DE1518382B2

DE1518382B2 - Verfahren zur herstellung von l- alanin

Info

Publication number: DE1518382B2
Application number: DE1965T0029829
Authority: DE
Inventors: Chibata Toyonaka; Kakimoto Toshio; Kato Joji; Sakai; Ichiro (Japan)
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1964-11-24
Filing date: 1965-11-23
Publication date: 1976-12-09
Also published as: DE1518382A1; GB1059668A; US3458400A; DE1793806B1; CH449043A; FR1476603A

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Alanin durch enzymatische Decarboxylierung von L-Asparaginsäure.

L-Alanin kann bekanntlich mit Hilfe von Mikroorganismen erhalten werden, die diese Aminosäure durch Gärung erzeugen. Zum Zwecke einer gewerbsmäßigen Gewinnung ist dieses Verfahren aber nicht wirtschaftlich genug.

Wie beschrieben wurde, besitzt L-Asparaginsäure-jS-decarboxylase (L-Aspartat-4-carboxy-lyase, EC 4.1.1.12) die Fähigkeit, die Decarboxylierung von L-Asparaginsäure in der j9-Stellung zu katalysieren, was zur Bildung von L-Alanin führt (Biokhimiya 14, [1949] 44). Bestimmte Stämme der Art Pseudomonas und Achromobacter erzeugen diese Decarboxylase (Journal of Bacteriology 80 [1960], 830; Biochem. J. 88 [1963], 578). Die Aktivität der von dem Pseudomonas-Stamm erzeugten Decarboxylase war jedoch so gering, daß sie den Wert von 60 für Qcx>2 bei 35° C nicht überschritt (Qo^^lCOi erzeugt/Stunde/mg Protein). Außerdem bildet der eingesetzte Stamm der Art Pseudomonas, Pseudomonas reptilivora, gleichzeitig noch ein anderes Enzym, durch das L-Alanin decarboxyliert wird. Der eingesetzte Achromobacter-Stamm, Achromobacter d-15, war wegen seines schlechten Wachstums für die industrielle Gewinnung von L-Alanin schwer zugänglich.

Es wurde nunmehr gefunden, daß sich bei der Gärung von Pseudomonas dacunhae in Gegenwart einer Dicarbonsäure eine erheblich höhere Aktivität an L-Asparaginsäure-j3-decarboxylase in den Zellen ansammelt. So erreicht beispielsweise die aus der Gärbrühe von Pseudomonas dacunhae des Stammes IAM 1152 gewonnene L-Asparaginsäure-jS-decarboxylase-Aktivität bei 30° C einen Q_Co₂-Wert von 1824. Außerdem werden keine anderen störenden Enzyme erzeugt, die eine Zersetzung oder Racemisierung von L-Alanin bewirken könnten.

Erfindungsgemäß wird L-Alanin in hoher Ausbeute durch Gärung von Pseudomonas dacunhae in einem wäßrigen Nährmedium, das eine Dicarbonsäure als wichtigste Kohlenstoffquelle sowie andere geeignete Nährstoffe enthält, und Umsetzung der erhaltenen Gärbrühe mit L-Asparaginsäure gewonnen.

Ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeignetes Nährmedium enthält etwa 0,5 bis 2% Dicarbonsäuren wie Fumarsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure oder deren Salze als einzige oder hauptsächliche Kohlenstoffquelle. Als Stickstoffquelle können anorganische Ammoniumsalze, z. B. das Chlorid, Phosphat oder Sulfat zugesetzt werden. Bessere Ergebnisse werden aber mit den Ammoniumsalzen der obigen organischen Säuren erzielt. Außer diesen Nährstoffen können 1 bis 3% organische Stickstofflieferanten wie Maiseinweichwasser, Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Caseinhydrolysat oder Harnstoff und geringe Mengen Mineralsalze wie Kaliumphosphat, Magnesiumphosphat zu dem Nährmedium zugesetzt werden.

Die Bildung der L-Asparaginsäure-j3-decarboxylase erreicht das Maximum, wenn das bakterielle Wachstum in ein Stadium zwischen dem Ende der logarithmischen Phase und dem Anfang der stationären Phase tritt. Die besten Bedingungen für die Enzymbildung sind gegeben, wenn man die Gärung einen Tag lang unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 25 bis 30⁰C und vorzugsweise bei 30° C durchführt.

Nach der Gärung wird L-Asparaginsäure zu der Gärbrühe zugesetzt und das Gemisch genügend lange bebrütet, um L-Asparaginsäure in L-Alanin umzuwandeln.

