DE1919837B2 - Leupeptine, deren Salze und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Leupeptine, deren Salze und Verfahren zu ihrer Herstellung

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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides

Description

CH3
und
R3 die Substituenten CH3 — oder CH3 — CH2
bedeuten, "=?wie deren Säureadditionssalze.
2. Verfahren zur Herstellung der Leupeptine nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß einer der folgenden Streptomyces-Stämme: Streptcmyces roseus MA839-A1 (NIHJ MC-9-42), Streptomyces roseus MB 262-M1 (NIHJ MC-11-42) oder Streptomyces roseochromagenes MA 943-M1 (NIHJ MC-10-42), in einen? Medium gezüchtet wird, das ein stickstoffhaltiges und kohlenstoffhaltiges Nährmittel enthält.
Die Erfindung betrifft Leupeptine der allgemeinen Formel
CHO
.NH
R3 — CO — NH — CH — CO — NH — CH — CO — NH — CH — (CH2), — NH — C '
(L)
NH5
worin R, und R2 den Substituenten
— CH, — CH :
CH3
CH1
und R3 die Substituenten CH3 — oder CH3 — CH2 — bedeuten, sowie deren Säureadditionssalze.
Diese Verbindungen sind wertvolle Arzneistoffe.
Wie aus der allgemeinen Formel hervorgeht, sind die beanspruchten Leupeptine Acetyl-L-leucyl-L-leucyl-DL-argininal, Propionyl-L-leucyl-L-leucyl-DL-argininal. Die Erfindung umfaßt die therapeutisch geeigneten Substanzen sowie ihre Säureadditionssalze Leupeptine eignen sich zur Inhibierung von enzymatischen Reaktionen von Trypsin, Papain, Kallikrein, Plasmin und Thrombokinase sowie zur Inhibierung einer Fibrinolyse, einer Kininbildung aus Kininogen sowie einer Blutkoagulierung. Leupeptine besitzen eine niedrige Toxizität und zeigen eine therapeutische Wirkung auf eine durch Karragenin erzeugte Entzündung in Ratten. Sie eignen sich zur Behandlung von Pankreatitis und Entzündungskrankheiten, insbesondere zur Behandlung von Entziindungskrankheiten der Haut, beispielsweise Verbrennungen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der vorgenannten Leupeptine, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Streptomyces roseus MA 839-Al (NIHJ MC-9-42), Streptomyces roseus MB 262-M1 (NIHJ MC-Il-42) oder Streptomyces roseochromagenes MA 943-M1 (NIHJ MC-10-42) in einem Medium gezüchtet wird, das stickstoffhaltiges und kohlenstoffhaltiges Nährmittel enthält, und daß die entstandenen Leupeptine von der Nährbrühe abgetrennt werden.
Die Züchtung wird submers unter aeroben Bedingungen so lange durchgeführt, bis eine merkliche Menge des Leupeptins oder an Leupeptinen in der Lösung angereichert ist.
Wie die vorstehende allgemeine Formel zeigt, existieren zwei Gruppen von Leupeptinen, die danach unterschieden werden, ob eine Acetyl- oder eine Propionylgruppe vorliegt. Im folgenden werden Leupeptine mit einer Acetylgruppe als »Leupeptin Ac« und
Leupeptine mit einer Propionylgruppe als »Leupepiin Pr« bezeichnet. Acetyl- oder Propionyl-L-leucyl-L-leucyl-DL-argininal v/ird als Leupeptin Ac-ll bzw. Pr-Li. abgekürzt.
Die Erfindung ist nachstehend in Verbindung mit den Zeichnungen näher beschrieben. Es zeigt:
F i g. 1 das IR-Absorptionsspektrum von gereinigtem Leupeptin-Pr-LL-Hydrochlorid (KBr-Preßlinge) und
F i g. 2 das IR-Absorptionsspektrum von gereinigtem Leupeptin-Aou.-Hydrochlorid (KBr-Preßlinge). Es hat sich gezeigt, daß Leupeptine von vielen Stämmen verschiedener Spezies von Streptomyces erzeugt werden. Zehn Stämme, von denen sichergestellt ist, daß sie Leupeptine erzeugen, sind nachstehend genannt: Streptomyces roseus, (2 Stämme; die Labornummern des Institute of Microbial Chemistry sind MA 839-Al, MB 2(32-Ml), Streptomyces roseochromogenes (3 Stämme, MA 943-M1, MB 456-AEl MB
26O-A2), Streptomyces charireusis (1 Stamm, MB 58- IAQl), Streptomycesalbirsticuli (1 Stamm, MB26-A1) Streptomyces thioluteus (1 Stamm, MB 321-Al), Streptomyces lavendulao (1 Stamm, MB172-A2) und Streptomyces noboritoensis (1 Stamm, MB46-AG). Die Eigenschaften dieser Spezies werden in »The Actinomycetes«, Band II (von S. A. W a k s m a n The Williams & Wilkins Company, 1961) beschrieben. Darüber hinaus wurden andere, Leupeptine erzeugende Stämme festgestellt, die in mehr als 11 Spezies eingeteilt werden müssen. Das Leupeptin-Erzeugungsvermögen ist unter Streptomyces weit verbreitet. Unter Anwendung der erfindungsgemäßen Methoden zum Testen der Aktivität sowie des Herstellungsvermögens ist es einfach, Stamm? von Streptomyces aufzufinden, die sich zur Herstellung von Leupeptinen in Kulturen und natürlichen Quellen eignen.
