JP3233878B2 - Ｌ−アスパラギン酸の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酵素によりマレイ
ン酸をフマル酸に変換する方法、並びにマレイン酸とア
ンモニアとからＬ−アスパラギン酸を生産する方法にお
いて、基質媒体中の酸素濃度を低下させることにより、
反応に用いる酵素の寿命を延ばすことを特徴とするＬ−
アスパラギン酸の製造に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、マレイン酸をフマル酸に転換する
微生物として、シュードモナス属、バチルス属、アエロ
バクター属、ブレビバクテリウム属に属する微生物（特
公昭４２−１１９９３、特公昭４２−１１９９４）が知
られている。酵素を用いた反応においては、長時間の使
用により酵素活性が低下する事により、ある一定期間反
応を行った後、酵素の交換を行わざるを得ないのが現状
である。このような酵素の活性低下は、酵素が蛋白質で
ある以上避けられないことであるが、特にマレイン酸と
アンモニアからのＬ−アスパラギン酸の生成においては
用いるマレイン酸異性化酵素が酸素に対し不安定である
ため、酵素の交換も煩雑に行わなければならない。この
ような方式で連続反応を行うと設備的な負担あるいは人
件費の負担が大きくなってしまう。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、安価
な原料を用い、工程が簡単であり、かつ長時間にわたり
安定にマレイン酸からフマル酸を連続的に変換する方
法、並びにマレイン酸とアンモニアからアスパラギン酸
を製造する方法を提供しようとするものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、連続生体
触媒反応において酵素反応学的見地から、鋭意検討を行
った結果、本発明を完成するに至った。すなわち、本発
明は、マレイン酸に、反応器に充填されたマレイン酸イ
ソメラーゼ活性を有する酵素含有物を作用せしめること
によりフマル酸に連続的に変換する方法において、脱酸
素剤及び／又は不活性ガスにより酸素濃度を低減化させ
た基質媒体を反応器に導入することを特徴とするフマル
酸の生成方法、並びにこれを応用した、マレイン酸とア
ンモニアからアスパラギン酸を製造する方法、に関する
ものである。

【０００５】本発明によると、高濃度のマレイン酸を含
有する基質媒体を反応器に導入するにあたり、基質媒体
中の酸素濃度を脱酸素剤及び／または不活性ガスにより
低減化する事により、酵素の活性の低下につながる酸素
の濃度を低く保ち、酵素の寿命を延ばし、効率よくフマ
ル酸を生成できる。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下に本発明の実施実態を説明す
るが本発明はかかる実施実態のみに限定されるものでは
ない。本発明に使用する微生物としてはマレイン酸イソ
メラーゼ活性を有する微生物であれば特に限定されない
が例えば、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）
属に属する微生物（アルカリゲネス・フェーカリス（Ａ
ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ８７
５０）、エンテロバクター属に属する微生物（エンテロ
バクター・アグロメランス ＮＳＭ−１）、シトロバク
ター属に属する微生物（シトロバクター・フロインディ
ア ＮＳＭ−２）、クレブシェラ属に属する微生物（ク
レブシェラ・プランティコラ ＮＳＭ−３）、シュード
モナス属に属する微生物（シュードモナス・フルオレセ
ンスＮＳＭ−４）等、マレイン酸よりＬ−アスパラギン
酸を収率よく生成する特徴を有する微生物が好適に用い
られる。エンテロバクター・アグロメランス ＮＳＭ−
１、シトロバクター・フロインディア ＮＳＭ−２、ク
レブシェラ・プランティコラ ＮＳＭ−３及びシュード
モナス・フルオレセンスＮＳＭ−４は、工業技術院生命
工学工業技術研究所にそれぞれ寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１４４４７（寄託日平成６年７月２１日）、ＦＥＲＭ
Ｐ−１４４４８（寄託日平成６年７月２１日）、ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５１４４（寄託日平成７年８月３０日）、及
びＦＥＲＭ Ｐ−１５５６０（寄託日平成８年４月１２
日）として寄託されている。

