LU84273A1 - Production d'aspartase - Google Patents

Description

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La présente invention concerne la production d’aspartase. Plus particulièrement, 1*invention concerne un procédé de préparation d’une solution aqueuse d1aspartase,.exempte de cellules et pouvant être uti-5 lisée pour transformer le fumarate d’ammonium en acide aspartique· L’acide L—aspartique est un acide aminé important qui. est utilisé dans des applications pharmaceutiques et comme matière première pour des produits chi-10 miques de spécialités tels que la L—alanine et l’aspartame* Cet acide aminé est également utilisé comme additif aux produits alimentaires pour l’homme et l’animal. L’acide aspartique a été préparé par des . moyens chimiques mais, en règle générale, les procé-15 dés chimiques donnent un mélange racémique des deux formes D et L. Seule la forme L de l’acide aspartique est biologiquement assimilable. En conséquence, les procédés préférés pour la production d’acide aspartique impliquent la culture de micro-organismes produc-20 teurs d’aspartate sur des milieux nutritifs appropriés. Par exemple, dans le brevet des Ebats-Unis d’Amérique n° 3*214.345 aux noms de Chibata et al., on décrit des ' procédés de fermentation pour la production d’acide aspartique, procédés dans lesquels on utilise l’acide 25 fumarique (sous forme de son sel d’ammonium) comme source principale de carbone. Le procédé dont il est question dans cette référence,implique un procédé de type discontinu dans lequel on inocule un micro-orga- · nisme dans un milieu nutritif de fermentation tandis 30 que, après une période d’incubation, on récupère l’acide aspartique de ce milieu de fermentation.

Il a été également fait mention de la production d’acide aspartique en utilisant des réacteurs à cellules immobilisées. Par exemple, dans le brevet 35 des Etats-Unis d’Amérique n° 3.791.926 aux noms de

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Chibata et al., on décrit la préparation d*un réacteur à cellules immobilisées en enfermant des cellules de micro-organismes producteurs draspartate dans un polymère diacrylamide. On prépare ensuite 1*acide 5 aspartique en mettant les cëllules immobilisées en contact avec du fumarate d* ammonium» La réaction peut être de type discontinu ou continu. Dans des réacteurs continus, on charge les cellules immobilisées dans une colonne à travers laquelle on fait passer continuelle- îr 10 ment une solution de fumarate d,ammonium.

Les réacteurs à cellules immobilisées présentent plusieurs avantages vis-à-vis des procédés de fermentation de type discontinu. Dans les procédés de type discontinu, la récupération ,du produit implique 15 fréquemment des procédés complexes réduisant le rendement global et donnant, dans de nombreux cas, un produit qui est contaminé par des cellules, des métabo— lites et autres matières présentes dans le milieu nutritif. En utilisant des cellules immobilisées, on 20 élimine bon nombre de ces problèmes ; toutefois, d»im-portantes quantités d*impuretés cellulaires peuvent néanmoins être présentes dans le produit final.

" Les procédés par lesquels on évite les pro blèmes de récupération et de contamination que posent 25 les procédés à cellules immobilisées et de type dis continu, impliquent 1*isolation, la purification et 1*utilisation de la ou des enzymes essentielles pour effectuer la réaction désirée. L*enzyme intervenant dans la transformation du fumarate d*ammonium en acide 30 aspartique est 1* aspartase. Des essais ont été entre— t pris en vue d*immobiliser 1*aspartase dans des colonnes ou sur des supports solides en vue de transformer directement .le fumarate dVammonium. en acide^aspartique. Par exemple, - dans- -la- partie - introductive -du — 35 brevet des Etats-Unis d1Amérique 3·791.926, on décrit ! t 4 des procédés impliquant la fixation d1aspartase sur un • polysaccharide échangeur d*anions ou 1*emprisonnement de 1*aspartase dans un polymère d*acrylamide* Toutefois, ces procédés ont rencontré un succès limité du 5 fait qu*il est difficile d*extraire et de purifier 1* enzyme aspartase, sans compter que l*on enregistre une perte importante de 1*activité enzymatique au cours de la purification, de la concentration et de 1*immobilisation de 1*enzyme* 10 On a également proposé des réacteurs du type à dialyse en vue d*immobiliser les enzymes. Telle qui elle figure dans la présente spécification, 1*expression "dialyse” est utilisée dans son sens large et elle englobe une dialyse réelle (échange de molé-1$ cules de solutés entre deux liquides séparés par une membrane), 1*osmose (transport d*un solvant à travers une membrane) et 1*ultrafiltration (mouvement d*un solvant ou d*un soluté provoqué par une pression différentielle à travers une membrane), Dans des réac-20 . teurs du type à dialyse, une solution-d*enzyme est efficacement retenue sur une face d*une membrane semi-perméable, Le substrat destiné à la réaction enzymatique est ensuite mis en contact avec 1*autre face de cette membrane semi-perméable, La membrane semi-25 perméable est conçue pour être perméable au substrat et au produit, cependant qu,elle doit être imperméable vis-à-vis de 1*enzyme. Dès lors, le substrat peut migrer vers la face de la membrane qui comporte l1enzyme, où il est transformé en produit, lequel 30 peut migrer pour revenir dans la solution du substrat de laquelle il peut être récupéré.

