JPS6287088A - Ｌ―アラニンの製造法 - Google Patents
Ｌ―アラニンの製造法Info
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- JPS6287088A JPS6287088A JP22822085A JP22822085A JPS6287088A JP S6287088 A JPS6287088 A JP S6287088A JP 22822085 A JP22822085 A JP 22822085A JP 22822085 A JP22822085 A JP 22822085A JP S6287088 A JPS6287088 A JP S6287088A
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はＬ−アラニン（又は、Ｌ−アラニンとＤ−アメ
／４’ラギン酸）の製法に関し、更に詳しくはＬ−アス
・！ラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有する微生物のアラ
ニンラセマーゼ活性を除去し、該微生物を用いてＬ−ア
ラニンを単独であるいはＬ−アラニンとＤ−アスパラギ
ン酸とを同時に製造する方法に関する。
／４’ラギン酸）の製法に関し、更に詳しくはＬ−アス
・！ラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有する微生物のアラ
ニンラセマーゼ活性を除去し、該微生物を用いてＬ−ア
ラニンを単独であるいはＬ−アラニンとＤ−アスパラギ
ン酸とを同時に製造する方法に関する。
（従来の技術）
Ｌ−アス・卆うギン酸β−脱炭酸酵素はＬ−アスパラギ
ン酸のみに作用してＬ−アラニンと炭酸ガスとを生成す
る反応を触媒する酵素である。
ン酸のみに作用してＬ−アラニンと炭酸ガスとを生成す
る反応を触媒する酵素である。
従来、上記し一アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を利用す
るし一アラニンの製造法としては、Ｌ−アスパラギン酸
β−脱炭酸酵素活性を有する微生物を基質であるＬ−ア
スパラギン酸またはその塩含有培地に培養する方法や該
微生物の生産した酵素を基質に作用させる方法等多数知
られている。
るし一アラニンの製造法としては、Ｌ−アスパラギン酸
β−脱炭酸酵素活性を有する微生物を基質であるＬ−ア
スパラギン酸またはその塩含有培地に培養する方法や該
微生物の生産した酵素を基質に作用させる方法等多数知
られている。
しかしながら、一般に微生物の細胞壁の構成成分として
Ｄ−アラニンが必須であるため、これらの微生物は同時
にアラニンラセマーゼ活性を有することが知られており
、Ｌ−アラニンの生成と共にＤ−アラニンも副生してく
る。従ってＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有
する微生物を用いて光学純度の高いし一アラニンを効率
よく製造するためには該微生物のアラニンラセマーゼ活
性発現を田土する必要がある。
Ｄ−アラニンが必須であるため、これらの微生物は同時
にアラニンラセマーゼ活性を有することが知られており
、Ｌ−アラニンの生成と共にＤ−アラニンも副生してく
る。従ってＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有
する微生物を用いて光学純度の高いし一アラニンを効率
よく製造するためには該微生物のアラニンラセマーゼ活
性発現を田土する必要がある。
しかしながら現在知られている酵素を酸処理する方法（
特開昭５７−１３２８８２ ）では、低−Ｉにおけるタ
ンツク変性を引き起すため、アラニンラセマー゛ ゼ活
性は抑えられるがＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活
性も共に抑えられるためＬ−アラニンの生成量が低下す
るという難点があった。
特開昭５７−１３２８８２ ）では、低−Ｉにおけるタ
ンツク変性を引き起すため、アラニンラセマー゛ ゼ活
性は抑えられるがＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活
性も共に抑えられるためＬ−アラニンの生成量が低下す
