JPH04218364A - シュードモナス属微生物の培養方法 - Google Patents

シュードモナス属微生物の培養方法

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JPH04218364A
JPH04218364A JP3052528A JP5252891A JPH04218364A JP H04218364 A JPH04218364 A JP H04218364A JP 3052528 A JP3052528 A JP 3052528A JP 5252891 A JP5252891 A JP 5252891A JP H04218364 A JPH04218364 A JP H04218364A
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acid
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誠 後藤
Hisashi Yamagata
山縣　恒
Shoichi Nara
昭一 奈良
Koichi Uchida
内田　康一
Masato Terasawa
真人 寺沢
Hideaki Yugawa
英明 湯川
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はシュードモナス属に属し
、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物の培
養方法に関するものである。アスパラギン酸脱炭酸酵素
は、Ｌ−アラニンの酵素的生産に有用な酵素である。
【０００２】
【従来の技術】アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有す
る微生物の培養法としては、これまでに、培地中に乳酸
、ピルビン酸を添加する方法（特公昭６０−１９９９７
号公報）、培地中にＬ−グルタミン酸を添加する方法（
特公昭５３−２７３５５号公報）等が提案されているが
、これらの有機酸、アミノ酸は培地に添加するには高価
である等の問題があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、安価な培地
で、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素の含有量が高い菌体
を得ることのできる、シュードモナス属に属するアスパ
ラギンβ−脱炭酸酵素を含有する微生物の培養方法の提
供を目的としてなされたものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意検討を行った結果、培地中にキレート
剤を含有させて培養することにより、菌体内のアスパラ
ギン酸β−脱炭酸酵素の含有量が著しく増大した菌体が
得られることを見いだし、本発明を完成した。かくして
本発明によれば、シュードモナス属に属し、アスパラギ
ン酸β−脱炭酸酵素を含有する微生物を培養する方法に
おいて、培地にキレート剤を添加して培養することを特
徴とするシュードモナス属微生物の培養方法が提供され
る。
【０００５】本発明に使用する微生物としては、シュー
ドモナス属に属し、アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含
有するものであれば特に限定されないが、例えば、シュ
ードモナス・ダクネー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄａ
ｃｕｎｈａｅ）ＡＴＣＣ　２１１９２、シュードモナス
・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）Ａ
ＴＣＣ　２１８１２、シュードモナス・フルオレッセン
ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｓ）
ＩＦＯ　３０８１、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ）ＩＦＯ　３３
１０等が挙げられ、これらの菌株が好適に用いられる。
【０００６】アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する
微生物菌体の調製に使用される培地としては、通常一般
に使用されるものでよいが、本発明ではこの培地にキレ
ート剤を存在させることが特徴である。培地に添加する
ことができるキレート剤としては、培地中の金属イオン
とキレートを形成するものであればいかなるものでも使
用することができ、例えばエチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（２−アミノエチ
ル）四酢酸（ＥＧＴＡ）、ヒドロキシエチレンジアミン
三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（
ＤＴＰＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、トリエチレン
テトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）もしくはこれらの塩、ま
たはｏ−フェナンスロリンなどが好適に用いられる。
【０００７】培地中のキレート剤の濃度は、通常０．０
０１〜５ｇ／ｌ、好ましくは０．００５〜２ｇ／ｌが適
当である。使用されるキレート剤の種類によって、その
最適な濃度範囲が多少異なり、例えばＥＤＴＡでは０．
１〜２ｇ／ｌ、ＨＥＤＴＡおよびＴＴＨＡでは０．０５
〜０．５ｇ／ｌ、ｏ−フェナンスロリンでは０．００５
〜０．０５ｇ／ｌである。キレート剤の培地への添加時
期は、培養開始前後を問わないが、培養中期までに行う
ことが好ましい。
【０００８】アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する
微生物菌体の調製に用いられる培地の炭素源としては、
特に制限はないが、例えばフマル酸、コハク酸、アスパ
ラギン酸などを挙げることができ、中でもフマル酸が好
ましい。培地の窒素源としては、アンモニア、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素
