DE1919837A1 - Therapeutisch geeignete Verbindungen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Therapeutisch geeignete Verbindungen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung

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DE1919837A1 DE19691919837 DE1919837A DE1919837A1 DE 1919837 A1 DE1919837 A1 DE 1919837A1 DE 19691919837 DE19691919837 DE 19691919837 DE 1919837 A DE1919837 A DE 1919837A DE 1919837 A1 DE1919837 A1 DE 1919837A1
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

Sob/Gl M 1?69
ΖΑΙΜΗ HOJIN BISSIBUSSU KAGAKU KBNKTU KAI, Shinagawa~ku, Soldo / Japan
Therapeutieoh geeignete Verbindungen sowie Verfahren su ihrer Herstellung
Die Erfindung betrifft eine neue wertvolle Gruppe von Substansen, die £eupeptine genannt werden. Die Struktur dieser Substanzen lässt eich durch die folgenden Formeln wiedergeben:
R2 H1 OHO
I* I1 I
5-CO-NH-0H-0O-HH-0h-0O-HH-OH-(CH2)3-lIH-Ov
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- 2 «
CH, CH, «w
, -CH2-CH ρ -CH-CH2-CH3
/0Η5 Ltupeptin-Ao-LLl R3VOH3-, R^ ,Hg—CHp-OH
CH, leupeptin-Pr-LL: R3SCH3-CH2-* R1 ,Ega-CHg-CH
X1
Wie aus diesen Formain hervorgeht, sind Xoupdptine Aoetyl-L-
9 Propionyl-
arginlnal und deren Analoge, ^sbti 1 $üm? 2 Ij^isiiöin mit L-Ieoleuoin und/oder L-YaIin sQ^stltulert 1st hsv, sind· Sie Erfindung betrifft Leupep^in-j sovie deren Hero teilung. Insbesondere befasst sich &l® !bindung mit Verfahren zu Ihrer Herstellung duroh Gärung sowie mit Methoden zur Gewinnung und Eeinigung, Die Erfindung umfasst die therapeutisch geeigneten Subetansen sowie ihre Säareaddiiionsßalze als Ronkons9ii$?atef als gereinig·» te Feststoffe flowie in reiner Form. Leupeptine eignen sloh zur Inhibierung von eneymatischen Reaktionen ττοη Tr^^ain, Papain, Kallikrein, P.laomin und Shsomboklnase sowie zur Ishibierimg einer Fibrinolyse, einer Kininbildung aus Kininogen sowie einer Blutkoaguliorung. Lsupeptine besitzen eine niedrige Zoxißität und sseigen eine therapeutic nhe Wirkung auf eine duroh Carrageo nin erseugte EntsUndung in Ratten. Sie eignen ο ich sur Behandlung von Pankroatitie und EntellnÄungskreii ^slter 7 i@eb@sondere zur Behandlung von SntsUndiuigskranlcheiten der Fa-it, belsplels» weise Verbrennungen.
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Vit ana des vorstehend geseiften Strukturen hervorgeht, *xletieren SiMi Oruppen von Leupeptlnen, und «war Je naohde«, ob •in· Acetyl- oder Propionylgruppe vorliegt» Srfindungsgeaise «lxt Levpeptin ait einer Aoetylgruppe al· Leupeptin Ao rod L»upeptin alt einer Propionylgrupp· ale Ltupeptin Pr bt«tiohn#t. Aoetyl- oder Propionyl-L-ltuoyl-L-leuoyl-DL-argininal wird al· Ltupeptln Ao-IL bsv. Pr^Ut abgtkttret.
Si· rigBrext 1 und 2 eind Ι«ττ·η der Xnirorotepaktran d·· a« Bftietux gereinigten Leupeptin Pr-LL-Hydroohlorida wa& Letipeptin Ao-ü-Hydroohlorlde, tmd ever geneaeeii ale Ialiuebromid-Tablette.
Dureh die Erfindung worden therapeutisch geeignete Verbindungen oder Mischungen dieser Verbindungen but Verfügung gestellt» die aue Leupeptinen sit den oben angegebenen Strukturen bestehen· Fernes füllt in den Halmen der Erfindung die Schaffung eines Verfahrens «ur Herstellung von Leupeptinen» wloheo darin besteht t dass ein Stam von Streptoayoes in einem wtteerigen Mediüa gezUohtot wird, dae stickstoffhaltige Haterialien enthält, wobei die Züchtung snbmers unter aeroben Bedingungen solange durchgeführt wird, bis eine merkliche Menge eines Loupeptine oder an Leupeptinen in der Löeung angereichert worden 1st.
Es hat sieh herausgestellt9 dass Xieupeptine von vielen Stammen verschiedener Species von Streptonyoes orseugt werden· Zehn Stttaue, von denen sichergestellt ist» dass sie Leupeptine erseugen» werden naohetahend klaeeifiaierti Streptonyoes xoeeue, (2 StUnnaej die Labomumiaern des Institute of Kiorobial Chemistry sind HA839-A1, MB262-K1)» Streptomyoee roseoohrodiogeneo (3 St&nmo, MA945-K1, MB456-AB1, HB260-A2), Streptomyces ohartreusis (1 Stand, MB58-M(H)f Strepf@i^e©e albiretiouli (1 Staam, HB26-Al)t StreptoBjroes thiolut@ue ('■
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HB321-Al), Streptiomycee lav&ndulao (1 iiiainni, ΚΒ172-Λ2) und Streptomyoes noboritoeneic (1 Steam, ΪΙΒ46-ΑΟ). Sie Eigen* schäften dieser Speeies v/erden in "She Acti&omyeetee", Band ZI (von S.A. Wakeman, The Williams & Willcine Company, 1961) beschrieben· Darüber hinaus wurden andere, leupeptine-erzeugendo Stamzae festgestellt, die in mehr als 11 Spesiee eingeteilt werden rattssen. Das Leupeptln^rjEeugungsvermugen ist unter Streptomyoos weit verbreitet. Unter Anwendung der erfindungegeinäs6<m Methoden zum Te ο ten der Aktivität sowie des Hers ιοί lunge Vermögens ist ee einfacht Stßrame von Streptomyoes aufzufinden, die aioh cur Herstellung von Leupeptinen in Kulturen und natürlichen Quellen eignen*
Eine eäruttgabrUhe» die Lsupeptine enthält, wird in der Weise hergestellte dass Sporen odor liyzeln von Leüpeptin-erzeugenden Organ!tiiaon auf ein geeignetes HediUB aufgeimpft werden, vorauf onsoliliessond imter aeroben Bedingungen gezüchtet wird. Di« Temperairui? Kann innorlia2.b des breiten Beroiohee von 23 -.. 370O wobei imiorlxalb Sieees Semporaturboroiöh^e der waohaen kimu, Äempöraturen voa 27 - 35*0 w&x&en doch Ifovorßugt. Bei dem ßubms^oen aeroben ZUoiit©» men zur Herstellung von Loupoptiaon exithtllt das Medium aid .