【０００７】なお、ＮＳＭ−１株及びＮＳＭ−２株の菌
学的性質は次の通りである。

【０００８】

【表１】

【０００９】また、ＮＳＭ−３株の菌学的性質は次の通
りである。

【００１０】

【表２】

【００１１】

【表３】

【００１２】本発明者等は、つくば市内の土壌より、Ｎ
ＳＭ−４株を分離した。ＮＳＭ−４株の菌学的性質は、
以下の通りである。

【００１３】

【表４】

【００１４】

【表５】

【００１５】

【表６】

【００１６】以上の菌学的性質について、バージイズ・
マニュアル・オブ・システマティク・バクテリオロジー
ｖｏｌ．１〜４（１９８６年）をもとに検索を行った結
果、ＮＳＭ−１株は、ＯＦテスト、ＶＰテスト、インド
ール生成、各種糖からの酸生成、クエン酸の利用等の点
から、エンテロバクター・アグロメランスに属するもの
と判明し、ＮＳＭ−２株は、ＯＦテスト、ＶＰテスト、
クエン酸の利用、硫化水素の生成等の点から、シトロバ
クター・フロインディに属するものと判明し、ＮＳＭ−
３株は、運動性、ウレアーゼテスト、クエン酸の利用、
ｍ−ヒドロキシ安息香酸資化性、メチルレッドテスト等
の点から、クレブジェラ・プランティコラに属するもの
と判明し、そしてＮＳＭ−４株は、グラム陰性、運動性
＋、ＯＦテスト−、オキシダーゼ＋、糖の資化性、有機
酸の資化性、アルギニンデヒドロラーゼ＋、蛍光色素の
産生等の点から、シュードモナス・フルオレセンスに属
するものと判明した。

【００１７】培養して得られた微生物菌体は遠心または
濾過により集め、水または適当な緩衝液を用いて洗浄
し、本発明の反応に使用する。微生物は更に、超音波、
摩砕、凍結融解、界面活性剤処理などにより物理的また
は生化学的に処理して破砕した菌体破砕物、さらに、硫
酸アンモニウム塩析、アセトン沈殿等定法により得られ
る酵素に精製することができる。本発明の反応に用いる
酵素含有物としては、微生物菌体または菌体破砕物もし
くは酵素をセルロース、アルギン酸、κ−カラギーナン
などの適当な天然高分子、あるいはイオン交換樹脂やポ
リアクリルアミド等の適当な合成高分子を担体として定
法により固定化して用いる。

【００１８】本発明に用いる基質となるカルボン酸は無
水マレイン酸、マレイン酸あるいはマレイン酸塩から選
ばれる少なくとも１つである。また、メルカプトエタノ
ール、グルタチオン、システイン、ジチオスレイトール
などのＳＨ基を有する化合物を０．１〜５０mM、好まし
くは１〜１０mMの濃度で添加することが好ましい。

【００１９】基質媒体に含まれる酸素によりマレイン酸
イソメラーゼやアスパルターゼが失活することが知られ
ており、メルカプトエタノールなどのＳＨ化合物を添加
しているが、それだけでは安定化の効果は高くない。そ
のため、酵素は基質溶液中の酸素濃度を低減化すること
を行ったところ、酵素の寿命を延ばすことができること
が判明した。

【００２０】酸素濃度は通常の濃度で２５℃で８ppm で
あるが、これを１ppm 好ましくは０．１ppm 、更に好ま
しくは０．０１ppm 以下に保つことにより酵素の寿命を
のばすことができる。基質媒体中の酸素を除去する方法
は、（１）脱酸素剤を基質媒体に添加する方法、（２）
不活性ガスにより酸素を除去する方法がある。脱酸素剤
としては、亜硫酸イオンを用いることができる。亜硫酸
イオン源としては、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウ
ム、亜硫酸アンモニウム、亜硫酸アンモニウム等の塩ま
たは亜硫酸、あるいはハイドロサルファイトを用いるこ
とができる。亜硫酸イオン、又はハイドロサルファイト
としては、２０ppm 以上１％以下、好ましくは１００pp
m 以上０．５％以下の濃度で添加する事が好ましい。亜
硫酸又は亜硫酸塩を添加して酸素を除去する効率は、基
質媒体の温度に依存する。２０℃より低温では、酸素の
除去速度は遅く、酸素除去率も悪いが、３０℃以上に基
質媒体を昇温することにより極めて効率よく酸素を除去
できる。脱酸素剤の基質媒体への添加は、基質媒体調整
時に調製タンクに添加してもよいし、基質媒体保存容器
へ、または、反応器への導入ラインで添加してもよい。
また、ハイドロサルファイトは低温においても酸素除去
効率が高いため、特に低温で反応を行うときに有利であ
る。