るという難点があった。
（本発明が解決しようとする問題点）
上記の従来技術のもっている欠点を解決し、低声による
タンツク変性を防ぎながらアラニンラセマーゼ活性を抑
え光学純度の高いＬ−アラニンおよびＤ−アスパラギン
酸の製造法を確立するととにある。
タンツク変性を防ぎながらアラニンラセマーゼ活性を抑
え光学純度の高いＬ−アラニンおよびＤ−アスパラギン
酸の製造法を確立するととにある。
（問題点を解決するだめの手段）
しかるに本発明者等は鋭意研究を重ねた結果、微生物の
有するＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性には全く
失活を与えること々く微生物のもつアラニンラセマーゼ
活性のみを選択的に失活させ、同時に菌体内酵素である
Ｌ−アスパラギン酸−β−脱炭酸酵素の活性化を図る方
法を見出した。
有するＬ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性には全く
失活を与えること々く微生物のもつアラニンラセマーゼ
活性のみを選択的に失活させ、同時に菌体内酵素である
Ｌ−アスパラギン酸−β−脱炭酸酵素の活性化を図る方
法を見出した。
即ち、本発明によれば、Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸
酵素活性を有する微生物又はその固定化微生物をアルカ
リ処理することにより当該微生物又は固定化微生物のア
ラニンラセマーゼ活性が除去され、更にはこの様にして
得られた微生物又は固定化微生物にＬ−アスパラギン酸
（又はＤＬ−アスパラギン酸）を作用させることによシ
ム−アラニン（Ｌ−アラニンとＤ−アスパラギン酸）を
製造することができる。
酵素活性を有する微生物又はその固定化微生物をアルカ
リ処理することにより当該微生物又は固定化微生物のア
ラニンラセマーゼ活性が除去され、更にはこの様にして
得られた微生物又は固定化微生物にＬ−アスパラギン酸
（又はＤＬ−アスパラギン酸）を作用させることによシ
ム−アラニン（Ｌ−アラニンとＤ−アスパラギン酸）を
製造することができる。
本発明方法において用いられるし一アスパラギン酸β−
脱炭酸酵素活性を有する微生物としては上記活性を有す
る微生物であればいずれも用いることが出来、かかる微
生物としては、例えばシュードモナス・エスピーＡＴＣ
Ｃ１９１２１，シュードモナス・ダクネーＩＡＭ１１５
２．アセトバクター・ランセンスＯＵＴ ８３００．ア
クロモバクタ−・ペスチファーＩＡＭ １４４６．アク
ロモバクタ−・被スチファ−ＡＴＣＣ２５０９、キサン
トモナス・ベゴニアエＩＡＭ１６４４ 。
脱炭酸酵素活性を有する微生物としては上記活性を有す
る微生物であればいずれも用いることが出来、かかる微
生物としては、例えばシュードモナス・エスピーＡＴＣ
Ｃ１９１２１，シュードモナス・ダクネーＩＡＭ１１５
２．アセトバクター・ランセンスＯＵＴ ８３００．ア
クロモバクタ−・ペスチファーＩＡＭ １４４６．アク
ロモバクタ−・被スチファ−ＡＴＣＣ２５０９、キサン
トモナス・ベゴニアエＩＡＭ１６４４ 。
ブレビバクテリウム・インペリアルＡＴＣＣ８３６５。
アースロハクター・ウレアファシェンスＩＡＭ１６５８
゜エルビニア・アロイダエエＡＭ１０６８号等が好適に
あげられる。
゜エルビニア・アロイダエエＡＭ１０６８号等が好適に
あげられる。
こわらの微生物は遊離菌体のまま用いることができ、該
菌体をそれ自体公知の方法で固定化した微生物であって
もよく、例えば光重合性樹脂、ポリアクリルアミドゲル
、金儲多糖類ｒル（カラギーナン、ファーセレラン等、
コラーゲングル、アルギン酸グル、ポリビニルアルコー
ルグル、寒天グルで固定化した微生物をいずれも本発明
の目的に用いることができる。上記の内光重合性樹脂に
よる場合は例えば特開昭５８−１８７１８７号記載の通
り微生物菌体の水けん濁液に光重合性樹脂〔例えばＥＮ
Ｔ−４０００〕およびベンゾインエチルエーテルを混合
したのち光照射により重合せしめることによシ、固定化
微生物が得られる。また、カラギーナン、ファーセレラ
ン等の金儲多糖類による場合は例えば特開昭５３−６４
８３号に記載の通り微生物菌体をカラギーナン水溶液に
けん濁し、このけん濁液にｒル化剤（例えば第４周期以
上のアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムイ
オン等）を接触させるか冷却してｒル化させることによ
り固定化微生物が得られる。金儲多糖類としては分子内
の硫酸基含量ＩＱＷ／Ｗチ以上、とりわけ硫酸基含量１
２〜６２ Ｗ／Ｗ％のものを用いるのが好まり、イ。そ
の他、コラーゲングル、アルギン酸グル、ポリビニルア
ルコールグル、寒天グル等による場合も、それ自体公知
の方法例えば特開昭５１−１４４７８０号、特開昭４９
−３０５８２号、特開昭４９−８０２８５号、特開昭５
１−１３３４８４号記載の方法に従って当該微生物を処
理することによυ容易に相当する固定化微生物を得るこ
とができる。これらの固定化微生物は例えば立方体状（
１辺約３ｆｉ程度）、球状（直径約３瓢程度）、繊維状
（径約１ｆｉ程度）、膜状あるいは板状等の適当な形状
に成型すればつづいての処理操作を効率よ〈実施できる
ので好ましい。
菌体をそれ自体公知の方法で固定化した微生物であって
もよく、例えば光重合性樹脂、ポリアクリルアミドゲル
、金儲多糖類ｒル（カラギーナン、ファーセレラン等、
コラーゲングル、アルギン酸グル、ポリビニルアルコー
ルグル、寒天グルで固定化した微生物をいずれも本発明
の目的に用いることができる。上記の内光重合性樹脂に
よる場合は例えば特開昭５８−１８７１８７号記載の通
り微生物菌体の水けん濁液に光重合性樹脂〔例えばＥＮ
Ｔ−４０００〕およびベンゾインエチルエーテルを混合
したのち光照射により重合せしめることによシ、固定化
微生物が得られる。また、カラギーナン、ファーセレラ
ン等の金儲多糖類による場合は例えば特開昭５３−６４
８３号に記載の通り微生物菌体をカラギーナン水溶液に
けん濁し、このけん濁液にｒル化剤（例えば第４周期以
上のアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムイ
オン等）を接触させるか冷却してｒル化させることによ
り固定化微生物が得られる。金儲多糖類としては分子内
の硫酸基含量ＩＱＷ／Ｗチ以上、とりわけ硫酸基含量１
２〜６２ Ｗ／Ｗ％のものを用いるのが好まり、イ。そ
の他、コラーゲングル、アルギン酸グル、ポリビニルア
ルコールグル、寒天グル等による場合も、それ自体公知
の方法例えば特開昭５１−１４４７８０号、特開昭４９
−３０５８２号、特開昭４９−８０２８５号、特開昭５
１−１３３４８４号記載の方法に従って当該微生物を処
理することによυ容易に相当する固定化微生物を得るこ
とができる。これらの固定化微生物は例えば立方体状（
１辺約３ｆｉ程度）、球状（直径約３瓢程度）、繊維状
（径約１ｆｉ程度）、膜状あるいは板状等の適当な形状
に成型すればつづいての処理操作を効率よ〈実施できる
ので好ましい。
上記の如き微生物又は固定化微生物のアルカリ処理は当
該微生物又は固定化微生物をアルカリ溶液中に浸漬する
か又は当該微生物又は固定化微生物を含有する液中にア
ルカリを加えることにより実施できる。アルカリとして
は、例えば苛性ソーダ、苛性カリ、水酸化カルシウム、
水酸化アンモニウム、炭酸ソーダ等の無機アルカリ、テ
トラヒドロ７ラン、トリスヒドロキシメチルエタン等の
有機アルカリのいずれも用いることができる。これらア
ルカリによる処理はｐＨ８〜１２、と夛わけ８．５〜１
０の条件下に実施するのが好ましく、又アルカリは水溶
液それ自体だけでなくアルカリ緩衝液をも用いることが
できる。
該微生物又は固定化微生物をアルカリ溶液中に浸漬する
か又は当該微生物又は固定化微生物を含有する液中にア
ルカリを加えることにより実施できる。アルカリとして
は、例えば苛性ソーダ、苛性カリ、水酸化カルシウム、
水酸化アンモニウム、炭酸ソーダ等の無機アルカリ、テ
トラヒドロ７ラン、トリスヒドロキシメチルエタン等の
有機アルカリのいずれも用いることができる。これらア
ルカリによる処理はｐＨ８〜１２、と夛わけ８．５〜１
０の条件下に実施するのが好ましく、又アルカリは水溶
液それ自体だけでなくアルカリ緩衝液をも用いることが
できる。
微生物又は固定化微生物含有液中にアルカリを加えて実
施する場合には前記アルカリを上記声範囲となるように
アルカリの添加量を調整することにより行なう。更に微
生物又は固定化微生物のアルカリ処理は約０〜６０℃、
とりわけ約２０〜５０℃で実施するのが好ましい。接触
時間は微生物が遊離菌体の場合約３分〜２４時間、とり
