DK159329B - Fremgangsmaade til kontinuerlig enzymatisk omdannelse af alfa-hydroxycarboxylsyrer til de tilsvarende optisk aktive alfa-aminocarboxylsyrer - Google Patents

Description

DK 159329 B

Opfindelsen angår en særlig fremgangsmåde til kontinuerlig enzymatisk omdannelse af a-hydroxycarbox-ylsyrer til de tilsvarende optisk aktive cc-aminocarbox-ylsyrer i en enzymreaktor, under tilstedeværelse af 5 nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD+/NADH), der har fået forøget molekylvægten ved binding til et højmolekylært, vandopløseligt stof samt en dehydrogenase, der er specifik for den anvendte α-hydroxycarboxylsyre, en dehydrogenase, der er specifik for den a-aminocarboxyl-10 syre, der skal dannes, og af ammoniumioner.

Der kendes allerede fremgangsmåder til kontinuerlig fremstilling af alanin ud fra pyruvat i en enzymreaktor under tilstedeværelse af nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD+/NADH), som har fået forøget molekylvæg-15 ten ved binding til en vandopløselig dextran, af lac-tatdehydrogenase, af alanin-dehydrogenase og af ammoniumioner (K. Mosbach og P.-O. Larsson i Enzyme Engineering B III, side 291 til 298). Egne forsøg har dog vist, at disse kendte fremgangsmåder ikke kan gennemfø-20 res kontinuierligt over et længere tidsrum, idet omsætningen til analin allerede efter relativ kort tid reduceres stærkt, for til sidst at gå fuldstændig i stå, hvorefter der overhovedet ikke bliver dannet mere alanin.

25 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendomme lig ved, at man kontinuerligt tilfører en vandig opløsning af den α-hydroxycarboxylsyre, der skal omsættes, i en koncentration svarende til 25 til 100% af den maksimalt opløselige mængde, den til a-hydroxycarboxylsyren 30 svarende a-ketocarboxylsyre i en koncentration på mellem 1 og 10 km, med hensyn til den anvendte aminocar-boxylsyre-dehydrogenase, og en mængde ammoniumioner, der mindst er ækvimolær med den anvendte mængde a-hy-droxycarboxylsyre, til en med en ultrafiltreringsmem-35 bran med en nominel afskæringsgrænse på 2.000 til 50.000 udrustet membranreaktor, der indeholder en van-

DK 159329 B

2 dig opløsning af 0,1 til 10 mmol/1 NAD+/NADH, bundet til en polyethylenglycol med en gennemsnitlig molekylvægt på mellem 500 og 50.000, den dehydrogenase, der er specifik for den anvendte α-hydroxycarboxylsyre, og den 5 dehydrogenase, der er specifik for den a-aminocarbox-ylsyre, der skal dannes, idet der over membranen opretholdes et differenstryk på mellem 0,1 og 15 bar, og man bag membranen kontinuerligt bortleder en filtratstrøm indeholdende den dannede a-aminocarboxylsyre.

10 Først fremgangsmåden ifølge opfindelsen tillader kontinuerlig omdannelse af α-hydroxycarboxylsyren til den tilsvarende optiske aktive a-aminocarboxylsyre over et længere tidsrum. Den hertil væsentlige foranstaltning består i, at membranreaktoren kontinuerligt ikke 15 kun tilføres α-hydroxycarboxylsyre, der skal omsættes, men også en i sammenligning med denne væsentlig ringere mængde af den tilsvarende a-ketocarboxylsyre. Ved hjælp af denne foranstaltning er det muligt at omdanne den anvendte α-hydroxycarboxylsyre kontinuerligt til den 20 tilsvarende optisk aktive α-aminocarboxylsyre med et højt volumen-tid-udbytte og således fremstille denne a-aminocarboxylsyre billigt.