【００２１】不活性ガスにより基質媒体中の酸素濃度を
低減化する方法では、不活性ガスとして窒素、アルゴ
ン、ヘリウム等が用いられる。不活性ガスの投入方法と
しては、基質媒体を調製した後、保存容器に入れ、気相
部を不活性ガスで置換し、気相部中の酸素濃度を下げる
方法、また、基質媒体に不活性ガスを導入し溶存酸素を
除去する方法等特に方法は限定しない。保存容器の気相
部を不活性ガスで置換するとき気相部の酸素濃度は５％
以下、好ましくは３％以下更に好ましくは１％以下であ
る。基質媒体を保存する容器は、材質は特に限定しない
が、ステンレス、鉄、プラスティック、ガラス等を用い
ることができる。形状は特に限定しないが、蓋付きで密
閉できるか、不活性ガスで気相部を保つことができる構
造が好ましい。

【００２２】基質媒体中の酸素を除去する方法は、上記
の脱酸素剤を基質媒体に添加する方法と不活性ガスによ
り酸素を除去する方法があるが、これらを組み合わせる
こともでき、組み合わせることにより、更に効果的とな
る。酵素反応の速度は温度に依存するため、あまり低い
温度で反応を行うと反応が遅いため、収率を上げるため
には大量の酵素が必要となる。また、マレイン酸イソメ
ラーゼは、温度が高くなると活性低下が起こりやすいた
め、酵素の活性低下を抑えるためには、反応器内の温度
を高くできない。これらのことから、反応器内の温度
は、５〜５０℃、好ましくは１０〜４０℃、更に好まし
くは、１５〜３５℃の範囲であることが望ましい。

【００２３】また、生成したフマル酸とアンモニアより
アスパルターゼ活性を有する酸素含有物を用いて連続的
酵素反応によりＬ−アスパラギン酸を製造することもで
きる。アスパルターゼ活性を有する微生物としては例え
ばエッシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属す
る微生物（エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣＡＴＣＣ１１３０３，ＡＴＣＣ
９６３７，ＡＴＣＣ２７３２５）、ブレビバクテリウム
（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物で
あれば特に限定されない。

【００２４】マレイン酸よりフマル酸に変換しさらにア
スパラギン酸を製造する方法においては、原料のマレイ
ン酸の濃度は５−４０重量％が好ましいが、マレイン酸
塩の溶解性と生体触媒の反応性を考えると特に１０から
３０重量％の範囲で反応させるのが効果的であり、より
好ましくは１０−２５重量％の範囲で反応させるのが効
果的である。また、基質媒体には、更に塩化マンガン、
硫酸マンガン等のマンガン塩、または塩化マグネシウ
ム、硫酸マグネシウムなどのマグネシウム塩または、亜
鉛塩、カルシウム塩、ニッケル塩、コバルト塩、鉄塩等
の金属塩を０．１−５０mM、好ましくは１−１０mMの濃
度で添加することが好ましい。

