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Verfahren zur Gewinnung von Laevansucrase
Es ist bekannt, dass Bac. subtilis und auch einige andere Bakterien in Gegenwart von Rohrzucker
Laevan bilden, und es sind bereits einige Versuche beschrieben worden, mit dem laevanbildenden Fer- ment, der Laevansucrase, eine rein fermentative Laevansynthese durchzuführen (Literatur : Nature, 149 (1942), S. 527 ; Appl. Microbiol., 3 [1955], S. 321, I. biol. Chem. 159 [1945], S. 585).
Das Ferment wird unter den bisher bekanntgewordenen Bedingungen, jedoch nur in so geringen Kon- zentrationen gebildet, dass kein technisches Verfahren darauf aufgebaut werden konnte ; über seine Rein- darstellung und chemische Konstitution ist bisher nichts bekanntgeworden. Für die Darstellung technischer
Ansätze von Laevan, wie sie für verschiedene pharmazeutische Zwecke gebraucht werden könnten, hat das Enzym bisher keine Rolle gespielt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung von Lösungen des En- zyms Laevansucrase, das unter geeigneten Bedingungen in der Lage ist, aus Saccharose hochmolekulares
Laevan aufzubauen. Die Laevansucrase wird bei diesem Verfahren in Kulturen von Bac. subtilis gebildet.
Es wurde gefunden, dass es unter Einhaltung einer ganzen Reihe bestimmter Bedingungen möglich ist,
Lösungen von Laevansucrase in verhältnismässig sehr hohen Konzentrationen technisch herzustellen. Die
Gewinnung maximaler Mengen des Fermentes gelingt erfindungsgemäss, wenn man Bac. subtilis in einer filtrierten Nährlösung, die ausser den üblichen organischen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, zweckmä- ssig in Form von Maisquellwasser, noch 0, 1-2, oho Ammoniumsalze (berechnet als Ammoniumsulfat), 2 - 15"/0, vorzugsweise 10%, Saccharose und den für das optimale Wachstum der Mikroorganismen erfor- derlichen, jedoch 0, 15% nicht übersteigenden Gehalt an Phosphaten (berechnet als KHPO") enthält, un- ter intensiver Belüftung bei einem PH von 6,0 bis 7,
0 vorzugsweise bei einer Temperatur von ungefähr 300C und innerhalb von ungefähr 7 bis 15 Stunden züchtet, wobei gegebenenfalls auftretende Nieder- schläge jeweils entfernt werden, und die gebildete Laevansucrase, gegebenenfalls nach Abtrennung bzw.
Abtötung der Mikroorganismen nach an sich bekannten Methoden gewinnt.
Beim erfindungsgemässen Verfahren wird als Grundnährlösung zweckmässig eine 2% ige Maisquell- wasserlösung verwendet, aus der zuvor die in der Hitze bei PH 7,0 fällbaren Stoffe entfernt wurden. Be- züglich der Wirkung der einzelnen Massnahmen der erfindungsgemässen Kombination wird folgendes fest- gestellt :
Es zeigte sich, dass bei Konstanz der Rohrzuckerkonzentration und anderer Fermentationsbedingun- gen Zusätze von Ammonium-Ionen zur Grundnährlösung in den oben angegebenen Grenzen zu einem er- heblich höheren Gehalt an Laevansucrase in der Kultur führen, während gleichzeitige Erhöhung des Phos- phatgehaltes über 0, 15% eine starke Herabsetzung der Bildung von Laevansucrase bewirkt.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die hauptsächliche Laevansucrase-AusschUttung erst zwi- schen der logarithmischen und der stationären Wachstumsphase von Bac. subtilis beginnt, jedoch sofort aufhört, sobald der Rohrzucker verbraucht ist.
Besonders hohe Ausbeuten an Laevansucrase wurden bei sehr intensiver Belüftung und bei einer Tem- peratur von zirka 300C erzielt. Bemerkenswerterweise wird bei höheren Temperaturen trotz schnellerer
Zellvermehrung wesentlich weniger Enzym gebildet.
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Von wesentlicher Bedeutung ist es, die Fermentation bei einem PH von 6,0 bis 7,0 zu führen, indem man die gebildete Säure mit CaCO und, wenn erforderlich, durch zusätzliche Gaben von konzentrierter Sodalösung neutralisiert.
Laevansucrase wird ausserordentlich leicht adsorptiv gebunden, wobei gewisse Eigenschaften des Fermentes verändert werden (vgl. österr. Patentschrift Nr. 205173). Da die bei neutraler Reaktion in der Hitze aus Maisquellwasserlösungen fällbaren organischen und anorganischen Stoffe eine sehr stark adsorptive Wirkung für Laevansucrase besitzen und der mikrobielle Aufschluss gewisser Bestandteile dieser in erhitztem Maisquellwasser enthaltenen Feststoffe die Bildung von Laevansucrase in der Kultur stark hemmt, ist es erforderlich, solche Stoffe vor der Beimpfung der Nährlösungen zu entfernen.
Die verwendete Methode zur Bestimmung relativer Konzentrationen von Laevansucrase ist trotz einer vergleichweise grossen Fehlergrenze für technisch-betriebliche Belange ausreichend. Als relatives Mass für entstandene Laevankonzentration diente der bei der enzymatischen Synthese des Polysaccharids auf-
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Standard-Glukose-Lösungläuft, sondern bei höheren Laevansucrase-Konzentrationen schon sehr schnell zu einem Gleichgewicht führt, wurden mehrere Verdünnungen jeder Kulturlösung hergestellt und diese mit jeweils gleichen Mengen an Rohrzucker (25go) versetzt. Die Proben wurden mit Toluol versetzt, 17 Stunden bei 300C gehalten und dann zwecks Inaktivierung des Enzyms kurz auf 1000C erhitzt.
Der bereits in der Kulturlösung vorliegende "Anfangsgehalt an reduzierendem Zucker" wurde bestimmt, nachdem unverdtinnte Proben der Kulturlösung sofort nach der Zugabe von Rohrzucker auf 1000C erhitzt worden waren. Zur Berechnung der Laevansucrase-Konzentration wurden nur die Verdünnungen von Kulturlösungen verwendet, die nach Ende der angeführten Reaktionszeit nicht mehr als 1, 0-5, 0% reduzierenden Zuckers, bezogen auf Glukose, enthielten. Die nach Abzug des"Anfangsgehaltes an reduzierendem Zucker" mit dem Verdunnungsfaktor multiplizierte "Glukose-Konzentration" ergab so die relative Konzentration an Laevansucrase.
Beispiel l : 2% ige Maisquellwasserlösung wird mit KOH auf pH 7 eingestellt, 20 Minuten auf 120 C erhitzt und nach Abkühlen filtriert. Nach Zusatz von 10% Rohrzucker und 0, 30/0 (NHSO wird die Lösung 40 Minuten bei 110 C sterilisiert und zu 7,5 1 in einen Laboratoriumsfermenter abgefüllt. Der Fermenter wird mit 150 cm3 einer 15- bis 18stündigen Schüttelkultur eines laevanbildendenStammes von Bac. subtilis, welcher in rohrzuckerfreier Grundnährlösung bei 300C kultiviert wurde, beimpft. Es folgt ein Zusatz einer sterilen Suspension von 75 g CaCOs in 150 ems Wasser. Die Fermentation wird mit 41 Luft je Minute bei 400 Umdrehungen des Rührwerkes je Minute belüftet. Die Temperatur beträgt 30 C.
Wenige Stunden nach der Beimpfung verschiebt sich der pH-Wert in den sauren Bereich. Von diesem Zeitpunkt an wird der pH-Wert der Kultur durch häufige Zusätze von konzentrierter Na CO-Lösung zwischen 6, 2 und 6,8 gehalten. Nach 12sttindiger Kulturdauer beträgt die relative Konzentration an Laevansucrase im Fermentationsansatz 45, 0.
Beispiel 2 : In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse einer Reihe von Vergleichsversuchen zu Beispiel 1 zusammengefasst. Aus dem sehr wechselnden Gehalt der Kulturen an Laevansucrase geht die Bedeutung der erfindungsgemässen Kombination der Kulturbedingungen hervor. Eine relative Laevansucrase-Konzentration von 8,3 in Versuch H besagt, dass der Enzymgehalt gegenüber dem in Beispiel 1 (relative Laevansucrase-Konzentration = 45) knapp 20% beträgt.
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Maisquellwasser, <SEP> enthaltend <SEP> (NH) <SEP> SC <SEP> K. <SEP> HPO <SEP> Belüftung <SEP> Relativer <SEP> Laevan-
<tb> 10% <SEP> Rohrzucker <SEP> (filtriert <SEP> % <SEP> % <SEP> (l <SEP> Luft <SEP> je <SEP> Minute) <SEP> sucrase-Gehalt
<tb> bzw. <SEP> nicht <SEP> filtriert) <SEP> der <SEP> Kultur
<tb> A <SEP> filtriert--4 <SEP> 14,4
<tb> B <SEP> filtriert <SEP> 0, <SEP> 03-4 <SEP> 26,2
<tb> C <SEP> filtriert <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> - <SEP> 4 <SEP> 37,7
<tb> D <SEP> filtriert <SEP> 0,15 <SEP> 0,15 <SEP> 4 <SEP> 20,0
<tb> E <SEP> filtriert <SEP> 0,15 <SEP> 0,05 <SEP> 4 <SEP> 27,0
<tb> F <SEP> filtriert-0, <SEP> 15 <SEP> 4 <SEP> 10,2
<tb> G <SEP> filtriert-0, <SEP> 15-2 <SEP> 25, <SEP> 0
<tb> H <SEP> nicht <SEP> filtriert <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> - <SEP> 4 <SEP> 8,3
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