DE1620639A1 - Verfahren zur Herstellung von 9-ss-D-Ribofuranosyl-7-deazapurin-3',5'-cyclophosphaten - Google Patents

Description

Vg? fähig art zur Herstellung von g-B-D-Blbofüranosyl-?- deazapurin-3' ,5*l

Gegeixstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von neuen zyclisohen ITulcleosidphosphaten, insb e s ond er e ,von De az ap ur in-r ib ο s i d -3^r■■■» 5' - ο ycBopho s pha t en (9-ß-d -B ib Df ur a no syl - 7 -de a ζ apur in - 3', 5' -ö yoBb * phosphaten), ■ _;

Das erfindungsgeraäße yerfahren und die mit ihm erhältlichen neuen Produkte (II) lassen sich durch das nachstehende Formelschema veranschaulichen:

M-P-U

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- 2 ·* ■

In dsm Z Wasserstoff, eine Hydroxy-, Amino-, eine Acylaininogruppe, deren Acylrest einer Kohlenwasserstoff-Carbonsäure mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen entstammt, eine Mercapto- oder eine Alkylmeroaptogruppe, deren Alkylrest 1 bis 4 C-Atome aufweist, bedeutet*

Daserfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß man ein 7-Deazapurin-ribosidphosphat (I) in basischer Lösung mit einem Kondsnsationsmittel, vorzugsweise einem Dialkyl- oder Dicjaloalkyl-carbodiimid zum entsprechenden 7-Deazapurin-ribosid^* ,^'-oyöSophosphat (H) umsetzt»

Die neuen 7-Deazapurin-ribosid~3'_>5*-oyäophosphate (II) besitzen in vitro bedeutende cytotoxische Wirksamkeit, vor allem ge/ren KB-Tumorzellen und gegen Viren, insbesondere gegen die verschiedenen Herpes-, Coe- und Vaccinia-Arten. Aus diesem Grunde können sie zur Reinigung von Glasgeßenständen und Instrumenten verwendet werden, die zur Züchtung von Gewebekulturen und TumorenTorschung verwendet werden, zum Auswaschen von herausgesohnittenem Tumorgewebe, das für die Transplantation in Tiere bestimmt ist, um das Wachstum irgendwelcher KB-Tumorzellen, die sonst in umgebendes Gewebe ausgestreut oder in andere Teile des tierischen Körpers gelangen wurden, zu verhindern. Die Antivirus-Wirksamkeit kann auch zur Herstellung von Virusphagen-freien Kulturen von Mikroorganismus,z.B. von phagenfreien, antibiotikumbildenden Streptomyces- Kulturen benutzt werden. Die Verbindungen können in geeigneten pharmazeutischen Trägern oral, parenteral oder lokal verabreicht werden. Die 7~Döazapurin-ribosid-5'-phosphate sind bekannt (J.E. Pike et al., J. of Heterocyclic Chemistry 1, 159 (1964) oder können wie in den nachfolgenden Präparaten hergestellt werden·

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Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird 7-Deazapurin-ribosid-5^f>phospliat mit einem Kondensat Ions· mittel in ba&ischer "Lösung erhitzt* Meistens werden als Lösungsmittel Pyriäin, MethylpyrIdin, Ätüylpyridin, Lutidine, Morpholin oder dergl. verwendet· Pyridin wird bevorzugt. Da basieche Bedingungen erforderlich sind,- wird eine starke, in Pyriäin lösliche Base zugesetzt, wie Trdäthylamin oder vorzugsweise ^-Morpholinyl-N, N'-Dicyclohexylcai^vboxamidin der Formel

in der CgH₁₁ einen Cyolohexylrest darstellt* Zur Erzielung optimales Ausbeuten wird die Umsetzung unter absolut wasserfreien Bedingungen durchgeführt. Zu diesem Zweck engt man eine wasserfreie Pyridin-Lösung der ReaktionstöLnehmer unter verringertem DrucK zu einem trockenen Rückstand ein. Um eine vollkommene Trocknung zu. erreicheni wird diese Maßnahme mehrmals wiederholt. Die Kondensation führt man bei höherer Temperatur, vorzugsweise bei der Rückflußteiaperet-ur e^es Reaktionsgemisches durch. Die Reaktionszeit schwankt zwischen einigen Minuten Und mehreren Stunden. Durchschnittlich beträgt sie zwischen Γ und 6 Stunden, !fach beendeter Umsetzung wird dem Reafctionsgemisch Wasser zugesetzt, um das nicht umgesetzte Carbodiimid in einen wasserunlöslichen Harnsstoff umzuwandeln. Dieser wird gewöhnlcih durch Filtrieren entfernt. Das Produkt wird nach üblichen Verfahren, z. B.

0 0 9 S 36 / 213 h _BAD

durch Konzentrieren oder Lyophilisieren aus der wässrigen Lösung gewonnen und auf herkömmliche Weise, z«B. durch Chromatographieren, Lösungsmittel-Verteilung in einer Craig-Extraktlösevorrichtung, Elektrophorese und dergl. gereinigt.

Die nachfolgenden Präparate und Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.