©in im Handel ©rJiUltlichee Glyoeridöl oder
StUrke, ölykoaer aiyser Laktoe© ofler dorgloiohon« und
ia r©iaer Fosm oäo.? ia Rohfona, während als Stiekstoffquella oia auorgahißches Material eingesetzt wird, beiepiels Peptffn, Eaßeiahyärolyeat, K&&&i.n9 Hafeextrakt, Flelooh
Süjabolmenmehi, Erdnusociohl t AminosStirsn oder gleiohon. ffegebenenfalle 2ruimen ειιοΐι anorganische quollon verwendet werfleii. Wonn auoh Lsupeptiae in einem Medium erzeugt werden, welches diese stickstoffhaltigen Materialien so werden, dennoch Poptoja und S!&oeinhydro2.vsat
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BAD ORiGJNAL
welee ale Stioketoffquellen sur Herstellung Ton Leupeptinen verwendet. Bioeynthetieohe Untersuchungen ergeben, daee der Ieuoin-, Isoleucin«» Valin- und Guanidin-Anteil τοη Arginin •uv Herstellung τοη Leupeptinen Terbrauoht wird. Daher eind •IB Hydrolysat τοη Protein, wie beispielsweise Pepton, 1-2-Asia (Sheffield Ohemloal, Iyp A)» Iaeelnbydrolyeat und Hefehydrolyeat Stioketoffquellen, die eioh but Srseugung τοη Leupeptinen eignen«
Leupeptine sind bei neutralem und saurem pH stabil» j t do oh relativ instabil bei alkaliaoben pH. Daher iet es «veokeMseig, den pH der Kulturbrtlhe nioht oberhalb 7,5 während der Gärung itt halten. Wird ein Medium* das I9O £ Glukose, 1,0 £ StBrke, 2,0 t Pepton und 0,5 3* HaOl enthält, mit einem leupeptinerseugenden Mikroorganismus beimpft und bei 270C unter Schütteln gestlohtet» dann wird der pH während einer Zeitspanne Tön 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden und 96 Stunden auf 6,0, 6,5, 7,5bsw. 8,0 gehalten. Bs werden bereite naoh 24 Stunden leupeptine orseugt« Sie maximale Ausbeute wird während einer Zeitspanne von 48 - 72 Stunden erhalten und nimmt danach ab. Die DOnnsohiohtohromatögraph|.e unter Verwendung τοη Kieselsäure der Kulturfiltrate seift einige Sinhydrin-poeitive Pleoken, wobei unter diese Hecken diejenigen flecken fallen, welche Leucin, I β öl ouo in und Valin entsprechen· Bleue Pleoken werden bis ium Verstreichen einer Zeitspanne von 48-72 Stunden beobachtet und Tersohwisden ansohlieesend· Dies ist ein wertvoller Hinweis auf die maximale Herstellungoperiode τοη Ltupeptinen während der Gärung·
In einem Kedlum, das organische Materialion, wie beispielsweise Pepton, Kaselnhydrolysat oder dergleichen enthält, werden im allgemeinen verschiedene Leupeptino gleichseitig erseugt. Jedooh werden Hyieln Lcupeptin-erseugender Organismen bei einem züchten in einem synthetischen Medium er Beugt, die Leu-
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oln, Leupeptin, Fr-LIi und Ao-LL enthorton, Werden anstell® mm Leucin Valin odor Isoleuoin sugesetst, dann werden Benpeptine erhaltenv welche diese Aninofläuren enthalten.
Die Methode ium Testen der AatiplasBinwlrkung wird wie folgt . durchgeführt f Die Mischung, welohe aus 0,5 al einer Euglobulin« lösung, die aus menschlichem Senim nach der von Kline (J.Siol, Ones. 204» 949» 1953) und Honaan (J.Exptl.Hed. 106, 423» 1957) beschriebenen Methode hergestellt wird» 0,4 al eines 1/50 n-Pliosphatpuffers (PBS) alt einem pH ton 7*2 in einer physiolofieohen leohealslSaung, die ein Sestaaterial enthalt, und O91 «1 eines Streptokinaee~X8sung (200 Einheiten/0,1 al PBS) Isetehtf wird bei 370O 3 Minuten lang inkubiert» worauf 2,0 ml einer fibrinogen-Iiuoung (2,0 i> in PBS) sugee@tst werden, Dann wird 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Haoh ühv Irumbation werden 1,5 al einer 3,5 m-Perohlorsäure «agesetst, wöranf §i© Mischung bei Zimmertamparatur ι-ΐ!Ρ: "ew.u @in@r ^eitepaim 1 Stunde etehengelasson wird, Bann td.rd sentrlftigiert . die Extinktion der ttberstohfraüen 91Ue©igkeit bei 28O rap. b@« stiBBit· Der Projsenfcoatz ä#r Inhibieswig wird in folgender berechnet ι (a-b)/b χ 100, worin a die Extinktion mit ist und b die Extinktion ohne Leupeptin darstellt.
Leupeptine sind bei neutralen und sauren pH-Wertsn etebil. Bei einen Irhitien in einer 0» in-HCl-Löouag bei 93 - 100°0 wüirend einer Zeitspenne von 30 Hinuten erfolgt keine Zersetsäng, Sine ▼ollettodige Sersetsung tritt allerdings dann auf, wenn 30 Mi« nuten lang bei einer Temperatur -von 95 - 100°0 in einer 0,1 n-KtOH-Xiusung erhitzt wild« Werden Lempeptin· in wässrigen lösungen »it einem pH von 9,0 bei βΟ°Ο wKhrend einer Zeitspanne ▼on 30 Minuten behandelt, dann tritt sehr als eine §0 fSige 2ersetiung auf. Daher ist e» sweokalseig, das Material während der Ixtraktion ait tinea neutralen oder sauren Medina ?>\\ behandeln,
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In der Kulturbrühe Leupoptin-erzewgisndfcr Stamms liogon die Leupeptine hauptsächlich in dem flüssigen Seil vor. Laupeptine sind stabil genug, um einer Verdampfung der Brlihe durch Destillation unter Vakuum an Kiderstehen· Aus einer derartig konzentrierten Lösung können Leupeptine durch Zugabts oinee Lösungsmittels, in welchem Leupeptiße praktisch unlöslich sind, ausgefällt werden. Ein derartiges Lösungsmittel muss aueoerdem mit Waooer mischbar sein. Beinpieleuoioa sei Acston erwähnt.