L-Asparaginsäure kann zu der Gärbrühe in einer Menge von mehr als 70 Prozent zugegeben werden. Da die Löslichkeit der L-Asparaginsäure in Wasser weniger als 1 Prozent beträgt, liegt der größte Teil der L-Asparaginsäure im Anfangsstadium in suspendierter Form in der Brühe vor und löst sich beim Fortschreiten der Umsetzung langsam darin. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird also durch die Pufferwirkung der allmählich in Lösung gehenden L-Asparaginsäure bequem in dem für die enzymatische Umwandlung günstigsten Bereich gehalten, der bei pH 4,5 bis 7, insbesondere 5 bis 6 liegt, wie durch einige Vorversuche unschwer feststellbar ist.

Gewöhnlich kann die Decarboxylierung bei einer Bebrütung von 2 bis 4 Tagen und einer Temperatur von 30 bis 40⁰C, vorzugsweise von 37° C, im wesemlichen zu Ende geführt werden.

Bei dem obigen Decarboxylierungsverfahren kann die Gärbrühe durch eine wäßrige Suspension lebender Zellen, die durch Filtration aus der Brühe isoliert wurden, oder durch Trockenzellen ersetzt werden. Es kann auch ein zellfreier Extrakt verwendet werden, der nach gewöhnlichen Verfahren, wie z. B. durch Extraktion nach Schallbehandlung oder durch Zerreiben der lebenden Zellen mit Quarzsand, gewonnene L-Asparaginsäure-ß-decarboxylase enthält.

Die Reaktionszeit der enzymatischen Decarboxylierung kann auf etwa ein Drittel verkürzt werden, wenn etwa 0,005 bis 2% eines oberflächenaktiven Stoffes, wie z. B. eines Fettsäureesters des Polyäthylenglycols ode: Polyäthylenglycolsorbitans, zu dem Reaktionsgemiscr zugesetzt werden.

Das in dem Reaktionsgemisch erzeugte L-Alanir wird dann gereinigt durch Filtrieren des Gemisches Behandeln des Filtrats mit einem stark saurer Kationenaustauscherharz, wie beispielsweise einerr Sulfonsäureharz, und Konzentrieren der behandelter Lösung. Es können so mehr als 43 g reines L-Alanin ir kristalliner Form aus 100 ml des Reaktionsgemische; gewonnen werden. Eine so hohe Ausbeute wurde nacl den früheren Verfahren niemals erzielt.

Für die nachfolgenden Beispiele wurden jeweil 120 ml eines wäßrigen Nährmediums bereitet. Die ii Beispiel 1 bis 5 und 9 eingesetzten Nährmediei

enthielten die folgenden Bestandteile in %-Gewicht/ Volumen:

Tabelle I

Bestandteil

II

III

NH4-Fumarat	0,5	0,5	0,5
Na-Fumarat	1,0	1,0	1,0
Maiseinweichwasser	2,2	0,55	—
KH2PO4	0,05	0,05	0,05
MgS04 · 7 H2O	0,01	0,01	0,01
Pepton	—	1,8	0,9
Caseinhydrolysat	—	—	0,2
	Beispiel 1

120 ml des Nährmediums I wurden auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und in einen 500-ml-Schüttelkolben gegeben. Nach der Sterilisierung wurde Pseudomonas dacunhae IAM 1152 auf das Nährmedium geimpft und dieses 26 Stunden unter Schütteln (140 Hin- und Herbewegungen pro Minute) bei 30° C bebrütet. Zu der Gärbrühe wurden 48 g L-Asparaginsäure zugesetzt und die Mischung bei 37⁰C bebrütet. Innerhalb von 96 Stunden konnte eine 100%ige Umwandlung in L-Alanin erreicht werden. Nach Einstellen des pH-Wertes auf 4,0 wurde das bebrütete Gemisch- zum Sieden erhitzt und filtriert. Das erhaltene Filtrat wurde durch eine Säule mit einem Kationenaustauscherharz vom Sulfonsäuretyp geschickt. Nach dem Eluieren mit wäßrigem Ammoniak wurde das Eluat eingeengt und lieferte 29,2 g (91 %) L-Alanin in kristalliner Form

[tx] ²o⁵ +14,3° (C = 4, in 6 N-HCl)