Präparat 1 '

9-ß-P-Ribofuranosyl-7-deazaadenin-5 '-phosphat

i9-ß-D-Ribofuranosyl-6-amino-7-deazapurin-5'-phosphat (VI), (Sparsomyoin-il-5¹ -phosphat)!

NHz

Mf OfI

IV

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BAD ORIGINAL

ho m

Die nachstehende Verbindung IIIV 9'-ßⁱ-D-Ribbfüranosyl-7-cleazaaäeniii l· ^;

!I!

«ο W

wird in: der Literatttur auoh als Tüberoidiii . ."bezeichnet... Vorliegend wird jedoch die Bezeichnung "Spar3omyoin A^ir bevorzugt,

Sparsomycin A (III| - -

-ν' . BADORlQiNAL

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A. Fermentation

line auf einem Schrägnährboden gezüchtete Kultur von Streptomyoes sparsogenes yar„ sparsogenea NRRL 294o, der aus einer Bodenprobe isoliert worden war, wurde zur Beimpfung einer Reihe von 5°Q om Erlanmeyer-Kolben verwendet. Jeder Erlsnmeyer-Kolben enthielt loo ml Nährmediums aus folgenden Bestandteilen:

ßlukosemonohydrat 25 g
Pharmamedia*) . 25 g
Leitungswasser, um auf 1 Liter aufzufüllen»

⁺)pharmamedia ist ein Baumwollsaatmehl technischer Qualität, hergestellt von Traders Oil Mill Uo,, Fort Worth, Texas.

Das Medium wurde bei pH 7,2 vorsterilisiert. Der Mikroorganismus wurde zwei Tage bei 28⁰C auf einem Gump-Rotationsschüttler, der sich mit 25q Umdrehungen/Minute drehte, gerüttelt.

lin die gezüchtete Kultur enthaltender Kolben (loo ml) wurde zur Beimpfung eines 2o Liter Tankes verwendet, der 15 Liter des oben genannten sterilen Impfmediums (S-I) sowie 1 ml/Liter Specköl enthielt. Der Tank wurde 24 Std. auf einer Temperatur von 28⁰C gehalten, wobei man mit einer Geschwindigkeit von Io Liter/Minute belüftete und mit 4oo Umdrehungen/Minute rührte.

Dieser beimpfte Tank wurde dann alö Impfmaterial für einen 38o Liter Gärbottich verwendet, der 25o Liter des folgenden sterilen Mediums enthielt:

Glukosemonohydrat Io g/l

Dextrin 15 g/l

Pharmamedia 2o g/l

Wilson's Peptone Liquor Nr. 159⁺) 5 g/l ·'

Specköl 2 ml/1

Leitungswasser ; Rest

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W WiIsPIi¹S Peptone Liquor Nr. 159 ist hydrolyeiertes Protein tier iac heH Ursprungs,

Die Fermentation führte man 113 Stunden durch, während dieser Zeit hielt man die Temperatur auf 28°C, 'belüftete mit gefilterter Luft in einer Geschwindigkeit 70η loo L/Minute und rührte mit 28 Umdrehungen in der Minute. Während der Fermentation wurden 185o ml Specköl als Antischaummittel zugesetzt. /

B« GaffInnung

Die gesamte Gärlösung., die zu Ende der Fermentation einen pH-Wert von 7*1 hatte, wurde mit 35o nil (konzentrierter) Schwefelsaure auf pH 2,4 eingestellt und unJTer Verwendung von 3>6 Ψ Diatömeenerde als Filterhilfsmittel filtriert* Der Filterkuchen wurde mit o,2 Volumteilen entionisiertem Wasser gewaschen, die klare Gärlösung sowie das Waschwasser (Volumen: 2Bo Liter) wurden mit 300 ml 5o Se-igen wässrigen Katriumhydroxyd auf einen pH»Wert von 7,35 gebracht und über iiaoh bei Io ⁰G stehen gölassQn_e Dann stellte man ■ die klare Gärlösung mit 5° ml ^o^-ißin¹ wässrigen Hatriumhydroxyd auf pH 8 ein und rührte sie'll Stunde lait 1 f» Entfärbüngskohle unö 5 $ Kieselgur. Das Gemisch wurde filtriert und der Kohlekuchen mit o₈2 Volumteilen 2o 5»-igem wässrigen Aceton gewasehen. Der geweschene Kohlekuchen wurde zweimal mit o,4 Volumteilen 50 ^-igem wässrigen Aceton, das mit konzentrierter Schwefelsäure auf pH 2,5 angesäuert wer, Qlurier%| worauf die Eluate vereinigt wurden. Das veröinigte Aceton-iluat (72 Liter) wurde mit 30 ml 5o5&-igem wässrigen Hatriumhydroxyd auf pH 6,4- eingestellt und zu einer wässrigen Lösung von 4o Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde auf pH 5,9 eingestellt und gefriergetrocknet. Mail erhielt 44? g lyofliilisiertes Material,

ORIGINAL

Weitere 1126 g erhielt man durch zweimalige Wiederholung der vorstehend beschriebenen Fermentation. Das vereinigte lyophilisierte Material (1573 g) wurde in Io Lite* Methanol bei 4o°C 1 Stunde lang aufgeschlämmt. Das unlösliche Material wurde abfiltriert und dreimal mit 5°o ml warmem Methanol (4o°c) gewaschen. Die Methanolextrakte und WaschfXassigkeiten wurden vereinigt (11,5 Liter) und im Vadium zur Trockene eingeengt; 321 g (HRV-25,3)· Die Untersuchung ergab 1,25 Proteus vulgaris Bio-Einheiten je Milligramm.

