DE3226532A1

DE3226532A1 - Verfahren zur herstellung von aspartase und verwendung derselben zur produktion von asparaginsaeure

Info

Publication number: DE3226532A1
Application number: DE19823226532
Authority: DE
Inventors: Lois Jean 21701 Frederick Moser, Md.; David Charles 20896 Garrett Park Sternberg, Md.
Original assignee: Genex Corp
Current assignee: Genex Corp
Priority date: 1981-10-15
Filing date: 1982-07-15
Publication date: 1983-09-01
Also published as: GB2108128A; IT8267896A0; IL66262A0; ZA824805B; AU8592482A; DD207219A5; BR8204099A; SE8204306L; DK307582A; ES514018A0; FR2514782A1; JPS5867184A; ES8400142A1; LU84273A1; PL238624A1; FI823502L; FI823502A0; NL8202854A; BE893838A; SE8204306D0

Description

PAT E N TAN AVALT Ε

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) · Dl P L-I N G. W. EITt C . D R. R E R. NAT. K. H OFFMAN N . Dl PL.-1 N G. W. LE H N

DIPL.-ING. K. FDCHSLE . DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 . D-8000 MÜNCHEN 81 . TELEFON (089) 911087 . TE LEX 05-29619 (PATHE)

37 191 m/hl

Genex Corporation,
Rockville, Maryland / USA

Verfahren zur Herstellung von Aspartase und Verwendung derselben zur Produktion von Asparaginsäure

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Aspartase sowie. die Verwendung derselben zur Gewinnung von Asparaginsäure. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer wässrigen, zellfreien Lösung von Aspartase, die für die Umwandlung von Ammoniumfumarat zu Asparaginsäure verwendet werden kann.

L-Asparaginsäure stellt eine wichtige Aminosäure dar, die zur pharmazeutischen Applikation und als Ausgangsmaterial für Spezialchem'ikalien, wie z.B. L-Alanin und Aspartam verwendet wird. Diese Aminosäure wird duch als Additiv für tierische und menschliche Nahrungsmittel eingesetzt. Asparaginsäure ist mit chemischen Mitteln hergestellt worden, jedoch wird bei den chemischen Verfahren im allgemeinen

■•ν ν

ein raceraisches Gemisch von sowohl D- und L-Form hergestellt. Nur die L-Form der Asparaginsäure ist biologisch assimilierbar. Demzufolge umfassen bevorzugte Verfahren zur Gewinnung von Asparaginsäure die Kultivierung von Aspartat-produzierenden Mikroorganismen auf geeigneten Nährstoffmedien. Zum Beispiel beschreiben Chibata et al., US-PS 3,214,345 fermentative Verfahren zur Herstellung von Asparaginsäure, bei welchen Fumarsäure (als Ammoniumsalz) als Hauptkohlenstoffquelle verwendet wird. Das zitierte Verfahren erfolgt im chargenweisen Betrieb, wobei ein Nährstoff-Fermentationsmedium mit einem Mikroorganismus inokuliert wird und nach einer Inkubationsperiode Asparaginsäure aus dem Fermentationsmedium gewonnen wird.

Es wurde auch die Herstellung von Asparaginsäure unter Verwendung von immobilisierten Zellreaktoren beschrieben» So beschreiben z.B. Chibata et al., US-PS 3,791,926, die Herstellung eines immobilisierten Zellreaktors, wobei Aspartatproduzierende Mikroorganismenzellen in einem Acrylamidpolymer eingeschlossen werden. Asparaginsäure wird dann durch den Kontakt der immobilisierten Zellen mit Ammoniumfumarat hergestellt. In kontinuierlichen Reaktoren werden die immobilisierten Zellen in Säulen gepackt, durch welche eine Ammoniumfurnaratlösung kontinuierlich geleitet wird. *

Immobilisierte Zellreaktoren haben gegenüber chargenweisen Fermentationsprozessen mehrere Vorteile. Bei den ehargenweisen Verfahren führt die Gewinnung des Produktes häufig zu komplexen Verfahrensrnaßnahmen, welche die Gesamtausbeute reduzieren; in vielen Fällen ergibt sich ein Produkt, welches mit. Zellen, Metaboliten und anderen Materialien, die in dem Nährmedium vorliegen, kontaminiert ist. Die Verwendung von immobilisierten Zellen eliminiert viele dieser Probleme; dennoch können nennenswerte Mengen von zellulären *Die Reaktion kann sowohl chargenweise als auch kontinuierlich geführt worden.

"I '--.-I Γ:··;^:ί2.2^;6532

Verunreinigungen im Endprodukt vorliegen.

