DE2544348B2 - L-Leucin-13-Motilin, Verfahren zu dessen Herstellung und dasselbe enthaltendes Mittel - Google Patents

Description

(a) die miteinander verknüpfbaren Teilsequeiizen Fragment 1 bestehend aus Arginyl-(hydrobromid)-asparaginyl-N^£-tert.-butyloxycarbonyl-Jysyl-glycyl-glutamin-tert.-butylester (Aminosäuren 18 — 22), Fragment II, bestehend aus NKBenzyloxycarbonyl-glutamyl-(>>-tert.-butylester)-glutamyl-()>-tert.-butyIester)-N^E-tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-glutaminsäurey-tert.-butylester (Aminosäuren 14— 17), Fragment III, bestehend aus N^a-Benzyloxycarbonyl-N^N^-di-benzyloxycarbonyl- arginyl-leucin (Aminosäuren 12 — 13), Fragment IV, bestehend aus N^Ä-Benzyloxycarbonyl-glutamyl-(y-tert.-butylester)- leucyl-glutamin (Aminosäuren 9 — 11), Fragment V, bestehend aus O-tert.-Butylthreonyl-O-tert.-butyl-tyrosyl-glycin (Aminosäuren 6-8) und

Fragment VI, bestehend aus NKtert.-Butyl-

oxycarbonyl-phenylalanyl-valyl-prolylisoleucyi-phenylalanin (Aminosäuren 1 -5)
aufbaut, in denen alle Seitenkettenfunktionen der polyfunktionellen Aminosäuren acidolytisch leicht abspaltbare Schutzgruppen auf tert.-Butylkohol- Basis tragen und die komplexe Funktion des Arginins teils durch N^-Diacylierung und teils durch eine durch Salzbildung mit Bromwasserstoff bewirkte Protonierung maskiert ist,

(b) die Fragmente I bis Vl mit Hilfe des fiteraturbekannten Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hydroxysuccinimid-Verfahrens oder einer literaturbekannten Modifikation desselben miteinander verknüpft,

(c) aus dem erhaltenen, allseits maskierten, die Gesamtsequenz der Aminosäuren !-22 aufweisenden Polypeptid alle Schutzgruppen mit Hilf·; von Trifluoressigsäure abspaltet und danach die gebildete Trifluoracetat- und Bromidionen mit Hilfe eines Anionenaustauscherharzes entfernt und

(d) das erhaltene rohe L-Leucin-13-Motilin isoliert und reinigt.

3. Mittel mit Motilinwirkung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an L-Leucin-13-Motilin nach Anspruch 1 als wirksame Komponente.

Die Erfindung betrifft eine Verbesserung and weitere Ausgestaltung des Hauptpatents, aus dem L-Norleucin-13-Motilin bekannt ist, welches sich von dem natürlich vorkommenden Motilin dadurch unterscheidet, daß es als 13. von insgesamt 22 die Polypeptidkette aufbauenden Aminosäuren statt eines L-Methioninrestes der Formel

— NH- CH- CO-

CH₂
CH₂

CH₃

einen L-Norleucinrest der Formel

— NH- CH- CO-

CH₂

T'

CH,

CH₃
enthält. Das synthetische Motilinderivat hat praktisch die gleiche biologische Aktivität wie das natürliche Motilin (vgl. J. C. Brown in Demling et al. »Die Oberbaucheinheit — The Upper Gastro-lntestinal Tract, a Functional Entity« Schattauer Verlag, Stuttgart - New York, 1974, Seiten 11-13).

Es wurde nun gefunden, daß entsprechend vorteilhafte Ergebnisse erzielbar sind, wenn in 13-Stellung des Motilins statt des L-Norleucinrestes ein L-Leucinrest der Formel

— NH-CH-CO-

CH- CHj

CH₃

eingebaut wird. Gegenüber dem bekannten Norleucin-Motilin hat das Leucin-Motilin den Vorteil, daß es bei gleich guter biologischer Aktivität mit geringerem Kostenaufwand hergestellt werden kann, weil L-Leucin billiger ist als L-Norleucin, und daß es im Körper besonders leicht abgebaut wird, weil L-Leucon eine am Proteinaufbau maßgebend beteiligte, natürliche vorkommende Aminosäure ist.

