JPS6349091A - トリプトフアンの製造方法 - Google Patents
トリプトフアンの製造方法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
元日の目的と産業上の利用分野
り一トリブトファンはアミノ酸の一種で、輸ン夜の成分
として医薬用に用いられている他、近年は飼料用添加物
としても用途開発が進められている。
として医薬用に用いられている他、近年は飼料用添加物
としても用途開発が進められている。
この発明の目的は、ライフタイムの長い固定化酵素また
は固定化菌体(この明細書において固定化酵素または固
定化菌体を固定化酵素源と言う)を用いてL−)リブト
ファンを工業的に製造する技術を提供することにある。
は固定化菌体(この明細書において固定化酵素または固
定化菌体を固定化酵素源と言う)を用いてL−)リブト
ファンを工業的に製造する技術を提供することにある。
この発明はL−トリプトファンを工業的に製造するため
の技術分野に利用される。
の技術分野に利用される。
従来■及恵
従来よりL−トリプトファンの製造方法としては、L−
)リプトフ7ン生産能を有する微生物を栄養培地に培養
して、培地中にL−1−リプトファンを生成蓄積させる
方法、またL−トリプトファンを合成するトリプトファ
シンクーゼをインドールとL−セリンに作用させてL−
トリプトファンを生成させる方法、インドールとL−セ
リンからL−トリプトファンを生成する能力を有する微
生物を、アクリル酸アミド系単量体を重合させ1こ)置
体に固定化して行う方法(特公昭53−1836)等が
知られている。
)リプトフ7ン生産能を有する微生物を栄養培地に培養
して、培地中にL−1−リプトファンを生成蓄積させる
方法、またL−トリプトファンを合成するトリプトファ
シンクーゼをインドールとL−セリンに作用させてL−
トリプトファンを生成させる方法、インドールとL−セ
リンからL−トリプトファンを生成する能力を有する微
生物を、アクリル酸アミド系単量体を重合させ1こ)置
体に固定化して行う方法(特公昭53−1836)等が
知られている。
しかしながら前二者の方法では微生物菌体、或いは酵素
と原料とを直接混合して反応させるため、生成したL−
トリプトファンを分離、精製することが極めて困難なば
かりでなく、使用した微生物菌体或いは酵素は、活性が
残っているにも拘らず一回の使用で廃棄しなければなら
ず、不経済である。
と原料とを直接混合して反応させるため、生成したL−
トリプトファンを分離、精製することが極めて困難なば
かりでなく、使用した微生物菌体或いは酵素は、活性が
残っているにも拘らず一回の使用で廃棄しなければなら
ず、不経済である。
また後者の方法では基質溶液に例えばピリドキサールリ
ン酸塩等を添加すれば数回の繰り返し使用又は短時間の
連続反応でならL−トリプトファンを生成する能力を有
する固定化酵素源を用いることが出来るが、工業的にL
−トリプトファンを有利に生産する為には小規模生産の
場合にはバンチ反応法で固定化酵素源を繰り返し使用し
ても良いが、大規模生産には種々の点で有利である連続
生産法が要請される。
ン酸塩等を添加すれば数回の繰り返し使用又は短時間の
連続反応でならL−トリプトファンを生成する能力を有
する固定化酵素源を用いることが出来るが、工業的にL
−トリプトファンを有利に生産する為には小規模生産の
場合にはバンチ反応法で固定化酵素源を繰り返し使用し
ても良いが、大規模生産には種々の点で有利である連続
生産法が要請される。
そして連続生産法にはライフタイムの長い固定化酵素源
が使用出来るか否か、或いはライフタイムを長くするよ
うな反応条件を如何に確立することが出来るか否かがそ
の成否にかかっている。
が使用出来るか否か、或いはライフタイムを長くするよ
うな反応条件を如何に確立することが出来るか否かがそ
の成否にかかっている。
しかし従来の技術では、固定化酵素源を用いてL−トリ
プトファンを工業的に連続製造するについて、十分ライ
フタイムの長い固定化酵素源を用いるL−トリプトファ
ンの製造法は未だ開発されていない。
プトファンを工業的に連続製造するについて、十分ライ
フタイムの長い固定化酵素源を用いるL−トリプトファ
ンの製造法は未だ開発されていない。
そこで本発明者らは、上記問題点を解決するため鋭意研
究を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち、本
発明は、十分ライフタイムの長い固定化酵素源を用いて
L−トリプトファンを工業的に連続生産する技術である
。