わけ約３分〜２４時間程度とするのが好ましく、固定化
微生物の場合には約１０分〜５日間、とシわけ約１〜４
８時間程度とするのが好ましい。
施する場合には前記アルカリを上記声範囲となるように
アルカリの添加量を調整することにより行なう。更に微
生物又は固定化微生物のアルカリ処理は約０〜６０℃、
とりわけ約２０〜５０℃で実施するのが好ましい。接触
時間は微生物が遊離菌体の場合約３分〜２４時間、とり
わけ約３分〜２４時間程度とするのが好ましく、固定化
微生物の場合には約１０分〜５日間、とシわけ約１〜４
８時間程度とするのが好ましい。
かくして得られたアラニンラセマーゼ活性の除去された
微生物又は固定化微生物にＬ−アスパラギン酸またはそ
の塩を作用させるとＬ−アラニンが得られ、またＤＬ−
アスパラギン酸またはその塩を作用させるとＬ−アラニ
ンとＤ−アスパラギン酸が得られる。ここでＬ−アスノ
ぐラギン酸またはＤＬ−アスパラギン酸の塩としては、
例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム
塩、アンモニウム塩等が好ましい。酵素反応は、０〜５
０℃の広い温度範囲で実施することができるが、微生物
の酵素の安定性を考慮して３０〜４０℃で実施するのが
好ましい。尚、上記酵素反応に際しては基質溶液にピリ
ドキサールリン酸、ケト酸（例えばピルビン酸、α−ケ
トゲルタール酸等）等を適宜添加することによシ該酵素
反応を一層促進させることが出来、また更にコバルトイ
オン、ニッケルイオン等の２価金属イオンを添加すると
微生物の酵素活性の安定性を高めることが出来る。
微生物又は固定化微生物にＬ−アスパラギン酸またはそ
の塩を作用させるとＬ−アラニンが得られ、またＤＬ−
アスパラギン酸またはその塩を作用させるとＬ−アラニ
ンとＤ−アスパラギン酸が得られる。ここでＬ−アスノ
ぐラギン酸またはＤＬ−アスパラギン酸の塩としては、
例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム
塩、アンモニウム塩等が好ましい。酵素反応は、０〜５
０℃の広い温度範囲で実施することができるが、微生物
の酵素の安定性を考慮して３０〜４０℃で実施するのが
好ましい。尚、上記酵素反応に際しては基質溶液にピリ
ドキサールリン酸、ケト酸（例えばピルビン酸、α−ケ
トゲルタール酸等）等を適宜添加することによシ該酵素
反応を一層促進させることが出来、また更にコバルトイ
オン、ニッケルイオン等の２価金属イオンを添加すると
微生物の酵素活性の安定性を高めることが出来る。
上記において、遊離の微生物を用いる場合の反応はパッ
チ法で実施するのが好ましい。又、固定化微生物を用い
る場合の反応は使用する固定化微生物が水に不溶性であ
るため、パッチ法によるのみならず力２ム法によって連
続的に実施することが出来る。例えばカラム法による場
合、該固定化微生物をカラムに充填し、このカラムにＬ
−アスパラギン酸、ＤＬ−アスパラギン酸またはそれら
の塩を有する溶液を適尚な速度で導通すればＬ−アラニ
ンのみ、あるいはＬ−アラニンとＤ−アスパラギン酸と
を含む流出液が得られる。なおこの場合、酵素反応によ
シ生成する炭酸ガスのカラム内への滞留を避けるため基
質溶液はカラム下部よシ上部に向けて流すのが好ましい
。またパッチ法による場合、該固定化微生物を上記基質
溶液にけん濁し、かく拌する如き方法によ！１ｌＬ−ア
ラニンのみあるいはＬ−アラニンとＤ−アスパラギン酸
とを含む反応液が得られる。この場合には反応終了液か
ら固定化微生物をろ過あるいは遠心分離する如き方法に
より取得すれば再びこれを反覆使用することができる。
チ法で実施するのが好ましい。又、固定化微生物を用い
る場合の反応は使用する固定化微生物が水に不溶性であ
るため、パッチ法によるのみならず力２ム法によって連
続的に実施することが出来る。例えばカラム法による場
合、該固定化微生物をカラムに充填し、このカラムにＬ
−アスパラギン酸、ＤＬ−アスパラギン酸またはそれら
の塩を有する溶液を適尚な速度で導通すればＬ−アラニ
ンのみ、あるいはＬ−アラニンとＤ−アスパラギン酸と
を含む流出液が得られる。なおこの場合、酵素反応によ
シ生成する炭酸ガスのカラム内への滞留を避けるため基
質溶液はカラム下部よシ上部に向けて流すのが好ましい
