JPS5991890A - Ｌ−フエニルアラニンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はｔ−桂皮酸お工びアンモニアに関するフェニル
アラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）接触反応による
フェニルアラニンの調製方法に関する。特に本発明はＰ
ＡＬ触媒の活性が高度に維持さ１１．￥にこの触媒が再
使用用能である。この枠のフェニルアラニンの製造方法
に関する。

Ｌ−フェニルアラニンに栄養およびその他食品ならび圧
医学領域における重要な必須アミノ酸の１極であり、こ
れは卵アルブミンおＬびラクトアルブミンな含む各種の
タン白質から工業的に単離されて来に０肖該技術分野で
周知のＬ−フェニルアラニンを調製する実験両法は酵素
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（以下、ＦＡＩ、
とする）を用いて可逆反応？触媒するものである。

Ｌ−フェニルアラニン→トランスー桂皮酸＋アンモニア
英国特許第１，４８９．４６８号（１９７７年１０月１
９日）参照。

この反応の平衡はｔ−桂皮酸について８０：２０であシ
、そして数多くの方法がＬ−フェニルアラニンへの変換
のレベルな高めるために試みらｎて来た。英国特許第１
．４８９．４６８号はＬ−７エニルアラニンの理論上２
０チの収率に近づくことが。

ＰＡＬ触媒を含有する多量の細胞お工び過剰のアンモニ
ウムイオンを用いることＫＬって達成し得ることを開示
している。該特許の方法に工ｎば。

アンモニウムイオン諒ハ好１しくは塩化７ンモニウムで
あシ、そして反応はｐ　Ｈ８，５乃至９．７で行うのが
好ましい。

山田Ｓ、他１ｄ　ｒ　Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉ
ｅｒｏｂｌｏｌ、Ｊ４２ニア７３〜７８（１９８１年２
によって、変換収率に塩化水素酸Ｖｒ、ｃつて基負溶液
のｐＨ％ｒ１０、ＯＫ調節することによシフ０チを超え
て増加させ得ることを報告した。しかし、これらの条件
は余シ過酷なので回収された細胞のＰＡＬ活性は顕著に
減少し、その結果酵素の再使用はできない。

更産山田他は、細胞酵素の固定がその１１の細胞の使用
を超える伺らの効果ももたらさないことを述べている。

従って、この方法Ｋｘ７．Ｌ−７エ二ルアラニンの高濃
度に取シ敢えず可能であるが。

接触的酵素ケ再使用できないことがこの方法を大規模応
用に関して不経済なものとしている。

従って、を−桂皮酸およびアンモニアからＬ−フェニル
アラニンを製造する方法であって、該方法においてはＬ
−フェニルアラニンの高収率が達成さｎると共ＫＰＡＬ
が再使用し得るだけの十分な触媒活性？保持するものの
必要性が依然として継続している。

それ故１本発明の目的はｔ−桂皮酸からＬ−フェニルア
ラニンヲ調製する方法であって、これにニジ生成物は高
濃度で生成さｎ、セしてＰＡＬ酵累は反覆的に使用でき
る方法を提供するものである。

更に本発明の目的は、その反応が自由細胞バッチ方式か
、固足細胞あるいは酵素系において行われるＬ−フェニ
ルアラニンの製造方法を提供することにある。

その上６本発明の目的はＬ−フェニルアラニンの製造に
際してＦＡＩ、％？用いる経済的な７３法を提供するこ
とにある。

フェニルアラニンアンモニアリアーゼの存在下。

を−桂皮酸とアンモニアを反応させることによるＬ−７
二二ルアラニンの製法において、Ｌ−フェニルアラニン
の高収率が達成され、ｔ＊ＰＡＬの高度の触媒活性が保
持されることに関し改良が施さ−ｒｔ＋。制御された反
応条件下で、ＰＡＬの安定性は、該ＰＡＬを反覆的に用
いてＬ−フェニルアラニンを高濃度で生成できるように
、増加さｎる。