Verfahren, bei denen die Probleme der Gewinnung und Kontaminierung, wie sie mit dem chargenweisen Betrieb und den immobilisierten Zellen assoziiert wird, überwunden werden, umfassen die Isolierung, Reinigung und Verwendung des Enzyms oder der Enzyme, die für die Durchführung der gewünschten Reaktion erforderlich sind. Das für die Umwandlung von Ammoniumfumarat zu Asparaginsäure verantwortliche Enzym ist Aspartase. Es sind Versuche unternommen worden, um Aspartase auf Säulen oder festen Trägern zur direkten Umwandlung von Ammoniumfumarat zu Asparaginsäure zu immobilisieren. Zum Beispiel werden in der Einleitung der US-PS 3,791,926 Verfahren beschrieben, die die Bindung von Aspartase an ein Anionenaustausch-Polysaccharid oder den Einschluß von Aspartase in ein Acrylamidpolymer betreffen. DiesenMethoden ist jedoch nur ein begrenzter Erfolg beschieden, was darauf zurückzuführen ist, daß die Extraktion und Reinigung des Enzyms Aspartase schwierig ist und ein nenennenswcrter Verlust der Enzymaktivität während der Reinigung, Konzentrierung und Immobilisierung des Enzyms auftritt.

Reaktoren vom Dialysetyp werden ebenfalls für die Immobilisierung von Enzymen vorgeschlagen. Die Bezeichnung "Dialyse" wird hier im breiten Sinne angewandt und schließt sowohl die echte Dialyse (Austausch von Molekülen des gelösten Stoffes zwischen zwei durch eine Membran voneinander getrennte Flüssigkeiten) , Osmose (Lösungsmitteltransport durch eine Membran) und Ultrafiltration (Bewegung von Lösungsmittel und gelöstem Stoff aufgrund eines Trannraembran-Druckdifforonbials) Bei den Reaktoren vorn Dialysetyp wird eine Enzymlösung effektiv auf einer Seite einer semipermeablen Membran zurückgehalten. Das Substrat für die enzymatische Reaktion steht dann im Kontakt mit der anderen Seite der semipermeablen Membran.

Die semipermeable Membran ist so konstruiert, daß sie für das Substrat und das Produkt durchlässig, aber für das Enzym undurchlässig ist. Auf diese Weise kann das Substrat zur Enzymseite der Membran wandern, wo es in das Produkt umgewandelt wird, und das Produkt kann in die Substratlösung zurückwandern, aus der es gewonnen wird.

Reaktoren vom Dialysetyp können in verschiedenen Formen konstruiert werden. In der Industrie verwendete Einheiten liegen im allgemeinen als Filter-Pressekonfiguration vor, welche zahlreiche parallele Membranplatten umfaßt, die durch Kammern getrennt werden, durch welche die Flüssigkeiten fließen,

Kan, J. K. und Shuler, M. L., Biotechnology and Bioengineering, 20, 217-230 (1978) beschreiben die Verwendung einer Höhlfaser-Nierendialyseeinheit als Reaktor vom Dialysetyp. Bei Verwendung einer solchen Einheit werden die mikrobiellen, ganzen Zellen auf der Gehäuseseite der Nierendialyseeinheit immobilisiert. Eine Lösung des Substrats wird durch die Rdirseite der Hohlfasern im Dialysator zirkuliert. Das Substrat diffundiert durch die Fasern zu den Zellen, wo die Reaktionen stattfinden, und die gebildeten Produkte diffundieren in den rezirkulierendem Strom zurück. Das beschriebene, spezielle System umfaßt die Immobilisierung eines Stammes von Pseudomonas fluorescens zur enzymatischen Umwandlung, von L-Histidin zu Urocaninsäure.

Bis heute waren Versuche zur Verwendung immobilisierter Aspartase in Reaktoren vom Dialysetyp zur Herstellung von Asparaginsäure im allgemeinen nicht erfolgreich (z.B.

US-PS 3,791,926, w.ie vorstehend beschrieben). Es ist anzunehmen, daß dieser Mißerfolg darauf zurückzuführen ist, daß bei der Isolierung und Reinigung von Aspartase ein nennenswerter Verlust der Enzymaktivität auftritt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches die Herstellung einer wässrigen, im wesentlichen zellfreien Aspartaselosung gewährleistet, welche für die Gewinnung von Asparaginsäure eingesetzt werden kann und bei welcher die vorstehend beschriebenen Nachteile vermieden werden.

Die vorstehende Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß ein Verfahren zur Verfügung gestellt wird, welches die folgenden Merkmale umfaßt: Bildung einer wässrigen Zellsuspension von Aspartase-haltigen mikrobielltm Zellen; Inkubieren der wässrigen Zellsuspension unter Aspartasefreigebenden Bedingungen für eine Zeit, die ausreicht, daß ein wesentlicher Teil der intrazellulären Aspartase in die extrazelluläre Flüssigkeit passieren kann; Entfernung der Feststoffe aus der Zellsuspension unter Bildung einer klaren, Aspartase-haltigen Lösung/ und Zugabe einer ausreichenden Menge eines Aspartase-stabilisierenden Salzes zur wässrigen Zellsuspension oder zur klaren, Aspartase-haltigen Lösung, um die genannte Lösung in bezug auf die mikrobiellen Zellen hypertonisch zu machen. Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird die wässrige Zellsuspension mit einer hypertonischen Lösung des Aspartase-stabilisierenden Salzes gebildet.

