DE1955956A1

DE1955956A1 - Verfahren zur Enzymgewinnung

Info

Publication number: DE1955956A1
Application number: DE19691955956
Authority: DE
Inventors: Louis Chaiet; Kempf August John
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1968-11-07
Filing date: 1969-11-06
Publication date: 1970-05-21
Also published as: NL6915951A; FR2022748A1; BR6913695D0; US3652401A; CH547827A; GB1253606A

Description

Verfahren zur Evizymgewinnung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung des ale Dextranase "bekannten Enzyms, insbesondere im gereinigten Zustand .

Dextranase hat sich als zur Applikation bei Zahn und Zahnfleisch zwecks Verhinderung der Zahnbelagbildung und auch Herbeiführung der Zahnbelagentfernung von hohem Wert erwiesen. Einen Bericht über dieses Wirkungsvermögen enthält ein Aufsatz von R. J. Fitzgerald u.a., "The Effects of a Dextranase Preparation on Plaque and Caries in Hamsters, a Preliminary Report", J. Am. Dental Assn., 7j6, Nr. 2, S. 301 - 304, Februar 1968. Man hat dementsprechend vorgeschlagen, Dextranase z. B. herkömmlichen Zahnpulvern und -pasten und Mundwässern zuzusetzen, um eine Wirkung sowohl als Prophylaktikum als auch als Therapeutikum gegen Zahnbelag und schliesslich Karies zu erhalten.

Die beste heutige Dextranasequelle stellt die Bildung durch.

In einem künstlichen Kulturmedium waohsende Bakterien und Pilae dar. Die Dextranase wird in Form eines extrazellularen Pro-

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duictee hervorgebracht und muee dementsprechend von den Bestandteilen des Kulturmediums, von den anderen, in dem Kulturmedium auf Grund des Waohetumsprozesses erzeugten Substanzen und von den Zellen selbst abgetrennt werden. Sa die Dextranase-Bildung in ziemlioh geringen Mengen erfolgt, erfordert ihre Gewinnung in gereinigter Form eine sorgfältige Abtrennung von den Verunreinigungen in dem Kulturmedium.

Bas Züohten des gewählten, dextranasebildenden Organismus in einem ausgewählten, künstlichen Kulturmedium ist vertraut, Bas Penloilllum funioulosum stellt, da es eine verhältnismässig hohe Bextranase-Ausbeute ergibt, einen gutgeeigneten Organismus dar, aber man kann auch mit anderen bekannten Organismen arbeiten. Ein gutgeeignetes Kulturmedium 1st in Tabelle I eines Aufsatzes von R. E. Shope, "An Antiviral Substance from Penioillium Puniculoeum", J. Exp. Med. <J2, S. 601, 1966, beschrieben. Auch das von U. J. Lewis u.a., J. Am. Ohem. Soc, 82, S. 5178 (1960), beschriebene Kulturmedium ist verwendbar, und man kann auch mit weiteren, bekannten Kulturmedien arbeiten.

Bas wesentliche Merkmal der Erfindung liegt in der Erkenntnis, dass Eisen(III)-salze, wie Eisen(III)-chlorid, mit Dextranase in einem eingestellten pH-\iert-Bereich selektiv einen wasserunlöslichen Komplex bilden. Zur Durchführung der Erfindung gibt man z. B. :3ieen(III)-chlorId zu wässrigen, Dextranase und Verunreinigungen enthaltenden Präparaten hinzu, so dass der sich bildende £isen(III)-BextranaBe-Komplex ausfüllt und auf diese Weise dessen Abtrennung und Gewinnung erleichtert wird. Dieser Prozess erfreut sioh einer solchen Selektivität, dass Dextranase der Komplexbildung beim Vorliegen in einer derart geringem Menge wie etwa 1 MitoOgramm/ml Lösung beim Zusatz einer derart geringen Menge εη Eifen(IIl)-Ion wie 0,7 mg/ml Lösung unterliegt.

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Dae Eisen(III)-Ion geht die Komplexbildung mit der Dextranase in rohen wie auch partiell gereinigten Suspensionen ein« und zwar am wirksamsten bei pH 5, wenngleich auch ein pH-Bereich von 4,5 bis 5,5 zufriedenstellt. Unterhalb pH 4»5 geht das Eisen(III)-Ion bevorzugt eine Komplexbildung mit anderen Proteinen) die neben der Dextranase vorliegen können, ein, was die Durchführung einer Eisen-Vorbehandlungestufe zur Erzielung einer relativ gereinigten Dextranase ermöglicht.

Die Eisen-Komplexbildungebehandlung kann z. B. direkt an der Fermentationsbrtlhe zwecks Fällung der Dextranase erfolgen, wobei somit verschiedene Verunreinigungen in Lösung verbleiben. Man gibt hierzu das Eisen(III)-Chlorid zu der Fermentationsbrühe hinzu und stellt dann auf einen pH-Wert von etwa 3,0 ein. Unterhalb pH 3 ist die Dextranase etwas instabil. Der.Eiβen-(III)-Protein-Komplex läsnt sich leicht durch Abfiltrieren, Schleudern oder sogar Dekantieren entfernen, und die verbleibende Lösung zeigt eine uur noch geringe Dextranaeeaktivität.

Der Eisen(III)-Dextranaea-Komplex wird» wie oben erwähnt, am besten bei einem pH-Wert von 4,5 bis 5,5 gebildet (ausgenommen bei Ferment at ions brilhe, bei der man bei pH 3 arbeitet), wobei man dies an der Lösung durchführen kann, die nach der obenerwähnten Eisenvorbehand]ung verbleibt, oder an anderer, partiell gereinigter, aus dnr Fermentationsbrühe gewonnener Dextranaselösung. Ein solch)β anderes, partiell gereinigtes Präparat kann z. -B. von dem Gut gebildet werden, dass man durch die bekannte Anwendung cdner vorläufigen Konzentrierung oder Ammoniumsulfatfällung boi der FermentationsbrUhe erhält.

Der Eleen-Dextranase-Komplex lässt sich leioht durch Filtrieren, Schleudern oder Dekan ti ei en gewinnen, und zur Freisetzung der Dextranase aus dem Komplet versetzt man mit einer im wesentlichen neutralen Elektrolytlösung. Am besten arbeitet man hierzu mit einem Phosphatpuffer -von etwa pH 7 und entfernt dieses Salz

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dann aus der hoohgereinigten Dextranase durch Dialyse oder Gelfiltration. Zur Gelfiltration eignet sich z. B. als Entsalzungsoitttl ein Körper aus einer Reihe poröser Polyacrylamidgele eng gelenkter Porengrössen, wie Bio Gel P-6. Das anfallende, Falzfreie Produkt etellt hoohreine Dextranase dar.

Die Derftranase-Wert be Stimmung in den folgenden, der weiteren Erläuterung der Erfindung dienenden Beispielen beruht auf der Hydrolyse eines linearen Dextrans und Ausfällung des nichthydrtflysierten Dextrans mit Alkohol. Ein Vorliegen von 43 EinUeiten/mg Trockenfestetoff zeigt reine Dextranase an. Dextranase hat ein UV-Maximum bei 280 mn (Millimikron) und ein UV-Minimua bei 250 nm; E₁^ bei 280 mn etwa 20. Der UV-Wert bei 280 nm ist ein Anzeichen für die Gewichtsmenge an Protein in LfJiung; die Dextranasehydroly se einheit en je Einheit der optischen Dichte stellen ein Anzeichen für die Reinheit einer Probe dar (reine Dextranase entspricht 21 500 Einheiten/Einheit der optischen Dichte).

Beispiel 1 Eieenvorbehandlung

5 1 Dextranase-Isolat mit einem Gehalt an 80 000 Dextranase-Einheiten/ml und einer Aktivität von 3800 Einheiten/mg Trockenfeetstoff wurden mit 90 ml Eisen(III)-chlorid-IÖsung (10,6 g FeCl«/280 nl V'asser) behandelt. Per auf 3,3 fallende pHrWert wurde alt Alkali auf 4,4 eingestellt. Die Aufschlämmung wurde geschleudert; das beim Schleudere, erhaltene Gut (A) enthielt die gesamte Dextranase, wobei aber der Peststoffgehalt unter Ausbildung einer Aktivität von 8600 Einheiten/mg Feststoff entsprechend einem Faktor von etva 0,44 absank.

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Beispiel 2 Eisenfällmethode

200 ml Eisenfiltrat (A) von Beispiel 1 mit 5000 Dextranase-Einheiten/Einheit der optischen Dichte wurden mit 8 ml der obigen Eisen(III)-chlorid-Lö8ung behandelt, auf pH 5 eingestellt und filtriert. Das Filtrag (B) enthielt 57 # der Ausgangsdextranase bei einer Aktivität von 8000 Einheiten/Einheit der optischen Dichte. Beim Aufschlämmen der EiBenausfällung in 25 ml Wasser bei pH 7 wurde nur 1 $> Dextranase in lösliche Form übergeführt, beim Zusatz von 3 ml 1mol. Phosphatpuffer von pH 7 jedoch 20 fi.

Das Piltrat (B) wurde mit weiteren 6 ml Eieen(III)-ohloridlÖBung versetzt, auf einen pH-Endwert von 5 eingestellt und filtriert. Das Filtrat (0) enthielt nur 3 # der ursprünglichen Dextranase. Die Eisenaus fällung wurde mit 25 ml Waeser zuatiglich 3,5 ml tmol. Phosphatpuffer von pH 7 behandelt und geschleudert, wobei eine klare Lösung mit einem Gehalt an 4 Hillionen Einheiten bei einer Aktivität von 15 800 Dextranase-Einheiten/Einheit der optischen Dichte anfiel. Durch Entealeen der Lösung Über Bio-Gel P-10 wurde eine Lösung mit eines Gehalt an 35 000 Dextranase-Einheiten/mg Trookenfeststoff erhalten.

Beispiel 3 Eisenvorbehandlung, Eisenfällung

2 1 Dextranase-Isolat (Ansatz Hr. 2; P-6-Effluat) mit einen Gehalt an 187 χ 10 Dextranase-Einheiten (Reinheitsgrad I84.O Dextranase-Einheiten/Einheit der optischem Dichte) wurden auf pH 7 eingestellt und mit 60 ml Eisen(III)-ohlorid-Lösung auf einen pH-\fert von 3_f4 vereetat, worauf die Auefällung abfil-

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triert und mit Wasser unter Erzielung eines Filtrate (A) gewaschen wurde, das HO χ 10 Einheiten (Reinheitsgrad 2670 Einheiten/Einheit der optischen Dichte) enthielt.

Das Piltrat A wurde "bei einem pH-V/ert zwischen 7 und 4 unter Erzielung eines pH-Endwertes von 5 mit 60 ml Eisen(III)-chlorid· Lösung versetzt und die Aufschlämmung filtriert. Dae Filtrat (B) enthielt 136 χ 10⁶ Einheiten (Reinheitsgrad 9700 Einheiten/Einheit der optischen Dichte).

Das Filtrat ß wurde mit weiteren 60 ml Elsen(III)-chlorid« lösung bei einem pH-Endwert von 5 versetzt und filtriert. Das Filtrat (0) enthielt nur 1,4 χ 10 Einheiten. Die letzte Eisenfällung wurde dreimal mit 100 ml 0,2mol. Phoephatpuffer von pH 7 extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und auf 30 ml eingedampft, und das Konzentrat wurde über eine 250-ml-Bio-Gel-P-10-Säule entsalzt. Die salzfreien, hochaktiven Fraktionen enthielten 32 χ 10 Dextranase-Einheiten (Aktivität 14 000 Einheiten/Einheit der optischen Dichte; 30 000 Einheiten/mg Feststoff).

Beispiel 4

Auswirkung des pH-Wertes auf die Eisenkomplexbildung von Dextranase in Fermentationsbiühe

5 ml Fermentations brühe Hr. PP 16 359 und 16 360 (Werfcbestimmungi 640 Einheiten/ml) wurden jeweils in 6 Schleuderröhrchen mit 0,2 mT. Eisen(III)-ohlor?.d-Lösung (Gehalt an Eisen(III)-Ion 2,2 m,;) eingegeben, die pH-Werte der Röhrchen auf 3, 4, 5, 6, 7 bzw. 8 eingestellt und die Röhrohen 1/2 Std. geschüttelt und geschleudert, worauf die klare Flüssigkeit bewertet wurde und die Ausfälligen in 5 al 0,2mol. Phosphatpuffer von pH 7 auffeuoMMfft und ebenfalls bewertet wurden ι

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pH-Wert	Gut	Einteiten/ml	Ausbeute, #
3	Ausfällung Piltrat	450 23	70 4
4	Auefällung Filtrat	363 175	57 27
5	Ausfällung Piltrat	245 Σ 38	38 37
6	Ausfällung Piltrat	73 363	11 57
7	Ausfällung Piltrat	23 369	4 57
8	Ausfällung Piltrat	30 338	5 53

In zwei Schleuderröhrohen wurden zwei 5-ml-Anteile Fermentations brühe eingegeben, eine halbe Stunde mit 0,2 ml Eisenlösung bei pH 3 behandelt und geechleudert. Die eine Ausfällung wurde in 5 al 2mol. Phosphatpuffer und die ssweite in 5 al Wasser aufgenommen. Beide Aufsohlämmungen wurden gesohleudert, worauf die klare Flüssigkeit bewertet wurdet

Ausbeute, i»

Aufnahme in	Einleiten
Phosphatpuffer von pH 7 Wasser (pH 7)	519 450
Beispiel 5

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Auswirkung von Sale auf die Eiserkomplexbildung von Dextranase

Ein 10-ml-Anteil gereinigter, sal»freier Dextranaselusung mit einer Konzentration von 17 800 Einheiten/ml (UV bei 280 na β 1,83) wurde mit 1 ml Eisen(III)-chlorid-IÖBung (11 ag Eisen-(III)-Ion/ml) behandelt und auf pH 5 eingestellt, 15 Min. gerührt und geschleudert. Drei weitere 10-ml-Anteile wurden mit der Abänderung in identischer Weise behandelt, dass vor der

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ORIGINAL INSPECTED

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Eisenbehandlung 110, 330 bzw. 990 mg Natriumchlorid zugesetzt wurden.

Die Filtrate aller obigen Behandlungen wurden der Wertbestimmung unterworfen und auf ihr UV untersucht. Ergebnisse?

Versuch HaOl-Zusatz, mg (#) Filtratbewertung, UV des FiI- Einheiten/ml träte0 bei

280 nm, Einheit der optieohen Diohte

1 0 (0 %) 960 0,12

2 110 (1 90 5200 0,28

3 330 (3 #) 8800 0,44

4 990 (9 #) 6500 0,45

Beispiel 6

Auswirkung des pH-Werte8 auf die Eisenkomplexbildung von Dextranase

Eine gereinigte, salzfreie Lösung von Dextranase (26 ml) mit einem Gehalt an 20 000 Einheiten/ml wurde mit 0,6 ml Eisen-(III)-chlorid~i/isung (11 ng Eiset.(III)-Ion/ml) behandelt und der pH-Wert auf 7 eingestellt. Die Mleohung wurde mit ROl auf einen pH-Wert ^on 6, 5, 4 bzw. 3 eingestellt, und aliquote Anteile wurden bei den verschiedenen pH-Werten geschleudert. Ergebnissei

pH-Yert Dextranase im Piltrat, Einheittn/iil

7	11	700
«;	6	700
<>	1	180
4		300
5	7	900
		- β -
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ORIGINAL INSFSCTED

Claims

Patentansprtiohe

M. Verfahren zur Gewinnung gereinigter Dextranase aus einer Rohlösung, dadurch gekennzeichnet, dass man duroh Zusatz von Eisen(III)-Ion eine Ausfällung mit der Dextranase bildet, die Ausfällung gewinnt und die Dextranase aus ihr duroh Zueatz einer im wesentlichen neutralen Elektrolytlösung freisetzt und die freigesetzte Dextranase dann entsalzt oder dass man zur Reinigung Dextranase in der Lösung durch Zusatz von Eisen(III)-Zon Verunreinigungen einer selektiven Eomplexbildung unterwirft* ' d
2. Verfahren nach Anspruoh 1, daduroh gekennzeichnet, dass man bei der ersten Arbeitsweise dem Eisen(III)-Ion-Zusatz eine Ferment at ions brühe unterwirft» in welcher die Dextranase duroh Mikroorganismen hervorgebracht worden 1st, und den pH-Wert auf etwa 3,0 einstellt«
3. Verfahren nach Anspruoh 1, dttdurch gekennzeichnet, dass man bei der ersten Arbeitswej.se dem Ei sen (XIX)-Ion-Zusatz eine partiell gereinigte Dex1;ranaselösung unterwirft und den pH-Wert auf 4,5 bis 5,5 einstellt.
4. Verfahren naoh Anspruoh 1, cUtdureh gekennzeichnet, dass man ( bei der ersten Arbeitsweise clie Dextranase aus der Aus» fällung mit einem im vesentliehen neutralen Phosphatpuffer freisetzt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, ditduroh gekennsselohnet, dass man bei der ersten Arbeitsweise flie Entsalzung Mit einem Körper aus einer Reihe vm poröuen Polyaorylamidgelen bewirkt·
6. Verfahren nach Anspruoh 1, ditduroh gekennzeichnet, dais man bei der «weiten Arbeitsweise da· Elsen(IXX)«lon «usetit und dtn pH-Wert auf #tim 3,0 bis 4,4 βinsttilt.

* *^} " - BAD ORIGINAL

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