Eine Gärungsbrühe, die Leupeptine enthält, wird in der Weise hergestellt, daß Sporen oder Myzeln von Leupeptin erzeugenden Organismen auf ein geeignetes Medium aufgeimpft werden, worauf anschließend unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird. Die Temperatur kann innerhalb des breiten Bereiches von 23 bis 37° C schwanken, wobei innerhalb dieses Temperaturbereiches der Organismus wachsen kann. Temperaturen von 27 bis 35° C werden jedoch bevorzugt. Bei dem submersen aeroben Züchten der Organismen zur Herstellung von Leupeptinen enthält das Medium a's Kohlenstoffquelle ein im Handel erhältliches Glyceridöl oder ein Kohlehydrat, wie beispielsweise Stärke, Glykose, Glyzerin, Maltose, Dextrin, Rohrzucker, Laktose od. dgl., und zwar in reiner Form oder in Rohform, während als Stickstoffquelle ein anorganisches Material eingesetzt wird, beispielsweise Pepton, Kaseinhydrolysat, Kasein, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Aminosäuren od. dgl. Gegebenenfalls können auch anorganische Stickstoffquellen verwendet werden. Wenn auch Leupeptine in einem Medium erzeugt werden, welches diese stickstoffhaltigen Materialien enthält, so werden dennoch Pepton und Kaseinhydrolysat vorzugsweise als Stickstoffquellen zur Herstellung von Leupeptinen verwendet. Biosynthetische Untersuchungen ergeben, daß der Leucin-, Isoleucin-, Valin- und Guanidin-Anteil von Arginin zur Herstellung von Leupeptinen verbraucht wird. Daher sind ein Hydrolysat von Protein, wie beispielsweise Pepton, N-Z-Amin (Sheffield Chemical, Typ A), Kaseinhydrolysat und Hefehydrolysat Stickstoffquellen, die sich zur Erzeugung von Leupeptinen eignen.
Leupeptine sind bei neutralem und saurem pH stabil, jedoch relativ instabil bei alkalischem pH. Daher ist es zweckmäßig, den pH der Kulturbrühe nicht oberhalb 7,5 während der Gärung zu halten. Wird ein Medium, das 1,0% Glukose, 1,0% Stärke, 2,0% Pepton und 0,5% NaCl enthält, mit einem Leupeptin erzeugenden Mikroorganismus beimpft und bei 27° C unter Schütteln gezüchtet, dann wird der pH während einer Zeitspanne von 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden und 96 Stunden auf 6.0. 6,5, 7,5 bzw. 8,0 gehalten. Es werden bereits nach 24 Stunden Leupeptine erzeugt. Die maximale Ausbeute wird während einer Zeitspanne von 48 his 72 Stunden erhalten und nimmt danach ab. Die Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Kieselsäure der Kulturfiltraie zeigt einige Ninhydrin-positive Flecken, wobei unler diese Flecken diejenigen Flecken fallen, welche Leucin entsnrechen. Diese Flecken werden bis zum Verstreichen einer Zeitspanne von 48 bis 72 Stunden beobachtet und verschwinden anschließend. Dies ist ein wertvoller Hinweis auf die maximale Herstellungsperiode von Leupeptinen während der Gärung.
In einem Medium, das organische Materialien, wie beispielsweise Pepton, Kaseinhydrolysat od. dgl. enthält, werden im allgemeinen verschiedene Leupeptine gleichzeitig erzeugt. Jedoch werden Myzeln Leupeptin erzeugender Organismen bei einem Züchten in einem
ίο synthetischen Medium erzeugt, die Leucin, Leupeptin, Pr-LL und Ac-ll enthalten.
Die Methode zum Testen der Antiplasminwirkung wird wie folgt durchgeführt: Die Mischung, welche aus 0,5 ml einer Euglobulinlösung, die aus menschlichem Serum nach der von K 1 i η e (J. Biol. Chem. 204, 949, 1953) und N ο r m a η (J. Exptl. Med. 106, 423, 1957) beschriebenen Methode hergestellt wird, 0,4 ml eines 1/50 n-Phosphatpuffers (PBS) mit einem pH von 7,2 in einer physiologischen Kochsalzlösung, die ein Testmaterial enthält, und 0,1 ml einer Streptokonase-Lösung (200 Einheiten/0,1 ml PBS) besteht, wird bei 37° C 3 Minuten lang inkubiert, worauf 2,0 ml einer Fibrinogen-Lösung (2,0% in PBS) zugesetzt werden. Dann wird 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert.
Nach der Inkubation werden 1,5 ml einer 3,5 m-Perchlorsäure zugesetzt, worauf die Mischung bei Zimmertemperatur während einer Zeitspanne von 1 Stunde stehengelassen wird. Dann wird zentrifugiert und die Extinktion der überstehenden Flüssigkeit bei 280 ΐημ bestimmt. Der Prozentsatz der Inhibierung wird in folgender Weise berechnet: (a—b)/b · 100, worin α die Extinktion mit Leupeptin ist und b die Extinktion ohne Leupeptin darstellt.
Leupeptine sind bei neutralen und sauren pH-Werten stabil. Bei einem Erhitzen in einer 0,1 n-HCl-Lösung bei 95 bis 100° C während einer Zeitspanne von 30 Minuten erfolgt keine Zersetzung. Eine vollständige Zersetzung tritt allerdings dann auf, wenn 30 Minuten lang bei einer Temperatur von 95 bis 1000C in einer 0,ln-NaOH-I.ösung erhitzt wird. Werden Leupeptine in wäßrigen Lösungen mit einem pH von 9,0 bei 60° C während einer Zeitspanne von 30 Minuten behandelt, dann tritt mehr als eine 50 %ige Zersetzung auf. Daher ist es zweckmäßig, das Material während der Extraktion mit einem neutralen oder sauren Medium zu behandeln.