この所望の結果を連成するために、酸なアンモニアイオ
ン源と反応させることにエル基質溶液が調製さｎる。こ
のアンモニウムイオン源は如何する非ハロゲンアンモニ
ウム塩であってもよい。基質溶液のｐＨは非ハロゲン含
有酸な用いることにより約８．０乃至１０．０の範囲内
＆ｒｗＡ整され１次いでこの溶液はＰＡＬ、％’金含有
るＰＡＬ源、六とえは自由、非固定細胞系１穴は固足細
胞あるい社酵素系に添加さｎる。

本発明の方法に工ｎ、げ、基質溶ｐｆＬはｔ−桂皮酸と
アンモニウムイオン源とＶｒよって調製される。

アンモニウムイオン源は有機酸か鉱酸のアンモニウム塩
なｔ−桂皮酸Ｖｒ藺接接添加るか、あるいは水酸化アン
モニウムと非ハロゲン酸を混合することＫＬり基質溶液
中で調製することＫＬつて導入さｒしるものである。

英国特許第１．４８９．４６８号は、好ましいアンモニ
ウムイオン源が塩化アンモニウムと水酸化アンモニウム
（第３ページ、第２５〜２６行）の混合物であることを
教示している。Ｙａｍａｄａ他の方法も塩化アンモニウ
ムな用いるものである。こｎらの先行技術の教示とは反
対に、アンモニウム塩はへ四ゲンイオンを含１ない刀が
有利であることが見出さｎ＊。基質溶液中のノＳＯゲン
の存在はＰＡＬの触媒活性を抑制することが判明した。

従って、好ましいアンモニウム塩には、硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、桂皮酸アンモニウム。

酢酸アンモニウム、およびリン酸アンモニウムがある。

特に好ましいアンモニウム塩は硫酸アンモニウムである
。更にＩｆｔ、アンモニウム塩は基質溶液に高濃度で添
加するのが望ましい。アンモニウムイオンの濃度は通常
約０．１乃至７．５　Ｍ　、好フしくけ約１乃至５Ｍで
ある。アンモニウム塩の高濃度は系中のアンモニアの濃
度を増加し、また−万緩衝剤として作用するので０反応
のｐＨ調整がニジ容易に制御可能である。

アンモニウムイオンの濃度が、こｎら一示範囲内にあれ
ば、溶液中のｔ−桂皮酸の濃度は通常約３０乃至約２０
０ｍＭであり、そして好１しくに約６０乃至約１５０ｍ
Ｍである。

山田他に基質溶液’ｋｐ）１１０．ＯＫ−節すべきこと
な教示している。し力λし１本発明の７ｊ法においてｐ
Ｈは約８乃至約１０の範囲内で調節することが回部であ
り、そして約８．５乃至９．５の範囲内が好ましい。史
ＩＦ　Ｙａｍａｄａ等の文献は基質溶液のｐＨ？ｒ−塩
化水素酸で調節することを教示している。これ灯多量の
塊化物？基質に添加する可能性がある。

しかし６本発明においては先に述べたように、基質溶液
のｐＨに非ハロゲン含有酸で調節することが有利である
。ｐＨ調整用の好ましいｒｌには硫酸。

リン酸お□よび酢酸であるが、その他の非ハロゲン酸も
使用可能である。水酸化アンモニウムを含有する基質溶
液に添加する場合、特に好ましい酸は硫酸であり、こｎ
に反応して硫酸アンモニウム？生成し、この塩は周知の
酵素安定剤である。

基質溶液は培養肉汁、そｆＬから分離した細胞。

１７２：は単離した酵素ケ含有するＰＡ’Ｌに添加され
る。このＰＡＬＵ先行技術により教示さｒｔπ慣用法に
従って調製される。ＰＡＬ接随反応はＬ−フェニルアラ
ニン生成条件下で進行するが、こ−ｒｔには約１０℃乃
至約４５℃の反応温度を伴うことが好ましい。本発明に
よる７Ｊ法の条件下でＰＡＬ。