En membranreaktor udstyret med en ultrafiltreringsmembran anvendes som reaktionsbeholder. Membranen 25 tjener til at holde det anvendte enzym og det til omsætningen nødvendige coenzym tilbage i reaktoren, medens det lavmolekylære produkt og ikke omsat substrat lades trænge gennem membranen. Membranreaktoren kan være udformet som en såkaldt flademembranreaktor. Ved 30 denne reaktortype kan det f.eks. dreje sig om en flad, cylindrisk beholder, som er forsynet med et dæksel, der er pakket ved hjælp af en O-ring. Den relativt udstrakte flade membran er spændt fast med O-ringen. Substratstrømmen tilføres ved hjælp af en doseringspumpe til 35 den del af reaktionsbeholderen, der ligger under membranen, og som hensigtsmæssigt kan være forsynet med en

DK 159329B

3 omrøreranordning, f.eks. en magnetomrører. Filtratstrømmen, der indeholder produktet, forlader reaktionsbeholderen g gennem membranen og gennem en plade, som er placeret over membranen for at undgå at stille meka-5 niske krav til denne, og som er forsynet med 'borehuller, hvorefter den føres ud gennem dækslet. En såkaldt hulfiber-membranreaktor, hvori et bundt hulfibre af ultrafiltreringsmembraner, et såkaldt hulfibermodul, træder i stedet for flademembranen, er mere fordelagtig, 10 når der på grund af den geometriske indretning kan opnås højere Reynold1s-tal for strømningen parallelt med membranen og dermed ringere belægninger af enzymproteiner på membranen. Ved denne reaktortype drejer det sig f. eks. om en tilbage-føringsreaktor (Schlaufenreak-15 tor), der består af en reaktionsbeholder, en cirkulationspumpe og af hulfibermo-dulet. Substratstrømmen føres ved hjælp af en doseringspumpe til reaktionsbeholderen. I denne pumpes reaktionsblandingen rundt, således at den cirkulerende strøm i forhold til sub-20 stratstrømmen udgør mindst ca. 100:1, for at få så ringe belægning af enzymproteiner på hulfibermembranen som muligt. Filtratstrømmen indeholdende produktet trænger gennem hulfibermembranen, samles herefter sammen og føres bort. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anven-25 des membraner, som har nominelle afskæringsgrænser på 2.000 til 50.000. Egnede materialer til membraner er f.eks. acetylcellulose, polyamid, polysulfon eller modificerede polyvinylalkoholer.

Membranreaktoren indeholder en vandig opløsning 30 af 0,1 til 10 mmol/1 NAD+/NADH, der foreligger bundet til en polyethylenglycol med en gennemsnitlig molekylvægt på mellem 500 og 50.000, fortrinsvis mellem 1.500 og 20.000, en dehydrogenase, der er specifik for den anvendte α-hydroxycarboxylsyre og en dehydrogenase, der 35 er specifik for den α-aminocarboxylsyre, der skal dannes .

DK 159329 B

4

Det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen som co-enzym krævede NAD+//NADH, med forøget molekylvægt ved binding til en polyethylenglycol, skal ganske vist endnu være vandopløselig for at muliggøre en homogen kata-5 lyse, men på den anden side skal det sammen med det anvendte enzym med sikkerhed holdes tilbage af membranen. Fremstillingen af NAD+/NADH med forøget molekylvægt er udførligt beskrevet f.eks. i DE-PS 28 41 414.

Til dette formål omsættes eksempelvis coenzymet 10 i oxyderet form først med ethylenimin til N(l)-amino-ethylderivatet, som så igen ved carbodiimidmetoden [jvf. Cuatrecanas, J. Biol. Chem., 245, 3059 (1970)] kobles til en carboxyleret polyethylenglycol, hvis polyoxyethylenkæde har en gennemsnitlig molekylvægt på 15 mellem 500 og 50.000, fortrinsvis mellem 1.500 og 20.000. Det fremstillede koblingsprodukt reduceres derefter til det tilsvarende NADH-derivat, omdannes til N(6)-derivatet ved en Dimroth-omlejring og oxideres eventuelt igen til det tilsvarende NAD+-derivat. Coen-20 zymet med forøget molekylvægt anvendes i en sådan mængde, at koncentrationen af NAD+/NADH udgør 0,1 til 10 mmol/1, fortrinsvis l til 7 mmol/1.

En vandig opløsning af den a-hydroxycarboxyl-syre, der skal omsættes, føres kontinuerligt til mem-25 branreaktoren i en koncentration svarende til 25 til 100% af den maksimalt opløselige mængde. Principielt er det naturligvis muligt at anvende en ren enantiomer af α-hydroxycarboxylsyren, altså enten L- eller D-for-men, og at lade den specifikke dehydrogenase for den 30 anvendte enantiomer være tilstede i membranreaktoren.

