form der Natriumsalze). Nukleosid-5'-di- und-triphosphate könnten verwendet werden, wobei sich jedoch Gemische der Mono-, Di- und Triphosphate der Substratnukleoside ergeben würden, die eine zeitraubende und teure Reinigung erforderlich machen. Die Phosphotransferase-Enzymherstellung erfolgt vorzugsweise mittels einer Bakterienquelle und es kann ein Präperat intakter Zellen oder ein zellfreies Extrakt verwendet werden. Geeignete Bakterien sind solche, die hauptsächlich die Phosphorylierung bei der 5'-Stellung der Nukleoside katalysieren und es wurden Genera wie Pseudomonas, Alcaligenes, Achromabacter, Plavobacterium, Serratia und Staphylococcus (wie in Agr. Biol. Chem. 28, 586 - 600 (1964) beschrieben) als geeignet befunden. Besonders geeignet sind die verschiedenen Stämme von Serratia marcescens, Spezifische gereinigte Phosphorylierungsenzyme können ebenso verwendet werden. Beispielsweise kann die Deoxyguanosinkinase zur Umwandlung von 2-Amino-6-hydroxy-9-(ß-D-arabinofuranosyl)-purin (ara-G) in 2-Amino-6-hydroxy-9-(ß-D-arabinofuranosyl)-purin-5'-phosphat (ara-GMP) oder von 2-Hydroxy-6-amino-9-(ß-D-arabinofuranosyl)-purin (ara-iso-G) in 2-Hydroxy-6-amino-9-(ß-D-arabinofuranosyl)-purin-5'-phosphat (ara-iso-GMP) verwendet werden. Andere Phosphotransferasequellen als bakteriellen Ursprungs können ebenso geeignet sein. Beispielsweise kann ein brauchbares

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Phosphotransferasepräparat aus Karotten hergestellt werden_o

Chemische Phosphorylierung wird im allgemeinen dadurch kompliziert, daß in dem Nukleosidmolekül neben dem 5'-Hydroxylteil verschiedene Reaktionsstellen vorliegen. Die 2'- und 3'-Hydroxylgruppen sind annähernd so reaktionsfähig wie die 5'-Hydroxylgruppen und müssen daher im allgemeinen vor der Reaktion des Nukleosids mit einem Phosphorylierungsmittel geschützt und später entblockt werden,. Wenn Blockierungsgruppen verwendet werden, können sie selektiv durch sorgfältige Auswahl der Reaktionspartner und Reaktionsbedingungen verbunden werden oder es können alle drei Hydroxylgruppen (in 2'-, 3'- und 5'-Stellung) blockiert und dann die 5'-Stellung selektiv entblockt werden. Es kann aber auch die 5'-Stellung selektiv durch eine voluminöse Blockierungsgruppe blockiert werden, wonach man die 2'- und 3'-Stellungen in herkömmlicher Weise blockiert und die 5'— voluminöse Blockierungsgruppe entfernt. Ein Beispiel einer derartigen voluminösen Blockierungsgruppe ist die Iritylgruppe; 4,4'-Dimethoxytritylchlorid wurde für diesen Zweck verwendet. Ein weiteres Beispiel ist die tert-Butyldimethylsilylgruppe.

Die Phosphorylierung bei der 5'-Stellung kann dann bewirkt und die Biockierungsgruppen bei den 2'- und 3'-Stellungen können mittels geeigneter Verfahren entfernt werden. Im allgemeinen können Substituenten an dem Purinring in nicht

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blockierter Form belassen werden, vorausgesetzt, daß die Phosphorylierungsbedingungen ausreichend mild sind, daß sie nicht angegriffen werden _o