Des réacteurs du type à dialyse peuvent avoir différentes formes. Par exemple, des unités industrielles ont généralement la configuration d*un 35 filtre-presse comprenant de nombreuses plaques de * 5 * membranes parallèles séparées par des chambres à travers lesquelles des liquides peuvent s1écouler*

Dans "Biotechnology and Bioengineering", 20, 217—230 (197^)9 Kan, J.K. et Shuler, M*L* décrivent 5 1*utilisation d*une unité de dialyse de reins à fi bres creuses comme réacteur du type à dialyse* Lors de l*utilisation d*une telle unité, des cellules microbiennes entières sont immobilisées sur le côté enveloppe de 1*unité de dialyse de reins. On fait 10 circuler une solution d*un substrat à travers le côté tubes des fibres creuses du dialyseur. Le substrat se diffuse à travers les fibres et jusqu*aux cellules où des réactions ont lieu, tandis que les produits formés se diffusent pour revenir dans le courant de 15 recyclage* Le système particulier décrit implique 1*immobilisation d*une souche de Pseudomonas fluorés— cens pour la conversion enzymatique de la L-histidine en acide urocanique*

Jusqu*à présent, les tentatives entreprises 20 en vue d*utiliser 1*enzyme aspartase immobilisée dans des réacteurs du type à dialyse pour la production d*acide aspartique ont généralement été infructueuses (voir, par exemple, le brevet des Etats-Unis d*Améri-. que n° 3*791*926 mentionné ci-dessus)· On pense que 25 la raison de cet insuccès réside dans le fait que les procédés connus pour isoler et purifier 1*aspartase ont entraîné d*importantes pertes de 1*activité enzymatique*

Suivant la présente invention, on décrit 30 un procédé de préparation d*une solution aqueuse d*aspartase pratiquement exempte de cellules, ce procédé consistant à former une suspension aqueuse de cellules microbiennes contenant de 1 * as par tas-e -^incuber cette suspension aqueuse de cellules dans'des con-35 ditions donnant lieu à la libération d*aspartase pen- Λ.

« 6 dant un laps de temps suffisant pour qu’une importante ·· partie de l’aspartase intracellulaire passe dans le fluide extracellulaire ; retirer les solides de la suspension de ..cellules pour former une solution cla-5 rifiée contenant de l’aspartase et ajouter, à la suspension aqueuse de cellules ou à la solution clarifiée contenant de l’aspartase, un sel stabilisant l’aspar-tase en une quantité suffisante pour rendre cette solution hypertonique vis—à—vis des cellules micro-10 biennes. Dans une forme de réalisation préférée, on forme la suspension aqueuse de cellules avec une solution hypertonique du sel stabilisant l’aspartase.

Ce procédé est simple et efficace et l’on récupère généralement plus d& 8 0% de l’activité d’as— 15 partase des cellules dans la solution d’aspartase exempte de cellules. De plus, on constate que 1·*enzyme conserve son activité au cours de longues périodes dans une solution de ce type. Ces solutions .peuvent être utilisées très efficacement dans des 20 . réacteurs du type à dialyse décrits eï-dessus.

L’enzyme aspartase est produite par une large variété de micro-organismes et la présente invention n’est nullement limitée à l’utilisation de l’un ou l’autre genre, espèce ou souche particulier.