Das Verfahren ist einfach und effizient, und mehr als 80 % der Aspartaseaktivität der Zellen werden im allgemeinen in der zellfreien Aspartaselosung wiedergewonnen. Darüber hinaus wurde festgestellt, daß das Enzym seine Aktivität über eine längere Zeitdauer in einer derartigen Lösung beibehält. Die Lösungen können in ReakLoren vom Dialysetyp mit hohem Wirkungsgrad eingesetzt v/erden, wie dies vorstehend beschrieben wurde.

Das Enzym Aspartase wird von einer Vielzahl von Mikroorganismen produziert; die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Verwendung irgendwelcher spezieller Gattungen, Spezies oder Stamme limitiert. Zum Beispiel wurde beschrieben, daß Bakterien, wie Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeroginosa, Bacillus subtilus, Bacillus megatherium, Proteus vulgaris, Serratia marcescens, Escherichia coli und Aerobacter aerogenes für die Herstellung von Asparaginsäure geeignet sind. Ein spezieller Organismus, aus welchem Aspartase gewonnen wurde, stellt eine Glutamat-verwertende Mutante von E.coli (ATCC Nr. 31976) dar.

Als Ausgangsmaterial für Aspartase können Aspartase-produzierende Zellen auf einem Nährstoffmedium kultiviert werden, welches für die Produktion des Enzyms und das schnelle Wachstum der Zellen spezioll geeignet bzw. eingestellt ist. Verfahren zur Herstellung und Züchtung von Zellkultüren sind allgemein bekannt und sollen nicht Bestandteil der vorliegenden Erfindung sein. ""■■"--"

Im allgemeinen wird ein Nährstoffmedium, welches die essentiellen Minerale und Wachsturasfaktoren sowie assimilisierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, verwendet. Vorteilhafterweise enthält das Medium Fumarsäure; außerdem ist es vorteilhaft, wenn es einen Hefeextrakt als eine Quelle für Stickstoff, Vitamine und Wachstumsfaktoren, Ammoniumion als eine zusätzliche Stickstoffquelle und Calcium- und Magnesium' salze als essentielle Mineralien enthält. Phosphat- und Carbonatsalze von Kalium oder Natrium können als Puffer eingesetzt werden.

Dar; inokulierte Medium wird im allgemeinen unter Wachstumsbedingungen für eine ausreichende Zeitdauer fermentiert, um von ca. 2 bis ca. 6 g/l Feststoffe zu produzieren. 35

Im allgemeinen ist eine Fermentierung bei ca. 37⁰C über einen Zeitraum von 12 bis 14 h ausreichend, um die gewünschte Zellkonzentration zu produzieren.

Nach einer geeigneten Wachstumsperiode werden die Zellen vorteilhafterweise von dem extrazellulären Anteil des Fermentationsmediums getrennt (z.B. durch Zentrifugation oder Filtration) und gewaschen. Aspartase kann aus den Zellen freigesetzt werden durch Suspendieren derselben in einem wässrigen Medium und Inkubation unter Aspartase-freisetzenden Bedingungen. Das wässrige Suspensionsmediura kann Wasser oder eine wassi-ige Lösung darstellen, welche sich nicht nachteilig auf das Enzym auswirkt (wie z.B. allgemeine Puffer). Bevorzugte wässrige Suspensionsmedien sind hypertonische Lösungen von Aspartase-stabilisierenden Salzen (wie nachstehend besprochen); besonders bevorzugte Medien stellen hypertonische Lösungen eines löslichen Salzes von Fumarsäure oder Asparaginsäure dar. Ammoniumfumaratlösungen im Konzentrationsbereich von ca. 1,0 molar bis zur Sättigung, bevorzugt von ca. 1,4 molar, sind besonders vorteilhaft.

Die Zellen werden vorzugsweise in einem wässrigen Medium bei einer Konzentration von mindestens ca. 5 g/l (Trockenzellgewichtsbasis) und vorzugsweise von ca. 10 bis ca. 15 g/l suspendiert.

Die Zellsuspension wird im allgemeinen unter Aspartase-freisetzenden Bedingungen für ausreichende Zeit inkubiert, damit ein wesentlicher Anteil der intrazellulären Aspartase in die Fumaratlösung übergehen kann. Dabei wird im allgemeinen eine Inkubationstemperatur von ca. 2⁰C bis ca. 5O⁰C, vorzugsweise von ca. 25 ⁰C bis ca. 50 ⁰C angewandt. Eine besonders bevorzugte Inkubationstemperatur liegt bei ca. 37⁰C. Langsamere Enzymfreisetzungsgeschwindigkeiten und niedigere Enzym-

aktivitätcn sind assoziiert rait niedrigeren Inkubationstemperaturen, wohingegen höhere Inkubationstemperaturen das Enzym nachteilig beeinflussen können. Die Inkubationszeit ist in einem bestimmten Ausmaß von der Inkubationstemperatur abhängig; im allgemeinen beträgt sie mindestens ca. 10 min. Vorzugsweise wird eine Inkubationsdauer von mindestens 1 h, besonders bevorzugt von ca. 12 bis ca* 60 h angewandt.

Nach der Inkubation werden die Feststoffe aus der Zellsuspension entfernt, z.B. durch Zentrifugation oder Filtration, wobei eine klare (clarified) Aspartase-haltige Lösung gebildet wird. Es kann jedes beliebige Verfahren zum Klären angewandt werden, welches keine wesentlichen Verluste der Aspaiftaseaktivität ergibt. Die erhaltene Lösung enthält im allgemeinen 80 % der ursprünglich in den Zellen enthaltenen Aspartaseaktivität. Diese Lösungen sind relativ frei von unerwünschten Kontaminierungsstoffen; es wurde festgestellt, daß sie die gesamte Aspartaseaktivität bei 37⁰C für mehr als 4 0 Tage behalten.

Eine ciusreichende Menge eines Aspartase-stabilisierenden Salzes wird zu der klaren Lösung zugegeben, um diese Lösung hypertonisch zu machen. Nach einer bevorzugten Ausführungsform gemäß der Erfindung wird die Aspartase-stabilisierende Salzlösung als wässriges Zellsuspensionsmediurn verwendet; wenn nach diesem Verfahren gearbeitet wird, ist die Zugabe eines Aspartase-stabilisierenden Salzes zu der klaren Lösung im allgemeinen nicht erforderlich.

Es wurde festgestellt, daß das Aspartase-stabilisierende Salz das Enzym gegenüber einem Aktivitätsverlust für längere Zeit stabilisiert; eine Stabilisierung erfolgt auch gegenüber thermischem Abbau. Zum Beispiel zeigen Vergleiche der Aspartaseaktivität in Lösungen, die bei 65⁰C gelagert werden, daß das Puffer-extrahierte Enzym in der Tat nach 30 min

- 15 -

seine gesamte Aktivität verliert, wohingegen das. in 1,4 Ammoniumfumarat extrahierte Enzym mindestens 80 % seiner Stabilität nach 2 h Lagerung behält.

Die bevorzugten Aspartase-stabilisierenden Salze sind lösliche Salze von Pumar- oder Asparaginsäure. Soweit Fumarsäure das Enzymsubstrat für die Herstellung für Asparaginsäure darstellt, erfordert die Verwendung der Salze dieser Säuren im allgemeinen nicht die Abtrennung des Salzes von der Aspartase, Außerdem wurde festgestellt, daß solche Salze, insbesondere Ammoniumfumarat, besonders wirksam zur Extraktion und Stabilisierung des Enzyms sind. Obwohl Pumarat- und Aspartatsalze bevorzugt sind, soll betont werden, daß jedes beliebige Salz, das einen stabilisierenden Effekt auf das Enzym ausübt, verwendet werden kann. Derartige Salze können im allgemeinen durch die Formel MX dargestellt werden, wo in M ein Kation,wie Alkali oder Erdalkali, Ammonium, Niedrigalkylammonium, Niedrigalkyl-quaternäres Ammonium und dgl. darstellt und X ein Anion bedeutet, wie Halogenid, Nitrai:, Carbonat, Phosphat, Sulfat, Maleat, Fumarat, Aspartat und dgl. Die Konzentration des Aspartase-stabilisierenden Salzes in der geklärten Lösung liegt im allgemeinen im Bereich von ca. 0,5 molar bis zur Sättigung, vorzugsweise von ca. 1,0 molar bis ca. 1,4 molar.

Die Aspartase-Lösungen, die nach dieser Methode hergestellt worden sind, sind besonders für Reaktoren vom Dialysetyp geeignet, insbesondere für Hohlfaserreaktoren. Die zellfreie Lösung kann auf einfache Weise in das Gehäuse (shell side) eines solchen Reaktors eingeführt werden, nämlich durch Saugwirkung auf der Schlauchseite (tube side) des Reaktors. Nachdem das Enzym in den Reaktor eingeführt worden ist, kann eine Ammoniumfuiiiaratlösung durch die Schlauchseite des Reaktors zirkuliert werden. Das Ammoniumfuinaratt;ubstat und das Asparaginsaureprodukt passieren frei die Wände der Dialyse-

schläuche, und Asparaginsäure kann aus der zirkulierenden Lösung gewonnen werden. Andererseits kann das Enzym ÄSparfcase nicht die Wände der Schläuche passieren, so daß es effektiv in dem Reaktor zurückgehalten wird. Das Entfernen von dialysierbaren Verunreinigungen und Farbkörpern erfolgt bald nach dem Start der Reaktion, so daß diese nicht den. Produktstrom als Ganzes (bulk) kontaminieren.

Die Reaktionsbedingungen können je nach dem verwendeten Reaktortyp variiert werden. Im allgemeinen stellt das Substrat eine konzentrierte Lösung von Ammoniumfumarat dar, z.B. von 1 molar bis zur Sättigung, vorzugsweise von ca. 1,8 molar. Die Reaktionsmedien werden unter Asparaginsäureproduzierenden Bedingungen inkubiert. Der Reaktor wird vorteilhafterweise auf einer erhöhten Temperatur gehalten, um eine ausreichende Umwandlung des Substrates zu dem Produkt zu gewährleisten. Temperaturen von ca. 2°C bis ca. 70 ^bC, vorzugsweise von ca. 25°C bis ca. 50⁰C, und besonders bevorzugt von ca. 37⁰C, werden im allgemeinen angewendet. Die enzymatische Reaktion ist exotherm. Deshalb werden in großen Real;Loren oder in Reaktoren, in welchen niedere Fließge^- schwindigkeiten des Substrates angewendet werden, Mittel bzw. Vorrichtungen zur Entfernung überschüssiger Wärme eingesetzt. Die gewünschte Fließgeschwindigkeit der Substratlösung durch den Reaktor ist abhängig von dem jeweils angewendeten Reaktor, der Konzentration des Substrates, der Konfiguration des Enzyms (z.B. zirkulierende oder einmalige Passage), dem Niveau der Enzymbeladung und der gewünschten Rate der Wärmeabführung. Das I-Ioh3.faserreaktorsystem kann in einem rezirkulierenden Chargenbetrieb betrieben werden, bei welchem der Auslaßstrom aus dem Reaktor in ein Reservoir zurückkehrt. Die Zirkulation der Substratlösung wird fortgeführt bis ein größerer Anteil des Ammoniumfumarats zu Asparaginsäure umgewandelt worden ist. Alternative Reaktionsweisen umfassen

Systeme des einmaligen Passierens (single pass systems), bei welchen eine Mehrzahl von Reaktoren in Reihe betrieben werden können.

Es wurde festgestellt, daß die vorliegende Erfindung ein einfaches und effizientes Verfahren zur Gewinnung von Aspartase aus Aspartase-produzierenden Zellen zur Verfügung stellt. Die erhaltene zellfreie Aspartaselösung kann im Chargenbetrieb oder in immobilisierter Form verwendet werden und ist insbesondere geeignet für Reaktoren vom Hohldialysetyp.

Die zellfreien Aspartaselösungen gemäß der Erfindung besitzen mehrere Vorteile überüber ganzen Zellen in Reaktoren vom Dialysetyp_T Um eine hohe Enzymaktivität mit ganzen Zellen zu erhal-'ten, müssen die Zellen im allgemeinen in konzentrierter Form vorliegen. Konzentrierte Zellmedien sind sehr dicht und viskos, was mindestens zu zwei Problemen führt, die bei dem zellfreien System gemäß der Erfindung abgeschwächt sind.

Zu diesen Problemen-gehört erstens, daß Verunreinigungen und Farbkörper aus dem Zellschlamm durch die Dialysemembran in den Produktstrom wandern. Während dies im Falle der zellfreien Lösungen nur über eine kurze Zeitdauer im Anfangsstadium der Reaktion auftritt, besteht bei ganzen Zellen die Tendenz, daß Verunreinigungen und Farbkörper über einen ausgedehnten Zeitraum ausgewaschen werden und in den Produktstrom gelangen. Ein zweiter Vorteil des zellfreien Systems betrifft die Diffusionsprobleme in Kombination mit den Ganzzellcnsystemen. Es wird angenommen, daß Aspartaae ein intrazelluläres Enzym darstellt; aus diesem Grunde müssen die Reaktanten und Produkte nicht nur durch die Reaktomiembran diffundieren, sondern auch durch die extrazelluläre Flüssigkeit und die zellulären Bestandteile. Demzufolge werden weniger effiziente Umwandlungsraten mit derartigen Ganzzellensystemen beobachtet. So wurde z.B. gezeigt, daß mit ungefähr der gleichen Enzymaktivität ein zellfreies llohlfaserreaktorsystem eine ca, 4 5 % größere Umwandlungsrate besitzt, als

- 18 dies bei dem Ganzzellensystem beobachtet wird.

Die Erfindung wird im weiteren durch die folgenden Beispiele erläutert, die den Umfang derselben nicht beschränken sollen.

Beispiel I

Es wurden verschiedene Experimente durchgeführt, in welchen die Nährstoffmedien, die verschiedene Mengen an Hefeextrakt enthielten, unter Bildung von Aspartase fermentiert würden. Jedes Fermentationsmedium enthielt pro 1: 24-60 g Hefeextrakt,, 30 g Fumarsäure, 2 g dibasisches Kaliumphosphat, 0,5 g Natriumcarbonat, 2 mM Magnesiumsulfat und 0,1 mM Calciumchlorid und der pH-Wert wurde mit Ammoniumhydroxid auf ca.

7,2 eingestellt. Jedes Medium wurde mit 1 ml einer Kultur von E_._cali (ATCC Nr. 31976), die 12 - 16 h bei 37°C in einem Peptonmedium, welches 0,5 % Mononatriumgluatamat enthielt, inkubiert worden war, inokuliert. Jedes inokulierte Medium wurde bei 37⁰C 12 - 14 h lang inkubiert,und zu dieser. Zeit wurden die Zellen geerntet. Das Trockenzellgewicht betrug bei der Ernte ca. 2-7 g/l, je nach der Menge des verwendeten Hefeextraktes. Die Produktionsrate Aspartase ist in Tabelle I für jedes Fermentationsmedium gezeigt.

Es wurde eine zweite Gruppe von Experimenten durchgeführt, in welchen die Fermentationsmedien, die verschiedene Konzentrationen an Ammoniumfumarat enthielten, wie vorstehend hergestellt und fermentiert wurden. Jedes dieser Medien enthielt 8 % Hefeextrakt und die gleichen Konzentrationen der anderen Bestandteile, wie dies vorstehend beschrieben ist. Die Ergebnisse diener Experimente sind in Tabelle II zusammengestellt. Die Zollkultur, die aus dem Fermentationsmedium hergestellt wurde, welches 2,4 w/v% Hefeextrakt

und 3,0 % Ammoniumfumarat enthielt, wurde zentrifugiert, die Flüssigkeit dekantiert und verworfen. Die Zellen wurden dann mit Wasser gewaschen, wiederum zentrifugiert, dekantiert und in 0,05 Tris.HCl-Puffer, pH 8,5, auf 1/20 des ursprünglichen Volumens resuspendiert. Dieser Schlamm wurde dann mit 1,8 M Ammoniumfumaratlosung, pH 8,5, verdünnt, um eine Zellsuspension mit 1/5 des ursprünglichen Fermentationsvolumens herzustellen. Die erhaltene Suspension wurde in 6 Portionen aufgeteilt, die bei 37⁰C für Zeitspannen, die in Tabelle III aufgeführt sind, inkubiert und dann zentrifugiert wurden. Die überstände wurden dekantiert und die Feststoffe verworfen. Die überstände wurden auf Aspartaseaktivität analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.

Beispiel II

Eine zellfreie Aspartaselösung aus 12,5 g (Trockengewicht) Zellen, hergestellt in Übereinstimmung mit dem Beispiel I {2,4 % Hefeextrakt, 3 % Ammoniumfumarat) wurde in die Gehäuseseite (shell side) der Cordis-Dow-künstlichen Niere (CDAK 2.5D) unter Saugwirkung auf der Schlauchseite der künstlichen Niere eingefüllt. Nachdem das Enzym in den Reaktor eingebracht worden war, wurde die Gehäuseseite versiegelt und eine 1,8 M Ammoniumfumaratlosung, pH 8,5, durch die Schlauchseite des Reaktors mit der Fließgeschwindigkeit von ca. 11-15 l/h geführt. Es wurde eine rezirkulierendö Arbeitsweise angewandt, in welcher die Substratlösung durch den Reaktor aus einem Reservoir rezirkuliert wurde. Der Reaktor wurde auf einer Temperatur von 37°C gehalten.

Der Reservoirinhalt wurde periodisch auf restliches Fumarat analysiert. Die Ergebnisse der Analysen sind in Tabelle IV aufgeführt. Die Asparaginsäure wurde bei pH 2,8 durch Zugabe von H2SO4 gefällt, filtriert, gewaschen und getrocknet. Aus durchschnittlich 2,1 kg Fumarsäure, wurden 2,0-2,1 kg Asparagin-

säure gewonnen (8 3-86 % theoretische Ausbeute). Die auf diese Weise hergestellte Asparaginsäure wurde durch Eleriientaranalyse auf C, H, N und O charakterisiert; diese Werte waren zu 97-99% in Übereinstiinmung mit den theoretischen Werten. Die spezifische Rotation des Produktes wurde

25°

gemessen und wies folgenden Wert auf: [α] = +26 (C = in 2 N HCl). Das Produkt wurde mit Hilfe eines diagnostischen gekoppelten Enzymessays analysiert und war zu 96 % in Übereinstimmung mit einem authentischen Asparaginsäurestandard.

Tabelle I

Wirkung der Hefeextraktkonzentration im Fermentationsmedium (welches 3 % Ammoniumfumarat enthielt) auf die '- ' volumetrische Aspartaseaktivität der Kulturlösung (broth)

w/v

i Hefeextrakt	Aspartase raMol/ h-ral Kulturlösung
1,0	0,22
1,8	0,64
2,7	0,90
3,0 -	1 ,20
4,0	1 ,50
5,0	1 ,76
6,0	2,1 4
7,0	2,26
8,0	2,24

- 21 Tabelle II

Wirkung der Ammoniumfumaaratkonzcntration im Fermontationr;-medium (welches 8 % Ilefcextrakt enthielt) auf die volumotri-05 sehe Aspartaseaktivität der Kulturlösung

w/v % Fumarsäure	0	Tabelle III	Aspartase
	,0	mMol / h-ml
	,0	1,00
2	,0	2,50
4		2,52
6		0,48

Extraktion von Aspartase aus Zellen mit 1,4 M Ammoniumfurnarat

Zeit (h) % extrahierte Aktivität

0 —·—

4 70 %

7 73 %

14 79 %

25 24 80 %

48 84 %

Tabelle IV

Hohlfaserreaktor (CDAK 2,5D) beladen mit zellfreiem Enzym (extrahiert aus ca.12,5 g Zeil,Trockengewicht); verwendet bei rezirkulierender Chargenarbeitsweise mit einem gerührten 10 1-Reservoir von 1,8 M Ammoniumflamarat. Die Proben warden aus dem Reservoir entfern! und auf das verbleibende Fumarat analysiert:

TO Zeit verbleibendes Pumarat

0,0 1,81

0,25 1,63

0,5 · 1,52

1,0 1,30

1,5 1,12 2,0 ' 0,98

2,5 0,82

3,0 0,70

3,5 0,58

4,0 0,48 '

5,0 0,32

6,0 0,21

7,0 0,14

Claims

rATENTANMVÄI/J'E DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) · Dl PL.-I N (5. W. EITLE . DR. R ER. ΝΛΤ. K. HOFFMAN N ■ Dl PL..I NG. W. LEH N DIPL.-ING. K. FOCHSLE · DR. RER. NAT. D. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 . U-8000 M U NCH EN 81 . TELEFON (0B9) 911087 . TELEX 05-2^619 (PATHE) 37 191 m/hl Genex Corporation, Rockville, Maryland / USA Verfahren zur Herstellung von Äspartase und Verwendung derselben zur Produktion von Asparaginsäure Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung einer wässrigen, im wesenblichen zellfreien Lösung von Äspartase, dadurch gekennzeichnet , daß man eine wässrige Zellsuspension von Aspartase-haltigen mikrobiellen Zellen herstellt; die wässrige Zellsuspension unter Aspartase-freisetzenden Bedingungen so lange inkubiert, daß ein wesentlicher Anteil der intrazellulären Äspartase in die extrazelluläre Flüssigkeit übergeht; die Feststoffe aus der Zellsus-pension entfernt unter Bildung einer klaren, Aspartasehaltigen Lösung, und zu der genannten Zellsuspension oder gu der genannten klaren Aspartase-haltigen Lösung eine ausreichends Menge eines Aspöirtase-stabilisierenden Salaos zugibt, ^um die genannte klare Aspartase-haltige Lösung in bezug auf die mikrobiellen Zellen hypertonisch zu machen.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die genannte wässrige ZeHsuspension hergestellt wird durch Suspendieren der mikrobiellcn Zellen in einer hypertonischen Lösung des genannten Aspartase-stabilisierenden Salzes.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß als Aspartase-stabilisierendes Salz ein wasserlösliches Salz von Fumarsäure oder Asparaginsäure verwendet wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch g e k e η η zeichnet, daß als das genannte Aspartase-stabilisierendo Salz ein Ammoniumfumarat oder Ammoniumaspartat verwendet wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß als Aspartase-stabilisierendes Salz Ammoniumfumarat verwendet wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß die Konzentration von Ammoniumfumarat in der hypertonischen Ammoniumfumaratlösung von ca. 0,5 molar bis Sättigung beträgt.

.

7. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß die Konzentration von Ammoniumfumarat in der hypertonischen /unmoniiimfumaratlösung von ca. 1,0 bis ca. 1,4 molar beträgt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß die Bedingungen, unter denen Aspartase (rück)gewonnen wird, eine Inkubationstemperatur von ca. 2°C bis ca. 70⁰C umfassen,und >die ZeIl-

- 3 - ·
suspension mindestens 10 min lang inkubiert wird.

9. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß die Bedingungen/unter denen Aspartase (rück)gewonnen wird, eine Inkubationstemperatur von ca. 25⁰C bis ca. 50⁰C umfassen, und die Zellsuspension ca. 12 bis ca. 60 h inkubiert wird.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch g e k e η η zeichnet, daß die Inkubationsternperatur 37⁰C beträgt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß die Bakterienzellen in ausreichen- der hypertonischer Ammoniumfumaratlösung suspendiert werden, um eine Zellkonzentration von mindestens 5 g/l auf der Basis des Trockenzellgewichtes zu schaffen, und die Bedingungen, unter denen Aspartase (rück)gewonnen wird, im v/eiteren einen pH-Wert von ca. 7 bis ca. 9 einschließen.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterienzellen in ausreichend hypertonischer Ammoniumfumaratlösung suspendiert wer-

IS den, um eine Zellkonzentration von ca. 10 g/l bis ca.

15 g/l auf der Basis des Trockenzellgewichtes zu schaffen, und der pH-Wert von ca. 8 bis ca. 9 beträgt.

13. Verfahren gemäß Anspruch 1, 5, 6, 7, 9 oder 12, dadurch !0 gekennzeichnet, daß die Bakterienzellen ausgewählt werden aus der Gruppe der Aspartase-produzierenden Stämme von Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeroginosa, Bacillus subtilis. Bacillus megatherium, Proteus vulgaris, Serratia marcascens, Escherichia coli und Acrobacter aerogenes.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß die Bakterienzellen B. coli darstellen.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch g e kennzeichnet , daß die Bakterienzellen E. coli Stamm ATCC 31976 darstellen.

16. Eine wässrige, im wesentlichen zellfreie Lösung Von Aspartase., welche gemäß dem Verfahren von Anspruch 1 hergestellt wird.

17. Eine wässrige, im wesentlichen zellfreie Lösung von Aspartase, welche nach dem Verfahren gemäß Anspruch 11 hergestellt wird.

18. Eine wässrige, im wesentlichen zellfreie Lösung von Aspartase, welche nach dem Verfahren gemäß Anspruch 13 hergestellt wird.

19. Verfahren zur Herstellung von Asparaginsäure in einem Reaktor, welcher aus einer ersten Kammer und einer zweiten Kammer und einer semipermeabler Membran besteht, welche die erste Kammer von der zweiten Kammer trennt, wobei die semipermeable Membran für Aspartat und Fumarat durchlässig, aber für Aspartase undurchlässig ist, dadurch gekennzeichnet , daß man die wässrige, im wesentlichen zellfreie Aspartaselösung gemäß Anspruch 16 oder 17 in die erste Kammer in Flüs-0 sigkoitskomrnunikation mit der genannten semipermeablen Membran gibt und eine Lösung, welche Arnmoniumfumarat umfaßt, in die genannte zweite Kammer in Flüssigkeits-Kommunikation mit der genannten semipermeablen Membran plaziert; die genannten Lösungen unter Asparaginsäure-

produzierenden Bedingungen inkubiert, und die Asparaginsäure aus der Lösung in der genannten zweiten Kammer gewinnt.

20. Verfahren gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , daß der genannte Reaktor ein verschließbares Gehäuse umfaßt, welches Einrichtungen zum Füllen des genannten Gehäuses mit einer Flüssigkeit besitzt, und eine Mehrzahl von hohlen, semipermeablen Membranfasern, welche durch das genannte Gehäuse führen, so daß das Lumen der genannten Fasern vom Inneren des genannten Gehäuses versiegelt ist, und jede Faser ein Einlaßende besitzt, welches sich in einen Einlaßverteiler öffnet, der einen Schlaucheinlaßstutzen besitzt, und am Auslaßende, welches sich in einen Auslaßverteiler öffnet, der einen Schlauchauslaßstutzen besitzt, wobei die genannte wässrige, im wesentlichen zellfreie Aspartaselösung in das genannte Gehäuse gegeben wird, und das genannte Ammoniurnfumarat durch die hohlen semipermeablen Membranfilter geführt wird, und die Asparaginsäure aus der genannten Ammoniumfumaratlösung gewonnen wird.

21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration von Ammoniumfumarat in der Ammoniumfumaratlösung von ca. 1 molar bis Sättigung beträgt.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß eine im wesentlichen gesättigte Ammoniumfumaratlösung verwendet wird.

23,- Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet , daß die Asparciginsäure-produzierenden Bedingungen eine Inkubationstemperatur von ca. 2⁰C bis Ϊ5

ca. 70°C umfassen.

24. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet , daß die Asparaginsäure-produzieren- den Bedingungen eine Inkubationstemperatur von ca* 25°C bis ca. 50⁰C umfassen.

25. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet , daß der Reaktor in rezirkulierender, chargenraäßiger Arbeitsweise betrieben wird, wobei die Ammoniumfumaratlösung aus einem Reservoir durch den Reaktor recyclisiert wird bis eine wesentliche Menge an Ammoniumfumarat zu Asparaginsäure umgewandelt ist.