Allerdings 1st ein AdeorptioEßveriahron sur üxtr&ktion von Xeupeptin aus der KulturbrUhe vorsueiehen, AIh Aooorptionamittel können i&tiTkohle, Ioaen&ustausoherharse, Aluminium*- ozyd, Kieselsäure oder dergleichen vorwondot wercUm, Picee Matorlalion aäflosMoren Leupoptine, wobei die Xi6iip@ptine erneut eluiert verfloi? kennen· Beispiolßwciioo v&xü&n Laupoptine an einer JUctivkoiil«? aüsosbiert imS mit angsafeortom V/assor,, angosäuerteim Hethonol« einem angesäuerten wäserigon Methanol oder oinÖM asgesäuertsn «räesrigen Ktlia^oX oluiesi.. Wird eine schnell© Eluierung gowifnsöhtp äsmi lot Cas saiwfo Lösungsmittel aweoloBäßBißer als das neutrale T/öeungomi'fet·©!. Bin Anicmenaus« tausoherharz ist ein geeigneteren Msorptionsmritt©! sua? Extsalc« tion -von Löupeptisen. Bei einer Verorbeltime voa Xtoupeptinen mit einer (fuaniöingi?iipp© wirS ein EatioaoaauetauoeherharB vm>· liondet« Ein poröoeer scliwach-Eauxeo IiarsB bolöpisliiweise Lewatit«CIIP (3?as?boxiiebrilEen Bayer A&) ist vorzua.löheii, Das Kationenaiistauschesliass kau» in der II- f MA-, Ha« \m& Li-Form sowie in Mischungen aus dleoen Forman verwendet worden« Wird ©in SationGnaHstauaoI&erliars in der H«SOsa v®2?w©nd©te dans. w©2?« den dio aüsorfeier^ea Itinspaptine langsam mit VG^dUmiter Chlor-Wasserstoff »Hure eäer mittels elB.es gO $ig©n wässrigen Aoetono elulert. Jedoch ist; ein saures organisches lösungsmittelv bai*» eise O5,5J^=HCl.in einem 50 ^igoa wännffigen Aceton
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oder ©ine O1Sn-HGl in ©inem 50- Iiin 60 fSigen wäeerigen Metha« nol fttr die Eluierung geeigneter.
Zur weiteren Reinigung eignet si oft eine Kohlcmätoff»Qhrosiato«<> graphic, belepielsweiee eine Adsorption der Iscupeptine aus der w&serigen LiSsung und eine Eluiorung untor Verwendung von saurem wässrigen Methanol. Bine JUwMsttumo3qrd«03iroais,tographi© kann ebenfalls für Eeisigungsaweoke verwendet werden. Die Alu miniiraoxyd-ChroiBatographig wird Hit Methanol, Äthanol» Chlore iosm/Methanol, itnylacetaVHethanoi oder dergleichen eatwiekä Werden Leupeptine iu Hötbanol, Äthanol oder in den Mi^ohungen dieser .^euagemittel mit Wasser gelöstP dann durchlaufen die Loup&ptino die Alimini-umoscydeäale. Dieseo Tarfahren eignet sich aur Abtrennung von Leupeptinen rou gefärbten Terunreini·» gungen. Eine lonenouetausoh-Ohromatographio eignet Eioh falls sur Heinlgung von Lei^peptincn, beispielsweiee liest ein Eatioaeaaus'feauooiierharffi in der. g&miächten H«· imd K verwenden, vobei di@ Leupeptine iaife O9 1 - O1^n-HOl elui@rt den.
Eine SiesölsäiJX'e-säiilenohroiaatogrföpIsi© ist ©Anfalle nigung von Lsupeptiaesi g©©igaet« Beispielswais© liord tins ia ©iaes» Hisetejig aus Chloroform vnd Itethanol (9s 1) gelöst, worauf das OliXOmatog^amm mit ChlorofosmAlethanol (Öt2) ©ntwicfcoli?
&ögönstromv©rt©ilBiig kann e1>eafalle soz* Extraktion oder Reinigung ^on üaupeptinen angewendet werä©n. Ein
wie beispi©ls^©is© ö©r Pdibielniak , Icann. fttr dieses Zweok verwendet
sieiit voa Jjenpeptinen swiedhen Bntanol und eia@m Pfeoaphatpuff^r mit ©iness pEvon6P0 beträgt 1. Bi® iztraktioÄ voa-I»©ttp®p"feiiieii mit Butanol ■ eignet Beiaigang von.Locpeptinon. .
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BAD ORIGINAL
Leupeptine mit einer Guanidingruppe lassen aieh aus den wässrigen lösungen als ihre Pikrate, Plavicmate, Beineckate und 5-Mothyl-ß-naphthalineulfoü8äuresal2o ausfällest. Diese Ausfällungemethode eignet ei oh ebenfalls eur Herstellung von "Leupeptinen. Diese Salae werden mit organischen IiUeungsmitteln behandelt, welche Chlorwasserstoffsäure enthalten» und werden in Hydrochloride von leupoptlne umgewandelt. Nachstehend wird ein Virkeaiaes Verfahren sur Extraktion und Heinigung von Lau« peptinon aus einer Xulturbrähs angegeben: Loupeptine verden unter Yerwenduns eines po^Soen Sationena^ätaueoherharees mit Caxbonsäuregruppen adsorbiert und mit OhlorvasoeretqffsUure/ Methanol eluiert» worauf das Eluat unter Vakuum konzentriert wird. Die konsentrierte wäserigd lüsung wird einige !IaIe mJ.t Sutanol extrahiert» worauf der Butanolestrakt »ur Srookne eingedampft wird, per Rttoketand in der wiuerigen lösung wird duroh Surohleiten durch die Säule aus dem Anionenauetaueoherhara entfärbt, worauf der Abetron eingedampft wird. Dabei werden, gereinigte üioohungen der Hy&cochloride von £ettpeptin$ii erhalten. .