【００２５】以上のように、反応器に充填されたマレイ
ン酸イソメラーゼ活性を有する酵素含有物をマレイン酸
に作用させてフマル酸に転換する方法、並びにマレイン
酸とアンモニア、及び／またはマレイン酸アンモニウム
を含有する基質媒体に、反応器に充填されたマレイン酸
イソメラーゼ活性とアスパルターゼ活性を有する酵素含
有物、またはマレイン酸イソメラーゼ活性を有する酵素
含有物とアスパルターゼ活性を有する酵素含有物を作用
させて、連続的酵素反応によりＬ−アスパラギン酸を製
造する方法において、脱酸素剤や不活性ガスにより基質
媒体中の溶存酸素濃度を下げて、当該原料を反応器に連
続的に供給しながらＬ−アスパラギン酸を製造すること
を特徴とする方法を提供するものである。

【００２６】

【実施例】以下に本発明を実施例により詳細に説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。なお反応
生成物は、液体クロマトグラフィーにより分析した。実施例１． 表４に示す培地１００mlを入れて滅菌した坂
口フラスコにエンテロバクター・アグロメランスＮＭＳ
−１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４４４７）を接種し、２４時
間培養後、同組成の培地１Ｌを仕込んで滅菌した２Ｌジ
ャーファメンターに全量接種し、３０℃で通気攪拌培養
を行った。培養中４０％マレイン酸水溶液を用いて培地
のｐＨを７．５以下にコントロールした。培養８時間後
に１００００rpm で遠心分離することにより菌体を回収
し、０．１Ｍリン酸緩衝液で菌体を洗浄後、０．１Ｍリ
ン酸緩衝液２００mlを加え、ホモジナアイザーにより菌
体をつぶし、その上澄みを粗酵素液として用いた。粗酵
素液１mlと所定量の亜硫酸ナトリウムを含む表５に示す
マレイン酸水溶液９mlを２０mlの試験管に入れ、３０℃
で振とうし、経時的に試験管の基質液を採取し、反応液
の分析を行った。

【００２７】結果を表６に示す。マレイン酸は時間とと
もに減少し、フマル酸及びリンゴ酸に変化し、亜硫酸ナ
トリウムを入れた系では、３０時間以降においてもマレ
イン酸変換活性は保っていた。３０時間後の酸素濃度
は、亜硫酸ナトリウムの添加量が１０ｇ／１Ｌの時、０
ppm であった。

【００２８】

【表７】

【００２９】

【表８】

【００３０】

【表９】

【００３１】比較例１．基質液として、表７に示す組成
を使用する以外は実施例１と同様の実験を行った。結果
を表６に示す。初期においてはマレイン酸は時間ととも
に減少し、フマル酸及びリンゴ酸に変化したが、５時間
後、マレイン酸変換活性はほぼなくなった。また、この
ときの反応液中の酸素濃度は約７．５ppm であった。

【００３２】

【表１０】

【００３３】実施例２．シトロバクター・フロインディ
ＮＳＭ−２株（ＦＥＲＭＰ−１４４４８）を菌体として
用いる以外実施例１と同様の操作を行った。結果を表８
に示す。３０時間後の反応液を分析したところ、フマル
酸は６．１％、リンゴ酸は４．５％生成していた。

【００３４】

【表１１】

【００３５】比較例２．基質液として、表７に示す組成
を使用する以外は実施例２と同様の実験を行った。結果
を表８に示す。初期においてはマレイン酸は時間ととも
に減少し、フマル酸及びリンゴ酸に変化したが、５時間
後、マレイン酸変換活性はほぼなくなった。また、この
ときの反応液中の酸素濃度は約７．５ppm であった。

【００３６】実施例３．実施例１と同様にして、エンテ
ロバクター・アグロメランスＮＳＭ−１様の粗酵素液を
作成した。粗酵素液１mlと所定量の亜硫酸ナトリウムを
含む表９に示すマレイン酸アンモニウム水溶液９mlを２
０mlの試験管に入れ、３０℃で振とうし、経時的に試験
管の基質を採取し、反応液の分析を行った。

【００３７】結果を表１０に示す。マレイン酸は時間と
ともに減少し、Ｌ−アスパラギン酸に変化し、亜硫酸ナ
トリウムを入れた系では、３０時間以降においてもマレ
イン酸変換活性は保っていた。３０時間後の酸素濃度
は、亜硫酸ナトリウムの添加量が１ｇ／Ｌ，５ｇ／Ｌ及
び１０ｇ／１Ｌの時それぞれ、１ppm ，０ppm 及び０pp
m であった。