C. Reinigung

Trennsäule.

3oo g dieses Präparates (HRV-25,3) wurden in eine Trennsäule gegeben, die in folgender Weise hergestellt und entwickelt wurde; . -

Unter Verwendung gleicher Volumteile (35o Liter) von Mcllvaine's pH-6 Puffer und Methylethylketon wurde ein Lösüngsraittelsystem hergestellt. Eine Schlämmung aus 9*6 kg Kieselgur in 6o Liter der oberen Phase und 4,8 Liter der unteren Phase, des vorgenannten Losungsmittelsysteras,wunde · in elne-3oj5o cm Säule gegeben und mit Stickstoff von ο,28 atü gepackt. Die Beschickung für die Säulen wurde in 3 Litern der unteren Phase gelöst, mit 192o g Kieselgur aufgeschlämmt und mit soviel oberer Phsse versetzt, daß sie beweglich wurde.. Diese Beschickung brachte man vorsichtig oben auf die mit einer Schicht aus Seesand bedeckte Säule. Die Säule wurde mit aus oberer Phase bestehendem Lösungsmittel in einer Geschwindigkeit von 2 Liter/Minute cluriert. Es wurden Fraktionen von 4 Litern aufgefangen, außer zu Beginn und Ende als Fraktionen von 2o Litern gesammelt wurden. Die Fraktionen wurden eingeengt und ihre Wirksamkeit mit P.vulgaris untersucht. Zu diesem Zeitpmvftk des Verfahrens wurde die Trennung des Sparsomycins vom Sparsomycin A durchgeführt. Durel weitere Behandlung wurden

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_ή " 112Ö639

diese -Bestandteile gereinigt, bis sie schließlich in kristallinert Form vorlagen.

Die Fraktionen 24 bis einschl. 34 der Trennsäule enthielten das Sparsomyoin * , ■ / V

Reinigung-des- Sparsomyoin A.

Bas Sparsomyoin-A wurde wie folgt gereinigt und kristallisiert ; "

UIe Fraktionen 11 bis einsohl, 2o aus der zuvor beschriebenen Säule fTeil C) enthielten das Sparsotoyoin-A; sie wurcten vereinigt und ,unter verringertem Druck eingeengt« Man erhielt 7,2 g kristallines SateEial, Die Kristalle wurden in 4öo ml Wasser und 5o iflL·/"-d·,·! m HCl gelöst. Die Lösung wurde leicht erwärmt, damii- sich die Kristalle leichter lösten, und dann filtriert, Die klare Lösung wurde mit 5o■"jn-i.gem wässrigen Natriumhydroxyd auf pH 9,0 eingestellt und 5 Stunden im* Kiihlschrank gekühlt. Die abgeschiedenen Kristalle wuriien abfiltrlert, iaili Wasser gewä se hen und getrocknet« Man erhielt 5,65 g dies Präparates ADA-lo2yl* 2 g Rieses Präparates löste man in 75 ml Wasser und 2o ml ο,1 m HCl. Die klare Lösung wurde mit 5ο'%·<■!gern wässrigen Natriumhydroxyd auf pH 9,0 eingestellt. Die Kristallisation setzte sofort ein. Man ließ die Lösung ? Stunden bei 25°C stehen» Dann wurden die Kristalle gesammelt, mit 25 öil>Wasser gewaschen und zu 1>52 g des Präparates ADA-loß,! getrocknet, F. 247,B-25o^ÖC, ■

Optische DrehungCd3ψ = -62° (ο - 0,719 in o,l n> HCl);

269|

pKa^! -m. 3_so7 in Wasser j
W-Absörptionsspektfüm in

-"' ■-,.;■..■'■ BAß

009836/2134 VS>^B"

Wasser	H2SO4	• •	2?ο	m) Uf	a	- 44,14
ο,οΐ η		β * •	22?		a	» 85,28
	KOH		271	fflju;	a	» 4o,82
ο,öl η	ί	27ο	mAu{	a	- 43,50

Charakteristische IR-Absorption bei folgenden Frequen zen in Om-I

3350	(S)	1475	(M)	116ο	(W)	9ο3	(M)
3250	(S)	1458	(S) (Öl)	1134	(M)	867	(M)
3145	(S)	1445	(M) (Sch)	112ο	(M)	852	(W)
3095	(S)	(Sch)L426	(M)	1ο93	(K)	842	(H)
288o	(S).	{01)1370	(M)(Öl)	1ο8ο	(W)	799	(W)
281o	(S)	(01)1351	(M)	1ο55	(H)	715	(W)
1895	(W)	I306	(M)	1ο42	(S)	7ο4	(S)
164o	(S)	1276	(W)	1017	(S)	675	(M)
I592	(S)	I255	(S)	992	(S)	658	(M)
1553	(M)	1241	(M)	953	(W)
15o2	(M)	1198	(W)	912	(W)

Slementaranalyse;

Berechnet für C₁₁H₁₄K₄O₄: C: 49,62; H;5,3oj Df: 21 ,o4

gefunden ■; C: 49,81; H:5,2oj Νί 2o,92.