In der Kulturbrühe Leupeptin erzeugender Stämme liegen die Leupeptine hauptsächlich in dem flüssigen Teil vor Leupeptine sind stabil genug, um einer Verdampfung der Brühe durch Destillation unter Vakuum zu widerstehen. Aus einer derartig konzentrierten Lösung können Leupeptine durch Zugabe eines Lösungsmittels, in welchem Leupeptine praktisch unlöslich sind, ausgefällt werden, Ein derartiges Lösungsmittel muß außerdem mit Wasser mischbar sein. Beispielsweise sei Aceton erwähnt.
Allerdings ist ein Adsorptionsverfahren zur Extraktion von Leupeptin aus der Kuiturbrühe vorzuziehen. Als Adsorptionsmittel können Aktivkohle, lonenaus-
fio lauscherharze, Aluminiiimoxyd, Kieselsäure od. dgl. verwendet werden. Diese Materialien adsorbieren Leupeptine, wobei die Leupeptine erneut eluiert werden können. Beispielsweise werden Leupepline an einer Aktivkohle adsorbiert und mit angesäuertem Wasser, angesäuertem Methanol, einem angesäuerten wäßrigen Methanol oder einem angesäuerten wäßrigen Äthanol eluiert. Wird eine schnelle Eluierung gewünscht, dann ist das saure Lösungsmittel zweckmäßiger als das
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neutrale Lösungsmittel. Ein Anionenaustauscherharz dampft wird. Dabei werden gereinigte Mischungen der
ist ein geeigneteres Adsorptionsmittel zur Extraktion Hydrochloride von Leupeptinen erhalten.
von Leupeptinen. Ein poröses, schwachsaures Harz, Das am meisten gereinigte Leupeptin-Pr-Hydro-
beispielsweise Lewatit-CNP® (Farbenfabriken Bayer chlorid, das hauptsächlich Leupeptin-Pr-LL enthält,
AG) ist vorzuziehen. Das Kationenaustauscherharz 5 wie sich durch die Aminosäureanalyse ergibt (Leucin
kann in der H-, NH4-, Na- und Li-Form sowie in 1,00, Isoleucin 0,10 und Valin 0), besitzt folgende Eigen-
Mischungen aus diesen Formen verwendet werden. schäften: Weißes Pulver, das zwischen 110 und 14O0C
Wird ein Kationenaustauscherharz hi der Η-Form ver- schmilzt, [*]? — 56° (c = 1, Methanol), pKa' mehr
wendet, dann werden die adsorbierten Leupeptine lang- als 12.
sam mit verdünnter Salzsäure oder mittels eines io Analyse:
50 %igen wäßrigen Acetons eluiert. Jedoch ist ein saures CHON HCl-HO
organisches Lösungsmittel, beispielsweise eine 0,5n- "Berechnet .. C 502,95, H 8,76, O 16,16,
HCl in einem 50%igen wäßrigen Aceton oder eine N 16 98 Cl 7 16·
0,5n-HCl in einem 50-bis 80°/oigen wäßrigen Methanol gefunden ... C 51,'l3,' H 8,77,O 14,96,
für die Eluierung geeigneter. 15 N 1710* Cl 5 73
Zur weiteren Reinigung eignet sich eine Aktivkohle- ' '
Chromatographie, beispielsweise eine Adsorption der Es wird keine charakteristische UV-Absorption fest-
Leupeptine aus derwäßrigen Lösung und eineEluierung gestellt. Das IR-Spektrum zeigt eine Absorption, wel-
unter Verwendung von saurem wäßrigen Methanol. ehe Aldehyd entspricht (1720 bis 1730 cm"1), und
Eine Aluminiumoxyd-Chromatographie kann ebenfalls 20 starke Amidbenden (1650, 1540 cm-1). Das NMR-
für Reinigungszwecke verwendet werden. Die Alumi- Spektrum (100 MHz) in (CD3)8SO zeigt das Vorliegen
niumoxyd-Chromatographie wird mit Methanol, Ätha- einer N-Propionylgruppe in dem Molekül, und zwar
nol, Chloroform/Methanol, Äthylacetat/Methanol od. an Hand von Peaks bei δ 1,00 (Triplett, 3H) und bei
dgl. entwickelt. Werden Leupeptine in Methanol, Ätha- δ 2,12 (Quartett, 2 H).
nol oder in den Mischungen dieser Lösungsmittel mit 25 Das am meisten gereinigte Leupeptin-Ac-Hydro-
Wasser gelöst, dann durchlaufen die Leupeptine die chlorid, das hauptsächlich Leupeptin-Ac-LL enthält,
Aluminiumoxydsäule. Dieses Verfahren eignei sich wie .sich an Hand einer Aminosäureanalysc ergibt
zur Abtrennung von Leupeptinen von gefärbten Ver- (Leucin 1,00, Isoleucin 0,04 und Valin 0,01), besitzt
unreinigungen. Eine lonenaustausch-Chromatographie folgende Eigenschaften: Weißes Pulver, das bei 75 bis
eignet sich ebenfalls zur Reinigung von Leupeptinen, 30 110°C schmilzt, («]5— 52° (c = 1, Methanol), pKa'
beispielsweise läßt sich ein Kationenaustauscherharz mehr als 12.
in der gemischten H- und Na-Form verwenden, wobei l die Leupeptine mit 0,1 bis 0,2 n-HCl eluiert werden.