安定性は、そ；ｒＬｖ反覆して用いてＬ−フェニルアラ
ニンな高濃度で生成できるように増加する。

Ｌ−フェニルアラニンを生成する木刀法は、自由細胞バ
ッチ方式あるいけ固定細胞でたは酵素方式のいずれにお
いても利用可能である。バッチ方式は単純なバッチ、あ
るいぼ連続的供給バッチ方式のいずれでもよい。もしＰ
ＡＬがカラム中に固定されれば、カラム？単一の通過、
再循環、′！Ｆたに連続供給再循環方式として操作する
ことができる。

ＰＡＬ酵素−Ｆたは酵素を含有する細胞な固足する好ま
しい方法が１９８２年７月２０日に出願さｎた米国特許
出願第４００，１４１号中に開示さｎている。ＰＡＬ酵
累１には該酵素を含有する細胞なカラム上に固定する場
合、基質溶液なカラム中にポンプで送シ込む際カラムは
温度約１０乃至約４０Ｃ１そして好１しくは１８乃至３
０Ｃに維持することが可能である。

反応混合物ＨＬ−フェニルアラニン製造の慣用法によっ
て分析される。基質溶液中の塩゛化水累酸の代りに硫酸
が用いらｎると、生成さｎるＬ−フェニルアラニンは塩
化水素酸が用いら扛る場合の生成１１の約８乃至１０倍
とｒｃる。ＰＡＬ酵素が固足さｎ、ていると、こｎ７は
反応時の４１日後に約５０チの活性保持ケ示す。こ′７
１．は山田他により報告さｆ１７’ｒ２４時間後の２０
％保持とは対照的である。

Ｌ−フェニルアラニンは慣用法にょす反応混合物から単
陥可能である。

下記の実施例σ本発明の方法を例示し、かつ更に明確に
することケ慧図するものであるが、そｊ。

らは限定と考えら九るべきではない。

〔実施例１〕 培養基？以下の一般法により調製した。

１ｔの脱イオン水に、ペプトン１０Ｆ、酵母エキス１０
　ｒ、Ｉ）、　Ｌ−７ｃ＝７ｔｚ７う＝７０．５９゜塩
化ナトリウム５２．おＬびＬ−インロイシン５１を添加
する。硫酸および１２０℃で１０５ｆ−間。

１５　ｐｓｌにおいてオートクレーブな用いてｐＨＹ６
．０に調整する。こ扛が培養管および損とうフラスコ用
の標ｍｓ発用媒体である。

〔実施例２〕 Ｌう化カリウム（ＫＩ）１００ｍＭ％：媒体に添加しπ
以外は実施例１の一般法に従った。こｎに高誘発選択用
卿体である。

〔実施例３〕 媒体に対しＫＩ２００ｍＭを添加した以外は実施例１の
一般法に従った。これも’Ｆた。胃誘発選択用媒体であ
る。

〔実施例４〕 酵母エキス１５ｆ＆用い、そしてペプトンを排除した他
は実施例１の一般法に従った。更にＫＩ２００ｍＭも添
加した。こ扛は高誘発振とう７ラスコ生成用媒体である
。

〔実施例５〕 塩化ナトリウムお工びＬ−イソロイシンな排除した以外
は実施例４の一般法にニジ醗酵媒体を調製した。こｆｌ
、は高誘発醗酵生成用媒体である。

〔実施例６〕 実施例１．２および３のようにして３種類の培養基をに
Ｍ製した。栄養系寒天斜面上に保持さｆ′したロードト
ルラルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｒｕｂｒａ）（
ＡＴＣＣ＋４０５６）の菌種？生成するＰＡＬを用いて
名試験管培養物４．５ｃｃＫ接種を行った。