Motilin ist bekanntlich ein die motorische Aktivität sowohl in den Antrum- als auch in den Fundus-Drüsenarealen des Magens stimulierendes Polypeptid, das aus

der Duodenalschleimhaut des Dünndarms vOn Schweinen isoliert wurde (vgL z.B. »Can. J. Physiol. Pharmacol.« Bd. 49,1971, Seiten 399 - 405, »Gastroenterology« Bd. 62. 1972, Seiten 401-404 find »Can. J. Biochem.«Bd 51,1973, Seiten 533 - 537), die Pepsinausschüttung ohne eine Änderung aer H+-Sekretion stimuliert, und sich sowohl chemisch als auch physiologisch von den inzwischen aufgeklärten gastrointestinalen Hormonen unterscheidet Dem Motilin kommt daher sowohl als Therapeutikum als auch als Diagnostikum eine besondere Bedeutung zu, da mit seiner Hilfe z. B. eine gesteuerte Pepsinausschüttung, beispielsweise mit dem Ziele der Bestimmung oder Isolierung des Pepsins oder der Regulierung des Pepsinspiegels, sowie eine gezielte Antikörperbildung bewirkt werden kann.

Die ursprüngliche Strukturaufklärung des Motilins ergab die Aminosäuresequenz -Met-Glu-Glu- in 13-14-15-Stellung, die an dem dem Hauptpatent zugrundeliegenden Prioritätstag als zutreffend angesehen wurde. Inzwischen wurde über eine Korrektur dieser Aminosäuresequenz berichtet, wonach in 14-Steilung Glutamin statt Glutaminsäure vorliegen soll, so daß obige Teilsequenz -Met-Gln-Glu- heißen müßte (vgl. »Can. J. Biochem.« Bd. 52,1974, Seiten 7-8). Demnach wäre das aus dem Hauptpatent bekannte Motilinderivat mit 13-L-Norleucin-14-desamido-Motilin und das nunmehr beanspruchte Motilinderivat mit 13-L-Leucin-14-desamido-Motilin zu bezeichnen. So lange jedoch nicht mit Sicherheit feststeht, daß weitere Korrekturen der Aminosäuresequenz überflüssig sind, werden die bisherigen Bezeichnungen L-Norleucin-13-Motilin and L-Leucin-13-Motilin für die in 14-Stellung einen Glutaminsäurerest aufweisenden Motilinderivate beibehalten, noch dazu, wo sich gezeigt hat, daß die Amidgruppe in der Seitenkette der 14-Glutaminsäure r> auf die biologische Aktivität keinen Einfluß hat (vgl. z. B.

die rechte Spalte von Seite 8 der oben genannten Druckschrift »Can. J. Biochem.« Bd. 52,1974).

Gemäß Hauptpatent wurde das bei allen Naturstoffen bestehende Problem, daß die Isolierung aus beispiels weise tierischen Organen unerhört zeit- und kostenaufwendig ist und nur in minimalen Ausbeuten gelingt, dadurch gelöst, daß eine Totalsynthese des Mctilins durchgeführt wurde unter Ersatz des in 13-Stellung befindlichen Methioninrestes durch einen Norleucinrest, aus der Überlegung heraus, daß nach dem heutigen Stand der Peptidsynthese die mittelständige Arginylmethionyl-Bindung (Aminosäuren 12 und 13 des Motilins) praktisch kaum synthetisierbar ist, andererseits jedoch das dem Motilin entsprechende Norleucin-13-Dokosapeptid auf synthetischem Wege leichter zugänglich ist, eine vergleichsweise rasche Strukturermittlung gewährleistet und wichtige Aufschlüsse über die biologische Wirkungsspezifität des Methionins zu geben vermag.

Das in hohen Ausbeuten vollsynthetisch hergestellte L-Norleucin-13-Motilin besitzt nach der Reinigung praktisch die gleiche Aktivität wie natürlich vorkommendes Motilin, v/as als Indiz dafür anzusehen ist, daß der Sequenzplatz des Methionins auch von Norleucin eingenommen werden kann. Dieser Befund war insofern überraschend, als der Ersatz von Methionin durch Norleucin in natürlich vorkommendem Human-Gastrin 1 zu einem Syntheseprodukt führt, das nur etwa 10% Gastrin-Aktivität besitzt.

Gemäß vorliegender Erfindung wird eine weitere Verbesserung dadurch erzielt, daß ein gleich vorteilhaftes Motilinderivat wie nach dem Hauptpatent zur Verfügung gestellt wird, das jedoch billiger herstellbar und biologisch leichter abbaubar ist.