Es ist nicht immer notwendig, die 2'- und 5'-Stellungen vor der Phosphorylierung zu blockieren. Derivate der Phosphorsäure, bei denen eins bis drei Hydroxygruppen durch Halogenatome, z.B. Chlor, erset-zt sind, wie Phosphorylchlorid, werden zur Phosphorylierung bevorzugt. Bis zu zwei der Hydroxygruppen können ebenso unter Bildung von Alkyloxygruppen substituiert werden, die beispielsweise weitere Substituierungen unter Bildung von Arylalkyloxygruppen aufweisen können. Solche Halogenphosphorsäurederivate oder -phosphonate werden unter den üblichen neutralen oder alkalischen Bedingungen angewendet, wobei die letzteren vorzugsweise eine Aktivierung, beispielsweise mittels Carbodiimid, z.B. Carbodicyclohexylimid, erforderlich machen, außer wenn sie in Form des Anhydrids vorliegen.

Einzelne oder substituierte Alkoxygruppen, die mit einem Phosphonat eingeführt werden, können in einem geeigneten wäßrigen Medium in Gegenwart von Basen in einer nachfolgenden Stufe hydrolysiert werden. Substituierte Alkoxygruppen können ebenso der Hydrogenolyse, vorzugsweise in Gegenwart eines Katalysators, nach den üblichen Verfahren der Spaltung, beispielsweise der Benzylgruppe, in dieser Weise unterworfen werden.

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In einem bevorzugten Verfahren zur Phosphorylierung der Nukleoside dieser Erfindung setzt man die nicht geschützten Nukleoside mit Phosphorylchlorid (POCl-,) in Gegenwart von Trialkylphosphat und vorzugsweise in Gegenwart einer geringen Menge Wasser bei einer Temperatur von etwa 0 G oder weniger um. Bei diesen Reaktionsbedingungen bewirkt man die Phosphorylierung im allgemeinen, vorzugsweise an der 5'-Stellung. Offensichtlich wird das 5'-Dichiοrphosphat (5'-Phosphorodichloridat) am Anfang gebildet und leicht zu dem entsprechenden Phosphat nach Behandlung mit Wasser bei einem leicht basischen p_H-Wert hydrolysiert.

Zu weiteren brauchbaren Verfahren zur Herstellung der 5'-Monophosphate dieser Erfindung gehört die Umsetzung des ungeschützten Nukleosids mit Phosphorylchlorid in trockenem Pyridin. Dieses Verfahren liefert im allgemeinen ein Gemisch von 2'-, 3'- und 5'-Phosphaten, in dem die 5'-Phosphate vorherrschten. Die Abtrennung und Reinigung des 5'-Phosphats kann mittels chromatographischer Standardverfahren bewirkt werden. Die Umsetzung des nicht geschützten Efukleosids mit β,β,β-Trichlorathylchlorphosphonat bei niederen Temperaturen unter nachfolgender Entfernung der Trichloräthylblockierungsgruppen von der 5'-Stellung an dem Zuckerteil durch die Einwirkung von Ziriksfcaub in wäßrigem Pyridin liefert ebenso das entsprechende 5'-Nukleotid.

Die Mukleotide dieser Erfindung können ebenso durch enzyma-

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tische Umwandlung der Purinsubstituenten in den 2- und 6-Stellungen hergestellt werden. Von Enzymen ist bekannt, daß sie eine wechselseitige Umwandlung einer Hydroxygruppe, bzw. einer Aminogruppe in der 2-Stellung und ebenso die Umwandlung einer Aminogruppe in eine Hydroxygruppe in 6-Stellung bewirken. Beispielsweise kann ara-GMP (I, R =0H,

R =NHp) mittels enzymatischer Umwandlung aus ara-DAPMP

1 ο

(I, R =R =lTHp) durch die Wirkung von Adenylatdeaminase

oder aus ara-XMP (I, R¹=R²=0H) durch die Wirkung von GMP-Synthetase hergestellt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher die beschriebenen Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I und der bevorzugten Verbindung, worin die Reste R und

2
R =NHp sind,sowie ihre Additionssalze_o

Die Erfindung schafft weiterhin pharmazeutische Zubereitungen oder Präparate, die eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz derselben und einen hierfür geeigneten pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten. Die Zubereitungen können oral, parenteral oder örtlich, je nach dem, ob das Präparat zur Behandlung von inneren oder äußeren durch DNA-Viren bewirkte Viren-■ infektionen verwendet wird.