仄に、こ扛らの試験管ケ３０’Ｃかつ２５０ＲＰＭで振
とう機上に配置した。各試験管の７種類の移植体（０，
２ｃｃ）％ｒ２４乃至４８時間で新しい培養地４．５　
ｍｌに変」しに０培養試験管を用いて媒体２００　ｃｃ
％’振とうフラスコ１０００−中に接種した。１個のフ
ラスコ１（ついて各媒体を３０時間および５４時間で採
取した。細胞収率は３０時間で平均１４２ペースト／ｌ
、そして５４時間で平均２９ｔペースト／ｌであつ７ｔ
ｏＫ１１００ｍＭのＰＡＬ活性は対照、Ｃシも３１％高
かった。ＫＩ２００ｍＭのＰＡＬ活性は対間より３９％
高かった。

〔実施例７〕 ＫＩ２００ｍＭ培養物の２５ＰＪ類の選択移植体ケ調製
した他はＫＩ高訪発媒体２０ＯｒｎＭ中の生長Ｒ，ルブ
ラ用の実施例６による一般法に従った。

更に伽とうフラスコの接種２４時間後、媒体２．５％を
用いて１５種類の新しい（最約フラスコ）振とうフラス
コを接神し、そして培養時間２４時間後にこれらのフラ
スコ力１ら採取した。細胞収率お工びＰＡＬ活性は２，
３種類のフラスコおよび最終的にプールした細胞ペース
ト生成物について得た。

２８．７？ｍ　ペースト／を媒体における最大ＰＡＬ活
性ｔｌ　１　Ｂ、　４　Ｔ３／　９ｍペースト（５２８
Ｕ　ＰＡＬ／Ａ）であった。（１単位＝３０℃において
ｔ−桂皮酸およびアンモニア／ｆｊ−に変換されたＬ−
フェニルアラニン１モルノこの活性はカルグハッギおよ
びスバ・ラオによるｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、１４９　
Ｊ　６５〜７２゜１９７５年によって教示さｎる方法の
変形に基づいて測ださ−ｎた。この最終的にプールした
細胞生成物に２７９ｍペースト／を平均細胞収率（４０
５Ｕ　ＰＡＬ／ｌ）Ｋ、おいて１５．０単位ＰＡＬ／ｆ
ｍ　　ペーストな■していた。

〔実施例８〕 桂皮酸アンモニウム基質溶液を以下の一般法に従って調
製し六〇桂皮酸を溶解する１で、水酸化アンモニウム（
２８％）に添加した。次に水および酸を添加して、基質
容量おＬびｐＨ′４ｅ夫々調製した。桂皮酸濃度、アン
モニア濃度お工びｐＨ（酸の添加＋１りは以１下の具体
例においては変化するものとし、その結果生成するアン
モニウム塩の情もまた変化するものである。

〔実施例９〕 ＰＡＬＫ対するハロゲンの高濃度の効果ｆｆｐＨ降下基
質溶液に対し各秤の酸を用いて調べた。実施例８の一般
法ＶｒＬる２１φ類の基質を調製した（ＣＡ　６０　ｍ
Ｍ　、Ｎｌ２７．５Ｍ、ｐＨ１０）。溶液Ａは塩化水素
酸？用いてｐＨ調整し、−万溶液り、Ｂは硫酸を用いて
循整し穴。実施例４におけるように。

成長Ｒ，ルグラを３０℃で攪拌を伴うウォータージャケ
ットな備えたビーカー中に配置した。時間ケ記録した試
料を採取し、薄層クロマトグラフ法お工びＬ−アミノ酸
オキシダーゼ酵素装置の双方を利用してＬ−フェニルア
ラニンについて足置な行った。（塩化アンモニウムを含
有する）基質溶ｗＡａｐＡＬ酵素欠阻害することが判明
し穴。基質溶液Ｂ細胞は（反応時間の２４時間後］基質
溶液Ａ細胞に対し１０倍量のＬ−フェニルアラニンを生
成した。

〔実施例１０〕 実施例９の一般法を、硫酸にリン酸を対比させて行った
。リン酸によるｐＨ調整基質中のＲ，ルブラ細胞は硫酸
調整基質にニジ得られたＬ−フェニルアラニンの９０％
を生成し穴。