Det er dog mere fordelagtigt at anvende a-hy-droxycarboxylsyren som racemat. Herved består tre muligheder for hvilken dehydrogenase, der skal anvendes.

Man kan anvende en dehydrogenase, der kun er specifik 35 for den ene enantiomer. I dette tilfælde forbliver den anden enantiomer hver gang uforandret og forlader mem-

DK 159329 B

5 branreaktoren med filtratstrømmen, fra hvilken den kan genvindes. Man kan anvende en blanding af en for L-enantiomeren og af en for D-enantiomeren specifik dehydrogenase. I dette tilfælde omdannes således begge en-5 antiomere til sidst til den ønskede a-aminocarboxylsy-re. Man opnår det samme, når man kun anvender en for L-enantiomeren eller for D-enantiomeren specifik dehydrogenase, og der i membranreaktoren yderligere er en for den anvendte α-hydroxycarboxylsyre specifik racema-10 se til stede.

Membranreaktoren tilføres endvidere a-ketocarb-oxylsyren svarende til den α-hydroxycarboxylsyre, der skal omsættes, i en sådan mængde, at dens koncentration i reaktoren ligger mellem 1 og 10 km, med hensyn til 15 den anvendte aminocarboxylsyre-dehydrogenase. km betyder her den reciprokke værdi af adsorptionsligevægtskonstanten for a-ketocarboxylsyren med hensyn til den anvendte dehydrogenase, der er specifik for den a-ami-nocarboxylsyre, der skal dannes.

20 a-Ketocarboxylsyren kan enten tilsættes til den vandige opløsning af α-hydroxycarboxylsyren, der skal omsættes, eller doseres i form af en separat, vandig opløsning, hvilket under visse omstændigheder kan være fordelagtigt, idet doseringen således lader sig regule-25 re uafhængigt.

Membranreaktoren tilføres endvidere kontinuerligt ammoniumioner i en mængde, der mindst er ækvimolær med den mængde α-hydroxycarboxylsyre, der skal omsæt tes. Ammoniumioner i et overskud på indtil tre gange 30 den molære mængde forstyrrer imidlertid ikke omsætningen. Tilførslen af ammoniumioner udføres hensigtsmæssigt ved, at et egnet ammoniumsalt, f.eks. ammoniumfor-miat, i den ønskede mængde, sættes til den vandige opløsning af den α-hydroxycarboxylsyre, der skal omsæt-35 tes.

Den for den α-hydroxycarboxylsyre, der skal om-

DK 159329 B

6 sættes, specifikke dehydrogenase anvendes hensigtsmæssigt i en sådan mængde, at der ved ligevægtstilstand opnås mindst 50% af den opnåelige ligevægtsomsætning med hensyn til den som mellemprodukt forekommende, til-5 svarende α-ketocarboxylsyre. Den nødvendige enzymkoncentration afhænger af opholdstiden og af udgangskoncentrationen af a-hydroxy-carboxylsyre. Ved en opholdstid på 1 time og en substratkoncentration på 100 mmol/1 er en α-hydroxycarboxylsyre-dehydrogenaseaktivitet på 10 10 U/ml i almindelighed tilstrækkelig.

En eventuelt yderligere tilsat racemase, der er specifik for den α-hydroxycarboxylsyre, der skal omsættes, anvendes hensigtsmæssigt i en sådan mængde, at ra-cemiseringsreaktionen forløber med en tilstrækkelig ha-15 stighed til ikke at blive det hastighedsbestemmende trin i den samlede reaktion. I almindelighed er en racemaseaktivitet på 10 U/ml tilstrækkelig til dette, når man igen går ud fra en opholdstid på l time og en substratkoncentration på 100 mmol/1.

20 Den dehydrogenase, der er specifik for den a- aminocarboxylsyre, der skal dannes, anvendes hensigtsmæssigt i en sådan mængde, at det ved ligevægt indstillede forhold mellem NAD+ og NADH mindst udgør 5:1. Hertil anvendes indtil 100 U/ml af aminocarboxylsyre-dehy-25 drogenasen for ved en opholdstid på en time og en substrat-koncentration på 100 mmol/1 at opnå en omsætning på 90% af den ligevægtsomsætning, der med det koblede reak-tions-system er thermodynamisk mulig.