。またパッチ法による場合、該固定化微生物を上記基質
溶液にけん濁し、かく拌する如き方法によ！１ｌＬ−ア
ラニンのみあるいはＬ−アラニンとＤ−アスパラギン酸
とを含む反応液が得られる。この場合には反応終了液か
ら固定化微生物をろ過あるいは遠心分離する如き方法に
より取得すれば再びこれを反覆使用することができる。
これらの方法において、基質としてＤＬ−アス・ぐラギ
ン酸またはその塩を用いる場合Ｌ−アラニンとＤ−アス
パラギン酸とを含む溶液が得られるが、これらの両者は
例えば直接晶析法、イオン交換樹脂処理等の公知の単離
精製操作を適宜組合せることにより容易に分離採取する
ことができる。上記反応を実施するにあたって反応進行
率は固定化微生物の量、温度、反応時間、基質の流速そ
の他により影響される。例えばカラム法による場合は使
用する固定化微生物の量に従い基質溶液の導通速度を、
またパッチ法による場合はその反応時間を適描に調整す
ることにより反応進行率を１００％にまで高める至適条
件を見出すことも容易である。
ン酸またはその塩を用いる場合Ｌ−アラニンとＤ−アス
パラギン酸とを含む溶液が得られるが、これらの両者は
例えば直接晶析法、イオン交換樹脂処理等の公知の単離
精製操作を適宜組合せることにより容易に分離採取する
ことができる。上記反応を実施するにあたって反応進行
率は固定化微生物の量、温度、反応時間、基質の流速そ
の他により影響される。例えばカラム法による場合は使
用する固定化微生物の量に従い基質溶液の導通速度を、
またパッチ法による場合はその反応時間を適描に調整す
ることにより反応進行率を１００％にまで高める至適条
件を見出すことも容易である。
（作用及び効果）
以上の如く、本発明方法は（１）Ｌ−アスパラギン酸β
−脱炭酸酵素活性を有する微生物をアルカリ処理すると
いう極めて簡単な操作で該微生物のアラニンラセマーゼ
活性を完全に除去できること。
−脱炭酸酵素活性を有する微生物をアルカリ処理すると
いう極めて簡単な操作で該微生物のアラニンラセマーゼ
活性を完全に除去できること。
（２）アルカリ処理によシ菌体内酵素であるＬ−アスパ
ラギン酸−β−脱炭酸酵素が活性化されること。
ラギン酸−β−脱炭酸酵素が活性化されること。
（３）該方法は遊離の微生物にも固定化微生物にもとも
に適用できること。（４）又、一旦除去されたアラニン
ラセマーゼ活性は長期間酵素反応を実施しても再び出現
することがないこと。（５）更にアラニンラセマーゼ活
性の除去された微生物を公知の方法で固定化してもその
得られる効果には何ら変りがない等、種々のすぐれた特
徴及び効果を有するものである。又、本発明方法により
アラニンラセマーゼ活性の除去された微生物あるいは固
定化微生物を用いてＬ−アスパラギン酸（又はＤＬ−ア
スパラギン酸）からＬ−アラニン（又はＬ−アラニンと
Ｄ−アスパラギン酸）を製造すれば生成物中にＤＬ−ア
ラニンが含まれていないので再結晶等後処理が不用であ
り、この点からも本発明方法ばＬ−アス・母うギンの工
業的に極めてすぐれた製造方法となるものである。
に適用できること。（４）又、一旦除去されたアラニン
ラセマーゼ活性は長期間酵素反応を実施しても再び出現
することがないこと。（５）更にアラニンラセマーゼ活
性の除去された微生物を公知の方法で固定化してもその
得られる効果には何ら変りがない等、種々のすぐれた特
徴及び効果を有するものである。又、本発明方法により
アラニンラセマーゼ活性の除去された微生物あるいは固
定化微生物を用いてＬ−アスパラギン酸（又はＤＬ−ア
スパラギン酸）からＬ−アラニン（又はＬ−アラニンと
Ｄ−アスパラギン酸）を製造すれば生成物中にＤＬ−ア
ラニンが含まれていないので再結晶等後処理が不用であ
り、この点からも本発明方法ばＬ−アス・母うギンの工
業的に極めてすぐれた製造方法となるものである。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１
下記により調製した微生物を用いてＬ−アスパラギン酸
からＬ−アラニンを生成させ、その際副生するＤ−アラ
ニン生成物を比較した。
からＬ−アラニンを生成させ、その際副生するＤ−アラ
ニン生成物を比較した。
（１）微生物の調製
（本発明方法による微生物の調製）
フマール酸０．５ ｊｊ／ｄｉ、大豆蛋白加水分解物（