Eine Kieselsäure-Säulenchromatographie ist ebenfalls zur Reinigung von Leupeptinen geeignet. Bei- 35 spielsweise werden Leupeptine in einer Mischung aus Chloroform und Methanol (9:1) gelost, worauf das Chromatogramm mit Chloroform/Methanol (8:2) ent-
wickelt wird. p
Eine Gegenstromverteilung kann ebenfalls zur Ex- 40 spektrum festgestellt. Das IR-Spektrum ähnelt dem-
traktion oder Reinigung von Leupeptinen angewendet jenigen von Leupeptin-Pr-Hydrochlorid. Das NMR-
werden. Ein Vielstufenzentrifugalextraktor, wie bei- Spektrum (100 MHz) in (CD3)2SO (Peak bei δ 1,85
spielsweise der Polbielniak-Zentrifugalextraktor, kann (Singlett, 3 H) zeigt das Vorliegen einerN-Acetylgruppe.
für diesen Zweck verwendet werden. Der Verteilungs- Die Hydrochloride von Leupeptinen sind in Wasser,
koeffizient von Leupeptinen zwischen Butanol und 45 Methanol. Äthanol, Butanol, Essigsäure, Dimethyl-
einem Phosphatpuffer mit einem pH von 6,0 beträgt formamid und Dimethylsulfoxyd löslich und kaum
ungefähr 1. Die Extraktion von Leupeptinen mit Bu- löslich in Äthylacetat, Aceton, Chloroform, Tetra-
tanol eignet sich zur Reinigung von Leupeptinen. chlcrkohlenstoff, Äthyläther und n-Hexan.
Die Leupeptine lassen sich aus den wäßrigen Lösun- Leupeptine ergeben positive Rydon-Smith-, rote
gen als ihre Pikrate, Flavianate, Reineckate und 5-Me- 50 Tetrazolium-, 2,4-Dinitrophenylhydrazin-, Sakaguchi-
thyi-/?-naphthalinsulfonsäuresalze ausfällen. Diese Aus- Diacetyl- und Pentacyanoaquoferriat-Reaktionen unc
fällungsmethode eignet sich ebenfalls zur Herstellung negative Ninhydrin-, Jaffe-, Eisen(IIl)-chlorid-, An
von Leupeptinen. Diese Salze werden mit orga- thron-. Molisch- und Benzidin-Reaktionen.
nischen Lösungsmitteln behandelt, welche Chlor- Die Papierchromatographie von Leupeptinen nacl
wasserstoffsäure enthalten, und werden in Hydro- 55 der aufsteigenden Methode ergibt einen einzigei
Chloride von Leupeptinen umgewandelt. Nach- Flecken, der durch die Rydon-Smith-,rote Tetrazolium
stehend wird ein wirksames Verfahren zur Extraktion oder Sakaguchi-Reaktion entwickelt wird. Der Rf-Wer
und Reinigung von Leupeptinen aus einer Kultur- beträgt 0,9 bis 0,95, und zwar bei einer Entwicklun
brühe angegeben: Leupeptine werden unter Verwen- mit einer oberen Schicht aus Butanol/Essigsäure/Was
dung eines porösen Kationenaustauscherharzes mit 60 ser (4:1:5, bezogen auf das Volumen), 0,9 bis 0,9
Carbonsäuregruppen adsorbiert und mit Chlorwasser- unter Verwendung von n-Propanol/Wasser (7 : 3) un
stoffsäure/Methanol eluiert, worauf das Eluat unter 0,4 bis 0,6 bei Verwendung von Äthylacetat/Methano1
Vakuum konzentriert wird. Die konzentrierte wäßrige Wasser (4:1:1). Bei einer Hochspannungspapiei
Lösung wird einige Male mit Butanol extrahiert, wo- elektrophorese (350OV, 15 Minuten) unter Verwer
rauf der Butanolextrakt zur Trockne eingedampft 65 dung von Ameisensäure/ Essigsäure /Wassc
wird. Der Rückstand in der wäßrigen Lösung wird (25 : 75 : 900) findet man die Leupeptine in einer En
durch Durchleiten durch die Säule aus dem Anionen- fernung von 5 bis 6 cm vor dem Ausgangspunkt i
austauscherharz entfärbt, worauf der Abstrom einge- Richtung auf die Kathode. Bei einer Diinnschich
Analyse: HCl- H2O H 8,59, O 16,63,
C20H38O4N6- .. C 49,93, Cl 7,37
Berechnet . N 17,47, H 8,57, O 16,42,
.. C 50,34, Cl 5,27
gefunden . N 16,03, charakteristisches UV-Absorptions
Es wird kein
Chromatographie unter Verwendung von Kieselgel G (Merck) ergeben Leupeptine einen einzelnen Flecken bei einem Rf.-Wert von 0,6 bis 0,7 bei Verwendung von n-Propanol/Wasser (7 : 3), 0,2 bis 0,4 bei Verwendung von Chloroform/Methanol (7 : 3), 0,2 bis 0,3 bei Verwendung von Aceton/Wasser (1:1) und 0,3 bis 0,4 bei Verwendung von Äthylacetat/Essigsäure/Wasser (60 : 17: 17). Leupeptine Pr und -Ac lassen sich nicht durch Papier- und Dünnschicht-Chromatographie sowie durch Hochspannungspapier-Elektrophorese unter den vorstehend angegebenen Bedingungen unterscheiden. Bei der Dünnschicht-Chromatographie an Kieselgel G unter Verwendung von Butanol/Butylacetat/Essigsäure/Wasser (4:2:1: 1, bezogen auf das Volumen) als Entwicklungsmittel werden die Leupeptine Pr und -Ac getrennt. Jedes dieser Leupeptine ergibt zwei Flecken mit folgenden Rf.-Werten: 0,45 bis 0,50 und 0,35 bis 0,45 für Letipcptin Pr und 0,35 bis 0,45 und 0,30 bis 0,35 für Leupeptin Ac. Der Extrakt aus beiden Flecken läßt sich in Form von 2 Flecken bei Anwendung der gleichen Dünnschicht-Chromatographie nachweisen.