Under omsætningen skal der over membranen opret-30 holdes et differenstryk på mellem 0,1 og 15 bar, fortrinsvis på mellem 0,2 og 3 bar, hvilket opnås ved anvendelse af en passende dimensioneret doseringspumpe for den tilførte substratopløsning og eventuelt ved hjælp af en drøvleventil i filtratstrømmen efter mem-35 branen. Differenstrykket bevirker, at filtratstrømmen trænger gennem membranen med den ønskede hastighed. Det

DK 159329 B

7 absolutte tryk på membranens trykside skal hensigtsmæssigt indstilles således, at trykket, selv ved kraftig omrøring eller ved cirkulation i reaktorrummet foran membranen til opnåelse af kraftig turbulens langs mem-5 branen for at undgå en belægning af enzymer eller coen-zymer med forøget molekylvægt på membranen, på intet sted sænkes så meget, at der fjernes luft fra reaktionsblandingen på tryksiden.

Membranreaktoren holdes på en for enzymatiske 10 omsætninger sædvanlig temperatur mellem 25 og 50°C. Reaktionsblandingens pH-værdi holdes under omsætningen hensigtsmæssigt i området mellem 8 og 9,5.

Kun L-a-aminocarboxylsyrer kan i praksis for øjeblikket fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfin-15 delsen, idet D-aminosyre-dehydrogenaser endnu ikke står til rådighed. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er imidlertid iøvrigt anvendelig på mange måder. Eksempelvis kan mælkesyre omdannes til L-alanin med enzymsystemerne L-eller D- eller L- og D-lactat-dehydrogenase + 20 L-alanin-dehydrogenase eller L-eller D-lactat-dehydro genase + lactat-racemase (E.C.5.1.2.1. ). + L-alanindehy-drogenase. 2-Hydroxy-4-methylmercaptosmørsyre kan omdannes til L-methionin, 2-hydroxy-3-methylsmørsyre til L-valin, 2-hydroxy-4-methylpentansyre til L-leucin el-25 ler 2-hydroxy-3-methylpentansyre til L-isoleucin ved hjælp af enzymsystemet L- eller D- eller L- og D-2-hy-droxy-4-methylpentansyre-dehydrogenase + L-leucin-dehydrogenase. Phenylmælkesyre kan omdannes til L-phe-nylalanin med enzymsystemet L- eller D- eller L- og D-30 lactat-dehydro-genase + L-phenylalanin-dehydrogenase.

Indolylmælkesyre kan omdannes til L-tryptophan ved enzymsystemet L- eller D- eller L- og D-indolyllactat-dehydrogenase + L-phenyl-alanin-dehydrogenase.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærme-35 re ved hjælp af de følgende eksempler.

DK 159329 B

8

Eksempel 1

En flademembranreaktor, der havde en temperatur på 25°C og et volumen på 11,3 ml, og som var udrustet 5 med en magnetomrører og en ultrafiltreringsmembran med en diameter på 62 mm og en nominel afskæringsgrænse på 5.000 (Leveret fra firmaet: Amicon, Witten; Typ YM5), blev, for at opnå sterilisering, gennemskyllet i ca. 5 timer med vandig 70%'s ethanolopløsning med en tilfø-10 ringshastighed, der ved hjælp af en doseringspumpe var indstillet på 11,3 ml pr. time. Dernæst blev den vandige alkoholopløsning i løbet af endnu ca. 5 timer fortrængt af destilleret vand. Derefter blev der med en hastighed på ca. 9,3 ml pr. time i ca. 5 timer tilført 15 en substratopløsning, som var filtreret gennem et sterilt filter (0,2 ym), indeholdt 243 mmol/1 DL-mælkesyre i form af dettes natriumsalt og 486 mmol/1 ammoniumfor-miat, og som var indstillet til en pH-værdi på 9 med natriumhydroxidopløsning. Samtidig blev en pyrovatop-20 løsning, der indeholdt 11,3 mmol/1 af pyrodruesyrens natriumsalt, og som var indstillet til pH 9 med natriumhydroxidopløsning, ved hjælp af en anden doseringspumpe tilført over det samme sterilfilter med en hastighed på 2 ml pr. time i ca. 5 timer. Derved opnåe-25 des, så længe reaktionen i reaktoren endnu ikke var startet, en udgangskoncentration i reaktoren på 200 mmol/1 DL-lactat, 400 mmol/1 ammoniumformiat og 2 mmol/1 pytovat. Derefter blev en enzym-/coenzymblan-ding sprøjtet ind i substratopløsningen via en septum 30 før sterilfilteret, således at der i reaktoren blev opnået en koncentration på 1,32 mmol/1 NAD+/NADH, bundet til en polyethylenglycol med en middelmolekylvægt på 20.000, samt en L-lactat-dehydrogenaseaktivitet på 60,5 U/ml (målt med 0,2 mol/1 DL-lactat, 2 mmol/1 NAD+, 35 25°C, pH 9), samt en L-alanin-dehydrogenaseaktivitet på 178,6 U/ml (målt med 2 mmol/1 pyrovat, 2mmol/l NADH,

