JP2764084B2 - Ｌ―トリプトファンの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［技術分野］ 本発明はＬ−トリプトファンの製造方法に関し、特に
は固定化酵素源を用いて連続的にＬ−トリプトファンを
製造する方法に関する。

［背景技術］ Ｌ−トリプトファンはアミノ酸の一種で、輸液成分と
して医薬用に用いられているほか、飼料用添加物として
の用途開発が進められており、多くの需要が見込まれて
いる。

従来から、Ｌ−トリプトファンの製造方法は、トリプ
トファンシンターゼやトリプトファナーゼ等の酵素によ
る酵素反応を利用したものが多く、中でも、固定化酵素
源を用いる方法は、生成したＬ−トリプトファンを酵素
源から分離、精製することが容易であることから注目さ
れている。

固定化酵素源を用いて工業的にＬ−トリプトファンを
製造する場合、小規模な生産では固定化酵素源を数回繰
り返して使用できる回分反応法でも差し支えないが、大
規模生産には種々の点で有利な連続生産法が要請され
る。

この連続生産法の成否は、触媒として機能する固定化
酵素源の活性ライフタイムをいかにして伸ばすことがで
きるかにかかり、固定化酵素源自身の改良又は反応条件
の適切な設定により対処されるべきものである。

固定化酵素源又は酵素源自身の改良は遺伝子組換え操
作等により検討されているが、未だ満足すべき結果は認
められていない。また、改良が施されたとしても、活性
ライフタイムを伸ばすには、長期にわたる反応条件の適
切な設定に大きく依存しているのが通例である。

また、従来、反応条件を適切に選択することによって
固定化酵素の活性ライフタイムを伸ばすことは達成され
ていない。

［発明の開示］ 従って、この発明の目的は、固定化酵素源を用いてＬ
−セリンとインドールとからＬ−トリプトファンを製造
する方法であって、反応条件を適切に設定することによ
って固定化酵素の活性ライフタイムが伸ばされ、かつ、
反応液中のＬ−トリプトファンの生成濃度が高められた
方法を提供することである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、反応液中のＬ−セ
リンのモル数を、該反応液中に存在するインドールとＬ
−トリプトファンのモル数の和よりも過剰に存在させる
ことによって固定化酵素源のライフタイムを伸ばすこと
ができ、かつ反応液中のＬ−トリプトファンの生成濃度
を高めることができることを見出し、本発明を完成し
た。

すなわち、本発明は、固定化酵素源を用いてインドー
ルとＬ−セリンを反応させてＬ−トリプトファンを連続
的に製造する方法において、反応液中のＬ−セリンのモ
ル数を、該反応液中に存在するインドールとＬ−トリプ
トファンのモル数の和よりも常に過剰に存在させること
を特徴とするＬ−トリプトファンの製造方法を提供す
る。

本発明の方法により、Ｌ−トリプトファンの蓄積量に
かかわりなく、固定化酵素源のライフタイムを伸ばすこ
とができ、インドールとＬ−セリンとからＬ−トリプト
ファンを長期間にわたり連続的に製造することができ
る。また、生成されるＬ−トリプトファンの濃度を従来
よりも高めることが可能である。

［発明を実施するための最良の形態］ 本発明の方法において、固定化酵素源とは、トリプト
ファン・シンターゼ若しくはトリプトファナーゼ又はこ
れらの酵素を産生する微生物菌体を固定化して得られる
ものである。トリプトファン・シンターゼ産生菌として
はエシェリヒア・コリMT-10232（FERM BP-19）、エシェ
リヒア・コリMT-10242（FERM BP-20）及びノイスボラ・
クラッサ（ATCC 14692）等を挙げることができ、また、
トリプトファナーゼ産生菌としてはプロテウス・ブルガ
リスIFO 3167、エシェリヒア・コリIAM 1268、アエロバ
クター・アエロゲネスIFO 12019、クラブシェラ・ニュ
ーモニアエ（ATCC 8724）等を挙げることができるがこ
れらに限定されるものではない。酵素又は微生物菌体を
固定化した固定化酵素源の作製方法はこの分野において
周知であり、例えばアルギン酸カルシウム若しくはアル
ギン酸アルミニウムのようなアルギン酸塩、κ−カラギ
ーナン又はアクリルアミド共重合物のような担体に、常
法により酵素又は微生物菌体を固定化することにより得
ることができる。

本発明の方法においては、反応液中のＬ−セリンのモ
ル数を、反応液中に存在するインドールとＬ−トリプト
ファンのモル数の和よりも常に過剰に存在させる。Ｌ−
セリンのモル数が反応液中のインドールとＬ−トリプト
ファンのモル数の和よりもわずかに過剰な場合であって
も本発明の効果を得ることができるが、反応生成液中の
Ｌ−トリプトファンの濃度が高い場合、例えば、後述の
ように多段の反応器を使用して連続的に製造して得られ
る反応液又は同一の反応器で反応液を循環させて連続的
に反応を実施して得られる反応液等では、固定化酵素源
のライフタイムを工業的な連続生産に十分な程に伸ばす
ためには、反応液中のＬ−セリンのモル数は、反応液中
に存在するインドールとＬ−トリプトファンのモル数の
和の1.2倍以上であることが好ましい。また、酵素活性
への阻害効果はインドールの方がＬ−トリプトファンに
比べて大きいため、反応液中のＬ−セリンのモル数は、
インドールのみのモル数の1.5倍以上であることがより
好ましい。さらに、Ｌ−セリンの過剰量が大きくとも、
その効果に対して何ら支障はなく、また、制限されるも
のでもない。未反応Ｌ−セリンの回収や再使用の必要に
応じた値に設定すればよい。通常、実用的な面から10倍
以下で使用される。なお、セリンとしては、Ｌ−セリン
の量が本発明の範囲内に入るならばラセミ体のセリンを
用いることもできる。また、言うまでもなく、反応に供
せられる液中にＬ−トリプトファンが含有されていなく
てもよい。

反応条件は、特に限定されないが、反応温度は好まし
くは25℃ないし60℃である。酵素反応の速度を高め、同
時にＬ−トリプトファンの溶解度を高めるために、反応
に使用する酵素の許容範囲内で高温にて実施することが
好ましい。

さらに、Ｌ−トリプトファンは、両性電解質であり、
その水溶液中での溶解度はpHに依存するため、反応時の
pHを反応に使用している酵素の酵素作用の許容範囲内で
等電点よりも高く又は低く設定し、均相系としてのＬ−
トリプトファンの蓄積濃度を高めることが好ましい。こ
のように反応時のpHは酵素活性の至適pHと異なることが
多いが、本発明の方法によれば、固定化酵素源のライフ
タイムをより効果的に伸ばすことができる。通常、多用
されるpHは６〜11の範囲であり、好ましくは6.5ないし1
0.0の範囲である。

また、本発明の方法では、反応液中にピリドキサール
リン酸等の補酵素を添加して酵素活性の低下速度を抑え
る。また、固定化担体としてアルギン酸カルシウムやア
ルギン酸アルミニウムを用いる場合には、ゲル崩壊防止
のため各々カルシウムイオン、アルミニウムイオンを共
存させてもよい。

反応の形式としては、槽型の撹拌槽を用いた回分繰り
返し反応、連続通液反応、固定層や流動層を用いた連続
通液反応のいずれでもよく、これらを多段に組合わせた
ものでもよい。例えば、インドールとＬ−トリプトファ
ン及びこれらのモル数の和よりも過剰量のＬ−セリン、
さらには所望により該酵素反応を助ける上記成分を溶解
させた反応供給液を、所定の流量、温度で連続的に給液
し、かつ、この反応器内で新たに生成したＬ−トリプト
ファンを含む反応生成液を給液量と同流量にて連続的に
抜液することができる。特に好ましい態様では、下記実
施例３に示すように、反応は、直列に連結された複数の
反応槽中で行なわれ、各反応槽中で本発明の条件が満足
され、第２段目以降の反応槽には前段の反応槽からの生
成液が供給される。この際、いずれかの反応槽中で本発
明の条件に欠ける状態となった場合には、その反応槽に
は前段の反応槽からの生成液に加えてＬ−セリンが新た
に供給される。

本発明の方法によると、インドールとＬ−セリンから
Ｌ−トリプトファンを200時間以上の長期間にわたって
連続的に製造しても、反応液中に溶解しているＬ−トリ
プトファンの量に関わりなく反応を継続することが可能
であり、固定化酵素源のライフタイムを大きく伸ばすこ
とができる。また、本発明の方法によると、生成される
Ｌ−トリプトファンの濃度を大きくすることができ、例
えば、後述のように多段の反応器を使用して連続的に製
造して得られる反応液又は同一の反応器で反応液を循環
させて連続的に反応を実施して得られる反応液等ではＬ
−トリプトファンの濃度を10g/l以上とすることがで
き、Ｌ−トリプトファンの工業的な生産にとって特に有
利である。

［実施例１］ 以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明す
る。

実施例１ 固定化酵素源の作製 トリプトファン・シンターゼの生産菌であるエシェリ
ヒア・コリMT-10232（FERM BP-19）を500mlの坂口フラ
スコ中、第１表に示す組成の培地100mlに接種し、24時
間培養した。この培養液200ml（フラスコ２本）を30lの
ジャーファーメンター中の第２表に示す組成の培地15l
に接種し、35℃、pH6.8（28％アンモニア水で調整）で3
0時間培養した。

培養終了後、培養液を遠心集菌して湿菌体600gを得
た。これを密封容器に入れ、４℃の冷蔵庫に保管し、固
定化酵素源の作製に使用した。

上記湿菌体１重量部と生理食塩液１重量部とを撹拌混
合した。一方、蒸留水7.76重量部とアルギン酸ナトリウ
ム（（株）紀文フードケミファ社製NSPLL）0.24重量部
とを撹拌混合し、pHを8.5に水酸化カリウムで調整し
た。

菌体の懸濁液２重量部と上記のアルギン酸ナトリウム
の溶解液８重量部とを撹拌混合し、注射器に充填し、内
径が0.5mmないし0.8mm程度の注射針の先端よりゲル化液
に滴下した。

ゲル化液は、0.5モル濃度の塩化カルシウム二水塩水
溶液を６規定水酸化カリウム水溶液でpHを8.5に調整
し、10℃に保った液を10重量部使用した。

ゲル化液に滴下されて生成した粒子は液中で約１時間
撹拌熟成後、液中より取り出し反応に使用した。

Ｌ−トリプトファンの合成反応 第３表に示すＬ−セリン濃度のみが異なるＡ、Ｂ、
Ｃ、Ｄの４種類の組成の溶液を調製し、pHを8.5に調整
した。対応する各々の500mlの攪拌機付きガラス製反応
器に該溶液100mlと上記の固定化菌体50mlを装入した
後、反応器を温水浴中に保持して温度を35℃に保った。
次いで、各反応器に装入した溶液と同一組成の反応供給
液を毎時50mlの速度で連続的に給液し、同時に同流量で
連続的に抜液した。一定時間毎にサンプルを採取し、反
応生成液中のＬ−トリプトファン濃度、残存インドール
濃度及びＬ−セリン濃度を高速液体クロマトグラフ法に
より求めた。供給したインドール量に対して反応器内で
新たに生成したＬ−トリプトファンの収率を求め、該収
率が50％となる反応開始からの時間、すなわち、活性半
減期をライフタイムとして第３表に合わせて示した。

実施例２ 反応供給液の組成を、Ｌ−トリプトファン30g/l、イ
ンドール2g/l、塩化カリシウム・２水和物2.5g/l、ピリ
ドキサールリン酸10mg/lに、Ｌ−セリンをインドールと
Ｌ−トリプトファンの当量の和の約４倍に相当する70g/
lとし、反応器内のpHを10.0、温度を40℃として実施例
１と同様の連続流通反応を実施した結果、Ｌ−トリプト
ファンの収率が50％となる反応時間は650時間であっ
た。

実施例３ 固定化酵素源の調製法及び反応器の形式、液量、固定
化酵素の使用量は実施例１と同様にして、４基の反応器
を直列に配管で接続し、前段の反応器からの液だけが次
の反応器に流入するようにした。

第４表に示した組成の反応液を第１段目の反応器に48
ml/時間の速度で供給し、またインドールを62.5g/lの濃
度で溶解させたメタノール溶液を１〜４段の反応器にそ
れぞれ2ml/時間で滴下し、さらに、３段目の反応器には
Ｌ−セリンの粉末を0.655g/時間で連続的に供給し、Ｌ
−トリプトファン合成反応を実施した。また、比較のた
め、３段目と４段目でＬ−セリンを追加供給しない方法
も実施した。この場合、第３段目の反応は本発明の範囲
内に含まれるが第４段目の反応においてＬ−セリン量が
本発明の範囲よりも不足する。

各反応器の酵素のライフタイムを第５表に示した。ま
た、第５表には各反応器入口でのインドールに対するＬ
−セリンのモル比、インドールとＬ−トリプトファンの
合計モルに対するＬ−セリンのモル比を示した。

この実施例に示す方法で第１段目の反応器のみにより
反応を実施しようとすると、Ｌ−セリンを過剰に存在さ
せたとしても反応供給液中のインドール負荷量は0.125g
/時間が最大であり、従って、生成するＬ−トリプトフ
ァンの反応液中の生成量も最大0.2179g/時間であり、濃
度は4.36g/lである。これは工業的規模で実施するには
満足できる濃度ではない。

この実施例に示すように、本発明の条件で連続的に反
応を実施すると（３段目でＬ−セリンを新たに供給）、
固定化菌体のライフタイムを大きく伸ばすことができ
る。一方、３段目の反応器で新たにＬ−セリンを供給し
ない場合は、第４段目の反応器においてＬ−セリン／イ
ンドール＋Ｌ−トリプトファンモル比が本発明の範囲外
になり、ライフタイムを十分に伸ばすことができない。

［産業上の利用可能性］ 本発明の方法は、輸液成分や飼料用添加物として有用
なＬ−トリプトファンの工業的な連続的製造に適用する
ことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭58−16692（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−5098（ＪＰ，Ａ) Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．, 46（11），Ｐ2711−2718，1982

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】固定化酵素源を用いてインドールとＬ−セ
   リンを反応させてＬ−トリプトファンを連続的に製造す
   る方法において、反応液中のＬ−セリンのモル数を、該
   反応液中に存在するインドールとＬ−トリプトファンの
   モル数の和よりも常に過剰に存在させることを特徴とす
   るＬ−トリプトファンの製造方法。
2. 【請求項２】Ｌ−セリンのモル数が、インドールとＬ−
   トリプトファンのモル数の和に対して1.2倍以上であ
   り、かつ、インドールのモル数に対して1.5倍以上であ
   る請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】反応は、直列に連結された複数の反応槽中
   で行われ、請求項１記載の条件は各反応槽中で満足さ
   れ、第２段目以降の反応槽には前段の反応槽からの生成
   液及び請求項１記載の条件を満足するために必要な場合
   にはＬ−セリンが供給される請求項１記載の方法。