【００３８】

【表１２】

【００３９】

【表１３】

【００４０】

【表１４】

【００４１】比較例３．基質液として、表１１に示す組
成を使用する以外は実施例３と同様の実験を行った。結
果を表１０に示す。初期においてはマレイン酸は時間と
ともに減少し、Ｌ−アスパラギン酸に変化したが、５時
間後、マレイン酸変換活性はほぼなくなった。また、ア
スパルターゼ活性は、３０時間後失活していなかった。
このときの反応液中の酸素濃度は約８ppm であった。

【００４２】実施例４．実施例１と同様の方法によりエ
ンテロバクター・アグロメランスＮＳＭ−１株（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１４４４７）の粗酵素液を作成した。粗酵素液
１mlと所定量の表７に示すマレイン酸水溶液９mlを２０
mlの試験管に入れ、試験管内を窒素で置換した後密栓し
た。３０℃で振とうし、経時的に試験管内の反応液を採
取し、反応液の分析を行った。また、反応液の採取ごと
に窒素置換を行った。結果を表１２に示す。

【００４３】

【表１５】

【００４４】比較例４．試験管を窒素で置換せず、３０
℃で反応を行う以外は実施例２と同様の実験を行った。
結果を表１２に示す。

【００４５】実施例５．表４に示す培地１００mlを入れ
た滅菌した坂口フラスコにエンテロバクター・アグロメ
ランスＮＭＳ−１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１４４４７）を接
種し、２４時間培養後、同組成の培地１Ｌを仕込んで滅
菌した２Ｌジャーファメンターに全量接種し、３０℃で
通気攪拌培養を行った。培養中４０％マレイン酸水溶液
を用いて培地のｐＨを７．５以下にコントロールした。
培養８時間後に１００００rpm で遠心分離することによ
り菌体を回収し、０．１Ｍリン酸緩衝液で菌体を洗浄
後、４０℃の３％カラギーナン水溶液１００mlに加えて
混合し、２％塩化カリウム水溶液５００ml中にシリンジ
から滴下して直径約４mmの球状ゲルとし、固定化菌体を
調製した。

【００４６】この固定化菌体を２５℃に保った外部ジャ
ケット付きカラム（直径10cm、長さ30cm）に詰めて、表
１３に示すマレイン酸アンモニウム水溶液１Ｌを調製
し、２Ｌのガラス瓶に入れ、ＳＶ＝０．２で連続的に反
応器に通塔した。また、基質液を入れたガラス瓶には常
に窒素を流した。反応液を採取し分析を行った。マレイ
ン酸は消失しており、Ｌ−アスパラギン酸が２２．８重
量％の濃度で生成していた。Ｌ−アスパラギン酸への変
換率は９９％以上であった。マレイン酸変換率は２日後
においても９９％以上であった。また、２日後のマレイ
ン酸アンモニウム水溶液中の溶存酸素は検出限界以下で
あった。

【００４７】

【表１６】

【００４８】比較例５．基質液に亜硫酸ナトリウムを入
れず、基質液を入れたガラス瓶は蓋をせず用いた以外実
施例５と同様の実験を行った。反応液を分析したとこ
ろ、初期においてマレイン酸は９９％以上消失し、Ｌ−
アスパラギン酸に変換したが、１日後にはマレイン酸の
変換率は０％になった。

【００４９】実施例６．表１４に示す培地１００mlを入
れた滅菌した坂口フラスコに、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＮＳＭ−４株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１５５６０）を接種し、２４時間培養後、同組成の
培地１Ｌを仕込んで滅菌した２Ｌジャーファーメンター
に全量接種し、３０℃で通気攪拌培養を行った。培養中
４０％マレイン酸水溶液を用いて培地のpHを７．５以下
にコントロールした。培養８時間後に１００００rpm で
遠心分離することにより菌体を回収し、０．１Ｍリン酸
緩衝液で菌体を洗浄後、４０℃の３％カラギーナン水溶
液１００mlに加えて混合し、２％塩化カリウム水溶液５
００ml中にシリンジから滴下して直径４mmの球状ゲルと
し、固定化菌体を調製した。

