JPH0195780A - 固定化酵素の保存方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 童栗上■科朋公国 本発明は、所謂バイオリアクターの運転に用いられる固
定化酵素を保存する方法に関する。

ｌ米鼓街 従来から発酵技術の利用によってグルタミン酸ソーダな
どの有価物の生産が実施されて来たが、遺伝子組換え技
術など所謂ニューバイオテクノロジーの進歩により、生
体の機能を利用して有用な生産物を得る技術が近年飛躍
的な進歩を果した。

なかでも、微生物の機能を利用して有価物を生産する技
術の貢献度合は大きく、各種の反応を触媒する酵素が有
価物の生産に数多く利用されている。有価物生産の為に
、微生物が産生ずる酵素を利用する形態としては、培養
した微生物菌体から酵素を抽出精製して使用する方法、
酵素を保持した微生物の菌体をそのまま使用する方法、
微生物が増殖する状態で利用する方法などが有る。また
酵素または微生物菌体を固定化して利用する方法も実用
化されている。特にこの固定化して利用する方法は、酵
素または微生物と生産物との分離が容易である、酵素ま
たは菌体を繰り返し利用できるので菌体当りの生産性が
高い、従って生産物の高度の精製が容易である等の理由
から近年盛んに研究開発が進められ産業上の利用も進ん
でいるところである。

酵素または菌体を固定化する方法としては、例えば、ア
ルギン酸カルシウム、に−カラギーナンなどを担体とし
てそのゲル内に包括固定化する方法、イオン交換樹脂に
イオン結合で吸着固定化する方法、酵素それ自身を架橋
する方法などが報告されている。本発明者らは前記の固
定化酵素を用いて有価物を生産する技術の開発を進めて
いたが、その過程の中で次のような問題に直面した。

すなわち、酵素または菌体と担体とを混合せしめて固定
化酵素を製造した場合に、有価物を製造する為の反応に
供する迄、固定化酵素を単に冷所などで保存しておくだ
けでは酵素の活性が急激に低下してしまい、反応に使用
することが出来なくなってしまうという不都合な事実で
ある。言う迄もなく酵素の活性はそれ自身自己失活によ
り徐々に低下するものであるが、保存条件が不適切な場
合にはそれを越えた速度で失活してしまう。勿論固定化
酵素を製造した直後に反応に使用すれば問題はないが、
実際には、例えば小規模装置で１回当りの固定化酵素の
使用量が少ないにもかかわらず、固定化酵素の保存が出
来ない場合には、使用の都度少量の菌の培養、酵素の抽
出あるいは菌体または酵素の固定化操作が必要となり極
めて不便である。また大規模装置に於いても固定化酵素
の保存が出来ない場合には、−時に大量の固定化酵素を
製造する必要が生じ、固定化用装置の大型化、及びその
装置の稼動率が低くなるなどの問題が生じる。しかしな
がら、これ迄これらの問題点が有りながらも固定化酵素
の適切な保存方法が見出されておらず、上記のような問
題点を抱えていたのが実情である。

■が解°　しようとする。　占 本発明の課題は、固定化酵素または固定化菌体（以下、
固定化酵素と称することがある）を保存するに際し、該
固定化酵素の活性を低下させることな（保存する方法を
提供することにある。

すなわち、固定化酵素をその活性を低下させることなく
長期間保存する為の技術を提供すること、併せて固定化
酵素の保存方法を開発する事により固定化酵素の利用範
囲を更に広げようとするものである。

５題専を”パするための手 本発明者らは上記課題を解決する為鋭意研究を進めた結
果、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の方法は、炭素数１〜４の脂肪族アル
コールを含む水溶液中に該固定化酵素を浸漬保存して、
固定化酵素の活性を低下させる事なく保存する方法であ
る。