Das Präparat wird vorzugsweise oral oder als Lösung (Injektion) verabfolgt, wenn es als Unterdrückungsmittel eines

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Immun- oder Autoimmunansprechens verwendet werden soll.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Behandlung von Vireninfektionen, die von DHA-Viren bei Säugern (z.B. Mäusen, Ratten, Hunden, Menschen, usw.) verursacht werden, wozu man eine wirksame nicht-toxische antivirale Menge einer Verbindung der allgemeinen Formel I (vorzugs-

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weise worin R =R =NHp ist) oder ein Salz dieser Verbindung den infizierten Säugern verabfolgt. DKA-Viren sind solche Viren, die DNA als Baustein verwenden.

Die Erfindung beinhaltet weiterhin die neuen und brauchbaren Verbindungen der vorausgehenden allgemeinen Formel.

Zur oralen Verabfolgung können feine Pulver oder G-ranulate der Verbindungen Verdünnungs-, bzw. Streck-^Dispergier- und/ oder oberflächenaktive Mittel enthalten und sie können dargeboten werden als Trank in Wasser oder in einem Fruchtsaft, in Kapseln oder Kaschetten im trockenen Zustand oder in einer nicht-wäßrigen Suspension, in der Suspendierungsmittel enthalten sein können, in Tabletten, in denen Bindemittel und Gleitmittel enthalten sein können oder in Form einer Suspension in Wasser oder einem Fruchtsaft.

Sofern erwünscht oder notwendig, können Geschmacksstoffe, Konservierungs-, Suspendierungs-, Eindick- oder Emulgiermittel zugegeben werden. Tabletten und Granulate werden be-

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vorzugt und diese können beschichtet sein. Zur parenteralen Verabfolgung können die Verbindungen in Form wäßriger In- ;jektionslösungen dargeboten werden, die Antioxidationsmittel, Puffer usw. enthalten können.

Die Verbindung wird durch die nachfolgenden Beispiele erläutert, ohne damit den Erfindungsbereich einzuschränken.

Beispiel 1

2,6-Diamino-9-(ß-D-arabinofurano syl)-purin-5'-pho sphat (Ara-DaPMP; I, R¹=R²=NH ₂)

Man kühlt eine Suspension von trockenem 2,6-Diamino-9-(ß-D-arabinofuranosyl)-purin (0,57 g) in Triäthylphosphat (3,5 ml) unter Rühren auf -15°C und gibt dann Phosphoroxychlorid (0,75 ml) zu. Hach 1-stündigem Rühren bei -150 gibt man weiteres Triäthylphosphat (2 ml) und 30 Minuten später weiteres Phosphoroxychlorid (0,28 ml) zu_o Man läßt das Kühlbad sich auf -2⁰C während der nächsten Stunde erwärmen und hält das Reaktionsgemisch bei dieser Temperatur weitere 2,5 Stunden. Man filtriert das Reaktionsgemisch, entfernt die nicht umgesetzten Nukleoside (0,134 g). Man gießt das Filtrat auf ein Gemisch von Wasser und Eis und stellt den p_H-Y/ert des Gemischs auf 7,8 durch Zugabe von 1 N Natriumhydroxid ein. Man extrahiert die Lösung zweimal mit Chloroform. Die wäßrige Schicht verdünnt man auf ein Gesamtvolumen von sechs Liter und adsorbiert die Nukleoti-