〔実施例１１〕 硫酸に酢ａｒｔ対比させて実施例９の一般法を行った。

反応体中で生成されたＬ−フェニルアラニンの量は同じ
であった。

〔実施例１２〕 実施例６の一般＠による細胞な１製した。こｎらの細胞
な全細胞の再使用可能性（安定性］を検討するため釦用
いた。を−桂皮酸６０ｍＭ、アンモ＝７７．５Ｍ、硫酸
Ｋｘ＃）夫々ｐＨを１０１．０．９．０お工び８．０に
低下させ７？：３１１類の基質を調製した。

細胞（細胞ペースト４．５？ｍ）を各基質（４５ｅｅ）
中に３０℃で１６時間、配置した。Ｌ−フェニルアラニ
ン濃度はＬ−アミノ酸オキシダーゼ装置お工び薄層クロ
マトグラフ法に工り測定し穴。細胞な遠心分離し、洗浄
し、そして新鮮な基質中に１６時間配置した。結果は以
下の図表中に示す。

実験Ｉ　　　　　　　　実験ｎ　　　　　　　活性保持
ｐ■１　ｍＷ／ｎｒｌ　　Ｌ−ＰＨＥ　　　ｍＷ／ｄ　
　Ｌ−ＰＩＥ　　％８　　０．２２　　　　　　　　　
０．１２　　　　　　　　５５９　　０．９’５　　　
　　　　　　０．７８　　　　　　　　８２１０　　２
．０２　　　　　　　　　０．４３　　　　　　　　２
１こｎらの結果は、ｐＨ１０のものがｐ　Ｈ９，０のも
のの当初活性の２倍であるが、実験１回後にｐＨ９，０
細胞はｐＨ１０，０細胞より１６３チ高い活性’ｆ：有
することな示している。

〔実施例１３〕 ２週間安定性の検討ケ実施例１２におけるように行った
。しかし０反応物のｐＨは８．７５　、９．００お工び
９．２５であり、１７ｔアンモニア濃度は５．５Ｍであ
った。１４日間の試験を遊ｍＲ，ルック細胞について６
回連続のバッチ足置にぶって行った。

七ｎらの結果な以下の表中に示す。

生成Ｌ−フェニルアラニンｍ？７時間／細胞乾燥■量ｆ
ｍ（保持された当初活性チ）１　　　　　　５．９　　
　　　　　５．７　　　　　　　５．７７　　　　　３
．６　　　　　　　３．８　　　　　　　４．２（６１
）　　　　　（６７）　　　　　（７４）１４　　　　
　　３．５　　　　　　　３．５　　　　　　　４．０
（５９）　　　　　（６１）　　　　（７０）こｎらの
結果は、適切な条件がＰＡＬの再使用な可能としてＬ−
フェニルアラニンを生成し、更に活性の保持レベルが遊
離細胞について高いことを示している。

〔実施例１４〕 実施例７から得た細胞ベーストを米国特許出願第４００
．１４１号ＫＬり教示さｎる一般法によって固定した。

基質（８０ｍＭ、　ＮＨ５４，８Ｍ、　ｐＥ　９．２３
　）な、固定Ｒ，／ｌ／プラ細胞の上昇流によって充填
したカラム中にポンプで送シ込んだ。流量は２２℃で０
．１０．０．２５および０．５０　Ｓ　Ｖｈ−１ならび
に２８℃で０．２５お工び０．５０　Ｓ　ｖｈ−におい
て変化させた。溶出液をＬ−フェルアラニンについて試
）験した。結芽は下掲の表中に示す。

温　度　流入量　生　成　生産性 （℃）　　（ＳＶｈ−１）　Ｌ−ＰＨＥ（ｒ／１／ｈｒ
）−１ ０、ＩＳＶ　　　ｒおける基質の４０％転化率が２２℃
でＬ−フェニルアラニン５．４９ｍ／ｌ　ｋ生成するこ
とが観察さｎた。