究を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち、本
発明は、十分ライフタイムの長い固定化酵素源を用いて
L−トリプトファンを工業的に連続生産する技術である
。
l夙q適底
本発明の方法は、固定化酵素源を用いてインドールとL
−セリンよりL−トリプトファンを工業的に200時間
以上連続生産する方法に於て、反応液中のL−セリンを
インドールに対して、理論当量比よりも過剰に存在させ
ることにある。
−セリンよりL−トリプトファンを工業的に200時間
以上連続生産する方法に於て、反応液中のL−セリンを
インドールに対して、理論当量比よりも過剰に存在させ
ることにある。
これにより工業生産上置も重要な因子の一つである固定
化酵素源の活性のライフタイムを伸長させることができ
、L−トリプトファンの連続的工業生産を事実上可能と
したものである。
化酵素源の活性のライフタイムを伸長させることができ
、L−トリプトファンの連続的工業生産を事実上可能と
したものである。
本発明における酵素とはトリプトファン・シンターゼま
たはトリプトファナーゼであり、微生物菌体とはこれら
酵素を生産する微生物のいずれをも利用できる。
たはトリプトファナーゼであり、微生物菌体とはこれら
酵素を生産する微生物のいずれをも利用できる。
例えばトリプトファン・シンターゼの生産菌としてはエ
シェリヒア・コリ肘−10232(FERM BP−1
9)、エシェリヒア・コリMT−10242(FERM
BP−20)、ノイスボラ・クラソサ^TCC146
92などを挙げることが出来る。
シェリヒア・コリ肘−10232(FERM BP−1
9)、エシェリヒア・コリMT−10242(FERM
BP−20)、ノイスボラ・クラソサ^TCC146
92などを挙げることが出来る。
またトリプトファナーゼ生産菌としては、例えば、プロ
テウス・ブルガリスIFO3167、エシェリヒア・コ
リIAM 1268、アエロバクタ−・アエロバクタI
FOL2019、クラブシェラ・ニューモニアエATC
C8724、バチルス・アルヘイ ATCC6348な
どを挙げることが出来る。
テウス・ブルガリスIFO3167、エシェリヒア・コ
リIAM 1268、アエロバクタ−・アエロバクタI
FOL2019、クラブシェラ・ニューモニアエATC
C8724、バチルス・アルヘイ ATCC6348な
どを挙げることが出来る。
上記酵素または微生物菌体を固定化するための担体とし
ては、一般的に良く利用される担体でよい。例えばアル
ギン酸カルシウム、アルギン酸アルミニウムゲル、に−
カラギーナン、アクリルアミド重合物などである。
ては、一般的に良く利用される担体でよい。例えばアル
ギン酸カルシウム、アルギン酸アルミニウムゲル、に−
カラギーナン、アクリルアミド重合物などである。
かくして得られた固定化酵素源に、L−セリンをインド
ールに対して、理論当量比よりも過剰に存在させた条件
下に、L−セリンとインドールを作用させるとL−トリ
プトファンが生産されしかも固定化酵素源の活性のライ
フタイムが伸長する効果が得られる。
ールに対して、理論当量比よりも過剰に存在させた条件
下に、L−セリンとインドールを作用させるとL−トリ
プトファンが生産されしかも固定化酵素源の活性のライ
フタイムが伸長する効果が得られる。
なお、セリンとしてはDL−セリンであっても有効なL
−セリン量が事実上同一であれば良い。
−セリン量が事実上同一であれば良い。
またL−セリンの過剰量としては理論当量比より少し大
きい程度であっても効果がない訳ではないが固定化酵素
源の活性のライフタイムを伸長する効果が不十分である
。 大きい方は特に制限は無いが、L−セリンの回収や
再利用を考慮すると余りに大過剰は好ましくなく6程度
までが好ましい。
きい程度であっても効果がない訳ではないが固定化酵素
源の活性のライフタイムを伸長する効果が不十分である
。 大きい方は特に制限は無いが、L−セリンの回収や
再利用を考慮すると余りに大過剰は好ましくなく6程度
までが好ましい。
反応の形式としては種型のPiL拌槽を用いた回分繰り
返し反応、或いは連続通液反応、カラム法による連続通
液反応法のいずれでも良い。例えば、攪拌槽による連続
通液反応法の場合には、固定化酵素源を等量程度のイン
ドールを含まない反応液と混合し、反応器中で攪拌する
。該反応器へL−セリン及びインドールを溶解した反応
供給液を連続的に給液し、且つ給液量と同等量反応器中
の液を連続的に抜液する。
返し反応、或いは連続通液反応、カラム法による連続通
液反応法のいずれでも良い。例えば、攪拌槽による連続