25 Par exemple, des bactéries telles que Pseudomonas fluorés cens, Pseudomonas aeruginosa ., Bacillus subtil is, Bacillus mégathérium, Proteus vulgaris, Serratia mar-cescens, Escherichia coli et Aerobacter aerogenes ont été décrites comme bactéries appropriées pour la pro— 30 duction d’acide aspartique. Un organisme particulier duquel l’aspartase a été récupérée, est un mutant de E, coli utilisant du glutamate (ATCC n° 31976).

Comme-source d* aspartase, on peut cultiver----- des cellules productrices d’aspartase sur un milieu 35 nutritif conçu pour la production de l’enzyme et la ‘ \ 7 * croissance rapide des cellules. Des procédés en vue de préparer et de maintenir des cultures de cellules sont bien connus et ne font pas partie de la présente invention. ... · 5 En règle générale, on utilise un milieu nutritif contenant des substances minérales essentiel-. les et des facteurs de croissance, ainsi que des sources assimilables de carbone et d*azote. Selon une caractéristique avantageuse, le milieu contient de 10 - l1acide fumarique et il contient également, de préférence, un extrait de levure comme source d1azote, des vitamines et des facteurs de croissance, l*ion ammonium comme source supplémentaire d*azote, de même que des sels de calcium et de magnésium comme substances 15 minérales essentielles. On peut utiliser des sels phosphates et carbonates de potassium ou de sodium comme tampons.

On soumet généralement le miliëu inoculé à une fermentation dans des conditions de croissance 20 pendant une période suffisante pour, produire environ 2 à environ 6 g de solides par litre. Normalement, une fermentation effectuée à environ 37°0 pendant environ 12—14 heures est suffisante pour obtenir la concentration désirée de cellules.

25 Après une période de croissance appropriée^ on sépare avantageusement lés cellules de la portion extracellulaire du milieu de fermentation (par exemple, par centrifugation ou par filtration) et on les lave.

On peut libérer l*aspaftase des cellules en mettant cel-30 les-cien suspension dans un milieu aqueux et en les incubant dans des conditions donnant lieu à la libération d,aspartase. Le milieu aqueux de mise en suspension peut être l*eau ou n*importe quelle solution aqueuse n*exerçant aucun effet néfaste sur 1*enzyme 35 (par exemple, des tampons ordinaires). Des milieux 8 aqueux préférés de mise en suspension sont des solu-’ tions hypertoniques de sels stabilisant l*aspartase (comme on le décrira ci-après) et des milieux particulièrement préférés sont des solutions hypertoniques 5 de sels solubles de l*acide fumarique ou de lTacide aspartique. Des solutions de fumarate d1ammonium d*une concentration se situant entre environ 1 molaire et la saturation, de préférence, environ 1,4 molaire, sont particulièrement préférées* 10 On met avantageusement les cellules en sus pension dans le milieu aqueux à une concentration d*au moins environ 5 g/litre (sur la base du poids des cellules à sec), de préférence, d*environ 10 à environ 15 g/litre.

• 15 On incube généralement la suspension de cellules dans des conditions donnant lieu à la libération d*aspartase pendant un laps de temps suffisant pour qu*une importante portion de l*aspartase intracellulaire passe dans la solution de fumarate* On , 20 emploie généralement une température d*incubation se situant entre environ 2°C et environ 70°C, de préférence, entre environ 25°C et environ 50°C. Une température d*incubation particulièrement préférée est d1environ 37°C. Des vitesses de libération d*enzymes 25 plus lentes et des activités enzymatiques plus faibles sont associées aux températures inférieures d*incubation, tandis que des températures d1incubation plus élevées peuvent exercer un effet néfaste sur 1*enzyme.

Le temps d*incubation dépend, dans une certaine mesure, 30 de la température d1 incubation, mais il est généralement d*au moins environ 10 minutes. De préférence, on adopte une période d*incubation d*au moins environ 1 heure, -mieux--encore,—d-1 environ-J.2-à-environ .00 heures .