〔実施例１５〕 実施例１４の培養お工び固定条件に従つに０ＰＡＬｖ含
！する固５１ｊＲ，ルブラＩ■胞のカラムについて実験
２行い、成る条件下のカラムの生産性半減期ケ側足しに
０基質ｎ　ＣＡ　７５　ｍ　Ｍ　、ＮＨ−、４，５Ｍ、
ｐ）１９．２５であり、実験は２３℃、Ｒ景０．２５）
１−１ Ｓｖ　　で連続的に行っに０生産性半減期は４１日間（
第１回診１１ｆｔ）であることが示さｎ＊。この試験は
、固定ＰＡＬが連続的ＫＬ−フェニルアラニンを調製す
るために長期間にわたり使用可能であることを示してい
る。

〔実施例１６Ａ〕 実施例５におけるように醗酵媒体乞調製し、′！！ｆｃ
１０ｔの醗酵槽内の成長Ｒ，ルグラな用いた。

醗酵槽の錘子は実施例３に従って調製した。細胞の試料
は醗酵楕刀為ら周期的に採取した。こｎらの細胞につい
てＰＡＬ活性を足置して最適採取時間？決定した。最大
活性が現わｆＬｆｃ後６時間以内に最大活性の５０％未
満が保持されることが見出された。更に最大活性に先立
って、全てのり、Ｌ−フェニルアラニンが媒体から使い
果たさｆ″Ｌ穴ことが判明した。

〔実施例１６Ｂ〕 実施例１６Ａ％’反覆したが、最大活性が現わｎた直後
に、Ｄ、Ｌ−フェニルアラニンを醗酵槽内ｆ供給し７？
：　（５９ｍ／　１０　ｔ）　ｏ最初の１時間テハ。

実施例１６Ａｒおける工うｒＰＡＩ、活性の低下が見ら
−ｎ７ｔ。しかし、このＰＡＬ活性は採取に先立つ次の
３時間では安？であった（第２図参胛）。

〔実施例１７〕 実施例１４０手順に従って細胞ヲ誌製し、かつ固定した
が、用いた基質はＣＡ　７５　ｍ　Ｍ　、　ＮＨ５４，
５Ｍ、２３℃３℃チル］　９．４３　、　ソＬテｆｉｆ
ｉｉｊＳＶｈ−”＝０．５０であつに０このカラムσＬ
−フェニルアラニン１．９９ｍ７床容量支持体ｔ／時間
を生成することが判明した。流出液中のＬ−フェニルア
ラニンの濃度は３．８９ｍ７／Ｌであつ−ｆｅ。

〔実施例１８〕 細胞は実施例１４の一般法によって調製かつ固定さｎた
。固定した細胞なカラム内に充填し、そして基質（ＣＡ
　７５　ｍＭ、ＮＨ５４，５Ｍ、　ｐ　Ｈ９，４）−１ ３５２ｃｃ％ｒカラムを経由して１．Ｏ８Ｖ　　　で再
循環させπ。基質プールの試料は時間を置いた間隔で採
取し、セしてＬ−フェニルアラニン濃度ハＬ−アミノ酸
オキシダーゼ酵素装置お工び薄層り　□ロフトグラフ法
によって測足した。こ扛らの結果は以下の表中に示す。

再循環時間　　Ｌ−フェニルアラニン　転化率（ｈｒ−
）　　　　　　Ｃｆ１ｍ／Ｌ）　　　　　　％７　　　
　　　　　　２．８　　　　　　２３２１．５　　　　
　　　　４．６　　　　　　３７２４　　　　　　　　
　５．０　　　　　　４９４４．５　　　　　　　　６
．８　　　　　　５５本実施例は１反応条件下でＰＡＬ
を含有する固定した細胞を用いてＬ−フェニルアラニン
を高濃度かつ高転化率？もって調製し得ることを示して
いる。