DK 159329 B

9 400 mmol/1 ammoniumformiat, 25°C, pH 9).

Reaktoren blev drevet i 6 dage ved 25°C og pH 9 med en opholdstid på 60 minutter. Under hele driftstiden udgjorde differenstrykket over membranen ca. 1,7 5 bar. Den maksimale begyndelsesomsætning udgjorde 80% og faldt i løbet af 6 dage til 60% (omsætning med hensyn til L-enantiomeren i substratet). Det maksimale volumen-tid-udbytte udgjorde 1,92 mol/(l x d) eller 171 g (1 x d). Indenfor en driftstid på 6 dage blev 10,1 g 10 eller 113 mmol L-alanin fremstillet. Koncentrationen af enzymatisk aktivt coenzym faldt i løbet af 6 dage fra 1,32 mmol/1 til 0,49 mmol/1.

Pr. mol coenzym (brugt) blev 12.000 mol produkt dannet. Dette svarer til et behov på 615 mg NAD+ (na-15 tiv)/kg produkt.

Eksempel 2

En flademembranreaktor, der havde en temperatur 20 på 25°C og et volumen på 10,0 ml, og som var udrustet med en magnetomrører og en ultrafiltreringsmembran med en diameter på 62 mm og en nominel affjedringsgrænse på 5.000 (leveret fra firmaet: Amicon, Witten; type YM5), blev for at opnå sterilisering gennemskyllet i ca. 2 25 timer med en 0,05%'s vandig pereddikesyreopløsning med en tilføringshastighed, der ved hjælp af en doseringspumpe var indstillet til 20 ml/time. Dernæst blev sterilisationsopløsningen i løbet af endnu ca. 10 timer fortrængt af destilleret vand. Derefter blev der i 4 30 timer gennem et sterilt filter (0,2 pm) med en tilføringshastighed på 10 ml/time tilført en substratopløsning, der indeholdt 400 mmol/1 DL-2-hydroxy-4-methyl-mercapto-smørsyre ("DL-hydroxymethionin"), 800 mmol/1 ammoniumformiat og 1 mmol/1 2-keto-4-methylmercapto-35 smørsyre, og som var indstillet til pH 8 med natriumhydroxid.

DK 159329 B

10 I en separat reaktor (bægerglas) lod man 25 ml af en enskoncentreret substratopløsning, der indeholdt enzymerne Lleucin-dehydrogenase og L-2-hydroxy-4-meth-yl-pentansyredehydrogenase samt coenzymet NADH bundet 5 til en polyethylenglycol-20.000 reagere i 24 timer.

Derved blev der anvendt sådanne enzym- og co-enzymkon-centratio-ner, at man i løbet af 24 timer mindst opnåede en omsæt-ning, som den der senere skal tilstræbes i det kontinuerlige forsøg.

10 Denne opløsning blev doseret til flademembranre- aktoren med en tilføringshastighed på 2,7 ml/time. Dernæst blev den ovenfor angivne substratopløsning igen tilført med den samme hastighed.

