DE2334314A1

DE2334314A1 - Verfahren zur herstellung von polynucleotiden auf mikrobiologischem weg

Info

Publication number: DE2334314A1
Application number: DE19732334314
Authority: DE
Inventors: Yoshiki Katoh; Akira Kuninaka; Kyuji Rokugawa; Hiroshi Yoshino
Original assignee: Yamasa Shoyu KK
Current assignee: Yamasa Shoyu KK
Priority date: 1972-07-21
Filing date: 1973-07-05
Publication date: 1974-02-07
Also published as: DE2334314B2; JPS4930594A; IT1043863B; CA990671A; JPS524633B2; FR2193878B1; FR2193878A1; DE2334314C3; DE2365894A1; US3849249A; GB1394843A; DE2365894C2

Description

¹¹ Verfahren zur Herstellung von Polynuoleotiden auf mikrobiologischem Weg ^w

Priorität: 21. Juli 1972, Japan, Nr. 72 471/72

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden aus Nucleosiddiphosphaten unter der Einwirkung der Polynucleotid-Phosphorylase (Nucleosiddiphosphat: Polynucleotidyl-Transferase) eines Mikroorganismus der Gattung Achromobacter.

Polynucleotide wurden 1955 von S. Ochoa und M. Grunberg-Manago ( Fed. Prov. 1_4 (1955)S_f221) hergestellt. Seitdem wurden verschiedene biochemische Wirkungen dieser Verbindungen beobachtet. Insbesondere lässt die Interferon induzierende

als Aktivität dieser Verbindungen eine Verwendbarkelt/Arzneistoffe

erwarten. Die wirtschaftliche Herstellung von Polynucleotiden

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in grossem Maßstab war jedoch recht schwierig, da die Polynucleotide wegen ihrer komplizierten Struktur nicht auf chemischem Weg synthetisiert werden können. Obwohl es bekannt ist, dass Polynucleotide aus Nucleosiddiphosphaten unter der Einwirkung gereinigter Polynucleotid-Phosphorylase hergestellt werdeji können und dieses Enzym in vielen Mikroorganismen vorkommt, war bisher dieses Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden in grossem Maßstab nicht geeignet.

Die bekannten Polynucleotid-Phosphorylasen sind intracelluläre Enzyme. Bisher konnten sie jedoch in grossem Maßstab wirtschaftlich nicht aus den Zellen extrahiert werden. Ausserdem konnten verunreinigte Polynucleotid-Phosphorylase-Lösungen ohne weitere Reinigung nicht zur Herstellung von Polynucleotiden verwendet werden, da diese Rohenzymlösungen verschiedene andere Enzyme enthalten, die Nucleosiddiphosphate und/oder Polynucleotide abbauen. So enthalten z.B. Extrakte aus Escherichia coli, Micrococcus lysodeikticus und Azotobacter vinelardii,* die als Quelle für Polynucleotid-Phosphorylase bekannt sind, grosse Mengen an Nucleasen und an Nucleosiddiphosphat abbauenden Enzymen. Zur Herstellung eines Polynucleotide in guter Ausbeute müssen diese Extrakte daher vorher intensiv gereinigt werden.

Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, wurde ein Screening auf Mikroorganismen durchgeführt, die zur Herstellung von Polynucleotiden in grossem Maßstab geeignet sind. Ferner wurden die für die Herstellung von Polynucleotid günstigen Be-

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dingungen untersucht. Diese Untersuchungen ergaben, dass Mikroorganismen der Gattungen Pseudoinonas, Aerobacter, Proteus, Bacillus, Serratia, Xanthomonas und Brevibacterium eine hohe Polynucleotid-Phosphorylase-Aktivität aufweisen und dass dieses Enzym leicht aus den Zellen extrahiert werden kann. Ausserdem enthalten solche Extrakte nur wenig Nucleasen und Nucleosiddiphosphat abbauende Enzyme. Bei der Fermentation von Stämmen dieser Mikroorganismen, bei der Inkubation von Zellsuspensionen und von aus den aufgebrochenen Zellen hergestellten Präparationen können ohne weitere Reinigung aus mindestens einem Nucleosiddiphosphat wirtschaftlich Polynucleotide hergestellt werden ( . OS 2 107 U8- ).

