HU199560B - Process for transforming alpha-hydroxy-carboxylic acids to the corresponding l-alpha-amino-carboxylic acids with continuous enzimatic method - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás a-hidroxikarbonsavaknak a megfelelő L-a-aminokarbonsavakká történő folytonosüzemű, enzimatikus átalakítására, vizoldható nagymolekulás anyaghoz végzett kötéssel megnövelt molekulatömegű nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD⁺/NADH), a használt a-hidroxikarbonsavra specifikus dehidrogenáz, az előállítandó L-a-aminokarbonsavra specifikus dehidrogenáz és ammóniumionok jelenlétében, enzimreaktorban.

Ismeretes, már egy eljárás alanin folytonosüzemű előállítására piruvátból, enizmreaktorban, vízoldható dextránhoz végzett kötéssel megnövelt molekulatömegü nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD+/NADH), laktát — dehidrogenáz, alanin-dehidrogenáz, és ammónium-ionok jelenlétében (K- Mosbach-P. O. Larsson, Enzyme Engineering, Β III, 291 — 298. old.) Saját kísérleteink azonban azt mutatták, hogy ez az eljárás folytonos üzemben hosszabb időn át nem kivitelezhető, mert az átalakulás alaninná már aránylag rövid idő után erősen csökken, míg végül teljesen leáll, és egyáltalában nem képződik több alanin.

A találmány szerinti eljárás abban áll, hogy egy olyan 2.000—50.000 névleges kizárási határral rendelkező ultraszűrő membránnal ellátott membránreaktorba, amely 500—50.000 átlag molekulatömegű polietilénglikolhoz kötött alakban jelenlévő 0,1 — 10 mmól/lit. koncentrációjú oldatot NAD⁺/ /NADH, a használt a-hidroxikarbonsavra specifikus dehidrogenázt és az előállítandó L-a-aminokarbonsavra specifikus dehidrogenázt tartalmaz folyamatosan betápláljuk az átalakítandó α-hidroxikarbonsav olyan koncentrációjú vizes oldatát, amely a maximális oldható mennyiség 25—100 t%-át tartalmazza, továbbá az a-hidroxikarbonsavnak megfelelő α-ketokarbonsavnak a használt aminokarbonsav-dehidrogenázra számított 1 — 10 Km koncentrációjú oldatát, valamint az átalakítandó a-hidroxikarbonsav-mennyiséggel legfeljebb ekvimoláris mennyiségű ammóniumot, a membránon át 0,1—15 bar nyomáskülönbséget tartunk fenn, és a membrán mögött képződött, α-aminokarbonsavat tartalmazó szűrlet-áramot folytonosan elvezetjük.

Csak a találmány szerinti eljárás teszi lehetővé az α-hidroxikarbonsavak hosszabb időtartamon át, folytonos üzemben a megfelelő optikailag aktív a-aminokarbonsavakká történő átalakítását. Ezt az a lényeges intézkedés teszi lehetővé, hogy a membránreaktorba folytonos üzemben, nemcsak az átalakítandó α-hidroxikarbonsavat tápláljuk, hanem az α-hidroxikarbonsavnál lényegesen kisebb mennyiségű, megfelelő α-ketonkarbonsavat is. Ezzel az intézkedéssel lehetővé válik a betáplált α-hidroxikarbonsavak folytonosüzemű átalakítása a megfelelő optikailag aktív L-a-aminokarbonsavakká nagy tér-idő kitermeléssel, és így az L-a-aminokarbonsavak gazdaságos előállítása.