【図面の簡単な説明】

第１図は２３℃、ｐＨ９，２５における。ＰＡＬｖ含有
するＲ、ルブラ細胞を固定したカラムについての生産性
半減期を示すグラフ、第２図はり。 Ｌ−フェニルアラニンの供給を伴う場合と伴わない場合
のＲ，ルブラ醗酵忙おけるＰＡＬ活性保持％を示すグラ
フである。 （２５Ｊ Ｌ １　Φ 」９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１（ａ）　）ランス−桂皮酸をアンモニアイオン源
   と反応させて基質溶液を生成させる工程。 （ｂ）前記基質溶液のｐＨを調節する工程、および（ｃ
   ）　Ｌ−フェニルアラニン生成条件下で前記基質溶液を
   フェニルアラニンアンモニアリアーゼと接触させてＬ−
   フェニルアラニンを生成させる工程 を含むＬ−フェニルアラニンの製造方法において。 （１）実質的にハロゲンな含１ないアンモニウム塩なア
   ンモニウムイオン飾として使用し、そして（１１）実質
   的にハロゲンを含１ないｒＩ１１ｊｔ添加することＫよ
   シ基質溶液のｐＨを調整する工程な含むことを特徴とす
   る方法。 （２：基質溶液のｐＢが約８乃至約ｌＯの範囲内にある
   ように調節される特許請求の範囲第１項記載の方法。 （３１基質溶液のｐＨが約８．５乃至約９．５の範囲内
   にあるように調節される特許請求の範囲第１．’Ｆたは
   第２項記載の方法。 ＋４１アンモニウムイオン鯨が、硫酸アンモニウム。 リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、くえん酸アン
   モニウム、および酢酸アンモニウムη為ら成る群から選
   択さｎ、ｂ特許請求の範囲第１項記載の方法。□ ＋５＋　７７モニウムイオン諒がｉ　酸アンモニウムで
   ある特許請求の範囲第１項記載の７ｊ法。 （６）基質溶液のｐＢが、硫酸、リン酸および酢酸から
   成る群から選択さｎる酸に工って脆節さｒＩ、る特許請
   求の範囲第１．第２１πは第３項記載の方法。 （７）基質溶液のｐＨが硫ｔＩＲに工って幽節さｎる特
   許請求の範囲第１．第２１７？：は第３項記載の方法。 （８）アンモニウムイオンの濃度が約０．１Ｍ乃至約７
   ．５Ｍの範囲内にある特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 （９）アンモニウムイオン濃度が約ＩＭ乃至約５Ｍの範
   囲内にある特許請求の範囲第８項記載の方法。 Ｏ１溶液中のｔ−桂皮酸の濃度が約３０ｍＭ乃至約２０
   ０ｍＭの範囲に及んでいる特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ０υ溶液中のｔ−桂皮酸の濃度が約６０ｍＭ乃至約１５
   ０ｍＭの範囲に及んでいる特許請求の範囲第１０項記載
   の方法。 （Ｉクフェニルアラニンアンモニアリアーゼが再使用可
   能である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ｔ１１ハツチ式反応装置においてフェニルアラニンアン
   モニアリアーゼ含有非固足細胞ケ基質溶液に添加するこ
   とによってＬ−フェニルアラニンが調製さｎる特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ａ４バッチ方式が単一のパッチ力式である特許請求の範
   囲第１４項記載の方法。 ＋１５１バッチ方式が連続供給バッチ方式である特許請
   求の範囲第１４項記載の方法。 αＧフェニルアラニンアンモニアリアーゼカ再使用可能
   な担体上−Ｆだに相体内に固定される特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 （ＩＴ）　フェニルアラニンアンモニアリアーゼがカラ
   ム中に固定される特許請求の範囲第１項１７２：は第１
   ６項記載の方法。 ０１基質溶液がカラムを峰由してポンプで送り込’Ｆ　
   ｎ、る際ｆ該カラムが約１０乃至約４０Ｃの温度に維持
   さ扛る特許請求の範囲第１７項記載の方法。 ■基質溶液がカラム？経由してポンプで送り込に維持さ
   扛る特許請求の範囲第１８項記載の方法。