Ferner wurde überraschenderweise festgestellt, dass Mikroorganismen der Gattung Achromobacter besonders viel PoIynucleotid-Phosphorylase enthalten. Dieses Enzym kann aue den Zellen leicht extrahiert werden und ist weitgehend stabil.

Gegenstand .der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden auf mikrobiologischem Weg, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Mirkoorganismus der Gattung Achromobacter entweder

a) in Gegenwart mindestens eines Nucleosiddiphosphats und zweiwertiger Metallkationen fermentiert oder

b) in üblicher Weise fermentiert, die Zellmasse von der Kulturbrühe abtrennt, in einer Inkubationslösung suspendiert und in Gegenwart zweiwertiger Metallkationen und

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mindestens eines Nucleosiddiphosphats inkubiert oder

c) in üblicher Weise fermentiert, die Zellmasse von der Kulturbrühe abtrennt, die Zellen aufbricht, in einer Inkubationslösung suspendiert und in Gegenwart zweiwertiger Metallkationen und mindestens eines Nucleosiddiphosphats inkubiert.

Als zweiwertige.Metallkationen werden im erfindungsgemässen

bevorzugt
Verfahren/Magnesium- oder Mangan(II)- I&tionen verwendet.

Bisher war nicht bekannt, dass Mikroorganismen der Gattung Achromobacter besonders viel Polynucleotid-Phosphorylase enthalten und dass sich dieses Enzym für die wirtschaftliche Herstellung in grossem Maßstab von Polynucleotiden eignet. Es wurde festgestellt, dass alle untersuchten Stämme der Gattung Achromobacter, sowohl Stammkulturen als auch frisch isolierte Kulturen, besonders viel Polynucleotid-Phosphorylase enthalten. Das erfindungsgemässe Verfahren kann z.B. mit Hilfe der folgenden Stämme durchgeführt werden :

Achromobacter cycloclastes (ATCC 21921)

Achromobacter delmarvae, Smart. ' (ATCC 21922)

Achromobacter sp. ΚΕΠ7Ο-4 (ATCC 21942)

Achromobacter parvulus, (Conn) Breed. (ATCC 4335)

Achromobacter parvulus, (Conn) Breed. (NRRL B-2395)

Der Stamm Achromobacter sp. KR17O-4 (ATTC 21942) wurde aus "Kamaboko" isoliert. Die mikrobiologischen Merkmale dieses

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Stammes sind :

. Mikroskopisches Erscheinungsbild ;

a) Kurze Stäbchen mit einer Länge von 1,5 Mikron und einer Dicke von 0,5 Mikron

b)· nicht beweglich c) gramm-negativ

2. Eigenschaften der Kultur ;

a) Gelatine-Nährböden ;

kreisförmige, aufgewölbte, glänzende, durchsichtige und bläulich-weisse Kolonien; die Gelatine wird nicht verflüssigt

b) Agar-Schrägröhrchen :

dichtes Wachstum, faserförmige, konvexe, glänzende, weiche, durchsichtige und bläulich-weisse Kolonien

c) flüssiges Nährmedium :

trüb, dünnes Häutchen auf der Oberfläche, reichliches Sediment, weiss; die Farbe des Mediums ist unverändert

d) Gelatine-Stichkultur :

schwaches Wachstum, die Gelatine wird nicht verflüssigt,

e) Kartoffel-Nährböden :

dichtes Wachstum, gräulich-weisse, glänzende, weiche und aufgewölbte Kolonien; die Farbe des Mediums ändert sich von weiss auf rauch-grau