Gegenstand der Erfindung ist L-Leucin-13-Motilin der Kurzformel

H-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr-Tyr-Gly-Glu-Leu-Gln-Arg-Leu-Glu-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-GIy-Gln-OH (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (1(5) (17) (18) (19) (20) (21) (22)

worin die in Klammern angegebenen Zahlen die von 1 bis 22 durchnumerierte Stellung der Aminosäurereste (außer Glycin alle Aminosäuren in L-Konfiguration) in der Peptidkette angeben und worin die Bezeichnung der Aminosäurereste in üblicher bekannter Weise abgekürzt ist.

Gegenstand der Erfindung sind ferner ein Verfahren zur Herstellung von L-Leucin-13-Motilin und ein dasselbe enthaltendes Mittel, wie sie in den Patentansprüchen näher gekennzeichnet sind.

Die Anwendung dieses Mittels erfolgt in der Regel in solchen Dosierungen, daß pro kg Körpergewicht etwa 0,05 — 0,5 γ, entsprechend 50 —500 ng Motilinderivat entfallen. Als Trägermittel dienst vorwiegend physiologische Kochsalzlösung. Die Applikation ist intravenös, intramuskulär oder subkutan. So kann z. B. lyophylisiertes Motilinderivat je nach beabsichtigter Applikation in Mengen von 1 — lOOy/ml physiologische Kochsalzlösung, die z. B. durch Mannit stabilisiert werden kann, gelöst werden. Zur intravenösen Verabreichung an einen etwa 80 kg schweren Menschen ergeben 2 ml Injektionslösung, die 8 γ Motilinderivat enthalten, eine Dosierung von 0,1 γ/kg Körpergewicht. Zur Infusion an einen Menschen des angegebenen Gewichts können 8 γ Motilinderivat in 30 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst und 0,5 ml dieser Lösung pro Minute appliziert werden, was etwa 0,1 γ Motilinderivat/kg Körpergewicht/Std. entspricht. Im Tierversuch erwiesen sich vergleichbare Dosierungen als geeignet und so wurde z. B. natürlich vorkommendes Motilin in Mengen von 0,05 y/kg Körpergewicht intravenös an Hunde verabreicht, wodurch ein kräftiger motorischer Aktivitätsanstieg bewirkt wurde (vgl. z. B. die angegebene Druckschrift »Can. J. Biochem.« 51 [1973], 533, linke Spalte, Absatz 1).

Zur Herstellung des Leucin-13-Motilins konnte der für das Norleucin-13-Motilin entworfene Syntheseplan

ίο herangezogen werden. Die Synthese der Fragmente I, II, IV, V und VI erfolgte daher nach dem im Hauptpatent beschriebenen Verfahren, ebenso wie die Kondensation der Fragmente I und II zur Teilsequenz (14 —22b) sowie der Fragmente V und VI zur Teilsequenz (1—8).

Das Fragment III (Aminosäuren 12 — 13) mit C-endständigem Leucin wurde synthetisiert und mit der kondensierten Pepitidfraktion I — II (14 —22b) umgesetzt zur kondensierten Peptidfraktion 1-II-III (12-22a), woraus nach hydrogenolytischer Abspaltung der

bo Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe das entsprechende Undecapeptid (12 — 22b) in Form des riydrobromids isoliert wurde. Die weitere Umsetzung mit Fragment IV (9- 11) lieferte die kondensierte Peptidfraktion I-II-III-IV (9-22a), welche durch katalytische Hydrogenolyse in Gegenwart von Bromwasserstoffsäure zum Hydrobromid des Tetradecapeptids (9-22b) entacyliert und schließlich kondensiert wurde mit der kondensierten Peptidfraktion V-VI (1—8) zum voll-

kommen geschützten Verfahrensprodukt I — II — III- -IV-V-VI (l-22a), aus dem schließlich nach Entfernung der Schutzgruppen mittels Trifluoressigsäure und nachfolgender Ionenaustauscherbehandlung und Lyophilisation das gewünschte Leucin-13-Motilin (1 - 22b) als Rohprodukt erhalten wurde.

Die Erfindung wird durch die Zeichnung näher erläutert, in der darstellen:

F i g. 1 das Syntheseschema zur Herstellung des Fragments III sowie zur Verknüpfung der Fragmente + II + III,und

F i g. 2 das Syntheseschema zur Herstellung des Fragments IV sowie zur Verknüpfung der Fragmente IV mit (I - III), VI mit V, und (I - IV) mit (V- VI).