Da enzymerne og coenzymet ganske vist selv kan 15 passere sterilfilteret foran reaktoren, men ikke reaktorens ultrafilter, blev der i reaktoren opnået en koncentration på 1,42 mmol/1 coenzym, en L-2-hydroxy-4-me-thylpentansyre-dehydrogenaseaktivitet på 4,0 U/ml (målt med 0,4 mol/1 DL-2-hydroxy-4-methylmercaptosmørsyre, 20 0,1 mol/1 trispuffer, 1 mmol/1 NAD+, 25°C, pH 8) og en L-leucin-dehydrogenase-aktivitet på 86,3 U/ml (målt med 2 mmol/1 2-keto-4-methylmercaptosmørsyre, 1 mmol/1 NADH, 800 mmol/1 ammoniumformiat, 25°C, pH 8).

Reaktoren blev drevet kontinuerligt ved 25°C og 25 pH 8 under de nævnte betingelser i ca. 4,5 dage ved en opholdstid på 3,7 timer. Under driften udgjorde det maksimale differenstryk over membranen ca. 3 bar. I forsøgstidsrummet blev der opnået en maksimal omsætning på 38,4%, der i løbet af 2,6 dage nedsattes til 36,4% 30 (Omsætning beregnet på basis af L-enantiomeren i substratet). Det maksimale volumen-tid-udbytte udgjorde 0,5 mol/(l x d) eller 74,3 g/1 x d). Indenfor en driftstid på 4,34 dage blev 3 g eller 20 mmol L-methionin fremstillet. Koncentrationen af enzymatisk 35 aktivt coenzym faldt i løbet af 4,34 dage fra 1,42 mmol/1 til 1,25 mmol/1.

DK 159329 B

11

Pr. mol coenzym (brugt) blev 11.800 mol produkt dannet. Dette svarer til et behov på 378 mg NAD+ (na-tiv)/kg. produkt.

Claims (3)

1. Fremgangsmåde til kontinuerlig enzymatisk omdannelse af α-hydroxycarboxylsyrer til de tilsvarende optisk aktive a-aminocarboxylsyrer i en enzymreaktor 5 under tilstedeværelse af nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD+/NADH), der har fået forøget molekylvægten ved binding til et vandopløseligt, højmolekylært stof, en dehydrogenase for den anvendte a-hydroxycarboxylsyre, en dehydrogenase, der er specifik for den a-aminocarbo-10 xylsyre, der skal dannes, og af ammoniumioner, kendetegnet ved, at man kontinuerligt tilfører en vandig opløsning af den α-hydroxycarboxylsyre, der skal omsættes, i en koncentration svarende til 25 til 100% af den maksimalt opløselige mængde, den til a-hydroxy-15 carboxylsyren svarende a-ketocarboxylsyre i en koncentration på mellem 1 og 10 km med hensyn til den anvendte amino-carboxylsyre-dehydrogenase, og ammoniumioner i en mæng-de, der mindst er ækvimolær med den mængde a-hydroxycarboxylsyre, der skal omsættes, til en membran-20 reaktor, der er udrustet med en ultrafiltreringsmembran med en nominel afskæringsværdi på 2.000 til 50.000, og som indeholder en vandig opløsning af 0,1 til 10 mmol/1 NAD+/NADH, der foreligger bundet til en polyethylengly-col med en gennemsnitlig molekylvægt på mellem 500 og 25 50.000, den dehydrogenase, der er specifik for den an vendte α-hydro-xycarboxylsyre, og den dehydrogenase, der er specifik for den a-aminocarboxylsyre, der skal dannes, idet der opretholdes et differenstryk på mellem 0,1 og 15 bar over membranen, og man kontinuerligt bag 30 membranen bortleder en filtratstrøm, der indeholder den dannede a-aminocarboxylsyre.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man anvender den a-hydroxycarboxylsyre, der skal omsættes, som racemat, og ved at man 35 anvender en blanding af to dehydrogenaser, der er specifikke for henholdsvis L-enantiomeren og for D-enanti- 13 DK 159329 B omeren.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man anvender den a-hydroxycarb-oxylsyre, der skal omsættes, som racemat, og ved at man 5 kun anvender en for L-enantiomeren eller D-enantiomeren specifik dehydrogenase, men udfører omsætningen under samtidig tilstedeværelse af en for a-hydroxycarboxylsy-ren specifik racemase. 10 15 20 25 30 35