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-H-

de auf Dowex 1-x8 (Chlorid) (12 g). Man wäscht das Harz mit Wasser und eluiert das Nukleotid mit 1 M Lithiumchlorid, p_H 6,5. Das Eluat wird lyophilisiert. Das Lithiumchlorid in dem lyophilisierten Pulver extrahiert man mit Aceton/Methanol (9s1). Den Rückstand löst man in Wasser, filtriert und adsorbiert das Nukleotid in aktivierter Holzkohle. Das Ara-DAPMP eluiert man aus der Holzkohle mit 10 ^a/o Ammoniak/50 $ Äthanol. Das Volumen Eluant senkt man auf etwa 60 - 70 $ unter reduziertem Druck bei 40⁰C und lyophilisiert unter Bildung von reinem 2,6-Diamino-9-(ß-D-arabinofuranosyl)-purin-5'-phosphat (44 mg) als weißem Pulver; Schmelzpunkt >300°C (dunkelt bei 190⁰C). Mittels Hochdruck-FlüssigkeitsChromatographie stellt man >99$ige Reinheit fest. U.V.-Spektren in 0,1 N HCl:Xmax bei 252 und 289 nm undXmin bei 233 und 270 nmj in 0,1 N ITaOHs Xmax bei 254 und 278 nm und Xmin bei 236 und 265 nm.

Beispiel 2

2-Amino-6-hydroxy-9-(ß-D-arabinofuranosyl)-purin-5'-phosphat (Ara-GMP)j I, R¹=0H_tR²=flH ₂)

Man läßt ein Reaktionsgemisch, das Tris-succinat (100 mM, Ptt5,9), Kaliumchlorid (100 mM), ß-Mercaptoäthanol (5 mM), 2,6-Diamino-9-(ß-D-arabinofuranosyl)-purin-5'-phosphat (8,6 mM) und AMP-Deaminase (55 Einheiten) enthält, in ausreichend Wasser für ein Gesamtvolumen von 10 ml bei 25⁰C StcL stehen. Man filtriert das Reaktionsgemisch und verdünnt

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das Filtrat auf 100 ml. Man adsorbiert die Nukleotide auf aktivierte Holzkohle und eluiert danach mit wäßrigem Pyridin (10 #, 25 ml)_o Man verdampft das Eluant zur Trockne bei 30⁰C unter reduziertem Druck, löst das erhaltene Pulver in Wasser (25 ml), filtriert und lyophilisiert unter Bildung von 2-Amino-6-hydroxy-9-(ß-D-arabinofuranosyl)-purin-5¹-phosphat (30 mg). Dieses Produkt weist eine >99$ige Reinheit bei Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie auf; seine U.V-Spektren sind 0,1 N HCl λmax bei 255 und 276(sh) nm und A-min bei 219 nm und in 0,1 N NaOH Xmax bei 258 nm und 3-min bei 231 nm. Die Behandlung des Produkts mit 5'-Nukleotidase liefert 2-Amino-6-hydroxy-9-(ß-D-arabinofuranosyl)-purin, das mit einer authentischen Probe identisch ist.

Beispiel 3

2-Hydroxy-6-amino-9-(ß-D-arabinofuranosyl)-purin-5'-phoshat

(Ara-iso-&MP; I, R¹=NH ₂ , R²=0H)

Man verwendet ein teilgereinigtes Phosphotransferasepräparat aus Serratia marcescens zur Herstellung von Araiso-GMP aus Ara-iso-G·. S. marcescens (ATCC 14227) züchtet man in einem Difco-Nährbrühemedium zu der stationären Frühphase und erntet mittels Zentrifugieren. Die Zellen zerbricht man in einer "French-Press" bei ca. 1400 kg/cm und die erhaltene Suspension zentrifugiert man 15 Minuten bei 5000 χ g, um die Zelltrümmer zu entfernen. Nach Behand-

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lung der überstehenden Schicht mit Ribonuklease und Deoxyribonuklease zentrifugiert man die Suspension bei 100.000 χ g 2 Stunden. Man konzentriert die überstehende Schicht unter Verwendung einer Amicon-UItrafiltrations-Membrane, die Moleküle mit Molekulargewichten, die größer als 100.000 sind, zurückhält. Tatsächlich wird das gesamte Enzym durch die Membrane zurückgehalten. Im Verhältnis zu dem rohen Extrakt erhält man eine Gesamtenzymausbeute von 50 fo und eine 4-fache Reinigung.

Ein Reaktionsgemisch mit einem Gesamtvolumen von 2 ml und einem Gehalt von 300 mM Natriumacetat puff er, Ρττ 4,0, 1 mM Kupfer-II-sulfat, 220 mM p-Nitrophenylphosphat, 16 mM 2-Hydroxy-6-amino-9-(ß-D-arabinofuranosyl)-purin (Ara-iso-G) und einem Teil des voraus hergestellten Enzympräparats, das 10 mg Protein enthält, brütet man bei 37°C 3 Tage, zentrifugiert und lyophilisiert die überstehende Schicht.

Man löst das lyophilisierte Pulver in Wasser und führt es einer wasser-äquilibrierten Bio-Rad-P-2-Polyacrylamidgelkolonne (1 χ 60 cm) zu. Die Nukleotidfraktionen, eluiert mit Wasser, werden gesammelt, lyophilisiert und einer CeI-lulose-präparativen-Dünnschichtplatte (Uniplate Avicel F, 1000/nastark) zugeführt. Die Platte entwickelt man in n-Propanol/Wasser: 7/3. Me dem Nukleotid entsprechenden Banden eluiert man aus der Cellulose mit Wasser und lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver löst man in Wasser

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und führt es einer wasser-äquilibrierten Sephadex G-10-Kolonne (0,9 χ 100 cm) zu und eluiert mit Wasser. Die das Uukleotid enthaltende Fraktion sammelt und lyophilisiert man unter Bildung von 2-Hydroxy-6-amino-9-(ß-D-arabinofuranosyl)-purin-5'-phosphat (2 mg) als weißem Pulver. Das Produkt weist eine Reinheit von >99^ bei Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie auf; es bildet einen einzigen Tüpfel bei Cellulosedünnschichtchromatographie; seine TJ.V.-Spektren sind die gleichen wie die von Isoguaninarabinosid (in 0,1 N HCl Λmax 235(sh), 282 nm, ^ min 248 nm, p_H 7 λ max 247, 288 nm, X min 232, 263 nm, 0,1 N NaOH Xmax 250, 281, 320(sh) nm, λ min 237, 262 nm); sein Basen- zu Phosphatverhältnis beträgt 1:1,1 und nach Behandlung mit 5'-Nukleotidase spaltet man es zu Isoguaninarabinosid.

Beispiel 4

2,6-Dihydroxy-9-(ß-D-arabinofuranosyl)-purin-5'-phosphat (Ara-XMPj I, R¹=R²=0H)

Man bebrütet ein Reaktionsgemisch (20 ml), das 25 nM Tris-Cl, p_H 8,0, 100 mM Kaliumchlorid, 0,4 mM NAD⁺, 15 mM Brenztraubensäure, 10 mM 6-Hydroxy-9-(ß-D-arabinofuranosyl)-purin-5'-phosphat (Ära-BIP), 15 ng L-aktat-Dehydrogenase und 35 Millieinheiten IMP-Dehydrogenäse enthält, bei 3O⁰C 24 Stunden. Man gibt weitere 25 Millieinheiten IMP-Dehydrogenase zu und setzt das Bebrüten weitere 48 Stunden fort.