Leupeptin Pr-LL-di-n-Butylacetalhydrochlorid ist ein weißes Pulver, das bei 70 bis 900C schmilzt. [«]%-46o (c = 2, Methanol), pKa' mehr als 12.
Analyse:
C29H58O5N6
Berechnet
gefunden
HCl · H2O
.. C 55,70, H 9,83, O 15,35,
N 13,44, Cl 5,67;
.. C 55,73, H 9,68, 0 14,43,
N 13,56, Cl 5,86.
Die Molekülformel wird zu C29H58O5N6 ermittelt, und zwar durch den Stammpeak m/e = 570 in dem Massenspektrum.
Leupeptin Pr-LL-di-n-Butylacetalpikrat ist ein gelbes kristallines Pulver mit einem Schmelzpunkt von 60 bis 900C.
Analyse:
C29H58O5N6 · C6H3O7N3
Berechnet ... C 52,55. H 7.69, O 24,00, N 15,76; gefunden ... C 52,32, H 7,80, O 24,80, N 15,43.
Leupeptin Ac-LL-di-n-Butylacetalhydrochlorid ist ein weißes Pulver. F. 70 bis 900C, [a]S'-43° (c = 2, Methanol), pKa' mehr als 12.
Analyse:
C28H56O5N6 HCl-1/2H2O
Berechnet... C 55,84, H 9,71, O 14,61,
N 13.96, Cl 5,89:
gefunden ... C 56,03, H 9,67, O 14,77,
N 13,68, Cl 6,16.
Die Molekülformel ergibt sich aus dem Hochauflösungsmassenspektrum des Hydrochloride: Berechnetes Molekulargewicht für C28HseOsNe: 556,431; gefunden: m\e 556,429 ± 0,003.
Leupeptin Ac-LL-di-n-Butylacetalpikrat ist ein gelbes kristallines Pulver. F. 60 bis 1000C.
Analyse:
C28H58O5N9 · C6H3O7N3
Berechnet ... C 51,96, H 7,57, O 24,43, N 16,04; gefunden ... C 51,78, H 7,51, O 25,17, N 15,67.
Leupeptin-Pr- und -Ac-di-n-Butylacetalhydrochloride besitzen keine charakteristische UV-Absorption.
Die IR-Spektren zeigen eine starke Absorption bei 1070 cm \ die dem Acetal zugeschrieben wird. Bei der Durchführung einer Dünnschicht-Chromatographie unter Verwendung von Kieselgel G und Butanol/Butylacetal/Essigsüure/Wasser (4:2:1:1) ergeben Leupeptin-Pr-di-n-Butylacetal und -Ac-di-n-Butylacetal jeweils einen einzigen Flecken mit einem Rf.-Wert von 0,65 bzw. 0.60.
Die gereinigten Leupeptine besitzen eine Antiplasminakthität und zeigen eine Inhibierung von Trypsin, Papain und Kallikrcin, jedoch nicht von Chymotrypsin. Die 50%igen Inhibierungskonzentrationen von Leupeptinen werden in folgender Weise erhalten: Durch proteolytisehi. Hydrolyse von Fibrin durch Plasmin, von Kasein durch Trypsin und Hämoglobin durch Papain bei 6 meg ml, 2 mcg/ml und 0,15 mcg/ml Leupeptinen und estcrolytische Hydrolyse von p-Toluolsulfonyl-L-argininmethylester (TAME) und a-N-Benzoylargininäthylester (BAl F.) durch Plasmin, Trypsin oder Kallikrein bei 65 bis 85 mcg/ml Leupeptinen. Die Art der Inhibierung von Leupeptinen verläuft in Konkurrenz zu der Hydrolyse von TAME durch Trypsin und Hämoglobin durch Papain. Die Leupeptine inhibieren eine Blutkoagulierung bei Menschen, Kaninchen, Katzen und Rindern. Die Inhibierung einer Koagulierung des Blutes von Mäusen, Ratten und Hunden ist sehr schwach. Diese Wirksamkeit von Leupeptinen wird mit Trasylol, Trypsin-Inhibitor, trans - 4 - Aminomethylcyclohexancarbonsäure (t-AMCHA) und ε-Aminocapronsäure (ε-ACA) verglichen. Leupeptine, Trypsin-Inhibitor und Trasylol haben sich als wirksame Inhibitoren gefsnüber Plasmin und Trypsin erwiesen. Die inhibierende Wirkung von Leupeptinen ist um das lOOfache stärker als diejenige von ε-ACA und um das 20fache kräftiger als diejenige von t-AMCHA auf das Piasminsystem. Leupeptine sind wirksame Inhibitoren gegen eine Thrombokinasc, jedoch nicht gegen λ-Chymotrypsin. Trasylol vermag nicht eine Thrombokinase zu inhibieren, ist jedoch ein wirksamer Inhibitor gegen Λ-Chymotrypsin. Leupeptine zeigen ferner eine inhibierende Wirkung gegenüber einer Carrageenin-Entzündung in Ratten. Eine intraperitoneale Injektion von mehr als 6,25 mg/kg von Leupeptinen oder eine orale Verabreichung von mehr als 12,5 mg/kg an Ratten inhibiert eine Entzündung der Fußpolster, welche durch eine subkutane Injektion von 0,05 ml einer l,0%igen Caarageenin-Lösung erzeugt worden ist. Leupeptine werden gut auf oralem Wege absorbiert. Werden 1000 mg/kg auf oralem Wege an Ratten verabreicht, dann wird der höchste Blutgehalt von ungefähr 200 mcg/ml in dem Serum nach 1,5 Stunden festgestellt, während 2400 mcg/ml in dem Urin nach 3 bis 5 Stunden ermittelt werden. Insgesamt ungefähr 40% der verabreichten Leupeptine werden aus dem Urin wiedergewonnen. Die LD50 sind wie folgt: Mäuse 118 mg/kg durch intravenöse Injektion, 1405 mg/kg durch subkutane Injektion, 1550 mg/kg auf oralem Wege; Ratten: 125 mg/kg durch intravenöse Injektion, > 4000 mg/kg durch subkutane Injektion, > 4000mg/kg a'if oralem Wege; Kaninchen 35 mg/kg durch intravenöse Injektion, 300 mg/kg durch subkutane Injektion, > 1500 mg/kg auf oralem Wege.