全窒素６．４１７７ｄｉ ） １．８ ａｔ／ｄｉ、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４０，１ｊ；ｌ／ｄｉ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０
０，１ｊｌ／ｄｉ 、大豆油０．５ ｇ／ｄｉおよびオ
レイン酸０．５１７７ｄｔを含む溶液をＰＨ６，ｓに調
整後、５００ｄ容肩付フラスコに５０ｄ分注し、１１５
℃で１０分間殺菌した。
全窒素６．４１７７ｄｉ ） １．８ ａｔ／ｄｉ、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４０，１ｊ；ｌ／ｄｉ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０
０，１ｊｌ／ｄｉ 、大豆油０．５ ｇ／ｄｉおよびオ
レイン酸０．５１７７ｄｔを含む溶液をＰＨ６，ｓに調
整後、５００ｄ容肩付フラスコに５０ｄ分注し、１１５
℃で１０分間殺菌した。
この培地に、ブイヨン寒天培地で３０℃にて２４時間生
育させたシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ、ａｐ、） ＡＴＣＣ１９１２１を１白金耳植菌
し、３０℃にて１６時間振盪培養した。培養終了後苛性
ソーダを加え−を９．５に調整し３７℃で１時間放置し
た。
育させたシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ、ａｐ、） ＡＴＣＣ１９１２１を１白金耳植菌
し、３０℃にて１６時間振盪培養した。培養終了後苛性
ソーダを加え−を９．５に調整し３７℃で１時間放置し
た。
（対照微生物の調製）
苛性ソーダ処理をしない以外は上記と同様にして微生物
を調製した。
を調製した。
（２）実験方法
上記で得られた微生物各ＩＩを、１０−’Ｍピリドキサ
ールリン酸を含むＩ ＭＬ−アスパラギン酸アンモニウ
ム水溶液（アンモニアでＰＨ５，０に調整）７０ｍを入
れた２ ００ ｍｌ容三角フラスコに加え３７℃にて撮
とり反応させ反応中の全アラニン量とＤ−アラニン量を
経時的に測定した。
ールリン酸を含むＩ ＭＬ−アスパラギン酸アンモニウ
ム水溶液（アンモニアでＰＨ５，０に調整）７０ｍを入
れた２ ００ ｍｌ容三角フラスコに加え３７℃にて撮
とり反応させ反応中の全アラニン量とＤ−アラニン量を
経時的に測定した。
尚、全アラニン量の測定はロイｄノストック・チトロボ
ラムＡＴＣＣ８０８１を用いるバイオアッセイによシ行
ない、Ｄ−アラニン量の測定は豚腎よｐ調製したＤ−ア
ミノ酸オキシダーゼを作用させ生成したピルビン酸をヒ
ドラゾンとして測定する方法で行なった。
ラムＡＴＣＣ８０８１を用いるバイオアッセイによシ行
ない、Ｄ−アラニン量の測定は豚腎よｐ調製したＤ−ア
ミノ酸オキシダーゼを作用させ生成したピルビン酸をヒ
ドラゾンとして測定する方法で行なった。
（３）結果
結果は表１に示す通りであり本発明方法により調製した
微生物はＤ−アラニンを全く生成しないのに対し対照の
微生物は２０時間目におけるＤ−アラニン生成量が約２
５％に達することが認められた。
微生物はＤ−アラニンを全く生成しないのに対し対照の
微生物は２０時間目におけるＤ−アラニン生成量が約２
５％に達することが認められた。
表 １
実施例２
下記により調製した固定化微生物を用い反応を実施し反
応終了液中のＤ−’アラニン生成量を比較した。
応終了液中のＤ−’アラニン生成量を比較した。
（１）固定化微生物の調製
（本発明方法による固定化微生物■の調製）実施例１（
１）と同様の培地を５００ｄ容坂ロフラクコ１０本に５
０ｍＡ’宛分注しこれにシュードモナス・エスピーＡＴ
ＣＣ１９１２１を植菌した。３０℃で１６時間振とり培
養したのちこれに苛性カリを加えＰＨを１０．０に調整
し３０℃で１時間放蓄した。
１）と同様の培地を５００ｄ容坂ロフラクコ１０本に５
０ｍＡ’宛分注しこれにシュードモナス・エスピーＡＴ
ＣＣ１９１２１を植菌した。３０℃で１６時間振とり培
養したのちこれに苛性カリを加えＰＨを１０．０に調整
し３０℃で１時間放蓄した。
これに酢酸を加えＰＨ５，０に調整したのち遠心分離す
ることによりシー−トモナス・エスピー菌体１０ｇ（湿
重量）を集めた。
ることによりシー−トモナス・エスピー菌体１０ｇ（湿
重量）を集めた。
０．０５Ｍ酢酸バッファー（…５ ） ２５ｍに光重合