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. In den Figuren und Beispielen werden die folgenden, in der Peptidchemie üblichen Abkürzungen und Symbole verwendet:

Aminosäureabkürzungen,

Zahlenangaben
in Klammern,

DCCD

OCCD/HOSU

DCCD/HOBt

SU

NP

tBu

DBSI

Me

TFE

i.V.

Ausb.

d.Th.

F
(Z)

gebildet aus 3 Buchstaben, bei denen es sich in der Regel um die 3 Anfangsbuchstaben handelt,

die die Stellung innerhalb der Polypeptidkette wiedergeben, und die keinen weiteren Zusatz erhalten, wenn die betreffende Verbindung kein weiteres Derivat bildet, die jedoch fortlaufend mit dem Zusatz a, b, c usw. versehen werden, wenn von a ausgehend weitere Derivate hergestellt werden,

als Angabe der Konfiguration,
für den Benzyloxycarbonylrest (vgl. z. B. Bergmann et al. in »Berichte d. Dtsch. Chem. Ges.« Bd. 65, 1932. 1192 ff),

für den tert-Butyloxycarbonylrest (vgl. z. B. McKay et al. in »J. Am. Chem. Sog.« Bd. 79, 1957, S. 4686 und Anderson et al. in »]. Am. Chem. Soc Bd. 79,1957, S. 6180),

für das Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodi-

imid-Verfahren (vgl. z. B. Sheehan

et al. in »J. Am. Chem. Soc.« Bd. 77.

1955, S. 1067),

für das N.N'-Dicyclohexylcarbodi-

imid-N-Hydroxy-succinimid-Verfah-

ren (vgl. z. B. Wünsch et al. in

»Berichte d. Deutschen Chem. Ges.«

Bd. 99, 1966, S. 110 und W e y g a η d

et al. in »Zeitschr. f. Naturforschg.«

Bd. 216, 1966, S. 426, sowie König

et al. in »Bereichte d. Dtsch. Chem.

Ges.« Bd. 103,1970, S. 788)

für das N.N'-Dicydohexylcarbodi-

imid-N-hydroxybenzotriazoi-Verfah-

ren (vgl. z. B. König et al. in »Ber. d.

Dtsch. Chem. Ges.« Bd. 103, 1970, S.

788)

für die Phosphorazo-Methode (vgl. z.

B. Goldschmidt in »Angew.

Chem.« Bd. 62, 1950, S. 538 und

Goldschmidt et al. in »Liebigs

Ann.« Bd. 580,1953, S. 68)

für den N-Hydroxysuccinimidrest

für den p-Nitrophenylrest

für den tert.-Butylrest

für Dibenzolsulfimid als Salzbildner

für den Methylrest

für Trifluoroessigsäure

für »im Vakuum«

für Ausbeute

(nach Ausbeuteangaben in %) für

»der Theorie«

für Fließpunkt (Schmelzpunkt) und

(nach der Fließpunktsangabe) für

»unter Zersetzung«.

Die Herstellung der Fragmente I, II, IV, V und VI sowie die Kondensation der Fragmente I mit II, (I-II-III) mit IV, V mit VI und (I — II — III — IV) mit (V-VI) ist im Hauptpatent, auf das diesbezüglich verwiesen wird, detailliert beschrieben. Die Herstellung des Fragmentes III,dessen Kondensation mit(I — II)und den übrigen Fragmenten, sowie die Reindarstellung und Analyse des Verfahrensprodukts wird in den folgenden Beispielen erläutert.

Beispiel 1
Herstellung des Fragments III (Teilsequenz 12—13)

Zur Herstellung von Nc*,N<5,N(u-Tris-benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-leucin wurden 30 g Z-Arg(<5,w-Z₂)-OSU (12) und 11,6 g Leucin (13) in Dioxan/Wasser (1000:500 ml) nach Zugabe von 89 ml N-Natriumhydroxidlösung unter 18stündigem Rühren umgesetzt.

j5 Nach Zusatz von 89 ml N-Salzsäure wurde das Reaktionsgemisch in Essigsäureäthylester aufgenommen, die erhaltene Lösung mit verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel i. V. entfernt. Der Rückstand wurde aus Wasser/Äthanol und Essigsäureäthylester/Diäthyläther/Petroläther umgefällt.