本発明に使用する酵素または菌体は、特に種類を問わず
、酸化還元酵素、転移酵素、異性化酵素、加水分解酵素
、脱離酵素、合成酵素などの酵素、あるいはこれらを生
産する微生物菌体であればいずれでも利用出来る。特に
トリプトファン・シンターゼまたはトリプトファナーゼ
生産菌の場合有効である。例えば、トリプトファン・シ
ンターゼの生産菌としてはエシェリヒア・コリＭＴ−１
０２３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１９）、エシェリヒア・コ
リＭＴ−１０２４２（ＰＥＲＭＢＰ〜２０）、ノイスボ
・クラッサ　ＡＴＣＣ１４６９２などを挙げられる。ま
た、トリプトファナーゼ生産菌としては、例えば、プロ
テウス・ブルガリスＩＦＯ３１６７、エシェリヒア・コ
リＩＡＭ　１２６Ｂ、アエロバクタ−・アエロバクタＩ
ＰＯＬ２０１９、クラブシェラ・ニューモニアエＡＴＣ
Ｃ８７２４、バチルス・アルヘイ八ＴＣＣ６３４８など
が挙げられる。

上記酵素または微生物菌体を固定化するための方法とし
ては、−船釣に良く利用される方法でよい。例えば、ア
ルギン酸カルシウムゲル、アルギン酸アルミニウムゲル
、に−カラギーナンゲル、アクリルアミド重金物などで
包括固定化する方法、イオン交換樹脂などに結合させる
担体結合法、架橋法またはこれらの方法の複合法などを
挙げることが出来る。とくに、アルギン酸カルシウムゲ
ル中に菌体を包括固定化する場合に有効である。

上記のような方法で得られた固定化酵素を以下の特徴を
有する保存液中に浸漬保存する。

即ち、保存液は炭素数１〜４の脂肪族アルコールを１〜
２０容量χ含む水溶液である。

炭素数１〜４のアルコールとしては、メチルアルコール
、エチルアルコール、プロピルアルコール、イソプロピ
ルアルコール、ｎ−＋１ｓｏ−＋　ｔｅｒｔ−ブチルア
ルコール等であり、特にエチルアルコールが有効である
。アルコールの濃度としては、１〜２０容量χの範囲が
良いが、アルコールの使用量をできるだけ少く抑える観
点から３〜８容量χが好ましい。

保存する温度としては保存液の氷点を越える温度から４
０°Ｃの範囲が良いが、酵素の活性を出来るだけ長期間
低下させない為には１〜５°Ｃ程度の温度の範囲の冷暗
所が好ましい。その他の共存する溶質としては、例えば
アルギン酸カルシウムゲルを担体として使用する場合に
は、ゲル中からカルシウムイオンが脱離してゲルが崩壊
するのを防く為、０．０１〜０．１　Ｍｏ　ｊ２　／　
１程度の濃度の塩化カルシウムを添加したり、またトリ
プトファンシンターゼのようにピリドキサール−５゛−
リン酸（ＰＬＰ）を補酵素として要求する酵素の場合に
は、ＰＬＰを０．１〜ｌｍＭｏ　４２　／　ｊ２程度添
加するのが良い。その他使用する酵素または担体の種類
により適宜必要な溶質を添加すれば良い。

また溶液のｐＨは使用する酵素により異なるが、トリプ
トファンシンターゼの場合にはｐＨ＝１〜８．５に調整
して使用する。

使用する水は、雑菌が混入していないことが好ましいの
で、蒸留水、逆浸透膜透過水、限外ろ過膜透過水、加熱
殺菌処理水などが特に好ましい。

使用する液量は固定化酵素が十分に浸漬される量であれ
ば良い。

以上のように調整された固定化酵素保存液に、固定化酵
素を浸漬し、冷暗所に保存することにより、固定化酵素
の活性を低下させることなく、長期間保存することが出
来る。

作朋超本グカ来 この方法によれば活性を低下させる事なく固定化酵素を
長期間保存することができる。例えば、本発明の保存液
を使用しない場合には、固定化酵素を冷暗所に保存して
も１００時間で初期活性の１７１０程度に低下してしま
う場合でも、本発明の保存液中に保存する方法によれば
、１ケ月以上経ても初期活性の９０〜１００χを保持す
ることが出来る。

本発明の方法を適用することにより小規模使用の場合で
も、固定化酵素を一時に大量に製造して保存しておき必
要に応して使用することが出来、また大量に使用する場
合には、小型の固定化装置で連続的に製造して貯蔵して
おくことが可能となる。

すなわち、本発明の方法によれば、活性を低下させるこ
となく固定化酵素を保存することにより、必要な時に必
要な量だけ固定化酵素を使用する事が出来るので、固定
化酵素を用いて有価物を生産するプロセス、中でも固定
化酵素製造装置の能力に関して合理的な設計が可能とな
る。