Beispiel 2

Pseudomonas dacunhae IAM 1152 wurde auf 120 ml des wäßrigen Nährmediums II (pH 7,0) geimpft. Dann wurde 26 Stunden bei 30° C unter Schütteln bebrütet. Zu der Gärbrühe wurden 48 g L-Asparaginsäure zugesetzt, und das Gemisch wurde 72 Stunden bei 37° C bebrütet. Das bebrütete Gemisch gemäß diesem Beispiel und den Beispielen 3 bis 5 wurde wie in Beispiel 1 behandelt. In allen Fällen wurde L-Alanin in kristalliner Form mit folgendem Drehwert erhalten:

[<%]f,⁵ + 14,2°(C = 4, in 6 N-HCl)

Beispiel 3

Pseudomonas dacunhae IAM 1152 wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 2 der Gärung unterworfen. Zu der Gärbrühe wurden 0,1% Polyäthylenglycol-sorbitan-monolaurat und 48 g L-Asparaginsäure zugesetzt, und das Gemisch wurde 24 Stunden bei 37° C bebrütet.

Beispiel 4

Pseudomonas dacunhae IAM 1152 wurde auf 120 ml des wäßrigen Nährmediums III (pH 5,5) geimpft. Dann wurde 20 Stunden bei 30° C unter Schütteln bebrütet. Zu der Gärbrühe wurden 84 g L-Asparaginsäure zugesetzt, und das Gemisch wurde 72 Stunden bei 37° C bebrütet.

Beispiel 5

Pseudomonas dacunhae IAM 1152 wurde unter den Bedingungen des Beispiels 4 der Gärung unterworfen. Zu der Gärbrühe wurden 0,1% Polyäthylenglycol-sorbitan-monolaurat und 84 g L-Asparaginsäure zugesetzt, und das Gemisch wurde 24 Stunden bei 37° C bebrütet.

Beispiel

Ausbeute an L-Alanin	Prozent
g	der Theorie
	92
29,5	91
29,1	91
51,2	92
51,5
Beispiel 6

Es wurden 120 ml eines wäßrigen Nährmediums hergestellt, das die folgenden Bestandteile enthielt:

Natriumsuccinat
Caseinhydrolysat
Pepton
KH₂PO₄
MgSO₄ · 7 H₂O

l,2%(Gew./Vol.) 0,2% (Gew7 Vol.) 0,9% (GewyVol.) 0,05% (Gew./Vol.) 0,01%(Gew./Vol.)

Dieses Nährmedium wurde auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und in einen 500ml-Kolben überführt. Nach der Sterilisierung wurde eine Impfkultur aus Pseudomonas dacunhae IAM 1152 auf das Nährmedium auf geimpft und dieses bei 30° C 26 Stunden unter Schütteln (140 Hin- und Herbewegungen pro Minute) bebrütet. Man erhielt 120 ml einer Gärbrühe von Pseudomonas dacunhae IAM 1152.

30 ml der Gärbrühe wurden zentrifugiert. Die auf diese Weise gesammelten Mikrobenzellen wurden mit einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Dann wurden die Mikrobenzellen in Wasser suspendiert und durch Ultraschall (10 kH) während einer Zeitspanne von 10 Minuten zerstört. Die wäßrige Suspension der Mikrobenzellen wurde zur Entfernung von unlöslichen Materialien zentrifugiert. Dabei erhielt man eine überstehende Lösung, die L-Asparaginsäure-ß-decarboxylase enthielt. 0,5 ml der überstehenden Lösung wurden einer Mischung aus 2 ml einer wäßrigen 10 mM L-Asparaginsäurelösung und 1 ml einer wäßrigen 1 M Acetatpufferlösung (pH 5,5) zugesetzt. Die Mischung wurde bei 30°C während einer Zeitspanne von 10 Minuten inkubiert. Mit Hilfe eines Warburg-Manometers wurde die Menge an Kohlendioxid bestimmt, die durch die Mischung erzeugt wurde. Daraus läßt sich die L-Asparaginsäure-jS-decarboxylase-Aktivität berechnen. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle II aufgeführt.

48 g L-Asparaginsäure wurden zu 120 ml der

vorstehend erhaltenen Gärbrühe zugesetzt, und die Mischung bei 37° C 72 Stunden bebrütet. Die Menge des darin angereicherten L-Alanins wurde durch eine übliche mikrobiologische Untersuchung mit Leuconostoc citrovorum 8081 bestimmt. Der Prozentsatz der Umwandlung von L-Asparaginsäure in L-Alanin wird daraus berechnet. Dann wurde die Reaktionsmischung auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt, zum Sieden erhitzt und filtriert. Das auf diese Weise erhaltene Filtrat wurde durch eine mit einem stark sauren Kationenaustauscher gefüllte Säule geschickt. Nach dem Eluieren mit wäßrigem Ammoniak wurde das Eluat zur Trockne eingedampft. Dabei erhielt man L-Alanin in kristalliner Form in den in Tabelle II aufgeführten Ausbeuten.