Reakcióedényként ultraszürő membránnal ellátott membránreaktort használunk, amelynek membránja arra szolgál, hogy visszatartsa a reaktorban a használt enzimeket és az átalakításhoz szükséges koenzimet, de áteressze a kis molekulasúlyú terméket és az át nem alakított szubsztrátumot. A membrán reaktor úgynevezett lapos membránreaktorként is kiképezhető. Ennél a reaktortípusnál például szóba jöhet egy lapos, hengeres edény is, amelyre O-gyűrűvel tömített fedelet helyezünk. Az O-gyűrűvel együtt fogjuk be az aránylag nagy felületű, lapom membránt is. A szubsztrátum-áramot a membrán alatt elhelyezkedő reakciótérbe egy adagolószivattyúval tápláljuk be. A reakciótér keverőberendezéssel, pl. mágneses keverővei van ellátva. A terméket tartalmazó szűrlet-áram a membránon és annak mechanikai igénybevételét gátló, a membrán felett elhelyezett, furatokkal ellátott lemezen keresztül hagyja el a reakcióteret, és azt a fedélből vezetjük el. Az úgynevezett üreges rost-membránreaktor, melyben a síkmembrán helyén ultraszűrőmembránokból álló üregesrost-köteg helyezkedik el, akkor előnyösebb, ha a geometriai elrendezésből adódóan a membránnal párhuzamosan nagyobb Reynold-féle számok adódnak és ezáltal a membrán kisebb enzimprotein terhelése érhető el. Ennél a reaktortípusnál például egy fajta hurok-reaktorról van szó, amely egy reakcióedényből, egy üreges-rost modulból áll. A szubsztrátum-áramot adagolószivattyúval tápláljuk a reafccióedénybe. Ebben a reakcióedényben a reakcióelegyet oly módon keringtetjük, hogy a visszavezetett és a szubsztrátum folyadékáram aránya 100:1 legyen, azért, hogy az üreges rost membránok enzimprotein-terhelését a lehető legalacsonyabban tartsuk. A terméket tartalmazó szűrlet-áramot átvezetjük az üreges rost-membránokon, és azok mögött összegyűjtjük és elvezetjük. A találmány szerinti eljárásnál 2.000—50.000 névleges kizárási határú membránokat használunk. Alakalmas membránanyagok például az acetilcellulózok, poliamidok, poliszulfonok vagy módosított polivinilalkoholok.

A membránreaktor 0,1 —10 mmól/1 koncentrációjú 500 és 50.000 közötti, előnyösen 1.500—20.000 átlagmolekulatömegű polietilén glikolhoz kötött alakban jelenlévő NAD⁺/ /NADH vizes oldatot, egy a felhasznált a-hidroxikarbonsavra specifikus dehidrogenázt, és egy, az előállítandó L-a-aminokarbonsavra specifikus dehidrogenázt tartalmaz.

A találmány szerinti eljáráshoz koenzimként szükséges, polietilénglikolhoz kötéssel növelt molekulasúlyú NAD⁺/NADH-nak homogén katalízis lehetővé tétele miatt egyfelől még vízoldhatónak kell lennie, másfelől azonban azt a használt enzimekkel együtt a membránnak biztosan vissza kell tartania.

A növelt molekulasúlyú NAD⁺/NADH előállítását például a 2 841 414 sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás írja le.

-2ι ι cj ia<7uuv u

Ebből a célból például a koenzimet előbb etiléniminnel oxidált alakjává, N(l)-aminoetilszármazékává alakítjuk át, amelyet azután a karbodiimiddel [lásd: Cuatrecanas, J. Bioi. Chem., 245. Köt., 3059. old. (1970)] egy olyan karboxilezett polietilénglikollá kapcsolunk, melynek polietilén lánca 500— 50.000, előnyösen 1.500—20.000 átlagmolekulatömegíí. Az' így nyert terméket azután a megfelelő NADH-származékká redukáljuk, Dimroth-féle átrendezéssel az N (6)-származékká alakítjuk át és adott esetben ismét a megfelelő NAD⁺ — származékká oxidáljuk. A növelt molekulatómegű koenzimet olyan mennyiségben használjuk fel, hogy az NAD⁺/NADH-koncentráció 0,1 — 10 mmól/1, előnyösen 1 — 7 mmól/1 legyen.

A membránreaktorba folyamatosan tápláljuk be az átalakítandó a-hidroxikarbonsav vizes oldatát a maximálisan oldódó mennyiség 25—100 t%-ának megfelelő koncentrációban. Természetesen lehetőség van arra, hogy az α-hidrokarbonsav valamely tiszta enantiomerjét, tehát vagy L vagy D formáját tápláljuk be és a membránreaktorba előzetesen a betáplált enantiomernek megfelelő, specifikus dehidrogenázt vigyük be.