Sas am meisten gereinigte Leupeptin-l'r^Hvdrochlorid» das haupteüohlioh Leupeptin-Pr-LL onthlilt, wie sich durch die Aminoettareanalyse ergibt (Leuoin 1,00, Isoleucin O9IO und Valin 0), "besitzt folgende Eigenschaften* Weieses Pulver» dao awischon 110 und 1400G oobmilat, [a]^ - 56° (β»1, Methanol), pKa1 mehr als 12.
°21Η4Ο°Λ·ΗΟ:1·Η2Ο
Bereolmets 0 50,95, H 8,76, 0 16,16, N 16,90, 01 7,16
Gefunden! 0 51f13· H 8,77, 0 14.96, H 17.10, 01 5»75.
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Be wird keinfe ohax^ktoriB^isohe OT-Adeosption See IR-Spökferiiia geigt ©ine Absorption, v/elolio A-Msliycl entspricht (1720 - 1730 odT^), und starke Arai&bMiuaii (16£O, . 1
1540 em"1). Bas ME-Spateiim (100 MHb). Ia (GJtygßO soigt das Vorliegen einev E"«3?£opl©2aylgr»ppe in des HoIeIsUl9 uiiü sswaa? anhand voa Peaks bei €#,00 (ΧτΙρΙβΐΦ« 3H) iaaii toöi s 2H), =
Das am muiston gereinigte £eupupiiin»Ae^yü:£i>uhX93fiä9
Leupepfelii«Ao-LIi enthält, v;ia aioh aEhaaä diner yue ergibt C i oho la 1,00, läolmieiB D»ö4 mnd Valin 0,01), frost fcst .folßowilö Eig^OBOhafliSiis W^isees PuIyor, bei 75 -' 11OP0 sofeailsii, [&]ψ « 52° Co«1. Metlioaol), pKa' als !2.
0 49i93, H 8t§9» 0 16,63, H 17947, 01 7937. (?e£andeni 0 30,34, E 8t57, 0 16,42, H 16,03, Cl. 5,27,
Hs wirft kein oharaictezdG binchof] W-Alsso^ptionaspaktrtisi feirtgedtelll*. Das IB«Spekti?um iüinelt demjenig^i von üQiip@pti3t-f^ HyürooSiloriil, Daß K-iE-Spektsum (100 MHs) in (ODs)2SO {Paak bei </i,35 (Sihglett, 3Ξ) seigt das Vorliegall einer IJ-Jloetyl gruppa, .
Die Ilyilrochloridc you leupepfeihsn 0ind in V/üoröp, Methanol, Äthanol, Sutanol, BssigßSure» BimathyliOniiamid und Diraotlr/l eulifoxyd luslloh u?i^ lcaiiii liJolioh in Ithylaoe feat, Aooton, Chloroform, ϊetraoluloikoiilesis^off3 Äthyliither-
Laupeptind epgebfm positive fi^.don»Ssiith<»y rot©
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cyanoaquoferriat-Healctionen und negative iTinhyüria»·» Είοοη(ΙΙΙ)-ο1ι1οΓΐα.™? Aathron«*, Kolisoh- «ad
»ie E&piejionroaatogsraphie von Leupoptlaoa nach dar Methode ergibt einem eimsigen Fleekea, üq:c uuroh dio Rydon-Smith-, rote Setrasolium- oder Sal«&gttQhi«Eealcti0n entdeckt wird. Der Rf«Vest beträgt Of 9 - 0*95» «ad bkb? 1>ei einer wicklimg mit einer oberen Schicht aus Butanol (4s Ii5t bösiogöii auf dae Volumeia), 0»9 m 0,95 ^».ter Veswexidung von n-Propanol/Waoser (7i5) und 0,4 - 0»6 oei Yss^endimg von Äthylaoetat/Me-Öianol/Wasaex1 (4:1*1), Bei @inax* Hoohapaimuagö«- papierelöktroplioroeQ (3 500 V» 15 Miautaa) tiates Vesf^endisag von AmftlBeneäiirc/Ee3lgoäure/W&3öe:r (25i75i500j findet man die -
in einer Entiernuag von 5 ~ 6 om vor dem Ausgange· in Eiclitimg auf dia Kathode, Bei einer DßimscMcht-ChxOiBaunter Verwendung von Kieselgel 6 (H@rok) ergeben Ii©ueinen ©inselnsn Flocken bei eiaasi Ef-vrert von 0»6 « 0»7 bat Vörwendusg von n-PropaiioI/Wnssor (7s3)r 0*2 - 0»4 lsei wandung von Ghloroforia/iieiiliaiiol (7i3}8 0t2 « 0.93 bei
Aoeton/ftmeeer. (Ii 1) und 0P3 ·» 0,4 "bsi Verweaäun^ von Jlthylat/BoBigsSure/Waeser (60s 17»17).-'Leupeptine ?s*uaA »Ao laöaen sieli aielit duroli Pspi@s«» imcl SUmisehiolit-Ote'ßiiiatögrapiii© sowie dtu?oli Hoohspamiuiagspapier-Blektroplioaree© im1;©2? d@a a5ig©ge"bejaen Bedisigiinge». us.teraeh©id©ae Bsi cles? Oliroiäatßsraphi© aa Kieselg©! Q unt@s? Yerwendusg ■ von Butaaol/Bmtylae9tat/S8sigsätire/¥asB©2? (4ϊ251ϊ19 Gesogen auf öao Yoiumoa) als Bstwiekluagsmittel werösa di© Ifßixpeptia© Pr und -Ao gQts?©ant. Jedes dieeex L®upeptina ergibt swsi Flae&sn mit £olgo&fle& B£«lfextent 0,45 - 0»50 imd 0,35 - O045 £üs? Laupeptin usid 0e 35 - 0,45'«nÄ 0,30 - 0,3f für Leupeptln Ae, Bsr
1)oid@a 2Tleok©n läset »ioli in 9oxa voe.2 Pleoken l>ei Am-rea dung dor gl©icfe©a Dliiiaschieht-Ölisomatogmphi©
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Ιϊβύρβρϋη PsT-Uj^Si^a^Biity.lacetalhyä^oeiLlox'lä ist eis. Pulver, das bsi 70 - 9CK0 sohmilst« [ß]|^ - 46° (o»2, Hethssiol), mehr als 12,
°29Η58°5ΪΓβ·ΗΟ:ΐ·Η2Ο
Berechnet; 0 55.70, H 9,83, 0 15,35* H 13»44, 01 5t67 Gefunaon: C 55,73, H 9,68, 0 14,43, H 13,56, öl 5,86.
Die Molekülformel wird zu C29H58°5iT6 e^rai"t^eli;» im& ΏναΓ äuroh dezt Staampeai: m/es57O In dorn MaesenspöktEum,
Pr-LL-cll-Ji-Butylaoetalpikrat let ein gelbes lines Pulver mit einem Schmelsspunlct von 60 ~ 90°0. Analyse: .
σ29Η58°5!ί6·σ6Η3Ο7Ν3
Berechnet* 0. 52,55t H 7,69, 0 24,00, K 15,76 Gefunden; C 52,32, H 7,80, 0 24,60, H 15,43.
Leupeptin Ac-IL-di-n-ButylaoetaliiyürooiLLorid ist ein veisses Pulver. P. 70 - 90°0f [a]|^ - 43° (o*2, Methanol), pKa1 kehr als 12.
Analyse«
σ28Η56°5Ν6·Η01·1/2Η2°
Berechnet! C 55,84, E 9,71» 0 14,61, H 13,96, 01 5,89 Gefunden? 0 56,03, H 9,67» 0 14,77, N 13,68» Öl 6e16.
Die Molekül*onael ergibt eioh aus dem spektrum des Hydroohlorlde: Berechnetes Holekulargewißht S 556,431? gefunden, m/e 556,429 ± 0,003.
Leupeptin Ac-Zrlr-di-n-Butylacetalpikrat let ein gelbes kristal lines Pulver. P. 60 - 1006O.
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Λ rial .ya a j
Soroohnett G 51,96, H 7,57» 0 24,43. N,16,04 i C 51,78, H 7,51, 0 25,17, H 15,67.
Löupoptin Pr und ~Ac-di~n~ButylacetalliyclxOchlo;cidö besitsen keino charBktorisuiache UV-Absorptioa. Die IHWipektren zeigen oine stark© Absorption boi 1070 oaf* , di© Sem Acetal suge-
wird. Bei der Durchführung einer DUnnßchioht-Chromatographie unter Verwendung von Kieselgol 6 und Jöutanol/ButyX-aootat/EBsigsäure/Y/aBser (4$2ί1:1) ergeben Leupeptin-Pr-di-n-Butylaoetal und Ac-di^n-Butylacetal jeweiia eixion einzigen Plecken mit einem Rf-V/ort von 0,65 bzw. 0,60.
Die am meisten gereinigten lieupoptine beoitssn oine Antiplasminaktivität und zeigen eine Inhlbisrung von H'rypoin, Papain und Kallikrein, jedoch nicht /on Chymotrypsin. Die 50 ^igen Iiihibierungskonsentrationen von Leupeptinen werflüii in folgender Weise erhalten« Duroh protaolytische Hydrolyoe von Fibrin durch Plasmin, von Kasein durch Trypsin und Hämoglobin duroh Papain bei 6 mcg/ml, 2 mog/ml und 0,15 mcg/ml Lsupeptinen und esterolytisohe Hydrolyse von p-Soluolsulfonyl-L-argiiiinmethylester (ΤΛΜΕ) und a-N-Bensoylargininäthylester (BASE) duroh Plasmin, Trypsin oder Kallikrein bei 65 - 85 mcg/ml Lsupeptinön. Sie Art der Inhibierung von leupeptinen verlaufΐ in Konkurrenz zu der Hydrolyse von TASAE durch Trypsin und Hämoglobin durph Papain. Die Leupeptine inhibieren eine Blutkoagulierung bei Menschen, Kaninchen, Katzen und KUhan. Die Inhible^ung einer Koagulierung des Blutes von Hausen, Batten und Hunden ist sehr achwach. Diese Wirksamkeit von Leupeptinen wird mit Sraeylol, Trypsin-Inhibitor, transM-Aminomethylcj/olohexancarbonsUure ($<»AMGHA) und 6-Aminocapronsäwi-e ( 6-ACA) verglichen. Ijeupeptina, l'rypsin-
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BAD
« 14 -
Inhibitor und 'i'rasylol haben sich als wirksam© Inhibitoren gegenüber Plasmin und Trypsin erwiesen. Die inhibierende Wirkung von Leupeptlnen ist um da» 100~ittehe stärker als diejenige von C-ACA lind um das 20-fache kräftiger als diejenige von t-AMCHA auf das Plasminayöteia. Leupeptine sind wirksame Inhibitoren gegen sine Thrombokinase„ jedoch nicht gegen a-Ghymor trypsin. Trasylol vermag nicht eine l'hrombokinaae su inhibieren, ist jedoch ein wirksamer Inhibitor gegen a-Chymotrypoin. Leupeptine zeigen femer eine inhibierende Wirkung gegenüber einer Garrageenin-Entattndung in Batten. Eine intraperitoneale Injektion von mehr als 6,25 mg/kg von Leupeptinen oder eine orale Verabreichung von mehr als 12,5 mg/kg an Hatten inhibiert eine Entzündung der Fusepolster* welche durch eine subkutane Injektion von 0,05 nai einer 1,0 $igen Caarageenin-Lösung.erzeugt worden ist. Leupeptine werden gut auf oralem Wege absorbiert. V/erden 1000 mg/kg auf oralem Wege an Hatten verabreicht, dann wird der nächste Blutgehalt von ungefähr 200 mcg/ml In dem Serum nach T,5 Stunden festgestellt, während 2400 mog/ml In dem Urin nach 3-5 Stunden ermittelt t/erden. Insgesamt ungefähr 40 i> der verabreich ten lieupeptina werden aus dem Urin wiedergewonnen. Die L£~o sind wie folgt: Häuea 118 mg/ kg durch intravenöse Injektion, 1405 mg/kg durch subkutane Injektion, 1550 ag/kg auf oralem V/egej Hatten; 125 mg/Kg durch intravenöse Injektion, >4000 mg/kg duroh subkutane Injektion,
>4000 mg/kg auf oralem Wege; Kaninehen 35 mg/kg durch intravenöse Injektion, 300 reg/kg durch subkutane Injektion, >1500 mg/kg auf oralem Wege.
Die folgenden Beispiele, erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Beispiel 1
Streptomycea roseus ΕΑΘ39-Α1 wird bei 27°0 während einer Zelt-
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BAD OBlGlNAL
spanne von 71 Stunden in 65 Kolben (eingenommenes Vol. in einem Kolben: 125 ml) gestlchtet, wobei die Kolben-mittels einer öich hin- und herbewegenden SohUttölvorrichtung (130 Bewegungen/Minute) geschüttelt werden. Das Medium enthält 1 # Glukose, 1 ?£ Stärke, 2 # Polypeptea (})aigo Eiyo Co.) und 0,5 $> Natrium- . chlorid und wird unter Verwendung von 2 n-Natriurahydroxyd auf einen pH von 7»0 eingestellt. Ein vegetatives Inokulum, das 2 Tage lang in dem gleichen Medium gezlichtet worden war, wird in einer Menge von 1 Volumen-^ verwendet. Die KuIturbrtihe wird gesammelt (10 1, Antiplasminaktivität: IDk0 0,015 ml/ml) und zentrifugiert» und swar bei 3000 üpm während einer Zeitspanne von 10 Hinuten. Der Überstehenden Flüssigkeit (9 1, pH 7,3) werden 135 g Kohlenstoff (Wako Pure Ohem.) zugesetzt. Nach einem 30 Minuten dauernden Rühren wird der Kohlenstoff durch filtration abgetrennt und mit 6 1 Wasser gewaschen. Dann erfolgt eine Eluierung mit 1500 ml und 1200 ml eines sauren 80 "Algen Methanols (pH 2, eingestellt unter Verwendung von 2 n-Chlorwasserstoffsäure). Das aktive Eluat wird mit Amberlite IR 45 (OH-Form) neutralieiert und bis zur Trockne eingedampft. Dabei fallen 22 g eines bräunlichen Pulvers an (AJitiplasiäinaktivität: IBc0 95 meg/ml, Aktivitätsausboutei 38 $). Das bräunliche Pulirer wird in 500 ml Wasser (pH 7,0) gelöst und auf «sine Kohlenstoff säule (Wako Pure Chem.t 110 g) geachttttet. Die Säule wird mit 2 1 Wasser und 2 1 einer 0,02n~öhloi?wasser-* stoffsäure gewaschen und mit einer OoOSn^Chlorwaeaerstoffsäure In 80 S& Methanol elui©rt. Bas Eluat wird mit Amborlite IR 45 COH-Porm) neutralisiert und aur Srockne eingedampft. Dabei werden 8j9 β eines gelblichem Pulvers (Antiplasminaktivität: XDe0 53 mcg/ml, Aktivitätsausbeute: 72 f>) erhalten. 7,5 g des gelblichen Pulvers werden in 50 ml Methanol gelöst und auf eine Aluminiumoxydsäule (Woelm» sauer, 750 g) gegossen. Die Säule wird mit Methanol entwickelt; Das Eluat, das positive Rydon-Smith-, Sakaguohi- und rote Tetraaolium-ReakuieBen liefert,
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wird sur Sfroeknc: eingedampft« Babei werden 2,3 g Xieupeptinhyd.ro chloride erhalten (Antiplasmin&ktiviMt: ID~Q 12 mog/ral aktiv!tätsausbeutss 24 $}« t
ggiopisl 2
Streptomyoes rossus MA839°A1 wird in einem 2QQO ! (eingenommenes Voluiöoni 1500 1) gezüchtet. Das Medium enthält 2 $> Glukose, 1 # Sttirke, 2 # Peptozx, 0,5 # NaOl wad 0,2"5$ KH2PO^ uad ist bei 110°0 während einer Zaitapanae voxi 30 Minuten sterilißiert worden. Ein vegetatives XnoJculum, dao 48 Stunden lang in dem gleichen Medium ge&Hchtet worden ist, wird in einer Menge yon O813 Volumen-^ verbandet. DJ.® Temperatw2? vix'ä bei 27p0 gehalten. Die L^tstrSmimgagesehwindigkelt wird kon·= stant auf 1500 1 pro Minute eingestellt, während mit ©in©£ ß-e-Gchwindiglceit von 200 Upm gerlUirt liirö, Sie Kulturbrüh© (1500 I1 pH 7.15» AntiplaeminaktiYitätsIDcQ 0,015 ml/ml) wird naoh 53» 5 Stunden gesammelt und unter Verwendung von 45 &g Diealite als Filterhilfsmittel filtriert. Das Fiitrat wird durch eine mit Lewatit GKP-Harz (Parbsafabriken Ba^ea? AG, pH 6,0 unter Verwendung voa Hatriuinhydroxyd9 180 1) gefüllte Säule geschickt. Die Säule wird mit Wasser gewaschen t&nd mit 300 1 in-ClilorwasBerstoffoäuK'e in 80 $ Methanol imd 200 1 einer 0,2η-= Ohlorv/asserstoffsäure ia 80 f> Methan©! ©liiert, !Das aktive Eluöt (565 1) Hird auf ©insn pH von 5,2 mts? Verv/enduag von öa-iiatriurnnyäro^yd eingestellt und &ut 90 1 konzentriert«. Pas Konzentrat wird mit 80 1 Butanol extrahiert, worauf der 25wr Trockne eingedampft wird. Dabei werden 979» 1 g eines liehen Pulvers (Antiplaaminaktivitiit: XBe0 13 meg/ml, Akttvitätsaußbeutes 75 #) erhalten.
164 nig des bräunlichen Pulvere ia 2. ml Wasser werden entfärbt und mittels Harzehromatographie unter Verwendung von Bowex 1 χ
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100 » 200 mesh, Cl-SOria, 10 ml), wobsi mit Wasser entwickelt wird, gereinigt. Das Eluat, das positive Rydon-Smith- und Kasaguohi-Eeaktionen ergibt, wird zur Troclcae eingedampft, \*o boi 126 ag eines weisaen Pulvesa aus Leupeptiishydrochloridea anfallen (Antiplasminaktivität: IDr0 11 mcg/ml, Aktiv!tätsaus beute: 91 #)·
Trennung der leupeptin Pr- und -Ao-ui-n-Butylacetale
19»2 g der Leupeptinhydrochloride (IDk0: 15 mcg/ral) werden in 270 inl Butanol 2 Stunden lang am HUckfluss gehalten. Die Butanollöaung wird mit 270 ml Wasser gewaschen und zur Trockne eingedampft. Eabei werden 23,4 g eineö Rohpulvers erhalten. 14,0 g.dea Rohpulvers werden in 20 ml Butanol/Butylacetat/Eoeigeaurö/Waöser (4:8:1:1) aufgelöst und einer Säulenchromatographie (Kieselsäure, Mallinekrodt, 900 g) unterzogen, wobei mit dem gleichen Lösungsmittel entwickelt wird. Das erste Eluat (150 ml), daa Rydon-Smith- und Sakaguohi-Rsaktionen ergibt, wird zur Trockne eingedampft. Dabei werden 1,5 g üeupeptin-Prai-n-ButylacetalhydroChlorid in Form eines welßsen fulvevs erhalten. Das »weite Eluat (500 ml) wird zur 5)rookn© eingedampft, wobei 5j3 g einer Mischung anfallen, die Leupeptin-Pr- und -Aodi-n«Butylaoetal (Hydroohlorid) enthält. Das dritte El^at (1400 ml) wird zur Trookne eingedampft. Dabei werden 3,4 g Leupeptln« Ac-di-a°Butylaoetalhydroohlorld in Form eines welosen Pulvers erhalten«
93 mg Leupeptin-Pr-din-Buty.laoatalhydrociilorid werden in 5 ml einer 0,01&«Cnlorwasse?8toffsäure geltiat und 3 Stunden lang auf
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©rhitat. Die LiJmIMg wird untes? Verwendung von Amberllte IR 45 (OH-Foxm) auf Qlnon pH ύοώ. 6,0 aetttraiisi©xit ttnd zxiv Trookne eingeoanjpfi;. Dabsi wardsn Ί2 mg Iiewpoptin^Pj^Hydro-· Chlorid in 3?oiia sines weissen PEl^ers earlialtea (ΙΡηη? 8 meg/ml),
1,0 g Leupeptin-Ac-di-n-Butylßoetalhydroohloricl wi^d in 50 ml einer 0,01a~Chlorwa£issröto££Bäure geliisi; en>i nach äez in Bai-» apiel 4 beachriobenen Arboitsweise bolicmdolΐ. Auf diese V/eise wird ein v/siso^s Pulver aus leupep-öin«Ac»Hydroeiilorid (800 12 mog/ml) erhalten.
Beispiel JS
lüiner Lößioig von Ssupeptia-Pr-dia^Bmt^lacQtaHiydrochloi^d (48 ag) in 2 ml Waoser %?erden 31 mg iTa^iiimpikrai* in 1 ml V/aoser bei 40 » 500G zugesetst. lisoliäeiE &l@ MiBohsmg Ub©£* Ifaoht bei Zimmertemperatur otehensslaeseii· wordssi lot, wird äQr ölige Sirtiip durch Bokantleming a'ogctrennt und urttor 7@smisid©rtem 2)£u@k ßotrooknet. Der Hllokstand wird mit 2 el lcaI1;©]ä Wassero g@- waaohen, wobei 50 mg eines gelben kristallin®!! Pikrats von Loupeptin-Pr«di-n«Butylaootal erlialten VQxäm» Bae Pikrat wird mit hölaacm Wasser imkristalllsiert.
Einer I&eung von
(100 mg) in 2 ml Wasser werden 88 mg Hatritimpikrat is 1 ral Wasser bei 40 - 50°0 angesetzt· Ein golbe® krietallines Plkrai; von Iieupeptin-Ac-di-a-Butylacetal * OS lag) wird nnoh. der", in
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« 19 ~
Beispiel 6 "booohriebeaan Arbeitsweise erhalten.
Beispiel 8
Ein Loupeptin-ersseugenäer Stamm (Streptomyces roseus MA839-A1) wirä 48 S-gunden lang unter Schütteln unter Bedingungen gezUchtot, die dön in Beispiel 1 beschriebenen !ähnlich sind. Das iflyzel wiircl aus der £ulturbrühe (375 ml) dusch Zentrifugieren abgetrennt und mit 80 ml einer sterilisierten physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. 7,0 - 7» 8 g dos erhaltenen feuchten Hyzels wo??öen in 26 ml sterilisiertem Wasser swspsaäiert. 2 ml der Suspension wenden auf 30 ml eines synthetischen Mediums auf geimpft, das 0,2 # HH4HO-, 0,1 56 KgHPCK9 0,05 ^ HgSO^. 7HgO P 0,05 ^ KCIp 0,001 $ FeSO4.7H2O, 1,0 ^ Glukose, 1,0 % St&rke und eine Hischung aus Aminosäuren (3,05 nfliol Xr»Xi@uein, Ο,βΊ rrliol Xi-XsolenQin, 0,70 mMol ^-Prolin und O„23 sHcl Ii^Arginia) ent« Mit, vorauf 24 Stunden lang "bei 27°C - geeohttttelt wird.. Die ^eaktioaiöiiisohmig wird filtriert vmcl an Aobsrlite IRO 50«Hars (5 ml der Η-Fora), elng©£ttllt in eine Söuls, assortiert. Die Säule vjj.3?fc salt 5O ml ©ineo 50 ?Cigen wlisorigen Acetone g©w&- sehen ur«ö. mit- Op^n^HCl in einem 50 ^Ißeix \iäasrig©n Aooton oluiort. 15 ml öes Eluats werden mit Amhsrlit® IH 45 fOH-Fora) iieutrallei.ert mid sur Ssrookne eing©darapfta Der RUelcotanä wird In 1 ml oj.nes 80 ^lg©n Ifethanole gelöst rad mit ©in© mit § g eines e^ren Aluininiumoxyds gefüllte fliSmle gegeben. Bi© Bat« wicklung orfolgt mit 25 ral Methanol,, Daa aktive Eluat (5 ml) wird lccmsentriert und auf eine "Dünnschioht~öhroinatographie-» Platt® (Silieagel Q) punktweise aufgebracht. Die Platte wird mit einer Mischung aus Chloroform und Methanol (4s1} entwickelt. &ie Lsupeptine werden mit Methan©! aus dem Eieoelgels daa an einer Stell© gesammelt wird, Sie eisneia Hf-Wert τοη 0»15 "bie 0,30 entspricht, extrahiert. Bi.@ Kethanollöaung wird zur !Droclme eingedampiTt, wobei 1,2 mg eines aus Zieupeptinen he» Btehend©n \miBB&n Pulvers 'anfallen..AntiplasminaktivltHt:
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BAD ORiSiNAL*
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IBkq 10 s&eg/inl. Die Aniinooauroanalyae deo amiden Hydrolysate (HolverMltnio) ergibt T, 13 Leucin, 0,12 Isoleucin, 0,09 Prolinc Spuron Arginin und 0 Valin.
Bei der JDurchi'Uiirung eines ExperimentO9 das d©m vorstehend beschriebenen ähnlich ist, wobei 2,96 mHol !!»Leucin, 0,57 laMöl L-Iaoleueia und Op65 nsMol L->Prolin alö Miechuag von Aminosäuren, veniendet werden, vierden 0,6 mg cm Leupeptisien erhalten. Die Aminosäureanalyse ergibt 1,16 Leucin, 0,10 Isoleucin und 0,06 Prolin.
Werden 3#05 ni'Iol L-Louoin, 0,7 asMol L-Prolin uad 0,25 mHol L-Arginin ale Misohung von Aminosäuren verv/endet, dann werden 2 Leupeptine erhalten. Die Aminosäursanalyse ergibt 1,39 Leucin, 0,01 Isoleucin und 0,10 Prolin.
Aufgrund dor vorstehend beschriebenen biologißchen Wirksamkeiten eignen sich Loupoptine sowie ihre Salze» aus? Behandlung von verschiedenen EntsUndungslcrankheiten. Zur Behandlung von Pankreatitis werden L©upeptiae in einer sterilen Formulierung subkutan* intramuskulär, intravenös oder oral verabreicht. Zur Heilung von Hautkrankheiten können Lsupeptia© als Paste, CremeB Lösung oder Suopension verwendet werden.
In den Hahmen der Erfindung fallen auch die Säuread&itionssalse von Leupeptinen mit organischen und anorganischen Säuren, wie· beiopielsweise Chlortmsserstoffsäure, Schwefeloäure, Bromwasö ere toff säure, Jodwassero toffeäure, Phosphos-Bäure» Salpeter» säure, Zitronensäure, Apfelsäure, Weinsäure, Benssoesäure, Zimt"· säure, Ascorbinsäure, Essigsäure, Pikrinsäure» Phytinsäure, L@vopimarsäure°6,8a-oie~endobernsteineäur®, SulfaminBäure s ölykolsäure und Mandelsäure, Für therapeuticeh© Zweoke greift man auf S&Lse aioht-toxiaoher Säuren surüok, wobei ^edo«h auch
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BAD ORIGiNAL
Salas toxischer Slluran, bfjiopiöIsvfüisQ von Piteüioäurs, sur X>uroh£ührimg von loolismvageiaaiuioden gß-sigaet -öinßs laeiopislov/siaa sum Ausfällen swo itfiasrigen Löopjagen oouie fiix? Bsßin«
bai vjoIcIigh. eins SoXisitlit ohne Bßäsatung ia-s.
kömiim ölo e^fiaümiß.'iigQSiiGBßn Törbiadusigoa nit
, ooiem sie mil; sLtesoa
veraischt werden, l5öio^isls\i3.ioo Aft1;ih:5.at©misi©n, (boiepielowöioo fJiilfaüiasin, Sulißb©as&aiiä, Sulianilamld, 8ul£apyviüia9 Sulfatliiasol, SuXfapyrasln» SuIfa guaaldin, Swlfatlialiain, Sulfasusidi», Sülfloorasöl« Süll« amylon, Phthalylßulfacöfeamid, Η·-3#4
ilaßiid \mü H'-
, lipüHeopiochon Mitteln (iasbOBondarß Hothlouizi» Gholiii, Ieoslt wnd ö-Si-tostsrol «ud Mieehungen davon), mulontion £ür das aeatsale ITQrvöUGyotora (böJLapiolßV/öioa KofiTsin» Amphetamine)^ Lülailan?lotb.etikas /»iml^otd.ka (toispiolsv«)iß0 Aopisia, Sal.Loy3.amid, iiatriiiingontieat, p-Aoetylominopliönol, Phenaootin, Eodö.in), La^caliiva (boispiolavjoioo Phoiiolphthaleiii)» Sodativa (boiapielawaioe Barbituraten» Bromiden), antibiotisohexi Mitteln (beispielswöise Penicillinen, Kanarayoln, S-troptomyoin? Dihydro streptomycin, Baoltracin, Polyraixin, Tyrothrioin, Sxytluroovoin» Ohlocteteaoyolin, Osytotraoyclin, 3JetraoyoliiiB Olöandoaiycin, Chloramphenicol, Magnaiaycin, Novobiocin, Gycloaerin, Neomycin), Vitaminen (beispielsweise den Vitaminen A, Aj» B1, B2, Bg und B^ sowie Mitgliedern dieser Familie, FolsÜure und Hitgliedern dieeor i'amilio, den Vitaminen 2)r B2, S« und E), Hormonen (belsplalawoio© Cortison, Hydrocor cioon, 9«a-FluorcortlBon, 9-a-^luor·=· hydroco3*tieon, Prednison und Prednisölon), anabollsohen Mit» teln (boispielsweise 11,IT-DihyUroxy-S-a^iluor-IT-a-methyl-^ androston-3-on, 17-ÄihyX-l9-aorteotooteron) mymI antifmigalen Mitteln (beiopieloweiöo ISyooetatin).
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BAD ORfQiNAL

Claims (1)

  1. M<
    % LeupaptinQ der ^oreaiöXii
    mi
    E2 ΪΙ, OHO . >
    Ra-OO-HlI-Cn-CO-HH-CK-CO-Bn-CH- C OH0 ) „ -ITTi-G
    R,,R2* -CH2-OH , -OH-OH2-CH5, -OH
    leupöpfcin-Ao-ILi H-ö OK,-, R1
    "V
    Leupeptin-ir-LIjj R.,«
    2. SUuroailöitionssalK oiiiss Lsupepünc gemäoa Anopsneh 1
    5. SäwreaäditiOÄisf!3al.s von Ä
    6. SttTjroaääitionsaal» Tön gininal»
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    BAD
    7. !'oxtfaliren ium:· Iferatolltmg o.iao:·? öürl^üho P wolohö Laupeptlae Anspruch 1 eni;hlil'fep fiacUareh gekennisoieliaete άαοο ein
    cee-StEian λιι olncm Meaiura, öac ©lsi ctiökB-iioff Sährmltt-sl
    Q, Vorfahren »ach Ajifäpa?ucli I9 daduroh gokiüm^eiöMiott, öaos öle Lcupeptine 'eoa ßer öärlJsUho öurcli Adeag'p'&i.cm κίι einem Sa-feionenanstaußCherfiajfs wnä aaochlieBsendoö werden.
    9. Verfahren aach AuKpruoh 7, cLacliiröii gokeonsei dme t, öaos Löupoptisie von dar ßärbrUiio duroh Extraktion roit Ewtimol abgetrennt t/
    909845/17 58 BAD ORIGINAL
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