Apr ès~i4±ncubation, - on retire les solides-------- 35 de la suspension de cellules,par exemple, par centri— 9 r ί * ! 4 fugation ou par filtration afin de former une solution clarifiée contenant de 1*aspartase. On peut adopter n*importe quel procédé de clarification ne donnant pas lieu à d*importantes pertes de 11 activité d*aspartase. 5 En règle générale, la solution obtenue contient envi ron 80% de 1*activité d*aspartase initialement contenue dans les. cellules. Ces solutions sont relativement exemptes d1impuretés indésirables et on a trouvé qu1elles conservaient pratiquement toute leur activité •10 d*aspartase pendant plus de 40 jours à 37°C# A la solution clarifiée, on ajoute un sel stabilisant 1*aspartase en une quantité suffisante pour rendre cette solution hypertonique. Dans une forme de réalisation préférée de 1*invention, on 15 utilise la solution du sel stabilisant 1*aspartase comme milieu aqueux de mise en suspension des cellules et, lorsqu*on adopte ce procédé, il n*est généra-lement pas nécessaire d*ajouter un sél stabilisant 1*aspartase à la solution clarifiée.

20 On a trouvé que le sel stabilisant l*aspar- tase stabilisait 1*enzyme contre la perte d*activité au cours d*une certaine période et qu*il la stabilisait également contre la dégradation thermique. Par exemple, des comparaisons d,activité d1aspartase dans 25 des solutions conservées à 65°C indiquent que ltenzyme extraite avec un tampon perd virtuellement toute son activité après 30 minutes, tandis qu*une enzyme extraite dans du fumarate d*ammonium 1,4M conserve au moins 80% de sa stabilité après conservation pendant 30 deux heures.

Les sels préférés stabilisant 1*aspartase sont des sels solubles de 1*acide fumarique ou de 1*acide aspartique. Etant donné que 1*acide fumarique constitue le substrat enzymatique pour la produc-35 tion d1acide aspartique, en utilisant des sels de ces Γ • · ι ' * i - ίο acides, il n'est généralement pas nécessaire de séparer ultérieurement le sel de l'aspartase, De plus, on a trouvé que ces sels, en particulier, le fumarate d* ammonium, étaient particulièrement efficaces pour l'ex— 5 traction et la stabilisation de l'enzyme. Bien que les sels fumarateset aspartatessoient préférés, on comprendra que l'on peut utiliser n*importe quel sel hydrosoluble exerçant un effet stabilisant sur l'enzyme, Ces sels peuvent être représentés de manière 10 générale par la formule MX dans laquelle M représente un cation tel qu'un métal alcalin ou alcalino—terreux, l'ammonium, un composé d'alkyl inférieur-ammonium, un composé d'alkyl inférieur-ammonium quaternaire et analogues, tandis que X représente, un anion tel qu'un 15 halogénure,un nitrate, un carbonate, un phosphate, un sulfate, un maléate, un fumarate, un aspartate et analogues, La concentration du sel stabilisant l'as— 9 partase dans la solution clarifiée se situe avantageusement dans l'intervalle allant d'environ 0,5M à la 20 saturation, de préférence, entre environ IM et environ 1,4M.

Les solutions d'aspartase préparées par ce procédé sont particulièrement utiles dans des réacteurs du type à dialyse, en particulier, dans des 25 réacteurs à fibres creuses, La solution exempte de cellules peut être aisément introduite dans le côté enveloppe de ce réacteur en appliquant simplement une aspiration au côté tubes de ce dernier. Après avoir introduit l'enzyme dans le réacteur, on peut faire 30 circuler une solution de fumarate d'ammonium à travers le côté tubes du réacteur. Le substrat, à savoir le fumarate d'ammonium et le produit, à savoir l'acide aspartique, passent librement à travers les parois-des tubes -de dialyse, et l'acide^aspartique— 35 peut être récupéré de la solution en circulation.

|· u D*autre part, 1*enzyme aspartase ne peut passer à travers les parois des tubes ; en conséquence, elle est efficacement retenue dans le réacteur* L1 élimination des impuretés dialysables et des corps colo- -5 rés a lieu immédiatement après le démarrage de la réaction et, par conséquent, ils ne contaminent pas la masse du courant de produit.