Sokkal előnyösebb azonban, ha az a-hidroxikarbonsavat racemátként használjuk. Ebben az esetben az alkalmazandó dehidrogenáz tekintetében három lehetőség van. Használhatunk olyan dehidrogenázt, amely csak az egyik enantiomerre specifikus. Ebben az esetben a másik enantiomer változatlan marad és a membránreaktort a szűrletárammal együtt hagyja el, amiből visszanyerhető. Alkalmazhatunk L és D enantiomerre specifikus dehidrogenáz-elegyet is. Ebben az esetben végül is mindkét enantiomert a kívánt a-aminokarbonsavvá alakítjuk át. Ugyanezt érjük el azonban akkor is, ha csak az L- vagy csak a D- enantiomerre specifikus dehidrogenázt alakalmazunk, a membránreaktorban azonban ezen túlmenően még egy, a használt α-hidrokarbonsavra specifikus racemáz is jelen van.

A membránreaktorba ezen kívül folyamatosan tápláljuk be az átalakítandó a-hidroxikarbonsavnak megfelelő a-ketokarbonsavat is olyan mennyiségben, hogy annak koncentrációja a reaktorban a felhasznált aminokarbonsav-dehidrogenázra, számítva 1 — 10 Km között legyen. Km jelentése itt az a-ketokarbonsavnak a felhasznált, és képzendő L-a-aminokarbonsavra specifikus dehidrogenázra vonatkoztatott adszorpciós egyensúlyi állandóinak reciprok értéke.

Az α-ketokarbonsavat vagy az átalakítandó α-hidroxikarbonsav vizes oldatához adjuk hozzá vagy vizes oldat alakjában külön adagoljuk be. Ez utóbbi módszer adott esetben előnyösebb lehet, mert az adagolás ebben az esetben függetlenül szabályozható.

A membránreaktorba továbbá folyamatosan ammóniumionokat táplálunk, az átalakítandó, α-hidroxikarbonsavval minimálisan ekvimoláris mennyiségben. De a reakciót az sem zavarja, ha 3-szoros ammónium-ion-mólfelesleget használunk. Az ammóniumionok betáplálása célszerűen úgy történik, hogy az átalakítandó α-hidroxikarbonsav vizes oldatához kívánt mennyiségben valamely alkalmas ammóniumsót, például ammóniumformiátot adunk.

Az átalakítandó α-hidroxikarbonsávra specifikus dehidrogenázt célszerűen olyan mennyiségben alkalmazzuk, hogy az egyensúlyi állapotban a közbenső termékként fellépő, megfelelő α-ketokarbonsavra vonatkoztatott egyensúlyi átalakulásnak legalább 50%-at érjük el. A szükséges enzimkoncentráció a tartózkodási időtől és az α-hidroxikarbonsav kiindulási koncentrációjától függ. Egy órás tartózkodási időnél és 100 mmól/1 szubsztrátum-koncentrációnál általában elegendő egy 10 E/ml α-hidroxikarbonsav-dehidrogenáz aktivitás.

Az. esetleg használt, az átalakítandó a-hidroxikarbonsavra specifikus racemázt célszerűen olyan mennyiségben alkalmazzuk, hogy a racemizálási reakció kielégítő sebességgel menjen végbe és ne váljék a teljes reakció sebesség meghatározó tényezőjévé. Ehhez általában elegendő egy 10 E/ml-es racemáz-aktivitás abban az esetben, ha ismét egy órás tartózkodási időből és 100 mmól/1 szubsztrátum-koncentrációból indulunk ki.

Végül a képzendő L-a-aminokarbonsavra specifikus dehidrogenázt célszerűen olyan mennyiségben alkalmazzuk, hogy egyensúlyi állapotban az NAD⁺:NADH arány legalább 5:1 legyen. Ehhez 100 E/ml-ig terjedő aminokarbonsav-dehidrogenáz mennyiséget használunk, hogy egy órás tartózkodási idő és 100 mmól/1 szubsztrátum-koncentráció mellett legalább 90%-os egyensúlyi átalakulást állítsunk be, ami a kapcsolt reakciórendszerrel termodinamikailag lehetséges.