通液反応法の場合には、固定化酵素源を等量程度のイン
ドールを含まない反応液と混合し、反応器中で攪拌する
。該反応器へL−セリン及びインドールを溶解した反応
供給液を連続的に給液し、且つ給液量と同等量反応器中
の液を連続的に抜液する。
この場合反応供給液中のL−セリンとインドールのモル
比(L−セリン/インドール)を少なくとも1を越えて
、好ましくは1.5を越えて設定することが重要である
。
比(L−セリン/インドール)を少なくとも1を越えて
、好ましくは1.5を越えて設定することが重要である
。
かくして蛋白などの除去し難い夾雑物を含まずL−トリ
プトファンを含む溶液を連続的に得ることができる。
プトファンを含む溶液を連続的に得ることができる。
本発明の方法によれば、工業的に利用でき得る十分長い
間固定化酵素源の活性を保つことができる。
間固定化酵素源の活性を保つことができる。
即ちインドールを基準としたL−トリプトファンの収率
が50%に低下するまでの時間を固定化酵素源のライフ
タイムとした場合700〜1 、000時間以上が達成
される。
が50%に低下するまでの時間を固定化酵素源のライフ
タイムとした場合700〜1 、000時間以上が達成
される。
生成したL−トリプトファンは常法により単離、精製さ
れる。
れる。
またカラム法の場合は、固定化微生物をカラムに充填し
、これにインドールとL−セリンを含有する反応供給液
を通液することにより、L−1−リプトファンを含む溶
液が得られる。
、これにインドールとL−セリンを含有する反応供給液
を通液することにより、L−1−リプトファンを含む溶
液が得られる。
上記の反応供給液中のインドーノL/′/届度は1ない
し2.89程度とするのが適当である。
し2.89程度とするのが適当である。
反応温度としては25〜40°Cの範囲が良く、反応供
給液のpHは6〜9が好ましい。
給液のpHは6〜9が好ましい。
また反応供給液中にピリドキサールリン酸塩等を添加す
ると固定化微生物の酵素活性低下速度を低減する効果が
ある。
ると固定化微生物の酵素活性低下速度を低減する効果が
ある。
なお、固定化用の担体としてアルギン酸カルノウムゲル
或いはアルギン酸アルミニウムゲルを用いる場合は、ゲ
ルの崩壊を防ぐため、反応液中にカルシウムイオンまた
はアルミニウムイオンを常に存在させるとよい。
或いはアルギン酸アルミニウムゲルを用いる場合は、ゲ
ルの崩壊を防ぐため、反応液中にカルシウムイオンまた
はアルミニウムイオンを常に存在させるとよい。
主夙少尖盗開
以下に本発明の詳細な説明するが、本発明1よ言うまで
もなくこれら実施例に限定されるものではない。
もなくこれら実施例に限定されるものではない。
以下の本発明の実施例ではL−トリプトファン、L−セ
リン、インドールの濃度は高速液体クロマトグラフィー
を用いて測定した。
リン、インドールの濃度は高速液体クロマトグラフィー
を用いて測定した。
実施例1
固 ヒ酵素源の乍
トリプトファン・シンターゼ生産菌であるエシェリヒア
−DすMT−10232(FE!IM BF−19)を
500 m!!の坂ロフラスコ中の第1表に示す組成の
培地10〇−に接種し、35℃で24時間培養した。こ
の培養液200m1(フラスコ2本)を3([のジャー
ファーメンタ−中の第2表に示す組成の培地15fに接
種し、35°c、 pH6,8(28%アンモニア水で
調整)で30時間培養した。
−DすMT−10232(FE!IM BF−19)を
500 m!!の坂ロフラスコ中の第1表に示す組成の
培地10〇−に接種し、35℃で24時間培養した。こ
の培養液200m1(フラスコ2本)を3([のジャー
ファーメンタ−中の第2表に示す組成の培地15fに接
種し、35°c、 pH6,8(28%アンモニア水で
調整)で30時間培養した。
培養終了後、培養液を遠心集菌して湿菌体を約600g
得た。これを密封容器に入れ、4℃の冷蔵庫に保管し、
固定化酵素源の作製に使用した。
得た。これを密封容器に入れ、4℃の冷蔵庫に保管し、
固定化酵素源の作製に使用した。
第1表 培養培地の組成
第2表 増殖培地の組成
上記湿菌体1部を生理食塩液1部とを攪拌混合した。一
方蒸溜水7.76部と、アルギン酸ナトリウム(@記文
フードケミファ製N5PLL) 0.24部とを撹拌混
合しpHを8.5に苛性カリで調整した。
方蒸溜水7.76部と、アルギン酸ナトリウム(@記文
フードケミファ製N5PLL) 0.24部とを撹拌混
合しpHを8.5に苛性カリで調整した。
菌体の懸濁液2部と、上記のアルギン酸す) IJウム
の溶解液8部を攪拌混合し、注射器に充填、内径が0.
5〜0.8mm程度の注射針の先端より、ゲル化液に滴
下した。
の溶解液8部を攪拌混合し、注射器に充填、内径が0.
5〜0.8mm程度の注射針の先端より、ゲル化液に滴
下した。
ゲル化液は、0.5モル濃度の塩化カルシウム三水塩水
溶液を6規定苛性カリ水溶液でpHを8.5に調整し、
10°Cに保った液を10部使用した。
溶液を6規定苛性カリ水溶液でpHを8.5に調整し、
10°Cに保った液を10部使用した。
ゲル化液に滴下されて生成した粒子は液中で約1時間攪
拌熟成後、液中より取り出し反応に使用した。
拌熟成後、液中より取り出し反応に使用した。
L−トリプトファンの合成反応
500艷の攪拌機付ガラス製反応器に第3表に示した組
成からインドールだけを除いた?容?& 100 rr
&と前記の固定化酵素源501111!を装入し、この
反応器を温水浴中に保持して温度を常に30°Cに保っ
た。
成からインドールだけを除いた?容?& 100 rr
&と前記の固定化酵素源501111!を装入し、この
反応器を温水浴中に保持して温度を常に30°Cに保っ
た。
第3表 反応供給液の組成
第4表
次に第3表で示した組成の反応供給液を、内容を撹拌し
ている反応器に毎時50mt’の速度で連続的に供給し
、一方反応器からも同速度で連続的に抜液をおこない、
一定時間毎のサンプルをとり生成したL−トリプトファ
ン濃度及び残存インドール、L−セリン濃度を液体クロ
マトグラフ法により求めた。
ている反応器に毎時50mt’の速度で連続的に供給し
、一方反応器からも同速度で連続的に抜液をおこない、
一定時間毎のサンプルをとり生成したL−トリプトファ
ン濃度及び残存インドール、L−セリン濃度を液体クロ
マトグラフ法により求めた。
この手順により反応供給液中のL−セリンとインドール
のモル比を変動させた試験を第4表に示したように5回
実施した。
のモル比を変動させた試験を第4表に示したように5回
実施した。
インドール濃度は第3表に示した値に一定として、設定
したモル比によりL−セリン濃度を変動させたが、その
値は第4表に示した。
したモル比によりL−セリン濃度を変動させたが、その
値は第4表に示した。
反応の結果は、供給したインドール量を基準として生成
したL−トリプトファンの収率をもとめこの収率が良好
に維持される時間の長さで検討した。
したL−トリプトファンの収率をもとめこの収率が良好
に維持される時間の長さで検討した。
この収率が100%である場合とは、反応器から抜液し
た液中のL−トリプトファン濃度は4.38Qとなる。
た液中のL−トリプトファン濃度は4.38Qとなる。
第4表に示した各番号のランについてL−)リブトファ
ン収率の経時変化を第1図に示した。
ン収率の経時変化を第1図に示した。
比較例 I
L−セリンとインドールのモル比を1.0とした以外は
実施例1と同様に処理をした。その結果も第1図に比較
例として示した。
実施例1と同様に処理をした。その結果も第1図に比較
例として示した。
第1図について説明すると、し−セリン/インドールの
モル比が1.0である比較例では僅か30時間もたたな
いうちに収率の低下が始まるがモル比が1.5であるラ
ン1 (実施例)では300時間を越えても略80殉が
維持されている。
モル比が1.0である比較例では僅か30時間もたたな
いうちに収率の低下が始まるがモル比が1.5であるラ
ン1 (実施例)では300時間を越えても略80殉が
維持されている。
又里至四呆
本発明は同定化酵素源を用いてインドール及びL−セリ
ンよりL−トリプトファンを工業的に連続的に製造する
技術を提供したものであり、本発明によれば固定化酵素
源の活性のライフタイムを従来より大巾に伸長すること
ができるので、固定化酵素源を用いたL−トリプトファ
ンの工業的な生産が事実上可能となる。
ンよりL−トリプトファンを工業的に連続的に製造する
技術を提供したものであり、本発明によれば固定化酵素
源の活性のライフタイムを従来より大巾に伸長すること
ができるので、固定化酵素源を用いたL−トリプトファ
ンの工業的な生産が事実上可能となる。
4、皿亘立凰主星鋭貝
第1図は本発明の効果を示す試験結果を示したものであ
り、数字は第4表中の試験のラン階を示す。縦軸はL−
トリプトファンの収率を表し、横軸は反応時間を示して
いる。
り、数字は第4表中の試験のラン階を示す。縦軸はL−
トリプトファンの収率を表し、横軸は反応時間を示して
いる。
特許出願人 三井東圧化学株式会社
トリプトファン収率(%)
手続補正書
昭和61年10月20日
特許庁長官 黒 1)明 雄 殿
1、事件の表示
昭和61年特許願第190562号
2、発明の名称
トリプトファンの製造方法
3、補正をする者
事件との関係 特許出願人
住所 東京都千代田区霞が関三丁目2番5号4、補正の
対象 明細書の発明の詳細な説明の憫及び図面5、補正の内容 (1) 発明の詳細な説明の欄 (al 明細書第3頁第6行の記載を「サール5′−
リン酸等を添加すれば数回の繰り返し使」と補正する。
対象 明細書の発明の詳細な説明の憫及び図面5、補正の内容 (1) 発明の詳細な説明の欄 (al 明細書第3頁第6行の記載を「サール5′−
リン酸等を添加すれば数回の繰り返し使」と補正する。
する。
(C)明細書第11真に記載の第3表を次の通りに補正
する。
する。
「 第3表 反応供給液の組成
(d+ 明細書第11頁に記載の第4表を次の通りに
ン甫正する。
ン甫正する。
「 第4表
tel 明細書第11頁下から第3行の記載を「した
ように4回実施した。」と補正する。
ように4回実施した。」と補正する。
(2)図面
図面を別紙の通りに補正する。
6、添付書類の目録
別紙−葉(図面)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、固定化酵素源を用いて、インドール及びL−セリン
からL−トリプトファンを200時間以上連続的に製造
する方法に於て、反応液中のL−セリンをインドールに
対して、理論当量比よりも過剰に存在させることを特徴
とするL−トリプトファンの製造方法。 2、理論当量比よりも過剰の値が1.5以上であること
を特徴とする特許請求の範囲第1項に記載のL−トリプ
トファンの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP19056286A JPH0665315B2 (ja) | 1986-08-15 | 1986-08-15 | トリプトフアンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP19056286A JPH0665315B2 (ja) | 1986-08-15 | 1986-08-15 | トリプトフアンの製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6349091A true JPS6349091A (ja) | 1988-03-01 |
JPH0665315B2 JPH0665315B2 (ja) | 1994-08-24 |
Family
ID=16260130
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP19056286A Expired - Lifetime JPH0665315B2 (ja) | 1986-08-15 | 1986-08-15 | トリプトフアンの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0665315B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0438591A4 (en) * | 1987-10-12 | 1991-05-27 | Mitsui Toatsu Chemicals | METHOD FOR PRODUCING L-TRYPTOPHANE. |
CN102140483A (zh) * | 2011-01-14 | 2011-08-03 | 南开大学 | 一种固定化酶合成l-色氨酸的方法 |
-
1986
- 1986-08-15 JP JP19056286A patent/JPH0665315B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0438591A4 (en) * | 1987-10-12 | 1991-05-27 | Mitsui Toatsu Chemicals | METHOD FOR PRODUCING L-TRYPTOPHANE. |
EP0438591A1 (en) * | 1987-10-12 | 1991-07-31 | MITSUI TOATSU CHEMICALS, Inc. | Process for producing l-tryptophane |
CN102140483A (zh) * | 2011-01-14 | 2011-08-03 | 南开大学 | 一种固定化酶合成l-色氨酸的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0665315B2 (ja) | 1994-08-24 |
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