【００５０】半減期測定法 先に調製した固定化生体触媒を、ジャケット付きカラム
に充填し、ジャケットに３０℃の温水を循環させて反応
器の温度を３０℃に設定した。表１５に示すマレイン酸
アンモニウム水溶液１Ｌを調製し、２１のふた付きガラ
ス瓶に入れ、SV＝０．２で連続的に反応器に通塔した。
また基質液を入れたガラス瓶には窒素を流した。反応開
始後１２時間目に反応後の分析を行ったところ、反応生
成物として、消費マレイン酸と等量のＬ−アスパラギン
酸が生成していた。転化率が９０％以下になった時か
ら、転化率をＨＰＬＣで分析し、転化率の時間変化を追
跡した。この転化率の対数値を反応時間に対してプロッ
トした傾きから、マレイン酸をＬ−アスパラギン酸に変
換する酵素活性の半減期を計算したところ、３４．６時
間であった。この結果を表１６に示す。

【００５１】

【表１７】

【００５２】

【表１８】

【００５３】

【表１９】

【００５４】実施例７．表１７に示したマレイン酸基質
液を用いた以外は実施例６と同様にして活性半減期を計
算したところ、７２．２時間であった。

【００５５】

【表２０】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 13/20 (Ｃ１２Ｐ 13/20 Ｃ１２Ｒ 1:39） Ｃ１２Ｒ 1:39） (56)参考文献 特開 平８−332092（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−322791（ＪＰ，Ａ) 特開 平10−52288（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 13/20 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マレイン酸をマレイン酸イソメラーゼ活
   性を有する酵素含有物に作用せしめることにより、フマ
   ル酸を生成する方法において、脱酸素剤及びまたは不活
   性ガスを用いて反応器内の反応液中の溶存酸素濃度を１
   ppm 以下にし、ここで上記酵素が、エンテロバクター・
   アグロメランスＮＳＭ−１（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
   ４４４７）、シトロベクター・フロインディアＮＳＭ−
   ２（寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４４４８）、クレブシ
   ェラ・プランティコラＮＳＭ−３（寄託番号 ＦＥＲＭ
   Ｐ−１５１４４）、及びシュードモナス・フルオレセ
   ンスＮＳＭ−４（寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１５５６
   ０）から成る群から選ばれる微生物に由来することを特
   徴とする方法。
2. 【請求項２】 マレイン酸とアンモニア及び／またはマ
   レイン酸アンモニウムを含有する基質媒体に、反応器に
   充填されたマレイン酸イソメラーゼ活性とアスパルター
   ゼ活性を有する酵素含有物、またはマレイン酸イソメラ
   ーゼ活性を有する酵素含有物とアスパルターゼ活性を有
   する酵素含有物とを作用せしめることによりＬ−アスパ
   ラギン酸を連続的に製造する方法において、脱酸素剤及
   び／又は不活性ガスを用いて、反応器内の基質媒体中の
   溶存酸素濃度が１ppm 以下であり、ここで上記酵素が、
   エンテロバクター・アグロメランスＮＳＭ−１（寄託番
   号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４４４７）、シトロベクター・フ
   ロインディアＮＳＭ−２（寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１
   ４４４８）、クレブシェラ・プランティコラＮＳＭ−３
   （寄託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１５１４４）、及びシュー
   ドモナス・フルオレセンスＮＳＭ−４（寄託番号 ＦＥ
   ＲＭ Ｐ−１５５６０）から成る群から選ばれる微生物
   に由来することを特徴とする方法。
3. 【請求項３】 基質媒体に含有する脱酸素剤が、亜硫
   酸、亜硫酸塩、及び／またはハイドロサルファイトであ
   ることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。