B e i s ρ i e 1 1
Streptomyces roseus MA 839-Al wird bei 27°C während einer Zeitspanne von 71 Stunden in 85 Kolben (eingenommenes Volumen in einem Kolben: 125 ml)
509 504/403
gezüchtet, wobei die Kolben mittels einer sich hin- und herbewegenden Schüttelvorrichtung (130 Bewegungen/Minute) geschüttelt werden. Das Medium enthält 1% Glukose, 1% Stärke, 2% Polypepton (Daigo Eiyo Co.) und 0,5% Natriumchlorid und wird unter Verwendung von 2n-Natriumhydroxyd auf einen pH von 7,0 eingestellt. Ein vegetatives Inokulum,das 2Tage lang in dem gleichen Medium gezüchtet worden war, wird in einer Menge von 1 Volumenprozent verwendet. Die Kulturbrühe wird gesammelt (10 1, Antiplasminaktivität: ID50 0,015 ml/ml) und zentrifugiert, und zwar bei 3000 Upm während einer Zeitspanne von 10 Minuten. Der überstehenden Flüssigkeit (91, pH 7,3) werden 135 g Kohle (Wako Pure Chem.) zugesetzt. Nach einem 30 Minuten dauernden Rühren wird die Kohle durch Filtration abgetrennt und mit 6 1 Wasser gewaschen. Dann erfolgt eine Eluierung mit 1500 ml und 1200 ml eines sauren 80%igen Methanols (pH 2, eingestellt unter Verwendung von 2n-Chlorwasserstoffsäure). Das aktive Eluat wird mit »Amberlite® IR 45« (OH-Form) neutralisiert und bis zur Trockne eingedampft. Dabei fallen 22 g eines bräunlichen Pulvers an (Antiplasminaktivität: ID5095 mcg/ml, Aktivitätsausbeute·. 38%). Das bräunliche Pulver wird in 500 ml Wasser (pH 7,0) gelöst und auf eine Kohlesäule (Wako Pure Chem., 110 g) geschüttet. Die Säule wird mit 2 1 Wasser und 2 1 einer 0,02n-Salzsäure gewaschen und mit einer O,O2n-Salzsäure in 80% Methanol eluiert. Das Eluat wird mit »Amberlite® IR 45« (OH-Form) neutralisiert und zur Trockne eingedampft. Dabei werden 8,9 g eines gelblichen Pulvers (Antiplasminaktivität: ID50 53 mcg/ml, Aktivitätsausbeute: 72%) erhalten. 7,5 g des gelblichen Pulvers werden in 50 ml Methanol gelöst und auf eine Aluminiumoxydsäule (Woelm, sauer, 750 g) gegossen. Die Säule wird mit Methanol entwickelt. Das Eluat, das positive Rydon-Smith-, Sakaguchi- und rote Tetrazolium-Reaktionen liefert, wird zur Trockne eingedampft. Dabei werden 2,3 g Leupeptinhydrochioride erhalten (Antiplasminaktivität: ID50 12 mcg/ml, Gesamtaktivitätsausbeute: 24%).
Beispiel 2
Streptomyces rossus MA 839-Al wird in einem 20001-Gärgefäß (eingenommenes Volumen: 1500 1) gezüchtet. Das Medium enthält 2% Glukose, 1% Stärke, 2% Pepton, 0.5% NaCl und 0,2% KH2PO, und ist bei 110°C während einer Zeitspanne von 30 Minuten sterilisiert worden. Ein vegetatives Inokulum, das 48 Stunden lang in dem gleichen Medium gezüchtet worden ist, wird in einer Menge von 0,13 Volumenprozent verwendet. Die Temperatur wird bei 27°C gehalten. Die Luftströmungsgeschwindigkeit wird konstant auf 1500 1 pro Minute eingestellt, während mit einer Geschwindigkeit von 200 Upm gerührt wird. Die Kulturbrühe (15001, pH 7,15, Antiplasminaktivität: ID50 0,015 ml/ml) wird nach 53.5 Stunden gesammelt und unter Verwendung von 45 kg Dicalite® als Filterhilfsmittel filtriert. Das Filtrat wird durch eine mit Lewatit® CNP-Harz (Farbenfabriken Bayer AG, pH 6,0 unter Verwendung von Natriumhydroxyd, 1801) gefüllte Säule geschickt. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und mit 300 i 1 n-Chlorwasserstoffsäure in 80% Methanol und 2001 einer 0,2 n-Chlorwasserstoffsäure in 80% Methanol eluiert. Das aktive Eluat (565 1) wird auf einen pH von 5,2 unter Verwendung von 6n-Natriumhydroxyd eingestellt und auf 901 konzentriert Das Konzentrat wird mit 801 Butanol extrahiert, worauf der Extrakt zur Trockne eingedampft wird. Dabei werden 979,1 g eines bräunlichen Pulvers (Antiplasminaktivität: IDr10 13 mcg/ml, Aktivitätsausbeute: 75%) erhalten.