On peut faire varier les conditions de la réaction suivant le type de réacteur utilisé. En 10 règle générale, le substrat est une solution concentrée de fumarate d*ammonium, par exemple, d*une concentration d*environ IM à la saturation, de préférence, d*environ Ι,δΜ. On incube les milieux réactionnels dans des conditions produisant de 1*acide aspar-15 tique. On maintient avantageusement le réacteur à une température élevée afin d*assurer une transformation efficace du substrat en produit. On adopte généralement des températures' d*environ 2°C à environ 70°C, de préférence, d*environ 25°C à 50°C et, mieux 20 encore, d*environ 37°C. La réaction enzymatique est exothermique, si bien que, dans de grands réacteurs ou dans des réacteurs dans lesquels on adopte de faibles débits pour le substrat, on peut utiliser des éléments en vue de dissiper la chaleur excédentaire.* 25 Le débit désiré de la solution du substrat à travers le réacteur dépend du réacteur particulier adopté, de la concentration du substrat, de la configuration du système (par exemple, en circulation ou en une seule passe), de la charge enzymatique et de la vitesse à 30 laquelle on désire dissiper la chaleur.

Le système de réacteur à fibres creuses peut fonctionner dans un mode discontinu avec recyclage dans lequel le courant de sortie du réacteur revient ù .uil réservoir.. _ On continue à faire circuler 35 la solution du substrat jusqu1à ce qu*une partie im- ϋ fs 12 portante du fumarate d*ammonium ait été transformée en acide aspartique. Parmi d* autres modes de réactions, il y a les systèmes à une seule passe dans lesquels plusieurs réacteurs peuvent fonctionner en 5 série.

On a trouvé que la présente invention fournissait un procédé simple et efficace en vue de récupérer l’aspartase de cellules productrices d’aspartase. La solution d’aspartase ainsi obtenue et exempte de .

10 cellules peut être utilisée dans des modes discontinus ou avec immobilisation et elle est particulièrement appropriée pour des réacteurs du type à dialyse à fibres creuses.

Les solutions d’aspartase exemptes de cel-15 Iules suivant la présente invention offrent plusieurs avantages vis-à-vis des cellules entières dans les réacteurs du type à dialyse. Afin d’obtenir un haut degré d’activité enzymatique avec des cellules entières, les cellules doivent généralement être sous une 20 forme concentrée. Les milieux cellulaires concentrés sont très denses et visqueux, ce qui pose au moins deux problèmes qui sont évités par le système exempt de cellules suivant la présente invention. En premier lieu, les impuretés et les corps colorés prove-25 nant de la bouillie de cellules migrent à travers la membrane de dialyse pour pénétrer dans le courant de produit. Au lieu d’apparaître au cours d’une courte période au stade initial de la réaction comme c’est le cas avec les solutions exemptes dé cellules, 30 les impuretés et les corps colorés ont tendance à se séparer des cellules entières par lixiviation au cours de périodes prolongées. Un deuxième avantage du système exempt de cellules se rapporteaux problèmes de— diffusion que posent les systèmes à cellules entières, 35 On pense que l’aspartase est une enzyme intracellulai— { 13 * re, si bien que les réactifs et les produits doivent s'e diffuser non seulement à travers la membrane du réacteur, mais également à travers le fluide extracellulaire et les constituants cellulaires. En con— 5 séquence, avec ces systèmes à cellules entières, on observe des vitesses de transformation moins efficaces, Par exemple, avec la même quantité d*activité enzymatique, on a constaté qu*un système de réacteur exempt de cellules et à fibres creuses assurait une 10 vitesse de transformation supérieure d*environ 45% à celle observée avec le système à cellules entières, L*invention est illustrée de manière plus détaillée par les exemples suivants qui nlont toutefois aucun caractère limitatif,

15 Exemple I

On a effectué plusieurs expériences au cours desquelles on a soumis des milieux nutritifs contenant des quantités variables d1extrait de levure en.vue de produire de lfaspartase* Chaque milieu de 20 ' fermentation contenait, par litre : 24—60 g d*extrait de levure, 30 g d*acide fumarique, 2 g de phosphate de potassium dibasique, 0,5 g de carbonate de sodium, 2 mM de sulfate de magnésium et 0,1 mM de chlorure de calcium, tandis que le pH a été réglé à environ 7,2 25 avec de l1 hydroxyde d1 ammonium, A chaque milieu, on a inoculé 1 ml d*une culture de E, coli (ATCC N° 3I976) que l*on a incubée pendant 12-16 heures à 37°C dans un milieu de peptone contenant 0,5$ de glutamate monosodique. On a incubé chaque milieu inoculé à 30 37°C pendant 12-14 heures, période au terme de la quelle on a recueilli les cellules. Lors de la récolte, le poids des cellules à sec était de 2-7 g par litre suivant la quantité d* extrait de levure—utilisé.