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3· Physiologische Eigenschaften :
• a) Lackmus-Milch : alkalisch, keine Veränderung

b) Indolbildung : keine

c) Nitrat-Reduktion : Nitrat wird zu Nitrit reduziert

d) Sauerstoffbedarf : aerob

e) Temperaturoptimum: 25⁰G

gutes Wachstum bis 30⁰G schwaches Wachstum bei O⁰C

f) Zuckerverwertung : Säure-, jedoch keine Gasbildung aus

Glukose, Fruktose, Galaktose, Mannose und Xylose -

alkalische Reaktion, jedoch keine Gasbildung, aus Saccharose, Lactose und Arabinose-

Die meisten der angeführten Merkmale ähneln sehr den Merkmalen von Achromobacter delmarvae (vgl. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7.Auflage, (1957), S. 308). Der oben beschriebene Stamm unterscheidet sich jedoch von der bekannten Art Achromobacter delmarvae dadurch, dass er aus Lactose keine Säure bildet; er erhält daher den Namen Achromobacter sp. KR170-4·

Im erfindungsgemässen Verfahren können Polynucleotide, z.B. Polyinosinsäure, Polyguanylsäure, Polycytidylsäure, PoIyadenylsäure und Polyuridylsäure.(im folgenden als Poly I₁

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Poly G, Poly C, Poly A und Poly U bezeichnet) hergestellt werden. Als Nucleosiddiphosphate können im erfindungsgemässen Verfahren z.B. Inosindiphosphat, Guanosindiphosphat, Qytidindiphosphat, Adenosindiphosphat und Uridindiphosphat (im folgenden rait IDP, GDP, CDP, ADP und UDP bezeichnet) verwendet werden. Wird im erfindungsgemässen Verfahren ein Gemisch mehrerer Nucleosiddiphosphate eingesetzt, so entstehen gemischte Polynucleotide. Setzt man z.B. als Ausgangsverbindung IDP ein, so entsteht Poly I; wird ein Gemisch aus GDP und CDP eingesetzt, so entsteht das gemischte Poly G-C In letzterem Fall werden die als Ausgangsverbindungen verwendeten Nucleosiddiphosphate so vermischt, dass das Verhältnis der Nucleosiddiphosphate dem gewünschten Verhältnis der Basen im PoIynucleotid entspricht.

Im erfindungsgemässen Verfahren kann jeder Mikroorganismus der Gattung Achromobacter, der eine hohe und leicht extrahierbare Polynucleotid-Phosphorylase-Aktivität aufweist, verwendet werden, unabhängig von seiner taxonomischen Stellung.

Die Fermentation der Mikroorganismen wird in üblicher Weise in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Bestandteile und Spuren wichtiger Nährstoffe enthaltenden Nährmedium durchgeführt. Die pH-, Belüftungs- und Temperaturoptima werden für jeden Stamm entsprechend gewählt.

Werden die Polynucleotide bei der Fermentation eines Mikroorganismus hergestellt, so wird der wachsenden Kultur mindestens ein Nucleosiddiphosphat und gegebenenfalls mindestens

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ein zweiwertiges Metallkation zugesetzt. Bei der weiteren Fermentation wird das bzw. die zugesetzten Nucleosiddiphosphat (e)in ein entsprechendes Polynucleotid umgewandelt. Gewöhnlich wird die wachsende Kultur zu einem bestimmten Zeitpunkt mit der gesamten Menge des bzw. der Nucleosiddiphosphat(e) versetzt; die portionsweise Zugabe der Nucleosiddiphosphate ergibt ebenfalls zufriedenstellende Ergebnisse.

Bei der Herstellung der Polynucleotide durch Inkubation der Zellmasse eines Mikroorganismus isoliert man die Zellen einer Kultur durch Zentrifugieren, wenn die Polynueleotid-Phosphorylase-Aktivität der Zellen das Maximum erreicht hat. Das Maximum wird im allgemeinen in der spaten Log-Phase beobachtet.

in Die abzentrifugierte Zellmasse wird / einem Inkubationsmedium, das mindestens ein Nucleosiddiphosphat, mindestens ein zweiwertiges Metallkation und einen Puffer oder Natriumchlorid enthält, suspendiert. Die Suspension wird dann unter für die Herstellung von Polynucleotid en günstigen Bedingungen inkubiert. Die- Konzentration des Puffers oder der Natriumchloridlösung liegt zwischen 0,001 m und 0,3 m. Der pH-Wert liegt zwischen 6 und 12. Die optimalen Bedingungen werden im allgemeinen bei einer Konzentration von 0,1 m und einem pH-Wert von 9 beobachtet.