164 mg des bräunlichen Pulvers in 2 ml Wasser werden entfärbt und mittels Harzchromatographie unter Verwendung von Dowex* 1 -2 100 bis 200 mesh, Cl-Fonn, 10 ml), wobei mit Wasser entwickelt wird, gereinigt. Das Eluat, das positive Rydon-Smith- und ίο Kasaguchi-Reaktionen ergibt, wird zur Trockne eingedampft, wobei 126 mg eines weißen Pulvers aus Leupeptinhydrochloriden anfallen (Antiplasminaktivität: ID50 11 mcg/ml, Aktivitätsausbeute: 91%).
»5 Beispiel 3
Trennung der Leupeptin-Pr- und -Ac-di-n-Butylacetale
19,2gderLeupeptinhydrochloride(IDso: 15 mcg/ml)
werden in 270 ml Butanol 2 Stunden lang am Rückfluß gehalten. Die Butanollösung wird mit 270 ml Wasser gewaschen und zur Trockne eingedampft. Dabei werden 23,4 g eines Rohpulvers erhalten. 14.0 g des Rohpulvers werden in 20 ml Buianol/Butylacetat/'Es-
sigsäure/Wasser (4:8:1:1) aufgelöst und' einer Säulenchromatographie (Kieselsäure, Mallinckrodt. 900gl unterzogen, wobei mit dem gleichen Lösungsmittel entwickelt wird. Das erste Eluat (150 ml), das Rydon-Smith- und Sakaguchi-Rcaktionen ergibt, wird zur
Trockne eingedampft. Dabei werden l."5g Leupeplin-Pr-di-n-Butylacetalhydrochlorid in Form eines weißen Pulvers erhalten. Das zweite Eluat (500 ml) wird zur Trockne eingedampft, wobei 5,3 g einer Mischung anfallen, die Leupeptin-Pr- und "-Ac-di-n-Butylacetal
(Hydrochlorid) enthält. Das dritte Eluat (1400 ml) wird zur Trockne eingedampft. Dabei werden 3,4 g Leupeptin-Ac-di-n-Butylacetalhydrochlorid in Form eines weißen Pulvers erhalten.
B e i s ρ i e 1 4
Leupeptin-Pr-Hydrochlorid
93 mg Leupeptin-Pr-di-n-Biitylacetalhydrochlorid werden in 5 ml einer 0,01 n-Chlor'wasscrstoffsäure ge·
lost und 3 Stunden lang auf 60D C erhitzt. Die Lösung wird unter Verwendung von Amberlite* IR 45 (OH-Form) auf einen pH von 6,0 neutralisiert und zui Trockne eingedampft. Dabei werden 72 mg Leupcptin-Pr-Hydrochlorid in Form eines weißen Pulvers erhalten (ID50: 8 mcg/ml).
Beispiel 5 Leupeptin-Ac-Hydrochlorid
1,0 g Leupeptin-Ac-di-n-Butylacetalhydrochlorid wird in 50 ml einer 0,01 η-Chlorwasserstoffsäure gelösi und nach der im Beispiel 4 beschriebenen Arbeitsweise behandelt. Auf diese Weise wird ein weißes Pulvei aus Leupeptin-Ac-Hydrochlorid (800 mg, ID50:12mcg/
do η») erhalten.
Beispiel 6 Leupeptin-Pr-di-n-Butylacetalpikrat
Einer Lösung von Leupeptin-Pr-di-n-Butylacetalhydrochlorid (48 mg) in 2 ml Wasser werden 31 mg Natnumpikrat in 1 ml Wasser bei 40 bis 5O0C zugesetzt. Nachdem die Mischung über Nacht bei Zim-
mertemperatur stehengelassen worden ist, wird der ölige Sirup durch Dekantierung abgetrennt und unter vermindertem Druck getrocknet. Der Rückstand wird mit 2 ml kalten Wassers gewaschen, wobei 50 mg eines gelben kristallinen Pikrals von Leupeptin-Pr-di-n-Butylacctal erhalten werden. Das Pikrat wird mit heißem Wasser umkristallisiert.
Beispiel 7
Leupeptin-Ac-di-n-Butylacetalpikrat
Einer Lösung von Leupeptin-Ac-di-n-Bulylacetalhydrochlorid (100 mg) in 2 ml Wasser werden 88 mg Natriumpikrat in t ml Wasser bei 40 bis 500C zugesetzt. Ein gelbes kristallines Pikrat von Leupeptin-Acdi-n-Butylacetal (109 mg) wird nach der im Beispiel 6 beschriebenen Arbeitsweise erhalten.
Beispiel 8
Ein Leupeptin erzeugender Stamm (Streptomyces roseus MA 839-Al) wird 48 Stunden lang unter Schütteln unter Bedingungen gezüchtet, die den im Beispiel 1 beschriebenen ähnlich sind. Das Myzel wird aus der Kulturbrühe (375 ml) durch Zentrifugieren abgetrennt und mit 80 ml einer sterilisierten physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. 7,0 bis 7,8 g des erhaltenen feuchten Myzels werden in 26 ml sterilisiertem Wasser suspendiert. 2 ml der Suspension werden auf 30 ml eines synthetischen Mediums aufgeimpft, das 0,2",, NH4NO3, 0,1 "/,K2HPO4, 0.05",, MgSO1 · 7H„O, 0,05 °o KCl, 0,001% FeSO4-7H2O, 1,0°,, Glukose, 1,0",, Stärke und eine Mischung aus Aminosäuren (3,05 mMol i.-Leucin, 0,61 niMol l.-lsolcucin, 0,70 mMol l.-Prolin und 0,23 mMol i.-Arginin) enthält,|worauf 24Stunden langbei 27°C geschüttelt wird. Die Reaktionsmischung wird filtriert und an Ambcrlitc* IRC 50-Harz (5 ml der Η-Form), eingefüllt in eine Säule, adsorbiert. Die Säule wird mit 50 ml eines 50"„igen wäßrigen Acctons gewaschen und mit 0.5 n-HCl in einem 50%igen wäßrigen Aceton cluiert. 15 ml des Eluats werden mit Amberlite® IR 45 (OH-Form) neutralisiert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 1 ml eines 80%igen Methanols gelöst und auf eine mit 5 g eines sauren Aluminiumoxyds gefüllte Säule gegeben. Die Entwicklung erfolgt mit 25 ml Methanol. Das aktive Eluat (5 ml) wird konzentriert und auf eine Dünnschicht-Chromatographie-Platte (Silicagel G) punktweise aufgebracht. Die Platte wird mit einer Mischung aus Chloroform und Methanol (4:1) entwickelt. Die Leupeptine werden mit Methanol aus dem Kiesclgel, das an einer Stelle gesammelt wird, die einem Rf.-Wert von 0,15 bis 0,30 entspricht, extrahiert. Die Methanollösung wird zur Trockne eingedampft, wobei 1,2 mg eines aus Leupeplinen bestehenden weißen Pulvers anfallen. Antiplasminaktivität: ID50 10 mcg/nil. Die Aminosäureanalyse des sauren
ίο Hydrolysate (Molverhältnis) ergibt 1,13 Leucin, 0,12 Isoleucin, 0,09 Prolin, Spuren Arginin und 0 Valin.
Bei der Durchführung eines Experiments, das dem
vorstehend beschriebenen ähnlich ist, wobei 2,96mMol ι-Leucin, 0,57 mMol i.-lsoleucin und 0,65 mMol L-Prolin als Mischung von Aminosäuren verwendet werden, werden 0,6 mg an Lcupeptinen erhalten. Die Aminosäureanalyse ergibt 1,16 Leucin, 0,10 Isoleucin und 0,06 Prolin.
Werden 3,05 mMol L-Leucin, 0,7 mMol L-Prolin und 0,23 mMol i-Arginin als Mischung von Aminosäuren verwendet, dann werden 2 mg Leupeptine erhalten. Die Aminosäurcanalyse ergibt 1,39 Leucin, 0,01 Isoleucin und 0,10 Prolin.
Auf Grund der vorstehend beschriebenen biologisehen Wirksamkeiten eignen sich Leupeptine sowie ihre Salze zur Behandlung von verschiedenen Entzündungskrankheiten. Zur Behandlung von Pankreatilis werden Leupeptine in einer sterilen Formulierung subkutan, intramuskulär, intravenös oder oral verabreicht. Zur Heilung von Hautkrankheiten können Leupeptine als Paste, Creme, Lösung oder Suspension verwendet werden.
In den Rahmen der Erfindung fallen auch die Säureadditionssalze von Leupeptinen mit organischen und anorganischen Säuren, wie beispielsweise Chlorwasscrstoffsäure, Schwefelsäure, Bromwasserstoffsäure. Jodwasscrstoffsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Zitronensäure, Apfelsäure. Weinsäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Ascorbinsäure. Essigsäure, Pikrinsäure, Phytinsäure, Le\opimarsäure-6.8a-cis-endobernsteinsäure, Sulfaminsäure, Glykolsäure und Mandelsäure. Für therapeutische Zwecke greift man auf Salze nichttoxischer Säuren zurück, wobei jedoch auch Salze toxischer Säuren, beispielsweise von Pikrinsäure, zur Durchführung von lsolicrungsmethoden geeignel sind, beispielsweise zum Ausfällen aus wäßrigen Lösungen sowie für Desinfektionszwecke, bei welcher eine Toxizität ohne Bedeutung ist.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Leupeptine der Formel
CHO
R3-CO-NH-CH-CO-Nh-CH-CO-NH-CH- (CHu)3 — NH — C'.
worin R1 und R2 den Substituenten
/CH3
— CH2 — CH,
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1292846A (en) * 1968-11-21 1972-10-11 Zaidan Hojin Biseibutsu A process for the synthesis of leupeptins and their analogues
JPS5022116B1 (de) * 1970-04-28 1975-07-28
US4059573A (en) * 1973-08-01 1977-11-22 Glaxo Laboratories Limited Extraction of N-blocked amino acids from aqueous media
US3971736A (en) * 1975-01-21 1976-07-27 Merck & Co., Inc. Cathepsin in D inhibitors
US4066507A (en) * 1976-10-13 1978-01-03 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Process for producing l-leupeptins
JPH02342B2 (de) * 1980-09-19 1990-01-08 Nippon Kayaku Kk
US7989173B2 (en) * 2006-12-27 2011-08-02 The Johns Hopkins University Detection and diagnosis of inflammatory disorders
US7931896B2 (en) * 2006-12-27 2011-04-26 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treating inflammation and auto-immune diseases
US20090142342A1 (en) * 2006-12-27 2009-06-04 Johns Hopkins University B7-h4 receptor agonist compositions and methods for treating inflammation and auto-immune diseases
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E77 Valid patent as to the heymanns-index 1977
8339 Ceased/non-payment of the annual fee