Le tableau I ci-après donne le débit de production------- 35 d*aspartase pour chaque milieu de fermentation.

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On a effectué un deuxième groupe d*expériences au cours desquelles on a préparé des milieux’ de fermentation contenant différentes concentrations de fumarate d’ammonium et on les a soumis à une fer-· 5 mentation comme décrit ci-dessus. Chacun de ces mi lieux contenait $% d’extrait de levure et les autres ingrédients dans les mêmes concentrations que celles indiquées ci-dessus. Le tableau II reprend les résultats de ces expériences. On a centrifugé la cul-10 ture de cellules préparée à partir du milieu de fermentation contenant 2,4.% en poids/volume d1 extrait de levure et 3% de fumarate d’ammonium, puis on'a décanté et éliminé le liquide. On a ensuite lavé les cellules avec, de l’eau, on les a soumises à nouveau à 15 une centrifugation, on les a décantées et on les’a remises en suspension à 1/20.du volume initial dans un tampon de tris,HCl 6,05j, pH 8,5· Ensuite, on a dilué la bouillie avec une solution 1,8m de fumarate d*ammonium, pH 8,5j pour former une suspension de cellules 20 ayant 1/5 du volume initial de fermentation. On a séparé la suspension obtenue en six portions que l’on a incubées à 37°C pendant les périodes indiquées dans le tableau III, puis on les a soumises à une centrifugation, On a décanté les produits surnageants et 25 l’on a éliminé les solides. On a soumis les produits surnageants à une analyse en vue de déterminer l’activité d’aspartase j les résultats obtenus sont repris dans le tableau III,

Exemple II

30 On a introduit une solution d’aspartase exempte de cellules formée à partir de 12,5 g (poids sec) de cellules préparées conformément au procédé de l’exemple I (2,4% d’extrait de levure, 3% de fumarate d’ammonium) dans le côté enveloppe du rein arti-35 ficiel de Cordis—Dow (CDAK 2,5D) en appliquant une *1 15 aspiration au côté tubes du rein artificiel. Après avoir introduit 1*enzyme dans le réacteur, on a scellé le côté enveloppe et on a fait passer une solution 1,8m de fumarate d1 ammonium, pH 8,5$ à travers le 5 côté tubes du réacteur à un débit d1environ 11-15 litres/heure. On a adopté un mode à recyclage dans lequel on a recyclé la solution du substrat dans le ' réacteur à partir d*un réservoir. On a maintenu le réacteur à une température de 37° C· On a analysé 10 périodiquement le contenu du réservoir en vue de déterminer le fumarate résiduel les résultats des analyses sont repris dans le tableau IV. On a précipité 1*acide aspartique à un pH de 2,8 par addition de H2S0^, on l*a filtré, on l*a lavé,puis on l*a 15 séché. A partir d*une quantité moyenne de 2,1 kg

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d1acide fumarique, on a récupéré 2-2,1 kg d1acide aspartique (rendement théorique ! 83 à &6%). L*acide aspartique ainsi produit a été caractérisé par des analyses élémentaires de détermination des teneurs • 20 en C, H, N et 0 qui concordaient à raison de 97—99% avec la théorie* On a mesuré la rotation spécifique 2Ç° du produit et elle était la suivante : [a] ^ = +26 (C = 10 dans HCl 2N). On a analysé le produit par un dosage enzymatique associé à un diagnostic et le 25 résultat concordait à raison de 9&% avec un étalon d1acide aspartique authentique.

t» 16

Tableau I

Effect de la concentration de 1*extrait de levure dans le milieu de fermentation (contenant 3% de fu~ marate d*ammonium) sur 1*activité volumétrique d*as-· 5 partase du bouillon.

Extrait de levure Aspartase {% en poids/volume) millimoles h-ml de bouillon de _________________ _culture__ 1,0 0,22 10 1,8 0,64 2,7 0,90 3,0 1,20 4,0 1,50 5.0 1,76 15 6,0 2,14 ' 7.0 2,26 8.0 , 2,24

Tableau II

Effet de la concentration en fumarate d1ammonium dans 20 le milieu de fermentation (contenant 8% d*extrait de levure) sur 1*activité volumétrique d*aspartase du bouillon.