Schließlich gibt man nochmals 25 Millieinheiten IMP-Dehydro-

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genäse zu und setzt das Bebrüten weitere 24 Stunden (also insgesamt 96 Stunden) fort. Man filtriert das Reaktionsgemisch, und lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver läßt man in einer minimalen Menge Wasser und führt es einer wasser-äquilibrierten Bio-Rad-P-2-Polyacrylamidgelkolonne (2,5 x 90 cm) zu. Me Kolonne eluiert man mit Y/asser und sammelt die Fraktionen, die TJ.Vo-Absorptionsmaterial enthalten, führt sie einer DEAE A-25 Sephadex-Kolonne zu und chromatographiert nach dem Verfahren von Galdwell (J.Chromatography, 44, 331 (1969) unter Verwendung eines Pjt4,7-Triäthylammoniumacetatpuffer. Fraktionen, die Ära-XMP enthalten, sammelt man, lyophilisiert sie und führt sie wiederum der wasser-äquilibrierten Bio-Rad-P-2-Polyacrylamidgelkolonne zu. Die Kolonne eluiert man mit Wasser und man sammelt die Ara-XMP enthaltenden Fraktionen und lyophilisiert sie unter Bildung von 2,6-Dihydroxy-9-(ß-D-arabinofuranosyl)-purin-5'-phosphat (1,2 mg) als weißem Pulver. Das Produkt zeigt eine >92fo±ge Reinheit bei Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie aufj sein U.V.-Spektrum in 0,1 Ή NaOH Vax 248, 276 nmj es wird umgewandelt durch XMP-Aminase zu einem Produkt, das einer authentischen Probe von Ara-GMP identisch ist; es wird gespalten durch 5' — Nukleotidase zu Ara-X /2,6-Dihydroxy-9-(ß-D-arabinofurano syl)-purin7·

Beispiel 5

Natrium-2.6-diamino-9-(ß-D-arabinofuranosyl)-purin-5'-phosphat

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(Natriumsalz von I, R¹=R²=NH ₂)

2,6-Diamino-9-(ß-D-arabino furano syl)-purin-5'-pho sphat (I, R¹=R²=HH₂) (1 mM) löst man in 0,1 Ν Natriumhydroxid (10 ml) und lyophilisiert dann unter Bildung des Natriumsalzes von 2,6-I)iamino-9-(ß-I>-ara'binofuranosyl)-purin-5^lphosphat in tatsächlich quantitativer Ausbeute.

Patentansprüche: -20-

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Claims

Patentansprüche :

Verbindung der allgemeinen Formel (I)

(D

1 2
worin die Reste R und R gleich oder verschieden sind und jeder Rest eine Amin- oder Hydroxylgruppe sein kann oder ein Salz der Verbindung, "besonders ein pharmazeutisch verträgliches Salz.

2ο Verbindung der allgemeinen Formel (i) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß beide

1 2
Reste R und R eine Amingruppe sind oder ein Salz der Verbindung, im besonderen ein pharmazeutisch verträgliches Salz.

3. Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet

daß beide

1 2
Reste R und R eine Hydroxylgruppe sind oder ein Salz der Verbindung, besonders ein pharmazeutisch verträgliches Salz.

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4. Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1,

1 dadurch gekennzeichnet, daß R eine

ρ
Amingruppe und R eine Hydroxylgruppe ist oder ein Salz der Verbindung, im besonderen ein pharmazeutisch verträgliches Salz.

5. Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet, daß R eine

ρ
Hydroxygruppe und R eine Amingruppe ist oder ein Salz der Verbindung, im besonderen ein pharmazeutisch verträgliches Salz.

6. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet , daß sie eine Verbindung der

1 ?

allgemeinen Formel (I), v/orin die Reste R und R gleich oder verschieden sind und jeder eine Amin- oder Hydroxylgruppe sein kann oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz der Verbindung, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.

7. Pharmazeutische Zubereitung gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Verbindung der Formel gemäß Anspruch 2 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz der Verbindung zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält»

8. Pharmazeutische Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet,

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daß sie in Form einer Tablette oder als Kapsel vorliegt.

9. Pharmazeutische Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form einer Salbe oder Creme vorliegt.

10. Pharmazeutische Zubereitung zur oralen oder parenteralen Verabfolgung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Verbindung der Formel (I) in einer Menge von 1 bis 100 mg/kg enthält.

11. Pharmazeutische Zubereitung zur oralen oder parenteralen Verabfolgung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Verbindung der allgemeinen Formel (I) in einer Menge von 10 bis 250 mg/Dosierungseinheit enthält.