性樹Ｉｌｌ ＥＮＴ〜４０００１０ ｇおよびペンゾイ
ヂエチルエーテル１００ｍ９を溶解した溶液に上記菌体
１０ｇを投入した。混合した後、透明フィルム上に流し
込み、３００〜４００ｎｍの近紫外線を表裏に３分づつ
照射した。得られた重合物を５×５曙の大きさに切断し
固定化シー−トモナス・エスピーを得た。
性樹Ｉｌｌ ＥＮＴ〜４０００１０ ｇおよびペンゾイ
ヂエチルエーテル１００ｍ９を溶解した溶液に上記菌体
１０ｇを投入した。混合した後、透明フィルム上に流し
込み、３００〜４００ｎｍの近紫外線を表裏に３分づつ
照射した。得られた重合物を５×５曙の大きさに切断し
固定化シー−トモナス・エスピーを得た。
（本発明方法の固定化微生物■の調製）上記と同様の培
地、菌体を用いて上記と同様に３０℃で２４時間振と９
培養したのち遠心分離してシュードモナス・エスピー菌
体１０ｇ（湿重量）を集めた。
地、菌体を用いて上記と同様に３０℃で２４時間振と９
培養したのち遠心分離してシュードモナス・エスピー菌
体１０ｇ（湿重量）を集めた。
この菌体を用い上記固定化操作を行ない固定化シュード
モナス・エスピーを得た。このゲルを１０ｍＭＬ−アス
・やラギン酸を含む０，２Ｍ炭酸ソーダ緩衝液（ｐ）ｆ
ｌ Ｏ，０） ２６０ｍｌ中に浸漬し３０℃にて２４時
間放置した。その後０．０５Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５
）で洗浄することにより固定化シュードモナス・ダクネ
ーを得る。
モナス・エスピーを得た。このゲルを１０ｍＭＬ−アス
・やラギン酸を含む０，２Ｍ炭酸ソーダ緩衝液（ｐ）ｆ
ｌ Ｏ，０） ２６０ｍｌ中に浸漬し３０℃にて２４時
間放置した。その後０．０５Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５
）で洗浄することにより固定化シュードモナス・ダクネ
ーを得る。
（対照微生物の調製）
上記本発明方法による微生物■と同様にして調製した。
固定化微生物を以後何ら処理することなく用いた。
（２）実験方法
固定化シュードモナス・エスピー４０ｇをそれぞれ実容
２００ ｒｕｌの攪拌型反応器に入れ、１０−’Ｍピリ
ドキサールリン酸を含むＩＭＬ−アスパラギン酸アンモ
ニウム溶液（アンモニアにてｐＨ６，０Ｋ Ｗ４整）に
なるように添加し、３７℃で２０時間反応したその反応
液の全アラニンとＤ−アラニンＩｉｆを測定した。
２００ ｒｕｌの攪拌型反応器に入れ、１０−’Ｍピリ
ドキサールリン酸を含むＩＭＬ−アスパラギン酸アンモ
ニウム溶液（アンモニアにてｐＨ６，０Ｋ Ｗ４整）に
なるように添加し、３７℃で２０時間反応したその反応
液の全アラニンとＤ−アラニンＩｉｆを測定した。
尚、全アラニン量およびＤ−アラニン量の測定は実施例
１と同様にして行なった。
１と同様にして行なった。
（３）結果
結果は下記表２に示す通りであり、本発明方法により調
製した固定化微生物はＤ−アラニンを全く生成しないの
に対し、対照の固定化微生物は約７係のＤ−アラニンを
生成することが認められた。
製した固定化微生物はＤ−アラニンを全く生成しないの
に対し、対照の固定化微生物は約７係のＤ−アラニンを
生成することが認められた。
表 ２
Claims (3)
- （１）Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有する
微生物又はその固定化微生物をアルカリ処理することを
特徴とする該微生物のアラニンラセマーゼ活性を除去す
る方法。 - （２）Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有する
微生物又はその固定化微生物をアルカリ処理した後、ア
ラニンラセマーゼ活性の除去された当該微生物又は固定
化微生物にＬ−アスパラギン酸又はその塩を作用させる
ことを特徴とするＬ−アラニンの製法。 - （３）Ｌ−アスパラギン酸β−脱炭酸酵素活性を有する
微生物又はその固定化微生物をアルカリ処理した後、ア
ラニンラセマーゼ活性の除去された当該微生物又は固定
化微生物にＤＬ−アスパラギン酸又はその塩を作用させ
ることを特徴とするＬ−アラニンおよびＤ−アスパラギ