などの無機塩を用いることができるし、ペプトン、酵母
エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸などの有
機栄養源を使用することができる。無機塩としては、リ
ン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグ
ネシウムなどが用いられる。
【０００９】アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を含有する
微生物菌体の培養は、通気撹拌、振盪などの好気的条件
下で行い、培養温度は２０〜４０℃、好ましくは２８〜
３２℃である。培養中のｐＨは５〜１０、好ましくは７
〜８付近であり、その調整は酸またはアルカリを用いて
行う。培養開始時のフマル酸濃度は、好ましくは０．１
〜５（ｗｔ／ｖｏｌ）％、さらに好ましくは０．５〜２
（ｗｔ／ｖｏｌ）％である。培養時間は８時間〜４日間
、好ましくは１０時間〜２日間である。
【００１０】上記の如く培養して得られた微生物菌体は
、菌体内にアスパラギン酸β−脱炭酸酵素を著量含有し
ているので、該微生物菌体又はその処理物を用いて、水
性反応液中でＬ−アスパラギン酸を酵素反応させること
により、Ｌ−アラニンを効率的に製造することができる
。ここで菌体の処理物とは、例えば、それ自体既知の超
音波処理、圧搾などの方法を用いて菌体を破壊した菌体
破壊物、菌体あるいは上記菌体破壊物を、公知の方法、
例えばアクリルアミド等のモノマーやアルギン酸塩を用
いて固定化したもの等を意味する。
【００１１】次に、本発明の応用として上記微生物菌体
又はその処理物を用いて、水性反応液中でＬ−アスパラ
ギン酸を酵素反応させてＬ−アラニンを製造する方法に
ついて述べる。水性反応液に添加することができるＬ−
アスパラギン酸又はその塩の添加濃度は０．５〜５０（
ｗｔ／ｖｏｌ）％、好ましくは３〜３０（ｗｔ／ｖｏｌ
）％である。なお、Ｌ−アスパラギン酸は、反応液への
溶解度の関係から溶解させた状態でも粉体で存在（不溶
解状態）していてもさしつかえない。
【００１２】該水性反応液には、さらにピリドキサール
５’リン酸を０．０００５〜０．０５（ｗｔ／ｖｏｌ）
％、好ましくは０．００１〜０．０１（ｗｔ／ｖｏｌ）
％添加して用いることが出来る。さらに必要な場合には
非イオン性の界面活性剤、例えばポリオキシエチレン（
１０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン
（２０）ソルビタンモノラウレート等を０．０１〜０．
５（ｗｔ／ｖｏｌ）％、好ましくは０．０３〜０．２（
ｗｔ／ｖｏｌ）％を添加して用いることが出来る。また
必要な場合は、該水性反応液にピルビン酸、α−ケト酪
酸等のα−ケト酸を０．０００１〜０．５（ｗｔ／ｖｏ
ｌ）％、好ましくは０．００１〜０．２（ｗｔ／ｖｏｌ
）％を添加することができる。
【００１３】酵素反応時のｐＨは４．５〜５．３、好ま
しくは４．８〜５．０であり、反応温度は３０〜４７℃
、好ましくは３７〜４２℃であり、反応は通常約３時間
〜約４８時間行われる。　　反応液のｐＨの調整はアル
カリ溶液、例えばアンモニア水、水酸化ナトリウム、水
酸化カリウム等の水溶液が好適に使用される。上記のよ
うな反応方法によって得られる反応液中に生成したＬ−
アラニンの分離・精製は公知のイオン交換樹脂処理等に
より行うことが出来る。
【００１４】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明する。なお、下記の実施例において、アスパラ
ギン酸β−脱炭酸酵素活性は、培養液１００ｍｌから集
菌した菌体を反応液（アスパラギン酸１５００ｍＭ、ピ
リドキサールリン酸０．０４ｍＭ、ピルビン酸ナトリウ
ム５ｍＭ、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニ
ルエーテル０．１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％及びアンモニア
０．４Ｍ含有；ｐＨ４．８）２０ｍｌに懸濁し、３０℃
にて１時間振盪した後の生成アラニン量を測定すること
により求めた。Ｌ−アラニンの定性は、ペーパークロマ
トグラフのＲｆ値と高速液体クロマトグラフの保持時間
及び精製物の比旋光度により確認し、　　定量は、高速
液体クロトグラフィー（島津ＬＣ−５Ａ）を用いて行っ
た。また、下記の実施例において、特記しないかぎり％
と表したのは（ｗｔ／ｖｏｌ）％を意味する。
【００１５】
【実施例】［実施例１］培地（フマル酸ナトリウム０．
５％、フマル酸アンモニウム１．０％、コーンスティー
ブリカー１．０％、リン酸二水素カリウム０．０５％、
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５％含有；ｐＨ７．０）１０
０ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに分注、滅菌した後
、シュードモナス・ダクネー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
　ｄａｃｕｎｈａｅ）ＡＴＣＣ２１１９２を植菌し、３
０℃にて１日間振盪培養を行った（前培養）。次に、上
記培地と同様の培地に第１表に示した各キレート剤を、
第１表に示した濃度で添加したもの各々１ｌを、２ｌ容
通気撹拌槽に仕込み、滅菌（１２０℃、２０分間）後、
前培養物の２０ｍｌを添加して、回転数１０００ｒｐｍ
、通気量１ｖｖｍ、温度３０℃、ｐＨ７．３にて１日間
培養を行った。培養終了後、各々の培養物１００ｍｌか
ら遠心分離して集菌し、該菌体を１００ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）で洗浄し、ついで該洗浄菌体のアスパ
ラギン酸β−脱炭酸酵素活性を前記方法で測定した。な
お、比較例１として、培地にキレート剤を加えずに同様
の操作を行った。それらの結果を第１表に示す。
【００１６】
【表１】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　第１表　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｌ−アスパラギン