Spezifische Drehung [oc] ² _D ⁵+14,3° (C = 4,6 N-HCl)

Beispiel 7

Natriummalat
Caseinhydrolysat
Pepton
KH₂PO₄
MgSO₄ · 7 H₂O

1,2% (Gew./Vol.)
0,2% (GewVVol.)
0,9% (GeWVVoI.)
0,05% (GewVVol.)
0,01%(Gew./Vol.)

Dieses Nährmedium wurde gemäß Beispiel 6 bebrütet. Man erhielt 120 ml einer Gärbrühe von Pseudomonas dacunhae IAM 1152. Bei der wie in Beispiele durchgeführten Bestimmung der L-Asparaginsäure-/3-decarboxylase-Aktivität wurden die in Tabelle II aufgeführten Werte erhalten.

48 g L-Asparaginsäure wurden zu 120 ml der vorstehend erhaltenen Gärbrühe gegeben und wie in Beispiel 6 angegeben weitergearbeitet. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.

Spezifische Drehung\x\» +14,2° (C = 4,6 N-HCl)
Tabelle II

Beispiele

IO

20 Mit Natriumhydroxid

neutralisierte Dicarbonsäure

Caseinhydrolysat

Pepton

KH₂PO₄

MgSO₄ · 7 H₂O

1,2% (Gew./Vol.)
0,2% (Gew./Vol.)
0,9% (Gew./Vol.)
0,05% (Gew./Vol.)
0,01%(Gew./Vol.)

Dieses Nährmedium wurde gemäß Beispiel 6 in der in Tabelle II angegebenen Zeitspanne bebrütet. Man erhielt 120 ml einer Gärbrühe von Pseudomonas dacunhae IAM 1152.

Bei der wie in Beispiel 6 durchgeführten Bestimmung der L-Asparaginsäure-j3-decarboxylase-Aktivität wurden die in Tabelle II aufgeführten Werte erhalten.

Die jeweilige, in Tabelle II angegebene Menge L-Asparaginsäure wurde zu 120 ml der vorstehend erhaltenen Gärbrühe gegeben und wie in Beispiel 6 angegeben weitergearbeitet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.

Bsp. Dicarbonsäuren

Zeitdauer.des
Züchtens

(h)

L-Asparaginsäure-

/?-decarboxylase-

Aktivität

(A)

(B) Zugesetzte
L-Asparaginsäure

(g)

(C)

(D)

(E)

6	Bernsteinsäure	26
7	Apfelsäure	26
8a	Oxalsäure	48
8b	Maleinsäure	32
8c	Adipinsäure	26
8d	Weinsäure	48
Bemerkungen:

3400	1744	48
4126	1852	48
1384	1704	12
3024	1805	24
4032	1711	48
3871	1878	48

32,0	99,6	29,7	92,4
31,5	98,0	29,3	91,2
7,9	98,4	7,2	89,7
15,8	98,4	14,6	90,9
32,0	99,7	29,6	92,3
31,9	99,3	29,4	91,6

A): Qco /ml Gärbrühe (d. h. μΐ CCh/h/ml Gärbrühe).

B): Qco /mg Protein (d. h. μΐ CCte/h/mg Protein in der Gärbrühe).

Menge (g) an in der Reaktionsmischung angereichertem L-Alanin.

Prozentsatz der Umwandlung von L-Asparaginsäure in L-Alanin.

Ausbeute (g) an kristallinem L-Alanin.

Ausbeute an L-Alanin in Prozent der Theorie, bezogen auf eingesetzte L-Asparaginsäure.

Beispiel 9

Es wurden 120 ml eines wäßrigen Nährmediums hergestellt, das die gleiche Zusammensetzung wie in Beispiel 8 hatte. Das Medium wurde auf den in der nachfolgenden Tabelle III angegebenen pH-Wert eingestellt. Das Nährmedium wurde gemäß Beispiel 6 in der in Tabelle III angegebenen Zeitspanne mit Pseudomonas dacunhae IAM 1152 bebrütet. Man erhielt 120 ml Gärbrühe.