Polynucleotide können im erfindungsgemässen Verfahren auch unter Verwendung aufgebrochener Zellen, Zeilrohextrakten oder daraus hergestellten partiell gereinigten Präparationen erhalten werden. Di~ Zellen können z.B. durch Ultraschall-

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behandlung, Durchpressen durch eine enge Düse, Verreiben mit Aluminiumoxid oder Quarzsand, durch Behandlung mit einer lysierenden Verbindung oder einer hochkonzentrierten Natriumchloridlösung aufgebrochen werden.

Die Extraktion der Polynücleotid-Phosphorylase in grossem Maßstab lässt sich besonders wirksam mit einer hochkonzentrierten Natriumchloridlösung durchführen. Zu diesem Zweck wird die abzentrifugierte Zellmasse in einer hochkonzentrierten, gewöhnlich gesättigten}Natriumchloridlösung, suspendiert. Die Suspension wird einige Zeit, im allgemeinen über Nacht, stehen gelassen und dann zentrifugiert. Die abzentrifugierte Zellmasse wird in einem Puffer oder in Wasser suspendiert, wobei die Polynücleotid-Phosphorylase aus den aufgebrochenen Zellen extrahiert wird. Die Extraktion wird noch wirksamer, wenn man die aufgebrochenen,mit Natriumchlorid behandelten Zellen einer Dialyse unterwirft. Die aufgebrochenen Zellen werden mit einer geringen Menge Wasser oder Puffer in einen Dialysiersohlauch eingebracht, der in viel Pufferlösung oder Wasser eingetaucht wird. Nach der Dialyse wird die im Dialysierschlauch befindliche Lösung zentrifugiert. Der von den Zelltrümmern befreite Zeilrohextrakt enthält die PoIynucleotid-Phosphorylase-Aktivität.

Einige Stämme, z.B. Achromobacter parvulus, enthalten beträchtliche Mengen an Nucleinsäuren und/oder Nucleosiddiphosphat abbauenden Enzymen. Diese Enzyme müssen vor der Herstellung der Polynucleotide entfernt werden, z.B. durch Be-

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handeln der Extrakte mit Streptomycin zur Entfernung der Nucleinsäuren und durch fraktioniertes Aussalzen mit Ammoniumsulfat. Die meisten der störenden Enzyme werden durch ,Aussalzen mit zu 50 Prozent gesättigtem Ammoniumsulfat entfernt. Die Hauptmenge der Polynucleotid-Phosphorylase-Aktivität wird dann durch fraktionierte Fällung mit zu 50 und 80 Prozent gesättigtem Ammoniumsulfat wiedergewonnen. Auf diese Weise erhält man leicht eine Enzymlösung, die besonders reich an Polynucleotid-Phosphorylase-Aktivität ist und nur wenig Nucleinsäure und/oder Nucleosiddiphosphat abbauende Enzyme enthält. Man kann die störenden Enzyme aber auch durch Fraktionieren mit organischen Lösungsmitteln entfernen. Die von den störenden Enzymen befreite Polynucleotid-Phosphorylase kann dann ohne weitere Reinigung zur Herstellung von PoIynucleotiden verwendet werden. Gegebenenfalls kann man das Enzym noch durch Kolonnenchromatographxe mit vernetztem Dextran mit Ionenaustauschereigenschaften, DEAE-Sephadex, reinigen. Da die Polynucleotid-Phosphorylase aus Mikroorganismen der Gat*tung Achromobacter weitgehend stabil ist', müssen bei der Extraktion, Reinigung und Inkubation keine besonderen Vorsichtsmassnahmen ergriffen werden. Die Mikroorganismen der Gattung Achromobacter sind deshalb für die Herstellung in grossem Maßstab von Polynucleotiden besonders geeignet.

Im allgemeinen wird im erfindungsgemässen Verfahren die Inkubation bei einer Temperatur von 0 bis 60°C und einem pH-Wert von 6 bis 12 durchgeführt. Die bei der Fermentation bzw. Inkubation nicht umgesetzten Nucleosiddiphosphate können in

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herkömmlicher Weise aus der Kulturbrühe bzw. aus dem Inkubationsgemisch leicht zurückgewonnen und bei weiteren Umsetzungen erneut als Ausgangsverbindungen eingesetzt werden.'

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Achromobacter cycloclastes (ATCC 21921) wird 24 Stunden bei 28⁰C in 10 ml Nährmedium, das 10 Prozent pulverisierten Fleischextrakt enthält, unter Schütteln inkubiert. Mit dieser Kultur wird ein 500 ml Nährmedium enthaltender 3 Liter-Erlenmeyer-Kolben beimpft. Die Fermentation wird 24 Stunden bei 28⁰C unter Kreisschütteln durchgeführt. Man erhält daraus 8 g feuchte Zellmasse, die in 80 ml gesättigter Natriumchioridlösung suspendiert und über Nacht stehengelassen wird. Die Suspension wird dann zentrifugiert, der Niederschlag wird in 16 ml Leitungswasser suspendiert und· 12 Stunden gegen Leitungswasser dialysiert. Die im Dialysiersehlauch zurückbleibende Suspension wird tropfenweise unter Rühren mit 6 ml einer lOprozentigen Streptomycinsulfatlösung, pH 7,6, versetzt. Der sich bildende Niederschlag wird abzentrifugiert. Der Überstand v/ird gegen 0,02 m Tris-HCl-Pufferlösung, pH 7>6, dialysiert. Die im Dialysiersehlauch zurückbleibende Lösung, etwa. 25 ml, wird als Rohenzymlösung verwendet.

1,5 g CDP-Natriumsalz und 0,05 g Mangan(II)-Chlorid werden in 100 ml 0,1 m Natriumchloridlösung, pH 9,2, gelöst und mit

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15 ral der Rohenzymlösung vermischt. Das Reaktionsgemisch wird 6 Stunden bei 37°C inkubiert und dann mit 100 ml Äthanol unter Rühren versetzt* Aus dem entstandenen Niederschlag wird Poly G in herkömmlicher Weise isoliert und gereinigt. Man erhält 672 mg (45 Prozent) gereinigtes Poly G mit einem Sedimentationskoeffizienten von 5,2 S.

. Beispiel2

Achromobacter delmarvae (ATGC 21922) wird in 1 Liter des in Beispiel 1 angegebeneu l\iährmediums 14 Stunden unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen fermentiert. Es wird gemäss Beispiel 1 aufgearbeitet, wobei man 17»5 g feuchte Zellmasse und schliesslich 30 ml Rohenzymlösung erhält.

1,5 g IDP-Natriumsalz und 50 mg Mangan( II)-Chlorid v/erden in 100 ml 0,1 m Tris-HCl-Puffer, pH 9,2, gelöst und mit 10 ml der Rohensymlösung versetzt. Das Gemisch wird 6 Stunden bei 37⁰C inkubiert und dann mit 100 ml Äthanol versetzt. Aus dem gebildeten Niederschlag wird Poly 1 in herkömmlicher Weise isoliert und gereinigt. Man erhält 760 mg (51 Prozent) gereinigtes Poly I mit einem Sedimentationskoeffizienten von 6,9 S.

Beispiel 3

Achromobacter delmarvae (ATCC 21922) wird in 10 ml des in Beispiel 1 angegebenen Nährmediums bei 28⁰C über Nacht

Ein
fermentiert./100 ml Nälirmedium enthaltender Erlenmeyer-Kolben

wird mit 1 ml dieser Kultur beimpft. Die Fermentation wird

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10 Stunden bei 28⁰G durchgeführt. Diese Kultur wird mit 2 g pulverisiertem CDP-Natriumsalz und 0,15 g Mangan(II)-chiorid versetzt und weiter inkubiert. Nach 48 Stunden werden die Zellen abzentrifugiert, der Überstand wird mit 200 ml Äthanol versetzt. Poly C wird in üblicher Weise aus dem gebildeten Niederschlag isoliert und gereinigt. Man erhält 923 mg (46 Prozent) gereinigtes Poly 0 mit einem Sedimentationskoeffizienten von 6,7 S.

Beispiel 4

Achromobacter parvulus (ATCC 4335) wird unter Schütteln bei 28°C in 10 ml des in Beispiel 1 angegebenen Nährmediums über Nacht fermentiert. Mit dieser Kultur wird ein 3 Liter-Erlenmeyer-Kolben, der 500 ml eines Nährmediums enthält, das aus 5 Prozent Koji-Sehimmelpilz-Extrakt und 0,8 Prozent Hefeextrakt, pH 7,0, besteht, beimpft. Die Fermentation wird 14 Stunden unter Kreisschütteln bei 28⁰C durchgeführt. Es wird gemäss Beispiel 1 aufgearbeitet. Man erhält 11g feuchte Zellmasse und schliesslich 30 ml Rohenzymlösung. Die eisgekühlte Rohenzymlösung wird portionsweise mit 10,6 g gepulvertem Ammoniumsulfat unter Rühren versetzt. Der gebildete Niederschlag wird abzentrifugiert.

Der eisgekühlte Überstand wird unter Rühren portionsweise mit 6)4 g gepulvertem Ammoηiumsulfat versetzt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und in 0,02 m Tris-HCl-Puffer _} pH 7,6 j gelöst und gegen diesen Puffer über Nacht dialysiert. Die im

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Dialysierschlauch zurückbleibende Lösung, 3,1 ml, wird als Enzymlösung verwendet.

1,5 g IDP-Natriurasalζ und 50 mg Mangan(II)-chiorid werden in 100 ml 0,1 m Tris-HCl-Puffer, pH 9,2, gelöst und mit 1,5 ml der Enzymlösung versetzt. Das Gemisch wird 6 Stunden bei 37⁰C inkubiert und dann mit 100 ml Äthanol versetzt. Aus dem Riederschlag wird Poly I in üblicher Weise isoliert und gereinigt. Man erhält 826 mg (55 Prozent) gereinigtes Poly I mit einem Sedimentationskoeffizienten von 6,5 S.

Beispiel 5

Achromobacter parvulus (NRRL B-2395) v/ird in 1 Liter des in Beispiel 4 angegebenen ITährmediums und unter denselben Bedingungen fermentiert. Man erhält 21 g feuchte Zellmasse und nach fraktioniertem Aussalzen mit Amaoniumsulfat gemäss Beispiel 4 schliesslich 6,5 ml Rohenzymlösung.

1,5 g IDP-Natriumsalζ und 50 mg Mangan(II)-Chlorid werden in 100 ml 0,1 m Natriumchloriglösung, pH 9j2, gelöst, dann mit 0,8 ml Enzymlösung versetzt. Das Gemisch wird 9 Stunden bei 20⁰C inkubiert und mit Äthanol versetzt. Aus dem Niederschlag wird in herkömmlicher V/eise Poly I isoliert und gereinigt.. Man erhält 584 mg (39 Prozent) gereinigtes Poly I mit einem Sedimentationskoeffizienten von 8,5 S.

Beispiel 6

1,5 g ADP-Natriumsalζ und 50 mg Mangan(II)-Chlorid werden in

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100 ml 0,1 m Natriumchloridlösung gelöst und mit einer gemäss Beispiel 5 hergestellten Enzymlösung versetzt. Das Gemisch wird 4 Stunden bei 37°C inkubiert und dann mit 100 ml 'Äthanol unter Rühren versetzt. Aus dem Niederschlag wird Poly A in herkömmlicher V/eise isoliert und gereinigt. Man erhält 870 mg (58 Prozent) gereinigtes Poly A mit einem Sedimentationskoeffizienten von 6,2 S.

Beispiel 7

Achromobacter sp. KR17O-4 (ATCC 21942) wird in 2 Liter des in Beispiel 4 angegebenen Mediums 10 Stunden unter den Bedingungen des Beispiels 4 fermentiert.. Es wird"gemäss Beispiel 1 aufgearbeitet, und man erhält 32 g feuchte Zellmasse und schliesslich 62 ml Rohenzymlösung.

15 g IDP-Natriumsalz und 0,5 g Mangan(II)-chlorid werden in 1 Liter 0,1 m Natriumchloridlösung, pH 8,7, gelöst und mit 30 ml Rohenzymlösung versetzt. Das Gemisch wird 8 Stunden bei

ο mit .

30 C inkubiert und dann/1 Liter Äthanol versetzt. Aus dem Niederschlag wird nach herkömmlicher Weise Poly I isoliert und gereinigt. Man erhält 6,5 g (43 Prozent) gereinigtes Poly I mit einem Sedimentationskoeffizienten von 9,2 S«

Beispiel 8

1,5 g UDP-Natriumsalz und 200 mg Magnesiumchlorid werden in 100 ml 0,1 m Natriumchloridlösung, pH 9,2, gelöst und mit 4 ml gemäss Beispiel 7 hergestellter Rohenzymlösung versetzt.

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Das Gemisch wird 6 Stunden bei 37⁰G inkubiert und dann mit 100 ml Äthanol versetzt. Aus dem Niederschlag wird in herkömmlicher Weise Poly U isoliert und gereinigt. Man^erhält 620 mg (41 Prozent) gereinigtes Poly U mit einem Sedimentationskoeffizienten von 5,0 S.

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Claims

Patentansprüche

Qt Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden atrf mikrobiologischem Weg, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus der Gattung Achromobacter entweder

a) in Gegenwart mindestens eines Nucleosiddiphosphats und zweiwertiger Metallkationen fermentiert oder

b) in üblicher V/eise fermentiert, die Zellmasse von der Kulturbrühe abtrennt, in einer Inkubationslösung suspendiert und in Gegenwart zweiwertiger Metallkationen und mindestens eines Nucleosiddiphosphats inkubiert oder

c) in üblicher Weise fermentiert, die Zellmasse von der Kulturbrühe abtrennt, die Zellen aufbricht» in einer Inkubationslösung suspendiert und- in Gegenwart zweiwertiger Metallkationen und mindestens eines Nucleosiddiphosphats inkubiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen der nachstehenden Stämme fermentiert :

Achromobacter cycloclastes (ATCC 21921)

Achromobacter delmarvae (ATCC 21922)

Achromobacter sp. KR170-4 (ATCC 21942)

Achromobacter parvulus (ATCC 4335)

Achromobacter parvulus (NRRL B-2395).

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3· Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als zweiwertige Metallkationen Magnesium- oder Mangan(ll)-Kationen verwendet. · -*
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3j dadurch gekennzeichnet, dass man das Nucleosiddiphosphat und das zweiwertige Metallkation der wachsenden Kultur des Mikroorganismus zusetzt und weiter fex'mentiert.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Zellmasse bei Erreichen des Icl/nucleotid-Phosphorylase-Aktivitätsmaximums von der Kulturbrühe abzentrifugiert.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Zellmasse in einer Inkubationslösung, die das zweiwertige Metallkation, das Nucleosiddiphosphat und einen Puffer oder Natriumchlorid enthält, suspendiert und inkubiert.
7· Verfahren nach Anspruch 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, dass man für die Inkubation einen Zellrohextrakt oder eine daraus hergestellte partiell gereinigte Präparation verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3j dadurch gekennzeichnet, dass man die Zellen mit einer hochkonz enterten Natriumchloridlösung aufbricht und in Puffer oder Wasser suspendiert.

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9· Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man die Inkubation bei einer Temperatur von O bis 60⁰C und einem pH-Wert von 6 bis 12 durchführt.

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