Sparsomycin A (III) wurde auch nach einem anderen Verfahren aus der Gärlösung isoliert und gereinigt* Die Fermentation wurde wie unter A) beschrieben durchgeführt. Die gesamte Gärijsung (AJW-63) wurde mit 565 ml konzentrierter Schwefelsäure auf 2,5 gebracht und unter Verwendung von 6 ^c/o Diatomeenerde als Filterhilfe filtriert. Der Filterkuchen wurde mit o,l Volumteilen ent- Ί, ionisiertem Wasser gewaschen und das Waschwasser in, der klaren Gärlösung gegeben. Dann.stellte man die klare Γ Gärlösung mit 4oo ml 5o $-igem wässrigen Matriumhydro- ; xyd auf pH 8 ein und rührte sie 1 Stunde mit 1 $ Int- \ färbungskohle und 3 ^ Kieselgus f

Ö0g@3ß/21t£ y-'-⁶' ^ßÄD ORIGINAL

Das Gemisch: wurde filtriert and den Kohlekuafchen mit ο,Γ Volumenteilen entionisiertem,Wasser und anschließend mit o, 2 Vo lucent eil en 2ö %-ißem wässrigen Acetongewasehen. Die gewaschene Kohle wurde zweimal mit o,4 Volumteilön 4o ^-igem wässrigen Aceton, das mit konzentrierter Schwefelsäure auf pH 2,5 angesäuert war, elu— iert. Die Eluate wurden vereinigt, mit 53 ml 5o $-igem wässrigen Natriunüiydroxyä auf pH 4,8 eingestellt, zu einer wässrigen Lösung eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhi%t das Präparat WMH-32»6 in einer Ausbeute von 284 g. Eine untersuchung dieses Präparates ."ergab in Gewebekultur 9 KB'-Einheiten /mg. Man löste loo g dieses Präparats in 6oo ml Methanol und gab zur Ausfällung des inaktiven Materials 4 Volumteile Xther zu. Durch langsames Abdampfen des Lösungsmittels erhielt man aus der überstehenden Methanol-Atherschicht zwei Chargen kristallinen Materials. Sie wurden vereinig; und in 35 ⁰¹I Wasser und 5 ifil O₈I n Salzsäure gelöst. Dann filtrierte man die Lösung uiiä stellte si«, mit 5o $-ig@m wässrigen liatriumhyäroxyd auf pH 9,4 ein... Das Sparsoraycin A schied sfch in kristelliner Form ab» Es wurde gesammelt, mit Wasser getraschen und getrocknet j Ausbeute 48o mg des Präparates ADA~lo4.l mit dem SciuaeÄpunlct 247_s8-25o ,8⁰C, der optischen Drehung Χ<ϊ3 £^ * 61° (0*0,908 in ο,l η HCl )_s dem iLgjiivalentgewiclit 27O₄ dem pKa*~Wert in Wasser von 5.05 und den Ultreviolet-cen Absorptionsspektrum in

Wasser 269,5 m.uj a =44,2?

ο,οΐ"η HgSQ^ 227 mvU| a = 86,06

271 m_vui β =

ο,οΐ η KOH . 2?o mjuj a .-- 43,61

,,^ BAD

Charakteristische IR-Absorption bei folgenden Frequenzen in em"¹:

34oo	(S)	(öl)	1526	(S)	12oo	(M)	8?o	(S)
331ο	(S)	(Öl)	I5I0	(M)	1164	(M)	852	(W)
324o	(S)	(Öl)	148o	(S)	1137	(S)	843	(W)
322o	(S)		I600	(S) ..	I26o	(S)	955	(M)
3l4o	(S)		1462	(S)(Ol)	1245	(S)	905	(M)
295o	(S)		1425	(S)	II25	(M)	800	(M)
292o	(S)		1370	(M)(Öl)	I092	(S)	715	(S)
285o	(S)	1355	(S) .	Io84	(Mi	7o2	(S)
262o	(M)	1342	(M)	I057	(M)
I9I0	(W)	I3I0	(S)	Io45	(S)
165o	(S)	1285	(M)	Io2o	(S)
1645	(S)	128o	(M)	995	(S)

9-ß-D-Ribofuranosyl-7-deazaadenin (Sparsomycin A) hat ein charakteristisches fapierchromatogremm und folgende Slementaranalyse:

Analyse'

Bereennet für C₁₁H₁₄N₄O₄: G 49,62,· H 5>3o; N 21,o4 : Gefunden : C 49,62; H 5,o4j N 2o,81

Die oben beschriebenen Eigenschaften des Sparsomycin A stimmen gut mit den in der Fachliteratur angegebenen Werten für Tubercidin übereinj vgl. Anzai, K.; G-. Nakamura und S. Suzuki: A new antibiotic, Tuberoidin. JY Antibiotics, Ser. A. S. 2ol-2o4, September 1957» Is ist jedoch kein Verfahren zur Herstellung von Tuhercidin beschrieben.

(2) 2* ^'-O-Isopropyliden-Sparsomycin A (IT)

Bei Raumtemperatur Bührte man 2 Stundenlang ein Gemisch »us 1 g Sparsomycin A, das über Nachbunter einem Druck von 0,3 mm bei Io8° getrocknet worden war, 7,5 g p-Toluolsulfonsäuremonohydrat und 50 ml Aceton, das zuvor

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über Kaliumpermanganat und dann über KäliumcaDonat destilliert worden war. Nach Kühlung des Reaktionsgemisches Auf 3 C wurden diesem 2oo ml o,5 η iatriumbioarbonatlösung von 3°C zugesetzt. Die erhaltene Lösung wurde unter vermindertem Druck bei 35°^c zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde zunächst zweimal mit je loo ml siedendem Chloroform und dann, zweimal mit je loo ml Chloroform von Raumtemperatur extrahiert. Die Extrakte wurden einzeln filtriert, dann vereinigt und eingeäampft. Man "löste den so gewonnenen Hackstand in 25ml siedendem Wasser und filtrierte die Lösung. Durch Kühlung des Filtrats erhielt man einen kristallinen Niederschlag aus 2',3¹HD-IsO-propyliäensparsomycin Aj Gewicht £L,75 g (65Jb) ; Schmelzpunkt ^{0 c}

Hach zweimaligem weiteren Ümkristaiiieren aus Wasser erhielt man 2^l-,3^r-0-Isbpropyriden-sparsomycin A (I¥) , das bei 174-177iCschmilzt und folgende Analysenwerte hatte« : '.'.-.-

Analyse	CH5	54,89; C 4^92*	H O	5,92; 2o,92
Berechnet für C^E, gN^O^	G CH,	54,72; 18,51; G 4,3.	K O	5,92; 21,2 ;
Gefunden:

(3) 2',3*-O-Isoprppyliden-sparsomycin A-S'-phosphat (Y) und Sparsomyoin 4-5^l-dihydrogenphosphat (Yl)

Eine Mischung aus 2„78. g (9_S1 Millimol) 2*_S3^S-Or propyliden-sparsomyoin A_s 2a ml ß-Gyanoäthyl-dihydrogen phosphat-Reagens (5o Millimol} her gestellt nach G₀M₀ Tener, J₉ Am« Chem„ Soc,_s 83> 159. (19W) und 12o ml trockenem Pyridin wurde unter verminäertem BEUok bei etwa 40⁰C"zur Trockne eingedampf„ Der erhaltene Hückstand

BAD ORIGINAL

009836/2134 -^

wurde in 12o ml trockenem Pyridin gelöst. Diese Lösung wurde dann wie vorstehend■nochmals zur Trockne eingedampft. Man wiederholte dieses Verfahren zweimal, löste dann den Rückstand in 12a ml trockenem Pyridin, gab 24 g (o,12 Mol) N^r'-Dleyclohexylcarbodiimid zu und ließ die Lösung IS Stunden bei Raumtemperatur stehen. Dann gab man 12 ml Wasser zu, ließ das Gemisch 45 Minuten stehen ufld filtrierte es. Das Filtrat wurde zweimal mit je loo ml Hexankohlenwasserstoffen (Skellysolve B) extrahiert und die wässrige Schicht unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Den Rückstand mischte man mit 48o ml o,4 molarer Lithiumhydroxydlösung, kochte das Gemisch 1 Stunde, filtrierte das gekühlte Reaktionsgemische extrahierte das Filtrat zweimal mit je loo ml Äther, führte die wässrige Lösung Über 2oo ml Kationen-Austauschharz (IRC-5o) und wusch das Harz mit 4oo ml Wasser aus. Das ausfließende Material und die Waschflüssigkeit wurden vereinigt (835 ml); pH-Wert 4,7» Man stellte dann den pH-Wert durch Zugabe von 1 η wässriger Schwefelsäure auf 2,5 ein, kochte die saure Lösung 1 1/2 Stunden, engte sie unί;er vermindertem Druck auf 28o ml ein und brachte mit gesättigter Bariumhydroxydlösung auf pH 7)5· Der Bariumsulfat-Mederschlag wurde atzentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit mit 128o ml (2 Tolumteilen) Äthylalkohol verdünnt. Beim Kühlen bildete sich ein Niederschlag, der abfiltriert wurde. Der Filterkuchen wurde mit Alkohol und Äther gewar sehen und dann getrocknet. Er wog 1,62 g und bestand haipfcsächlich aus dem Bariumsalz von Sparsomyein A-5'-phosphato Auch Lithium- und Natriüsisalze waren vorhanden«, . ■ .

Man erhitzte-2 g dieses Materials iß 50 ml Wasser» filtrierte das Gemisch und brachte das Filtrat auf loo ml Dowex-lxS (Formiat-Zyklus). Jiaa entwiokelt« die Säule mit 500 ml Anteilen von o₍ol n, o_fö2 n, o»o4a w&ü o_soQm

■.'■■'■■ BAD ORIGiNAL

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Ameisensäure und fing Io ml-Fraktionen auf.Die Fraktionen■ 31-Bo wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedaijipft. Der Rückstand wurde mit Io ml Wasser verrieben und das Gemisch gekühlt. Die Sparsomycin A-5¹-phosphat (VI) - Kristalle wurden ebf11triert 236 Ag} F. 255-265⁰G (Zers.). ,

Analyse Berechnet tür -	Gefunden:	• c E	38,16} H 16,18}" F	8	V95.
		C	38,25} H 16,175 F	4 9	,06,
Präparat I

-9*« (2* _J5^l»04Bopropyliäen-ß-D.ribofuranosylj "f!-aea2apurin · V

Maß schüttete eine iiösung von 1 g 6-Merdapto-9-ß-D-ribdfuraSio8yl<-7-äeezaadeniii in 8 ml o^4 η Natriumhydroxyd Io Minuten bei etwa 24°C_t wobei man in Teilmengen o,21 ml Methyl jodid zugab. Weitere 1,3 ml o,4 η Hatriumhydrosyd wurden Zugesetzt und die Lösung T?urd© nochmals mit o_#21 ml MethylJodidgesoMlttelt. Man ließ das Reaktionsgemisch 4 Stunden bei Ramtemperatur und aneohließend Über Hechi: bei etwe ο bis 5°C 2o Stunden in einem Kühlschrank stehen. Die abgeschiedenen Feststoffe wurden abfiltriert, über Natriumhydroxyd getroclaiet, einige Minuten rait 6 ml absolut em Methanol unter Rückflußerhitzt und Tasch^agekühlt« Is bildeten sich weiße Nadeln, die abfiltriert wurden. Sie bestanden aus 6-Methylmercepto^-ß-Drribofuranosyl^-deazaadenin.

1 δ 6-Methylmercaptö*9-ß-Dfrribofiiranosyl-7-de8zaad^eniⁿi flas vorher über Kacht bei lo8°C und 0,3 mm getrocknet worden war, ?,5 g p^oluolsulfons&ure-Monohyärat und 5o jnl Aceton, das zuiror über Keliumpermanganat und anschließend über Kaliumcarbonat destilliert worden war,

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wurden gemischt und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann kühlte man das ReaktioniBgemisch unter vermindertem Druck auf 3°C. Der so erhaltene Rückstand wurde zunächst zweimal mit je loo ml siedendem Chloroform und dann zweimal mit je loo ml Chloroform von Raumtemperatur extraMert. Die Extrakte wurden einzeln filtriert, vereinigt und eingedampft. Der Rückstan wurde in 25 ml siedendem Wasser gelöst und die Lösung filtriert» Durch Kühlung des Filtfats erhielt man 6-Methylmercapto-9-(2',3'-0-isopropyliden-ßTD-ribofuranosyl)-7-deazapurin als kristallinen Niederschlag.

Ersetzt man in Präparat 2 das Methyljodid durcK ein anderes niederes Alkyljodid, etwa durch Äthyljodid, Propyljodid, Isopropyljodid, Butyl Jod id, Isobutyljodid oder dgl., so erhält man andere 6-Alkylmercapto-9-(2¹,3^r-0-isOpropyliden-ß-D-ribofuranosyl)-7-äeazapurine , v/ie 6-Äthylmercapto-9-(2 ' ,3 '-O-isopropylidenß-D-ribofursnosyl)-7-deazapurin, 6-Propylmercapto-9-(2',3'-O-isopropyliden-ß-D-rabofuranosyl)-7-deezapurin, 6-lsopropylmercapto-9-(-2' ,3 '-O-isopropyliden-ß-D-ribofuranosyl)-7-deazapürln, 6-Eutylmerc8pto-9-(2^f,3'~0-isopropyliden-ß-D-ribofuranosyl)-7-deazapurin,6-Isobutyln;erc8pto-9-(2' ,3 '-O-isopropyliden-ß-Drribof urenosyl)-7-deszspurin u. dgl.

Präparat 3

6-Hethyln:ercap_ito-9-ß-D-riLOfur8nosyl-7-äeaz8purin-5^lphosphat

Wach dem unter Präparat 1 (3) beschriebenen Verfahren phosphorylierte man S-Hethylmercapto-o-(2¹,3^f-0-isopropyliden-ß-D-ribofura-nosyl)-7-deazapurin mit ß-Cyanoäthyl-dihydrOgen-phosphet in Gegenwart von N,N'-Dlcyclohexylcarbodiimid. Das erhaltene ß-Cyanoäthylphosphet wurde mit Lithiumhydroxyd behandelt; das erhaltene Produkt wurde mit 1 η -Wassriger Schwefelsäure und

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anschließend mit Bariumhydroxyd zu 6~Methyimercapto-9-Q-J)-Tibofuranoayl^'-äeazapurin-^¹ -phosphat umgesetzt.

Nach dem unter Präparat 3 beschriebene Verfahren-'lassen sich auch andere6-AlkylmereaptO-9~ß-DTribofuranosyl-7-de a zap ur in-5'-phosphate herst eilen,ζ.Β« 6-Ät hyl-, 6-Isopropyl-, 6-Propyl-, 6-Butyl- oder 6 Isolsutylmercapto-9-i3*D-r ibof uranosyl-7-äeazapür in-5' -phosphat.

Beispiel 1 ;

Sparsomycin A~3* j5^r-cyolo~piiosphat (9~ß~IJ-Eibo.£uranosyl--.

7-äeazaaäenin-3^f ,5V-oyclö-phosphat)_o

Eine L^ösuhg von 346 mg (1 Millimol) Sparsomycin A-5^r phosphat und 293 mg {1 Millimol) 4-Morpholinyl-N,E'^räicyclohexsrlcarboxamidin in 5 ml Wasser und 2ο ml Pyridin wurde in einem Bad bei 35-^o^oG untervermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Dann gab man wasserfreies Pyridin zu und engte .die Lösung ein. Dieses Terfehren wiederholte man dreimal, um sicher zu gehen, daß das Was* ser vollständig entfernt wird. Der syrupaxtige Rückstand wurde in loo ml wasserfreiem Pyridin aufgenommen und im Laufe von...14-0 Minuten durch einen Kühler tröpfenweise zu einer siedenen Lösung von £12 mg (2,ο Millimol) Dicyelohexyl-carbodiimiu in loo ml Pyridin gegeben,- Nach der Zugabe des gesamtenÄterials wurde das Gemiscli 80 Minuten unter Rückfluß erhitzt und dann in einem Bad unter vermindertem Druck bei 4o°C eingeengt₀ Den Rückstand nahm man- in loo ml Wasser und loo ml Üther auf, entfernte die Ätherschicht, filtrierte zur Entfernung des unlöslichen Dicyclohexylharnstoi'^⁵ äi® wässrige Schicht nach 2 Stunden und.lyophilisiert^ das wassrigeviiltrat unter Gewinnung von ο,6 g eines weißen _s flaumigen Feststoffs. Bissen festen Stoff löste man in 4 ml Wässer, gab.Aktivkohle (Daroo q~6o) _zu- _uni3 filtrierte die Losung

00-9 8 3 67 ti:3 4

durch Celit.e-Diatomeenerde.

••sä Die so hergestellte Lösung wurde auf pH 2 bis 3 angel und 48 Stunden in einen Kühlschrank gestellt. Danach fil trierte man die Lösung und engte sie ein. Man erhielt 25o mg Sparsomycin-A 3',5'-oyclo-phosphatI H₂O (pH2) max.=226m*u (c 19 2oo) ; 270 (£ 875o).

Analyse

Berechnet für C₁₁H₁₃H₃O₆P.3/2 H₂O: C, 37,2; H, 4,54;

IT, 15,75; P, 8,73.

Gefunden : C, 37,22; H, 4,53;

N, 16,07; P, 8,58.

Das Produkt wird mit gereinigter Schlangengift-Phosphoä diesterase in 24 Stunden bei 37°C unvollständig zu Sparsomycin-A 5'-phosphat und/oder Sp rsomycin A-3¹-phosphat gespalten. Mit rohem Schlangengift {crotalus adamanteus) wird Sparsömycin A-3^r,5^f-G9Glo-phosphat in Sparsomycin A-3'-phosphat und Sparsomycin gespalten.

Aufgrund einer Dünnschicht-Chromatographie auf Zellulose mit ein-_m Lösungsmittelsystem ("bestehend aus Isopropanol/ konz. HH^OH/HgO - 7:1:2} ergab sich für Sparsomycln A-3',5'cyelOBphosphat ein E_f-Wert von ungefähr 0,5, während SpsrsomyGin A-5^fi-piiosphat an der ursprünglichen Stelle bleibt,·

Beispiel 2

9-ß-D-Ribofuranosyl-7-deazapurin-3* ^t-cyclo-phosphat

Eine Lösung von 34o mg 9-ß-D-Ribofuranosyl-7-deazapurin-5'-phosphat und 300 mg 4-Morpholinyl-iT,M^l-dicyelohexylcarboxamidin in 5 ml Wasser und 2o ml Pyridin wurde" in

ORfGWAL

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einem Bad unter vermindertem Druck bei 35-^0-.0 zur
Trockne eingeengt. Dann gab man wasserfreies Pyridin
zuund engte die Lösung wieder ein; dieses Verfahren wiederholte man dreimal, ."um'sicher zu gehen, daß das Wasser vollständig entfernt-wird. Der syrupart ige Rückst and .-wurde in loo ml wasserfreiem Pyridin aufgenommen und im Laufe von 14o Minuten'durch einen Kühler einer siedenden Lösung von 412 mg ( 2,ο MillimolJ Dioyclohexylcarbodiimiä in 2oo ml Pyridin zugegeben. Hach Zugabe der gesaraten Menge wurde das Gemisch 80 Minuten unter Rückfluß erhitzt und
unter -vermindertew Druck in einem Bad bei 4o°C eingeengt. Der Rückstand wurde in loo ml Wasser und loo ml Äther ausgenommen und die Ätherschicht entfernt.Nach 2 Stunden wurde die wässrige Schicht zur Entfernung des unlöslichen
Dicyclohexylharnstoffs filtriert und das wässrige Filtrat lyophilisiert. Iwan erhfelt einen weißen Feststoff, den man in 4 ml Wasser löste. Man gab Aktivkohle (Darco G-60) zu, filtrierte die Lösung durch Celite-Diatomeeneräe, säuerte die Lösung an bis der pH-Wert 2 bis 3 betrug, gab 48 Stunden in einen Kühlschrank und filtriert · Han erhielt
9-ß-D-Ribofuranosyl-7-äee2epurin-3',S'-oyclo-phosphat als weißen Feststoff.

Beispiel 3

9-ß-D-Ribofuranosyl-6-inethylKereapto-7*äeezapurin-3' »5'-cyclo-phosphat - - .

Eine Lösung von 9-ß-D^Ribofur&nosyl-6-methyir;ercapto-7-deazapurin 5*-phQsphat* uad. 4-liorpholittyl-H,Ii'-äicyclohexyi cerboxamidin In Wasser und Pyridin wurde in einem Bad bei 35 - 4o σ unter verminderteai Druck zur Trockne eingeengt. /tropfenweise

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- 2ό -

Dann wurde wasserfreies Pyrldin zugegeben und die Lösung wiederum: eingeeiwb; dieses Verfahren wiederholte man dreimal,- um sieher zu gehen, daß das Wasser vollständig entfernt wird. Der Rückstand wurde in wasserfreiem Pyridin aufgenommen und durch einen Kühler tropfenweise zu einer siedenen Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid in Pyridin gegeben. Fach Zugabe der gesamten Menge wurde das Gemisch unter Rückfluß erhitzt und dann unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde in Wasser und Äther aufgenommen und die Ätherschidht entfernt. Hach 2 Stunden wurde die wässrige Schicht zur Entfernung des unlöslichen Dircyclohexylharnstoffs filtriert und das wässrige Filtret lyophilisiert. Man erhielt einen weißen festen Stoff, den man in Wasser löste» Man gab Aktivkohle {Darco G-6o) zu und filtrierte die Lösung durch Gelite-Diatonieanerde. Die erhaltene Lösung säuerte man auf pH 2 bis ρ an und stellte sie 48 Stunden in eine'n Kühlschrank, Danach wurde filtriert und eingeengt. Man erhielt 9-ß-D-Ribofur8nosyl-6-methylmercapto-7-deazapurin-3*,5'-eyclo-phosphat«

Kach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren lassen sich auch andere 9-S-D-Rlbofuranosyl*-7-eleaz8purin-3' ,5^t-cyclo-phoßphate herstellen, wenn man ein bestimmtes 9-£*-D-Ribofuranosyl-7-deazspurin-5ⁱ-phosphat mit -eines Kondensatlonsmittel, z.B. Dialkyl- oder Dicycloalkylearbodiimid in Pyridinlösung unter wasserfreien Bedingungen unter Rückfluß erhitzt. Z»B« wurden in dieser Weise äe3*göBt^llts--9*#-Ji»Bibof«yeiioS3ri-6*hydro3C3r--7*·

9*-β·-Ί5*-

Eibofur3nosyl-'6-äthylmercapto-7-äeazapurin-3^l ,5 '-eyölophospliat, ^-ß-D-Ribofuranosyl-e-propylniercapto-V-äeBzapurin-3^f ^'-cyelp-phosphetj 9-ß~D.Ribofuranosyl-6-butyl

mercaptQ5'7--äeazapürin-3^l ^^eyclo-phosphat, H -Benzoyl-9-ß-D-ribQfuranosyl-7-deazaadenin-3^t »^'-cyclo-phosphat, N -Anisoyl-9^ß-D-ribofuranos7l-7-äeazaadenin-3^l,5^t-cyclo phosphst, Έ ■-Acetyl^-ß-D-ribo.furanosyl^-deazaade.nin-3',^'-cyclo-rrioGBhet u«

0 09836/213 Α

bad original

Claims (3)

- «■«■«■ S P R ti C H E

1) Verfahren zur Herstellung eines 9-ß-D.Ribafursnosyl· 7-deazapurin-p', 5' -cyclo-phosphat s 3er allgemeinen formel.

O OH

in der Z Wasserstoff, eine Ujäxoxy-_} Amino- oder eine Aoylaminogruppe bedeutet, deren Acylrest -2 bis 12 Ca-Atoroe enthält oder eine Mercapto- oder Alfeiylmereaptogruppe, deren Alkylrest 1 bis 4 G-Atome aufweist'_s dadurch gekennzeichnet, daß man ein 9-ß-D-Riböfüranosyl· -^'-phosphat der allgemeinen Formel

on

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BAD ORIGINAL

in der. Z die oben angegebene Bedeutung hai;, in einem basischen, wasserfreien Lösungsmittel, mit einem Dialkylcarbodiimid oder einem Cycloalkylcarbodiimid erhitzt.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von Sparsomycin A-3^f»5^f-cyclophosphat der Formel

OH

OH

Sparsomycin A-^'-dihydrogen-phosphat in einem basischen, wasserfreien Lösungsmittel mit einem Dialkylcsrbodiimid oder einem Cycloalkylcarbodiimid erhitzt.

3) Verfahren jlach Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß man als basisches, wasserfreies"Lösungsmittel wasserfreies, ^-Mopholinyl-lijM'-äicyclohexylcarboxamidin enthaltendes Pyridin und als Ή,11*- Dialkylcarbodimiid U ,iM^-DicyclohexyloarbodiiiEid verwendet»

The Upjohn Company Ealamazzo, Mich. ÜT.St.A.

Q09836/2134

Hechtsanwalt

BAD