Bei der wie in Beispiel 6 durchgeführten Bestimmung

Tabelle III

der L-Asparaginsäure /J-decarboxylase-Aktivität, wobei jedoch der zugesetzte 1 M Acetatpuffer pH 5,3 hatte, wurden die in Tabelle III aufgeführten Werte erhalten. Die jeweilige, in Tabelle III angegebene Menge L-Asparaginsäure wurde zu 120 ml der vorstehend erhaltenen Gärbrühe gegeben und wie in Beispiel 6 angegeben weitergearbeitet Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt (als stark saurer Kationenaustauscher wurde ein solcher aus einem vernetzten Polystyrolgerüst mit SOsH-Gruppen benutzt).

Bsp. Dicarbonsäuren

pH

Zeitdauer
des Züchtens

(h)

L-Asparaginsäure-

jS-decarboxylase-

Aktivität

(A)

(B) Zugesetzte (C)
L-Asparaginsäure

(g)

(E)

9a _ Phthalsäure
9b Isophthalsäure
9c Terephthalsäure
9d Dipicolinsäure
Legende siehe Tabelle II.

8,0	48	3850	1802	48	32,0	99,0	29,5	91,0
8,2	64	1220	1007	12	8,0	99,7	7,3	90,9
8,2	48	2630	1566	12	7,9	98,4	7,2	89,7
7,2	48	3055	1710	24	15,9	99,0	14,5	90,3

Beispiel 10

Zum Nachweis, daß die übrigen Stämme der Art Pseudomonas dacunhae zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ebenfalls geeignet sind, wurden Versuche nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren mit Kulturen der Stämme IAM 1048, IAM 1089, IAM 1123, IAM 1152, IAM 1176 und IAM 1199 durchgeführt, wobei jeweils eine Gärbrühe hergestellt wurde, welche die in Tabelle IV angegebene hohe jS-Decarboxylase-Aktivität aufwies. Bei der Durchführung dieser Versuche wurde bei sämtlichen getesteten Stämmen keine Bildung eines Enzyms beobachtet, das gleichzeitig das gebildete L-Alanin zersetzt.

Die vorstehend genannten Stämme wurden jeweils in

120 ml des Nährmediums IH eingeimpft.

Das wäßrige Nährmedium hatte einen pH-Wert von 5,5. Es wurde 20 Stunden lang bei 3O⁰C unter Schütteln (140 Hin- und Herbewegungen pro Minute) bebrütet.

Bei der wie in Beispiel 6 angegeben durchgeführten Bestimmung der L-Asparaginsäure-jS-decarboxylase-Aktivität bei 30⁰C wurden die in der Tabelle IV aufgeführten Werte erhalten.

Eine bestimmte Menge L-Asparaginsäure wurde zu 120 ml der erhaltenen Gärbrühe zugesetzt, worauf die Mischung bei 37° C und einem pH-Wert von 5 bis 6 während einer Zeitspanne von 24 oder 48 Stunden inkubiert und wie in Beispiel 6 angegeben aufgearbeitet wurde. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.

Tabelle IV	L-Asparaginsäure- j3-decarboxylase- Aktivität (A) (B)	380	Zugesetzte L-Asparagin säure (g)	Zeitdauer der Decarb oxylierung (h)	(C)	(D)	(E)	(F)
Pseudomonas dacunhae- Stamm	1292	420	24 36 • 48	24 24 48	16,1 15,6 32,1	100 64,8 99,9	14,8 29,8 .	92 93
IAM 1048	1386	1445	24 48	24 24	16,0 15,7	99,6 48,9	14,7	92
IAM 1089	4191	1824	60	24	40,9	100	37,2	93
IAM 1123	5654	157	60 84	24 24	40,2 56,4	100 100	37,0 52,0	92 93
IAM 1152	550	521	12	24	8,0	99,6	7,3	91
IAM 1176	1615		24	24	16,1	100	14,6	91
IAM 1199

Legende siehe Tabelle II.

Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, daß mit sämtlichen Stämmen von Pseudomonas dacunhae eine gegenüber dem Stand der Technik erhöhte L-Asparaginsäure-ß-decarboxylase-Aktivität erzielt werden konnte.

609 550/473

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von L-Alanin durch enzymatische Decarboxylierung von L-Asparaginsäure mit Hilfe einer durch Gärung eines L-Asparaginsäure-jS-decarboxylase-erzeugenden Mikroorganismus in einem Nährmedium erhaltenen Gärbrühe oder einer gereinigten Zubereitung derselben, dadurch gekennzeichnet, daß man in dem Nährmedium, welches eine Dicarbonsäure oder ein Salz davon enthält, einen Stamm von Pseudomonas dacunhae züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymatische Decarboxylierung in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels durchführt.