Acide fumarique Aspartase (% en poids/volume) (millimoles/h-ml) 25 0 1,00 2,0 2,50 4.0 2,52 6.0 0,48 , ψ * 17

Tableau III

Extraction d*aspartase de cellules avec du fumarate d* ammonium 1,4M#

Durée (heures·) Activité extraite ($) 5 0 - 4 70% .

7 73% 14 79% 24 8o% 10 48 84%

Tableau IV

Réacteur à fibres creuses (CDAK 2,5D) chargé d1enzyme exempte de cellules (extraite à partir d*environ 12,5 g de cellules, poids sec) $ utilisé.dans un mode 15 discontinu à recyclage avec un réservoir agité de 10 litres de fumarate d*ammonium 1,SM, On a prélevé' des échantillons du réservoir et on les a soumis à une * analyse en vue de déterminer le fumarate résiduel* Durée (heures) Fumarate résiduel (m) 20 0,0 1,81 0,25 1,63 0,5 1,52 1,0 1,30 1.5 1,12 25 2,0 0,98 2.5 0,82 3.0 0,70 3.5 0,58 4.0 0,48 30 5,0 0,32 6.0 0,21 7,0 0,14

Claims (15)

1. Procédé de préparation d*une solution aqueuse d*aspartase pratiquement exempte de cellules, ce procédé consistant à former une suspension aqueuse 5 de cellules microbiennes contenant de l*aspartase ; incuber cette suspension aqueuse de cellules dans des conditions donnant lieu à la libération d*aspartase ' pendant un laps de temps suffisant pour qu*une impor tante partie de l*aspartase intracellulaire passe dans 10 le fluide extracellulaire 3 retirer les'solides de la suspension de cellules pour former une solution clarifiée contenant de l*aspartase et ajouter, à la suspension aqueuse de cellules ou à la solution clarifiée contenant de 1* aspartase, un sel stabilisant 15 l*aspartase en une quantité suffisante pour rendre cette solution' hypertonique vis—à—vis des cellules microbiennes* . 2* Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu*on prépare cette suspension aqueu-20 se de cellules en mettant les cellules microbiennes en suspension dans une solution hypertonique de ce sel stabilisant l*aspartase. r 3· Procédé suivant 1*une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le sel 25 stabilisant l*aspartase est un sel hydrosoluble de 1*acide fumarique ou de 1*acide aspartique*

4· Procédé suivant l*une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le sel stabilisant l*aspartase est le fumarate d* ammonium ou 30 l*aspartate d*ammonium.

5· Procédé suivant la revendication 2, caractérisé en ce que le sel stabilisant l*aspartase est le fumarate dT ammonium*_______ 6* Procédé-suivant—la revendication ^ , ca---------- 35 ractérisé en ce que la concentration du fumarate *- d*ammonium dans la solution hypertonique de fumarate d*ammonium se situe entre environ 0,5M et la saturation* 7·· Procédé suivant la revendication 5* ca-5 ractérisé en ce que la concentration de fumarate d*ammonium dans la solution hypertonique de fumarate d1ammonium se situe entre environ 1 et environ 1,4M ' 8* Procédé suivant la revendication 6, ca ractérisé en ce que les conditions de récupération 10 d*aspartase sont les suivantes : température d*incuba-tion : environ 2°C à environ 70°G ; durée d*incubation de la suspension de cellules : au moins environ 10 minutes#

9· Procédé suivant la revendication 69 ca-15 ractérisé en ce que les conditions- de récupération . d*aspartase sont les suivantes : température d*incu bation î environ 25°C à environ 50°C ·9 durée d*incu-bation de la suspension de cellules : environ 12 à environ 60 heures* 20 10# Procédé suivant la revendication 9j caractérisé en ce que la température d*incubation est d* environ 37°C* * 11* Procédé suivant la revendication 93 caractérisé en ce qu*on met les cellules bactérien-25 nés en suspension dans une solution hypertonique de fumarate d*ammonium en une quantité suffisante pour * obtenir une concentration en cellules d*au moins environ 5 g/litre (sur la base du poids des cellules à sec), les conditions de récupération d*aspartase 30 englobant également un pH d1 environ 7 à. environ 9· 12* Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce qu*on met les cellules bactériennes en suspension dans une solution hypertonique de fumarate d*ammonium en une quantité suffisante pour 35 obtenir une concentration en cellules d*environ 10 à t *» # . environ 15 g/litre (sur la base du poids des cellules à sec), -tandis que le pH se situe entre environ 8 et ' environ 9·