A reakció alatt a membránon át 0,1 — 15 bar, előnyösen 0,2—3 bar nyomáskülönbséget kell fenntartani, amit egy megfelelően méretezett szubsztrátum oldat betápláló adagoló szivattyú, és adott esetben egy, a szűrletáramba a membrán mögött beiktatott tartószelep felhasználásával érünk el. A nyomáskülönbség hatására a szürletáram a kívánt sebességgel lép át a membránon.

A membrán nyomóoldalán az abszolút nyomást célszerűen úgy kell megválasztani, hogy a membrán előtt erőteljes turburencia létrehozására a reakciótérben végzett erős keverés vagy cirkuláltatás következtében a membrán mentén egy helyen se csökkenjen le annyira a nyomás, hogy a reakcióelegy kigázosodása következzék be a nyomóoldalon. Az erőteljes keverésre vagy cirkuláltatásra azért van szükség, hogy elkerüljük a membrán terhelését az enzimekkel vagy a megnövelt molekulasúlyú koenzimmel.

A membránreaktort az enzimatikus reakcióknál szokásos 25—50°C hőmérsékleten 3

-3HU 199560 Β • 5 tartjuk. A reakcióelegy pH-ját a reakció alatt célszerűen 8 és 9,5 között tartjuk.

A találmány szerinti eljárással a gyakorlatban csak L-a-aminokarbonsavak állíthatók elő, mert D-aminosav-dehidrogenázok eddig 5 még nem állnak rendelkezésre. Egyébként azonban a találmány szerinti eljárás igen sokoldalúan használható. így például Lvagy D- vagy L- és D- laktát-dehidrogenáz+ +laktát-racemáz (E.C.5.1.2.1.)+L-alanin-de- ¹⁰ hidrogenáz enzimrendszerekkel a tejsav L-alaninná alakítható át. Az L- vagy D- vagy L- és D- 2-hidroxi-4-metilpentánsav-dehidrogenáz+L- leucin-dehidrogenáz enzimrendszerrel a 2-hidroxi-4.-metilmerkapto vajsav L- 15 -metioninná, a 2-hidroxi-3-meti!vajsav L-valinná. a 2-hidroxi-4-metilpentánsav L-leucinná vagy a 2-hidroxi-3-metilpentánsav L-izoleucinná alakítható át. Az L- vagy D- vagy L- és Dlaktát-dehidrogenáz+L-fenilalanin-dehidro- 20 genáz enzimrendszerrel a fenilvajsav L-fenilalaninná alakítható. Az L- vagy D- vagy L- és D- indolilaktát-dehidrogenáz+L-fenilalanin-dehidrogenáz enzimrendszerrel indoliltejsav L-triptofánná alakítható át. ²⁵

A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi példák világítják meg:

1. Példa

25°C-on tartott, 11,3 ml térfogatú síkmemb- 30 rán-reaktort, amely mágneses keverővei és egy 62 mm átmérőjű, 5.000 névleges kizárás-határú ultraszűrőmembránnal (gyártómű: Amicon, Witten: YM5 típusú) volt ellátva, sterilizálás céljából egy 11,3 ml/óra szállí- 35 tási sebességre beállított adagolószivattyú segítségével 5 órán át 70 t%-os vizes etanol oldattal öblítettük át. Ezután további 5 órán át a vizes alkohol oldatot desztillált vízzel szorítottuk ki. Ezután 9,3 ml/óra sebességgel 40 5 órán át egy steril szűrőn (0,2 pm) átszűrt szubsztrátum oldatot vezettünk a reaktorba, amely 243 mmól/1 DL-tejsavat (nátriumsó-alakjában) és 486 mmól/1 ammóniumformiátot tartalmazott, és amelynek pH-ját nátronlúggal 9-re állítottuk be. Egyidejűleg egy másik adagolószivattyúval ugyanezen a steril szűrőn keresztül, 2 ml/óra sebességgel 5 órán át egy piruvátoldatot táplálunk be, amely 11,3 mmól/1 borostyánkősavat tartalmazott 50 nátriumsó alakjában, és amelynek pH-ját nátronlúggal 9-re állítottuk be. Mindebből a reakció beindulása előtt a reaktorban 200 mmól/1 DL-laktát, 400 mmól/1 ammóniumformiát és 2 mmól/1 píruvát kezdeti koncent- 55 ráció adódott. Ezután a steril szűrő előtt elhelyezett szelepen át az adagolt szubsztrátum áramba egy enzim/koenzim elegyet fecskendeztünk oly módon, hogy a reaktorban 20.000 átlagmolekulasúlyú polietilénglikolhoz kötött „ NAD⁺/NADH-ra 1,32 mmól/1 koncentráció,

60,5 E/ml (0,2 mól/1 DL-laktáttal, 2 mmól/1 NAD⁺-al 26°C-on, pH=9-en mért) L-laktát-dehidrogenáz-aktivitás, valamint 178,6 E/ml (2 mmól/1 piruváttal, 2 mmól/1 NADH-val,

400 mmól/1 ammóniumformiáttal, 25°C-on ⁶⁵ pH=9-en mért) L-alanin-dehidrogenáz aktivitás adódott.

A reaktort 60 perces tartózkodási idővel, 25°C-on és pH=9-en 6 napon át folyamatosan üzemeltettük. A teljes üzemidő alatt a membránon keresztül a nyomásesés 1,7 bar volt. A maximális kezdeti kitermelés 80%-os volt, ami 6 nap alatt 60%-osra csökkent (a szubsztrátumban lévő L-enantiomerre vonatkoztatott kitermelés). A maximális tér-idő kitermelés 1,92 mól (lXd), ill. 171 g (1 Xd) volt. A 6 napos üzemidő alatt 10,1 g, ill. 113 mmól L-alanint ([a]£⁵ =+14,47°) nyertünk. Az enzimatikusan aktív koenzim-koncentráció 6 nap alatt 1,32 mmól/l-ről 0,49 mmól/l-re csökkent.

Egy mól (elhasznált) koenzimre 12.000 mól termék képződött. Ez 615 mg NAD⁺ (natív) szükségletnek felel meg 1 kg termékre.

2. Példa

25°C-on tartott, 10,0 ml térfogatú síkmembrán-reaktort, amely mágneses keverővei, és , egy 62 mm átmérőjű, 5.000 névleges kizárási határú ultraszürőmembránnal (gyártómű:

Amicon, Witten: YM5 típusú) volt ellátva sterilizálás céljából egy 20 ml/óra szállítási sebességre beállított adagolószivattyú segítségével kb. 2 órán át 0,05 tömeg%-os vizes perecetsav oldattal öblítettünk át. Ezután további 10 órán át a sterilizáló oldatot desztillált vízzel szorítottuk ki. Ezután 10 ml/óra ada- i golási sebességgel 4 órán át egy steril szűrőn j keresztül (0,2 pm) olyan szubsztrátum-oldatot vezettünk a reaktorba, amely 400 mmól/1 DL-2-hidroxi-4-metilmerkaptovajsavat („DL-hidroximetionin“), 800 mmól/1 ammóniumformiátot és 1 mmól/1 2-keto-4-metilmerkapto-vajsavat tartalmazott, és amelynek pH-ját nátronlúggal 8-ra állítottuk be.

Egy másik reaktorban (főzőpohárban) ml ugyanilyen koncentrációjú szubsztrátum oldatot, amely L-leucin-dehidorogenáz és L-2-hidroxi-4-metilpentánsav - dehidrogenáz enzimeket és koenzimként 20.000 átlagmoleku- 5 lasúlyú polietilénglikolhoz kötött NADH-t tartalmazott, 24 órán keresztül reagáltattunk. 1

Itt olyan enzim- és koenzim koncentrációkat * használtunk, hogy 24 óra alatt legalább olyan J kitermelést érjük el, mint amilyenre a későb- j biekben a folytonosüzemű kísérletben töreked- >

tünk.

Ezt az oldatot 2,7 ml/óra szállítási sebességgel ezután a síkmembrán-reaktorba adagoltuk. Ezt követően ugyanilyen sebességgel i adagoltuk tovább a fentiekben megadott j szubsztrátum-oldatot. |

Mivel az enzimek és a koenzim a reaktor 5 előtti steril szűrőn áthatolhattak, a reaktor | ultraszűrőjén azonban nem, a reaktorban 1

1,42 mmól/1 koenzim-koncentráció, 4,0 E/ml i

L-2-hidroxi-4-metilpentánsav - dehidrogenáz 1 aktivitás (0,4 mól/1 DL-2-hidroxi-4-metil-mer- £ kaptovajsavval, 0,1 mól/1 triszpufferrel, 1 mmól/1 NAD⁺-al, 25°C-on, pH=8-on mér- 1 ve), és 86,3 E/ml L-leúcin-dehidrogenáz ak- 1

-4πυ raaoou d tivitás (2 mmól/l 2-keto-4-metilmerkaptovajsavval, 1 mmól/l NADH-al, 800 mmól/l ammóniumformiáttal, 25°C-on, pH=8-on mérve) adódott.

A reaktort 3,7 órás tartózkodási idővel 5 25°C-on és 8-as pH-η az említett körülmények között 4,5 napon át folytonosan üzemeltettük. Ezalatt az üzemidő alatt a membránon át a maximális nyomáskülönbség kb. 3 bar volt.

A kísérlet időtartama alatt 38,4% -os ki- 10 termelést értünk el, ami 2,6 nap leforgása alatt 36,4%-ra mérséklődött (a kitermelést a szubsztrátumban lévő L-enantiomerre számítjuk). A maximális tér-idő kitermelés 0,5 mól/(lXd), ill. 74,3 g/(lXd) volt. 4,34 na- 15 pon át tartó üzemidő alatt 3 g, ill. 20 mmól L-metionint ((aj 25 =+23,4°) nyertünk. Az enzimátikusan aktív koenzim-koncentráció 4,34 nap alatt 1,42 mmól/l-ről 1,25 mmól/l-re csökkent. 20

Egy mól (felhasznált) koenzimre számítva 11.800 mól termék köpződött. Ez 378 mg natív NAD⁺ szükségletnek felel meg 1 kg termékre.

Claims (3)

1. Eljárás α-hidroxikarbonsavaknak a megfelelő L-a-aminokarbonsavakká történő foly- 30 tonosüzemű átalakítására, vízoldható nagymolekulás anyaghoz végzett kapcsolással megnövelt molekulatömegű nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD+/NADH), a használt o-hidroxikarbonsavra specifikus dehidroge- 35 náz, az előállítandó L-a-aminokarbonsavra specifikus dehidrogenáz és ammóniumionok jelenlétében, enzimreaktorban, azzal jellemezve, hogy 2.000—50.000 névleges kizárási határú ultraszűrő membránnal ellátott membránreaktorba, amely 500—50.000 átlagos molekulatömegű polietilénglikolhoz kötött alakban jelenlévő, 0,1 — 10 mmól/l koncentrációjú NAD+/NADH oldatot, a használt a-hidroxikarbonsavra specifikus dehidrogenázt és az előállítandó L-a-aminokarbonsavra specifikus dehidrogenázt tartalmaz, folyamatosan betápláljuk az átalakítandó a-hidroxikárbonsav olyan koncentrációjú vizes oldatát, amely a maximálisan oldható mennyiség 25—100 t%át tartalmazza, továbbá az a-hidroxikarbonsavnak megfelelő α-ketokarbonsavnak a használt aminokarbonsav-dehidrogenázra számított, 1 —10 k_m koncentrációjú oldatát, valamint az átalakítandó α-hidroxikarbonsav — mennyiséggel legalább ekvimoláris mennyiségű ammóniumiont, a membránon át 0,1 — 15 bar nyomáskülönbséget tartunk fenn, és a membrán mögött képződött, L-a-aminokarbonsavat tartalmazó szűrlet-áramot folytonosan elvezetjük, mimellett a membránreaktor hőmérsékletét 25—50°C-ra szabályozzuk és a reakcióelegy pH-értéke a reakció alatt 8 és

9,5 közötti.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az átalakítandó a-hidroxikarbonsavat racemát alakjában tápláljuk be és az L-enantiomerre specifikus, valamint a D-enantiomerre specifikus dehidrogenáz elegyét tápláljuk be.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az átalakítandó a-hidroxikarbonsavat racemát alakjában tápláljuk be, és csak az L-enantiomerre vagy a D-enantiomerre specifikus dehidrogenázt tápláljuk be, de a reakciót az α-hidroxikarbonsavra specifikus racemáz egyidejű jelenlétében hajtjuk végre.