　　　　　　　　試験Ｎｏ．　　　　　　キレート剤　
　　　　　　　　　濃度　　　　　　　　酸β−脱炭酸
酵素　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　の相対活性※　　　　　　　　　　　
　１　　　　　　エチレンジアミン　　　　　　　　　
　　　　　　　　　四酢酸（ＥＤＴＡ）　　　　１．０
ｇ／ｌ　　　　　　　　２２０　　　　実　　　　２　
　　　　　ヒドロキシエチレン　　　　　　　　　　　
　　　　　　　ジアミン三酢酸　　　　　　　　０．２
５ｇ／ｌ　　　　　　１４５　　　　施　　　　　　　
　　　　　（ＨＥＤＴＡ）　　　　　　　　　　３　　
　　　　トリエチレンテトラ　　　　例　　　　　　　
　　　　　ミン六酢酸　　　　　　　　　　　　０．２
５ｇ／ｌ　　　　　　１６０　　　　　　　　　　　　
　　　　　　（ＴＴＨＡ）　　　　１　　　　４　　　
　　　ｏ−フェナンス　　　　　　　　　　　　　　　
　　　ロリン　　　　　　　　　　　　　　　　０．０
２ｇ／ｌ　　　　　　１４０　　　　　　　　比 　　　　較　　　　１　　　　　　　　無添加　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１００　　　　例　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　※　　比較例のＬ−アスパ
ラギン酸β−脱炭酸酵素　　　　　　　　　　　　　　
　　の活性を１００とした相対値
【００１７】［実施例
２］菌株としてシュードモナス・フルオレツセンス（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｓ）ＩＦＯ
　３０８１を用い、エチレンジアミン四酢酸を０．５ｇ
／ｌ添加した他は、実施例１と同様の操作を行った。比
較例２として、培地にエチレンジアミン四酢酸を加えず
に、実施例２と同様の操作を行った。それらの結果を第
２表に示す。
【００１８】
【表２】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　第２表　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　アスパラギン酸β−脱炭酸酵素の相対活
性※　　　　　　　　　　　　　　　　実施例２　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１６０　　　　　　　
　比較例２　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０
０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　※　　比較
例のアスパラギン酸β−脱炭酸酵素　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　の活性を１００とした相対値
【
００１９】［実施例３］菌体としてシュードモナス・シ
リンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ
）ＩＦＯ　３３１０を用い、エチレンジアミン四酢酸を
０．５ｇ／ｌ添加した他は、実施例１と同様の操作を行
った。比較例３として、培地にエチレンジアミン四酢酸
を加えずに、実施例３と同様の操作を行った。それらの
結果を第３表に示す。
【００２０】
【表３】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　第３表　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　アスパラギン酸β−脱炭酸酵素の相対活
性※　　　　　　　　　　　　　　　　実施例３　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１５５　　　　　　　
　比較例３　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０
０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　※　　比較
例のアスパラギン酸β−脱炭酸酵素　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　の活性を１００とした相対値
【
００２１】［応用例１］　　　　Ｌ−アラニンの製造実
施例１と同様の方法で、シュードモナス・ダクネー（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄａｃｕｎｈａｅ）ＡＴＣＣ２
１１９２を、エチレンジアミン四酢酸１．０ｇ／ｌを添
加した培地で培養して、その１００ｍｌを遠心分離して
集菌後、０．９％Ｎａｃｌ液１００ｍｌで洗浄し、得ら
れた菌体全量を、水性反応液［Ｌ−アスパラギン酸３０
％、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフエニルエー
テル０．０５（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％、ピリドキサール５
’−リン酸０．００１％、ピルビン酸ソーダ０．０５％
含有；ｐＨ４．７（調整はアンモニア水（２８％ＮＨ３
含有）にて行う）］２００ｍｌに懸濁し、４２℃で５時
間振盪した後にＬ−アラニン生成量を測定した。なお、
比較例として、培地にエチレンジアミン四酢酸を加えず
に、同様の操作を行った。それらの結果を第４表に示す
。
【００２２】
【表４】

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】シュードモナス属に属し、アスパラギン酸
    β−脱炭酸酵素を含有する微生物を培養する方法におい
    て、培地にキレート剤を添加して培養することを特徴と
    するシュードモナス属微生物の培養方法。
JP3052528A 1990-04-27 1991-03-18 シュードモナス属微生物の培養方法 Pending JPH04218364A (ja)

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