13· Procédé suivant l*une quelconque des · 5 revendications 1, 5> 6, 7j 9 et 12, caractérisé en ce que les cellules bactériennes sont choisies parmi le groupe comprenant des souches productrices d*aspar-* tase de Pseudomonas fluoréscens, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Bacillus mégathérium3 Proteus vul— 10 garis» Serratia marcescensa Escherichia coli et Aero-bacter aerogenes·

14· Procédé suivant la revendication 13j caractérisé en ce que les cellules bactériennes sont des cellules de E« coli· 15 15· Procédé suivant la revendication 14> caractérisé en ce que les cellules bactériennes sont des cellules de la souche* E· coli ATCC 31976·

16. Solution aqueuse d*aspartase pratiquement exempte de cellules, préparée par le procédé 20 suivant la revendication 1*

17· Solution aqueuse d1aspartase pratiquement exempte de cellules, préparée par le procédé * suivant la revendication 11«

18· Solution aqueuse d*aspartase pratïque-25 ment exempte de cellules, préparée par le procédé suivant la revendication 13·

19· Procédé de production d*acide aspartique dans un réacteur comprenant une première chambre et une deuxième chambre, ainsi qu*une membrane semi-30 perméable séparant la première chambre de la seconde, t cette membrane semi-perméable étant perméable à l1 as-part ate et au fumarate, mais imperméable à 1*aspartase, caractérisé en ce qu!il consiste à déposer—la solution a queuse~dJ aspartase pratiquement- exempte-de cellules-------- 35 suivant la revendication 16 ou 17 dans cette première r φ. c * chambre en communication par fluide avec la membrane semi-perméable et placer une solution comprenant du fumarate d’ammonium dans la seconde chambre en communication par fluide avec la membrane semi-perméable5 5 incuber ces solutions dans des conditions productrices d*acide aspartique et récupérer lfecide aspartique de la solution se trouvant dans la seconde chambre.

20. Procédé suivant la revendication 19* caractérisé en ce que le réacteur comprend une enve-10 loppe pouvant être scellée et comportant des éléments en vue de remplir cette enveloppe d’un liquide, de même que plusieurs fibres creuses formant la membrane semi—perméable et passant à travers cette enveloppe, de telle sorte que les lumières de ces fibres soient 15 scellées vis-à-vis de 1*intérieur de 1*enveloppe, chaque fibre comportant une extrémité d*entrée débouchant dans un collecteur d*entrée ayant un orifice d*entrée de tube, de même qu’ une extrémité de sortie débouchant dans un collecteur de sortie ayant un 20 orifice de sortie de tube, la solution aqueuse d’as— partase pratiquement exempte de cellules étant déposée dans cette enveloppe, tandis que le fumarate d1ammonium passe à travers les fibres creuses de la membrane semi-perméable et que 1*acide aspartique est 25 récupéré de la solution de fumarate d*ammonium.

21. Procédé suivant la revendication 20, caractérisé en ce que la concentration de fumarate d’ammonium dans la solution de fumarate d’ammonium se situe entre environ IM et la saturation.

22. Procédé suivant la revendication 21, caractérisé en ce qu’on utilise une solution pratiquement saturée de fumarate d’ammonium.

23· Procédé suivant la revendication 20, caractérisé en ce que les conditions de production 35 d’acide aspartique englobent une température d’incu- » bation se situant entre environ 2°C et environ 70°C1 24· Procédé suivant la revendication 20,· caractérisé en ce que les conditions de production d1acide aspartique englobent une température d1incu-5 bation se situant entre environ 25°C et environ 50°C1

25· Procédé suivant la revendication 24, caractérisé en ce que le réacteur est mis en service * dans un mode discontinu à recyclage dans lequel la solution de fumarate d1ammonium est recyclée d1un 10 réservoir à travers le réacteur jusqu1à ce qu1une importante quantité du fumarate d1ammonium soit transformée en acide aspartique1 , t