ン酸の製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22822085A JPS6287088A (ja) | 1985-10-14 | 1985-10-14 | Ｌ―アラニンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22822085A JPS6287088A (ja) | 1985-10-14 | 1985-10-14 | Ｌ―アラニンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6287088A true JPS6287088A (ja) | 1987-04-21 |
| JPH0514556B2 JPH0514556B2 (ja) | 1993-02-25 |
Family
ID=16873055
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22822085A Granted JPS6287088A (ja) | 1985-10-14 | 1985-10-14 | Ｌ―アラニンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6287088A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5116743A (en) * | 1989-02-06 | 1992-05-26 | Mitsubishi Petrochemical Co., Ltd. | L-alanine production with two microorganisms having fumarase inactivity in a single reaction tank |
| US5149651A (en) * | 1990-04-27 | 1992-09-22 | Mitsubishi Petrochemical. Co., Ltd. | Process for culturing microorganisms of the genus pseudomonas and process for producing l-alanine using said microorganisms |
| US5478733A (en) * | 1993-07-16 | 1995-12-26 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing L-alanine by fermentation with arthrobacter |
-
1985
- 1985-10-14 JP JP22822085A patent/JPS6287088A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5116743A (en) * | 1989-02-06 | 1992-05-26 | Mitsubishi Petrochemical Co., Ltd. | L-alanine production with two microorganisms having fumarase inactivity in a single reaction tank |
| US5149651A (en) * | 1990-04-27 | 1992-09-22 | Mitsubishi Petrochemical. Co., Ltd. | Process for culturing microorganisms of the genus pseudomonas and process for producing l-alanine using said microorganisms |
| US5478733A (en) * | 1993-07-16 | 1995-12-26 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing L-alanine by fermentation with arthrobacter |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0514556B2 (ja) | 1993-02-25 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |