JPS6349091A - トリプトフアンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 元日の目的と産業上の利用分野 り一トリブトファンはアミノ酸の一種で、輸ン夜の成分
として医薬用に用いられている他、近年は飼料用添加物
としても用途開発が進められている。

この発明の目的は、ライフタイムの長い固定化酵素また
は固定化菌体（この明細書において固定化酵素または固
定化菌体を固定化酵素源と言う）を用いてＬ−）リブト
ファンを工業的に製造する技術を提供することにある。

この発明はＬ−トリプトファンを工業的に製造するため
の技術分野に利用される。

従来■及恵 従来よりＬ−トリプトファンの製造方法としては、Ｌ−
）リプトフ７ン生産能を有する微生物を栄養培地に培養
して、培地中にＬ−１−リプトファンを生成蓄積させる
方法、またＬ−トリプトファンを合成するトリプトファ
シンクーゼをインドールとＬ−セリンに作用させてＬ−
トリプトファンを生成させる方法、インドールとＬ−セ
リンからＬ−トリプトファンを生成する能力を有する微
生物を、アクリル酸アミド系単量体を重合させ１こ）置
体に固定化して行う方法（特公昭５３−１８３６）等が
知られている。

しかしながら前二者の方法では微生物菌体、或いは酵素
と原料とを直接混合して反応させるため、生成したＬ−
トリプトファンを分離、精製することが極めて困難なば
かりでなく、使用した微生物菌体或いは酵素は、活性が
残っているにも拘らず一回の使用で廃棄しなければなら
ず、不経済である。

また後者の方法では基質溶液に例えばピリドキサールリ
ン酸塩等を添加すれば数回の繰り返し使用又は短時間の
連続反応でならＬ−トリプトファンを生成する能力を有
する固定化酵素源を用いることが出来るが、工業的にＬ
−トリプトファンを有利に生産する為には小規模生産の
場合にはバンチ反応法で固定化酵素源を繰り返し使用し
ても良いが、大規模生産には種々の点で有利である連続
生産法が要請される。

そして連続生産法にはライフタイムの長い固定化酵素源
が使用出来るか否か、或いはライフタイムを長くするよ
うな反応条件を如何に確立することが出来るか否かがそ
の成否にかかっている。

しかし従来の技術では、固定化酵素源を用いてＬ−トリ
プトファンを工業的に連続製造するについて、十分ライ
フタイムの長い固定化酵素源を用いるＬ−トリプトファ
ンの製造法は未だ開発されていない。

そこで本発明者らは、上記問題点を解決するため鋭意研
究を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち、本
発明は、十分ライフタイムの長い固定化酵素源を用いて
Ｌ−トリプトファンを工業的に連続生産する技術である
。

ｌ夙ｑ適底 本発明の方法は、固定化酵素源を用いてインドールとＬ
−セリンよりＬ−トリプトファンを工業的に２００時間
以上連続生産する方法に於て、反応液中のＬ−セリンを
インドールに対して、理論当量比よりも過剰に存在させ
ることにある。

これにより工業生産上置も重要な因子の一つである固定
化酵素源の活性のライフタイムを伸長させることができ
、Ｌ−トリプトファンの連続的工業生産を事実上可能と
したものである。

本発明における酵素とはトリプトファン・シンターゼま
たはトリプトファナーゼであり、微生物菌体とはこれら
酵素を生産する微生物のいずれをも利用できる。

例えばトリプトファン・シンターゼの生産菌としてはエ
シェリヒア・コリ肘−１０２３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１
９）、エシェリヒア・コリＭＴ−１０２４２（ＦＥＲＭ
　ＢＰ−２０）、ノイスボラ・クラソサ＾ＴＣＣ１４６
９２などを挙げることが出来る。

またトリプトファナーゼ生産菌としては、例えば、プロ
テウス・ブルガリスＩＦＯ３１６７、エシェリヒア・コ
リＩＡＭ　１２６８、アエロバクタ−・アエロバクタＩ
ＦＯＬ２０１９、クラブシェラ・ニューモニアエＡＴＣ
Ｃ８７２４、バチルス・アルヘイ　ＡＴＣＣ６３４８な
どを挙げることが出来る。

上記酵素または微生物菌体を固定化するための担体とし
ては、一般的に良く利用される担体でよい。例えばアル
ギン酸カルシウム、アルギン酸アルミニウムゲル、に−
カラギーナン、アクリルアミド重合物などである。

かくして得られた固定化酵素源に、Ｌ−セリンをインド
ールに対して、理論当量比よりも過剰に存在させた条件
下に、Ｌ−セリンとインドールを作用させるとＬ−トリ
プトファンが生産されしかも固定化酵素源の活性のライ
フタイムが伸長する効果が得られる。

なお、セリンとしてはＤＬ−セリンであっても有効なＬ
−セリン量が事実上同一であれば良い。

またＬ−セリンの過剰量としては理論当量比より少し大
きい程度であっても効果がない訳ではないが固定化酵素
源の活性のライフタイムを伸長する効果が不十分である
。　大きい方は特に制限は無いが、Ｌ−セリンの回収や
再利用を考慮すると余りに大過剰は好ましくなく６程度
までが好ましい。

反応の形式としては種型のＰｉＬ拌槽を用いた回分繰り
返し反応、或いは連続通液反応、カラム法による連続通
液反応法のいずれでも良い。例えば、攪拌槽による連続
通液反応法の場合には、固定化酵素源を等量程度のイン
ドールを含まない反応液と混合し、反応器中で攪拌する
。該反応器へＬ−セリン及びインドールを溶解した反応
供給液を連続的に給液し、且つ給液量と同等量反応器中
の液を連続的に抜液する。

この場合反応供給液中のＬ−セリンとインドールのモル
比（Ｌ−セリン／インドール）を少なくとも１を越えて
、好ましくは１．５を越えて設定することが重要である
。

かくして蛋白などの除去し難い夾雑物を含まずＬ−トリ
プトファンを含む溶液を連続的に得ることができる。

本発明の方法によれば、工業的に利用でき得る十分長い
間固定化酵素源の活性を保つことができる。

即ちインドールを基準としたＬ−トリプトファンの収率
が５０％に低下するまでの時間を固定化酵素源のライフ
タイムとした場合７００〜１　、０００時間以上が達成
される。

生成したＬ−トリプトファンは常法により単離、精製さ
れる。

またカラム法の場合は、固定化微生物をカラムに充填し
、これにインドールとＬ−セリンを含有する反応供給液
を通液することにより、Ｌ−１−リプトファンを含む溶
液が得られる。

上記の反応供給液中のインドーノＬ／′／届度は１ない
し２．８９程度とするのが適当である。

反応温度としては２５〜４０°Ｃの範囲が良く、反応供
給液のｐＨは６〜９が好ましい。

また反応供給液中にピリドキサールリン酸塩等を添加す
ると固定化微生物の酵素活性低下速度を低減する効果が
ある。

なお、固定化用の担体としてアルギン酸カルノウムゲル
或いはアルギン酸アルミニウムゲルを用いる場合は、ゲ
ルの崩壊を防ぐため、反応液中にカルシウムイオンまた
はアルミニウムイオンを常に存在させるとよい。

主夙少尖盗開 以下に本発明の詳細な説明するが、本発明１よ言うまで
もなくこれら実施例に限定されるものではない。

以下の本発明の実施例ではＬ−トリプトファン、Ｌ−セ
リン、インドールの濃度は高速液体クロマトグラフィー
を用いて測定した。

実施例１ 固　　ヒ酵素源の乍 トリプトファン・シンターゼ生産菌であるエシェリヒア
−ＤすＭＴ−１０２３２（ＦＥ！ＩＭ　ＢＦ−１９）を
５００　ｍ！！の坂ロフラスコ中の第１表に示す組成の
培地１０〇−に接種し、３５℃で２４時間培養した。こ
の培養液２００ｍ１（フラスコ２本）を３（［のジャー
ファーメンタ−中の第２表に示す組成の培地１５ｆに接
種し、３５°ｃ、　ｐＨ６，８（２８％アンモニア水で
調整）で３０時間培養した。

培養終了後、培養液を遠心集菌して湿菌体を約６００ｇ
得た。これを密封容器に入れ、４℃の冷蔵庫に保管し、
固定化酵素源の作製に使用した。

第１表　培養培地の組成 第２表　増殖培地の組成 上記湿菌体１部を生理食塩液１部とを攪拌混合した。一
方蒸溜水７．７６部と、アルギン酸ナトリウム（＠記文
フードケミファ製Ｎ５ＰＬＬ）　０．２４部とを撹拌混
合しｐＨを８．５に苛性カリで調整した。

菌体の懸濁液２部と、上記のアルギン酸す）　ＩＪウム
の溶解液８部を攪拌混合し、注射器に充填、内径が０．
５〜０．８ｍｍ程度の注射針の先端より、ゲル化液に滴
下した。

ゲル化液は、０．５モル濃度の塩化カルシウム三水塩水
溶液を６規定苛性カリ水溶液でｐＨを８．５に調整し、
１０°Ｃに保った液を１０部使用した。

ゲル化液に滴下されて生成した粒子は液中で約１時間攪
拌熟成後、液中より取り出し反応に使用した。

Ｌ−トリプトファンの合成反応 ５００艷の攪拌機付ガラス製反応器に第３表に示した組
成からインドールだけを除いた？容？＆　１００　ｒｒ
＆と前記の固定化酵素源５０１１１１！を装入し、この
反応器を温水浴中に保持して温度を常に３０°Ｃに保っ
た。

第３表　反応供給液の組成 第４表 次に第３表で示した組成の反応供給液を、内容を撹拌し
ている反応器に毎時５０ｍｔ’の速度で連続的に供給し
、一方反応器からも同速度で連続的に抜液をおこない、
一定時間毎のサンプルをとり生成したＬ−トリプトファ
ン濃度及び残存インドール、Ｌ−セリン濃度を液体クロ
マトグラフ法により求めた。

この手順により反応供給液中のＬ−セリンとインドール
のモル比を変動させた試験を第４表に示したように５回
実施した。

インドール濃度は第３表に示した値に一定として、設定
したモル比によりＬ−セリン濃度を変動させたが、その
値は第４表に示した。

反応の結果は、供給したインドール量を基準として生成
したＬ−トリプトファンの収率をもとめこの収率が良好
に維持される時間の長さで検討した。

この収率が１００％である場合とは、反応器から抜液し
た液中のＬ−トリプトファン濃度は４．３８Ｑとなる。

第４表に示した各番号のランについてＬ−）リブトファ
ン収率の経時変化を第１図に示した。

比較例　Ｉ Ｌ−セリンとインドールのモル比を１．０とした以外は
実施例１と同様に処理をした。その結果も第１図に比較
例として示した。

第１図について説明すると、し−セリン／インドールの
モル比が１．０である比較例では僅か３０時間もたたな
いうちに収率の低下が始まるがモル比が１．５であるラ
ン１　（実施例）では３００時間を越えても略８０殉が
維持されている。

又里至四呆 本発明は同定化酵素源を用いてインドール及びＬ−セリ
ンよりＬ−トリプトファンを工業的に連続的に製造する
技術を提供したものであり、本発明によれば固定化酵素
源の活性のライフタイムを従来より大巾に伸長すること
ができるので、固定化酵素源を用いたＬ−トリプトファ
ンの工業的な生産が事実上可能となる。

４、皿亘立凰主星鋭貝 第１図は本発明の効果を示す試験結果を示したものであ
り、数字は第４表中の試験のラン階を示す。縦軸はＬ−
トリプトファンの収率を表し、横軸は反応時間を示して
いる。

特許出願人　　三井東圧化学株式会社 トリプトファン収率（％） 手続補正書 昭和６１年１０月２０日 特許庁長官　黒　１）明　雄　殿 １、事件の表示 昭和６１年特許願第１９０５６２号 ２、発明の名称 トリプトファンの製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　東京都千代田区霞が関三丁目２番５号４、補正の
対象 明細書の発明の詳細な説明の憫及び図面５、補正の内容 （１）　　発明の詳細な説明の欄 （ａｌ　　明細書第３頁第６行の記載を「サール５′−
リン酸等を添加すれば数回の繰り返し使」と補正する。

する。

（Ｃ）明細書第１１真に記載の第３表を次の通りに補正
する。

「　　　第３表　反応供給液の組成 （ｄ＋　　明細書第１１頁に記載の第４表を次の通りに
ン甫正する。

「　　第４表 ｔｅｌ　　明細書第１１頁下から第３行の記載を「した
ように４回実施した。」と補正する。

（２）図面 図面を別紙の通りに補正する。

６、添付書類の目録 別紙−葉（図面）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、固定化酵素源を用いて、インドール及びＬ−セリン
   からＬ−トリプトファンを２００時間以上連続的に製造
   する方法に於て、反応液中のＬ−セリンをインドールに
   対して、理論当量比よりも過剰に存在させることを特徴
   とするＬ−トリプトファンの製造方法。 ２、理論当量比よりも過剰の値が１．５以上であること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のＬ−トリプ
   トファンの製造方法。