12. Pharmazeutische Zubereitung zur äußeren Behandlung gemäß einem der Ansprüche 6, 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet , daß die Verbindung der allgemeinen Formel (I) in einer Menge von 0,1 bis 10 $ Gew/Vol enthält.

13. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß einem der An-

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sprüche 1 bis 5 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz dieser Verbindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger für die Verbindung zusammenbringt.

14. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (i)

HO - P - 0 —η

OH

OH

(D

1 2
worin die Reste R und R gleich oder verschieden sind und jeder eine Amin- oder Hydroxylgruppe sein kann oder ein Salz dieser Verbindung, besonders ein pharmazeutisch verträgliches Salz der Verbindung, dadurch gekennzeichnet , daß man: (a) Die Hydroxygruppe in 5'-Stellung in eine?Verbindung

der allgemeinen Formel (II)j

worin die Reste R und

R die oben definierte Bedeutung haben,

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(H)

phosphoryliert oder

(t>) eine Verbindung der allgemeinen Formel (i) in eine andere Verbindung der allgemeinen Formel (I) durch Zwi-

1 2

schenumwandlung von R und/oder R umwandelt, oder

(c) eine Blockierungsgruppe bzw. -gruppen τοη einer Verbindung der allgemeinen Formel (III),

HO — ρ „ ο

(III)

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1 2
worin die Reste R und R die oben definierte Bedeutung haben, und einer oder beide Reste G und 1 eine blockierte Hydroxygruppe sind,unter Bildung einer Verbindung der Formel (I) entfernt, und sofern das Produkt dieser Reaktion eine Base ist, gegebenenfalls eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) in deren Säureaddit ions salz umwandelt, und sofern das Produkt ein Salz einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) ist, gegebenenfalls dieses Salz in seine Base oder in ein anderes Salz umwandelt.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14 zur Herstellung einer

Verbindung der Formel (I), dadurch gekenn-

1 2 zeichnet , daß beide Reste R und R eine Amingruppe oder ein Salz dieser Verbindung, besonders ein pharmazeutisch verträgliches Salz, sind.

16. Verfahren gemäß Anspruch 14 (a), dadurch gekennzeichnet , daß man die Verbindung der Formel (II) enzymatisch phosphoryliert durch Bebrüten mit einer Phosphatquelle und einem Phosphotransferaseenzym, das geeignet ist, den Zuckerteil in 5'-Stellung zu phosphorylieren.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , daß man als Phosphatquelle ein liukleosid-5^t-monophosphat oder ein organisches Phosphat verwendet.

G 0 9 S ί ? / 1 η /_t 6

18. Verfahren gemäß Anspruch 17, dadurch g e kennze lehnet , daß man als organisches Phosphat Phenylphosphat oder p-Nitrophenylphosphat verwendet.

19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Phosphotransferaseenzym bakteriellen Ursprungs ist.

20. Verfahren gemäß Anspruch 14(a), dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindungen der allgemeinen Formel (II) chemisch phosphoryliert mittels einem Phosphorsäurederivat, das für diesen Zweck bekannt ist, und daß man, sofern erforderlich, danach das verbundene Phosphat in die gewünschte nicht-substituierte Form umwandelt ο

21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Phosphorsäurederivat verwendet, das eins bis drei durch Halogen substituierte Hydroxygruppen aufweist.

22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 20 und 21, dadurch gekennzeichnet, daß bis zu zwei der Hydroxygruppen in dem Phosphorsäurederivat substituiert sind unter Bildung von Alkoxygruppen, und daß man die Alkylgruppen von dem Produkt durch Hydrolyse in einem basischen Medium entfernt.

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23. Verfahren gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet , daß die Alkyloxygruppen eine
weitere Substituierung aufweisen unter Bildung von Arylalkyloxygruppen, und daß man die Arylalkyloxygruppe entweder durch Hydrolyse in einem basischen Medium oder durch Hydrogenolyse entfernt.

24. Verfahren gemäß Anspruch H(b), dadurch
gekennzeichnet , daß die Umwandlung enzymatisch erfolgte

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