実施炎 以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、勿論、
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

参考例１ トリプトファン・シンターゼ生産菌であるエシェリヒア
・コリＭＴ−１０２３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１９）を５
００ｍ　ｌの坂ロフラスコ中の第１表に示す組成の培地
１００ｍ　ｌ。

に接種し、３５°Ｃで２４時間培養した。この培養液２
００ｍｊ２　（フラスコ２本）を３０１１のジャーファ
ーメンタ−中の第２表に示す組成の培地１ｉに接種し、
３５”Ｃ，ｐＨ６，８（２８χアンモニア水で調整）で
３０時間培養した。

培養終了後、培養液を遠心集菌して湿菌体を約６００ｇ
得た。これを密封容器に入れ、４°Ｃの冷蔵庫に保管し
、固定化酵素源の作製に使用した。

第１表　培養培地の組成 第２表　増殖培地の組成 上記湿菌体１部と生理食塩液１部とを撹はん混合した。

一方、蒸留水７．７６部とアルギン酸ナトリウム（記文
フードケミファ社製Ｎ５ＰＬＬ　）　０．２４部とを撹
はん混合しｐＨを８．５に苛性カリで調整した。

菌体の懸濁液２部と、上記のアルギン酸ナトリウムの熔
解液８部を撹はん混合し、注射器に充填、内径が０．５
〜０　、８ｍｍ程度の注射針の先端より、ゲル化液に滴
下した。

ゲル化液は、０．５モル濃度の塩化カルシウムニ水塩水
溶液を６規定苛性カリ水溶液でｐＨを８．５に調整し、
１０°Ｃに保った液を５０部使用した。

ゲル化液に滴下されて生成した粒子は液中で約１時間撹
はん熟成後、液中より取り出し保存テストに使用した。

固定化酵素の活性の測定は以下の通り行った。

インドールとＬ−セリン及びＰＬＰを含む反応液１０ｍ
１を試験管にとり、固定化酵素約０．２　ｇを精秤して
加える。振とう培養機で、３５°Ｃ１１時間振とうして
反応を行ない、生成したＬ−トリプトファンを高速液体
クロマトグラフィーで分析した。固定化酵素の活性は、
単位時間当り、単位湿固定化酵素ゲル重量当り、生成し
たトリプトファンの重量で評価した。

実施例１ 塩化カルシウム０．０５モル濃度、ＰＬＰ　Ｏ，２ミリ
モル濃度、エチルアルコール５容量χの組成の保存液を
蒸留水を用いて調合した。ｐＨは６規定ＫＯＨで８．５
に調整した。この保存液１００部に参考例で作成した固
定化酵素ゲルを１０部浸漬し、４°Ｃの冷蔵庫に保存し
た。所定時間経過後、固定化酵素の活性を測定した。一
定時間経過後の活性Ａと、初期活性ＡＯとの比を求め第
１図中に示した。

比較例１ エチルアルコールを含まない他は、実施例１と同じ組成
の保存液を用いて、固定化酵素を実施例１と同じ条件で
保存し、固定化酵素の活性の変化を実施例１と同様に求
め第１図中に示した。

実施例２ エチルアルコールの濃度を１０容量χとした以外は実施
例１と同様の試験を行った結果、実施例１と同様の結果
を得た。

実施例３ アルコールとしてメチルアルコール５容量χ、１５容量
χ、イソプロピルアルコール５容量χ、２０容量χを含
んだ保存液を用いて、実施例１と同様の試験を行い、第
２図に示した結果を得た。

比較例２ 保存温度を３０°Ｃとして、その他は実施例１と同様の
試験を行い、第２図に示した結果を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の効果を示す試験結果を示したものであ
り、第１図中、横軸は固定化酵素の保存時間、縦軸は一
定時間後の固定化酵素の活性と初期活性との比である。 、第２図はアルコールの種類と保存安定性の関係を示し
たものであり、横軸と縦軸は第１図の場合と同じいみを
示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １）固定化酵素を保存するに際し、炭素数１乃至４の脂
   肪族アルコールを１〜２０容量％含む水溶液中に浸漬保
   存することを特徴とする固定化酵素の保存方法。