Ausbeute: 26,6 g(86,6% d.Th.);
F126-128°C;
₄, [λ] ϋ- 5,8 ± 1 ° bzw. [λ] - 7,1 ° (c = 1; in Essigsäure);

chromatographisch rein in n-Heptan/tertButanol/Essigsäure(5 :1 : 1)

Analyse

Ben/gef. C 62,69/62,59; H 6,28/6,41; N 10,15/9,94

Aminosäureanalyse: Arg 1,00 Leu 1,00

Beispiel 2

Kondensation (III) mit III

Eine Lösung von 1,7 g Peptid (14—22b), 1,4 g Z-Arg(o^u-Z₂)-Leu-OH (12—13), 03 g N-Hydroxysuccinimid und 0,14 ml Triethylamin in 100 ml Dimethylformamid wurde bei -10° mit 0,412 g N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 24 Sid. lang bei 4° C gerührt Nach weiterem 24stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert das Lösungsmittel LV. entfernt, und der Eindampfrückstand aus Methanol/Essigsäureäthylester umgefällt Das erhaltene Produkt wurde sorgfältig mit Wasser digeriert, abfiltriert und getrocknet

Es resultierte ΝΛ,Νό,Νω-Tris-benzyloxycarbonyl-L-arginyi-L-leucyl-L-gIutamyl()>-tert-butylester)-

L-glutarnyl()>-tert.-butylester)-N6-tert.-butyloxy-

carbonyl- L-lysyl- L-glutamyl-(y-tert.-butylester)-

L-arginyl(hydrobromid)-L-asparaginyl-Ne-tert.-

butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert.-

butylester(12-22a).

Ausb. 1,94 g (85% d.Th.).

chromatographisch rein in n-Heptan/tert-Butanol/Essigsäure (3:2:1) und n-Butanol/Essigsäure/Wasser (3:1:1)

Aminosäureanalyse:

Lys2,02 Arg 2,01 Asp 1,00 GIu 3,98

GIy 1,01 Leu 1,00

1,8 g Peptid in 500 ml Methanol wurden unter Zutropfen von 15,70 ml 0,1 N-Bromwasserstoffsäure bei pH 4,5 durch katalytische Hydrierung entacyliert. Das vom Katalysator befreite Filtrat wurde i. V. eingedampft und der erhaltene Rückstand wurde aus Methanol/Essigsäureäthylester umgefällt.

Es resultierte L-Arginyl(hydrobromid)-L-leucyl-L-glutamyl-()Mert.-butylester)-L-glutamyl(}>-tert.-butylester)-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glutamyI(}>-tert.-butylester)-L-arginyI(hydrobromidJ-L-asparaginyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert.-butylester-hydrobromid-Dihydrat (12 - 22b).
Ausb. 1,61 g(98°/od.Th.)
Analyse

Ber./gef. C 47,12/47,20; H 7,43/7,50; N 14,07/14,00

Kondensation der Fragmente I bis IV
(Gesamtsequenz 1 —22)

Kondensation vereinigt und aus dem erhaltenen Tetradecapeptid-Derivat (9—22a) wurde nach hydrogenolytischer Abspaltung der Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe

H-Glu(OtBu)-Leu-Gln-Arg(HBr)-Leu-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Arg(HBr)-

Asn-Lys(BOC)-Gly-Gln-OtBu(9-22b)

κι erhalten.

Während des Ablaufs vorstehender Reaktionen wurden die Fragmente V (6—8a) und VI (1—5a), letzteres nach Überführung in den (N-Hydroxysuccinimid)-ester(l —5b), vereinigt. Es gelang jedoch nicht

15 BOC-Phe-Val-Pro-He-Phe-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-OH(l-8)

rein zu gewinnen und die Aminosäureanalyse zeigte eine Verunreinigung mit etwa 10% (1 —5a) oder (1 —5b) an. Versuche zur Auftrennung dieses Gemisches

verliefen ohne Erfolg.
Das erhaltene »rohe« Teilstück (1 —8) wurde mit dem

obigen Teilstück (9—22b) wiederum nach dem angegebenen Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hydroxysuccinirnid-Verfahren zum

BOC-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Gln-Arg(HBr)-Leu-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(BOC)-GIu(OtBu)-Arg(HBr)-Asn-Lys-(BOC)-Gly-Gln-OtBu (1 -22a)

30

35

Mit dem carboxylendständigen Fragment I (18—22b) wurde mit Hilfe des angegebenen Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hydroxysuccinimid-Verfahrens das Fragment II (14—17a) durch Kondensation vereinigt und der erhaltene N-Benzyloxycarbonyl-nonapeptid-tert.butyl- <to ester (14—22a) wurde durch katalytische Hydrogenolyse in

45

50

H-Glu(OtBu)-GIu(OtBu)-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Arg(HBr)-Asn-Lys(BOC)-Gly-G!n-OtBu(14-22b)

überführt.

Die Vereinigung mit Fragment III wiederum mit Hilfe des genannten Verfahrens führte zur Bildung von

Z-Arg(<5,ö)-Z2)-Leu-GIu(OtBu)-Glu(OtBu)-

Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Arg(HBr)-Asn-Lys(BOC)-

Gly-Gln-OtBu(12-22a).

Durch katalytische Hydrierung wurden aus dem Undecapeptid (12—22a) die drei Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppen entfernt und durch Neutralisation der freigewordenen Guanido-Funktion mit Bromwasserstoffsäure während der Hydrierung resultierte

60

H-Arg(HBr)-Leu-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-LyS(BOC)-GIu(OtBu)-Arg(HBr)-Asn-Lys(BOC)-GIy-GIn-OtBu (12—22b)

in Form des Hydrobromkis.

Der erhaltene Undecapeptidester wurde mit Fragment IV (9—11) nach dem angegebenen Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hydroxybenzitriazol-Verfahren durch verknüpft.

Nach Abspaltung aller Schutzgruppen mittels wasserfreier Trifluoressigsäure und anschließendem Austausch der Trifluoracetat- und Bromidionen durch lonenaustauschchromatographie an einem unter der Bezeichnung »Dowex 44« bekannten schwach basischen Ionenaustauscherharz (Acetat-Form) wurde ein »Roh-Leucin-13-Motilin« (1—22b) erhalten, das aufgrund des Einsatzes von »unreinem« Teilstück (1—8) mit einer »Fehlsequenz« behaftet sein mußte, was sich bei der Reinigungsoperation auch bestätigte.

Beispiel 3
Reindarstellung und Aminosäureanalyse

Gemäß Hauptpatent erfolgte die Reinigung in Anlehnung an die Reindarstellung von natürlichem Motilin durch Ionenaustausch-Chromatographie mit Hilfe eines stark basischen Anionenaustauscherharzes, z. B. des in der Acetatform vorliegenden, unter der Bezeichnung »QAE-Sephadex A-25« bekannten Harzes auf der Basis eines modifizierten Dextrans mit Diäthyl-(2-hydroxypropyl)-aminoäthylresten als funktionelle Gruppen, und danach mit Hilfe eines stark sauren Kationenaustauscherharzes, z.B. des in der Ammoniumform vorliegenden, unter der Bezeichnung »SP-Sephadex C-25« bekannten Harzes auf der Basis eines modifizierten Dextrans mit Sulfopropylresten als funktionellen Gruppen.

Eine Aminosäureanalyse wurde nach saurer Hydrolyse (6 N-HCl) durchgeführt, wobei sich zeigte, daß praktisch dieselben Werte bei 20 und bei 72 Std. Hydrolysezeit erzielt wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt

ίο

Tabelle

Gefunden Berechnet

Lys	2,00	2
Arg	1,93	2
Asp	1,00	1
Thr	0,97	1
GIu	6,18	6
Pro	0,98	1
GIy	1,99	2
VaI	0,90	1
He	0,90	1
Leu	1,94	2
Tyr	0,93	1
Phe	1,82	2

Die biologische Aktivität des gefriergetrockneten L-Leucin-13-Motilins war praktisch gieich derjenigen des L-Norleucin-13-Motilins und unterschied sich somit kaum von derjenigen des natürlichen Motilins.

Hierzu 2 Bhill Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Weitere Ausbildung des Gegenstandes von Patent 23 15 271, betreffend L-Norleucin-13-Motilin der Formel

H Phe-VaI-PrO-Ile-Phe-Thr-Tyr-Gly-Glu-Leu-Gln-Arg-Nie-Glu-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly-Gln-OH (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) <12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22)

dadurch gekennzeichnet, daß die vorgenannte Verbindung in Stellung (13) an Stelle von L-Norleucyl (Nie) L-Leucyl (Leu) aufweist

2. Verfahren zur Herstellung von L-Leucin-13-Motilin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise