DE1292609B

DE1292609B - Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Lipoproteinlipase durch Zuechten von Mikroorganismen

Info

Publication number: DE1292609B
Application number: DEA49781A
Authority: DE
Inventors: Tamura Gakuzo; Arima Kei; Saiki Takashi; Narasaki Teiiti; Nakamura Yoshio
Original assignee: Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1964-07-18
Filing date: 1965-07-19
Publication date: 1969-04-17
Also published as: US3431175A; CH476840A; BE666986A; GB1117474A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Lipoproteinlipase durch Züchten von Mikroorganismen.
Die Lipoproteinlipase ist eine spezielle Glycerinesterhydrolase und hydrolysiert Triglyceride von Lipoproteinen, wie Chlomicron oder anderen Lipoproteinen, mit geringer Dichte. Wie von A n f i n s e n festgestellt wurde, findet sich die Lipoproteinlipase nach einer venösen Heparininjektion als lipämieentfernender Faktor im Blutplasma.
Es ist ebenfalls bekannt, daß die Lipoproteinlipase in verschiedenen tierischen Geweben auftritt und daß sie eine wichtige Rolle im Lipoidstoffwechsel von Tieren spielt.
Die Lipoproteinlipase wurde jedoch noch- nicht in höheren oder niederen Pflanzen- bzw. Organismen aufgefunden, weshalb man. annahm; daß sie ein, Enzym darstellt, das nur bei Tieren voikommt. Weiterhin gibt es noch keine guten Verfahren zur Reinigung von Lipoproteinlipase, und auch ihre chemischen Eigenschaften sind noch nicht festgestellt.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Lipoproteinlipase mit hoher Aktivität unter Verwendung von Mikroorganismen zu schaffen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man Pseudomonas sp. (M-12-33) IAM 18002 oder Pseudomonas sp. (M-4-32) IAM 18001 in einemwäßrigen Nährmedium züchtet, und aus der Fermentationsfiüssigkeit die Lipoproteinlipase in an sich bekannter Weise abtrennt und reinigt.
Kulturen der- verwendeten lebenden Organismen wurden bei dem Institut of Applied Microbiology der Universität von Tokyo. (IAM) mit.- deti angegebenen Hinterlegungsnummern hinterlegt.- =--- --Die erhaltene Lipoproteinlipase wird mittels der zur Abtrennung und Reinigung von Enzymen bekannter Methoden, wie fraktionärer Fällung, Absorption, Desorption oder Chromatographie aus den filtrierten Fermentationsmedien isoliert.
Die Erfindung stellt insofern eine wesentliche Bereicherung der Technik,:beispielsweise.auf dem Gebiet der pharmazeutischen oder Lebensmittelindustrie dar, als nunmehr eine hochgereinigte Lipoproteinlipase wirtschaftlich hergestellt werden kann.
Es wurde gefunden, daß die durch die genannten Organismen erzeugten Enzyme auf eine_ Olivenölemulsion nicht einwirkten, jedoch gegenüber einem mit einem Blutserum oder einem Blutplasma aktivierten, ein künstliches Lipoprotein enthaltenden. Olivenöl wirksam waren. Es wurde weiterhin gefunden, daß die Eigenschaften dieser Enzyme denen' einer Lipoproteinlipase aus Tieren entsprachen, da die Hydrolysierwirkung dieser Enzyme durch eine hochkonzentrierte Natriumchloridlö`süng"und eine'niedrlgkonzentrierteNatriumtaurocholatlösunggehemmtwurden.
Die erfindungsgemäß verwendeten Organismen werden in den üblichen wäßrigen Nährmedien nach den üblichen Züchtungsverfahren gezüchtet; die mikrobielle Lipoproteinlipase aus der Fermentations-$üssigkeit kann fraktioniert unter Verwendung von Salzen und Lösungsmitteln ausgefällt werden. Das so gewonnene rohe Enzym wird dann mittels weiterer für die Enzymreinigung bekannter Methoden aufgearbeitet.
Die gereinigte mikrobielle Lipoproteinlipase stellt ein saures Zuckerprotein mit-einer starken Anthronreaktion und einem Adsorptionsmaximum von 280 m#t dar; :sie ist bei einem pH-Wert von weniger als 3,0 unbeständig, bei einem pH-Wert von 4,0 bis 6,0 beständig und sogar bei einem pH-Wert von mehr als 9,0 ziemlich beständig. Der optimale pH-Wert liegt bei etwa 7,0 und die optimale Temperatur bei etwa 50° C.
Die Erfindung soll im folgenden an Hand der nachstehenden Beispiele näher erläutert werden. :Beispiel 1 In einem wäßrigen Nährmedium aus 10/, Maiswasser, 0,60/, Harnstoff, 0,501, Glukose, 10/0 Sojabohnenöl mit einem pH von 6,0 wurde Pseudomonas sp. (M-12-33) IAM 18002 2 Tage bei 26°C in Submerskultur gezüchtet. Der pH des Nährmediums wurde auf dem Wert 6,0 gehalten. Die Zellen wurden durch Zentrifugierung entfernt und die überstehende Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat versetzt. Der nach Erreichung eines Säitigungegrades. von 0,3 bis 0,6 erhaltene Niedersälag--..wtn,'de-,gesammelt. Die mikrobielle Lipoproteinlipase (LPL) wurde mit einer Ausbeute von etwa 850/0 gewonnen. Aus 101 Kulturlösung wurden etwa, 230 g. Niederschlag erhalten. Der Niederschlag wurä""in°2-1 -Ö,Olmolarer Ammonium-'hydröxydlösung aufgelöstrund "die erhaltene:-Lösung mit Diatomeenerde (Hyflo Super Gel, hergestellt von der Jönes-Manville Companyj vermischt, worauf abfiltreft wurde. Der°plI des Filtrats wurde mit 0,1molarer Schwefelsäure auf einen Wert von 4,0 eingestellt und .die Lösung 1 Stunde -bei 0°C stehengelassen.
-Der erhaltene Niederschlag wurde durch-- Zentrifitgierung gesammelt und hierauf in 500 ml einer Lösung, die 0,02 Mol Ammoniumhydroxyd enthielt, gelöst. Die erhaltene Lösung wurde 2 Tage bei 0 bis 3'C-- -unter Verwendung . einer Cellophanmembran dialysiert. Die dialysierte Enzymlösung wurde mit einer Azetatpufferlösung -von pH 4,5 veisetzt, die in bpzug auf Natriumchlorid 0,4molar und in bezug auf Essigsäure'.0,2molar war. Dem- Gemisch wurden unter gelegentlicher Rührung 150 g Diäthylaminoäthylcellulose (DÄAÄ-C) zugegeben und das Ganze 4 Stunden bei einer Temperatur von 0 bis 2'C stehengelassen. Das Gemisch wurde filtriert. Das erhaltene Filträt wurde mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 0,6 vermischt und dann über Nacht bei 0- bis 2'C stehengelassen., Der erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrifugierung abgetrennt und in 50iml einer 0,01molaren Ammoniumhydroxydlösung aufgelöst. Die Lösung wurde 2 Tage unter Verwendung von entsalztem Wasser dialysiert und einen weiteren Tag unter Verwendung eines 0,01molaren Acetätpüffers (pH 4;5): Hierauf wurde die dialysierte Enzymlösung durch --eine Säule, die mit 0,01molarem Acetatpuffer (pH 4,5) behandelten DÄAÄ-E gefüllt worden war, geleitet, worauf das Enzym mit einer wäßrigen Kochsalzlösung, deren Konzentrat nacheinander auf 0,4molar erhöht wurde, eluiert wurde. Die das mikrobielle LPL enthaltende Fraktion wurde gesammelt und dialysiert. Dann wurde das Dialysat mit dem gleichen Volumen Aceton versetzt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugierung abgetrennt und dann in 40 ml entsalztem Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde dialysiert und gefriergetrocknet. Auf diese Weise wurden 2,1 g einer gereinigten mikrobiellen LPL erhalten. Beispiel 2 In einem Nährmedium aus 0,30/, Fleischextrakt, 1,5010 Polypepton, 0,60/0 Harnstoff, 1,00/0 Glukose, 0,20/0 KH2P04, 0,05010 M9S04 ' 7H20, 0,05010 KCl und 1,00/0 Olivenöl mit einem pH von 6,0 wurde Pseudomonas sp. (M-4-32) IAM 18001 in Submerskultur 2 Tage bei 26°C gezüchtet. Der pH-Wert des Nährmediums wurde auf 6,0 gehalten. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugierung entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde im Vakuum bei 20 bis 24°C auf ein Fünftel ihres Volumens konzentriert, worauf das gleiche Volumen Aceton zugegeben wurde. Der dabei gebildete Niederschlag enthielt etwa 700/0 der gesamten mikrobiellen LPL. Aus 10l Nährmedium wurden auf diese Weise etwa 150 g Niederschlag gewonnen. Dieser Niederschlag wurde, wie im Beispiel 1 gezeigt, gereinigt, wobei etwa 1,6 g gereinigte mikrobielle LPL erhalten wurde.

Claims

Patentanspruch: Verfahren zur Herstellung und Gewinnung von Lipoproteinlipase durch Züchtung von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daB man Pseudomonas sp. (M-12-33) IAM 18002 oder Pseudomonas sp. (M-4-32) IAM 18001 in einem wäßrigen Nährmedium züchtet und aus der Fermentationsflüssigkeit die Lipoproteinlipase in an sich bekannter Weise abtrennt und reinigt.