DE1467923C - Verfahren zur Herstellung eines Anti biotikums aus Sporocytophaga cauhformis Typ II NCIB 9 488 - Google Patents

Description

Sporocytophaga cauliformis ist eine aerobe Myxobakterienart, die in fast allen Oberflächengewässern vorkommt und zuerst von Graf in »Archiv für Hygiene und Bakteriologie«, Bd. 146, Heft 2, S. 114 bis 125 (1962), ausführlich beschrieben wurde. Charakteristisch für diese Mikroorganismen sind die Haftstiele, die sie unter bestimmten Umweltbedingungen entwickeln und mittels derer sie an festen Unterlagen anhaften, um dem vorbeiströmenden Wasser die Nährstoffe zu entnehmen bzw. die mikrobielle Umweltflora auszunutzen. Durch ihre Fähigkeit zur kriechendgleitenden Fortbewegung, ihrer aktiven Flexibilität, des Vorhandenseins von deutlich abgegrenzten Nukleoiden und des durch die Ausbildung von Mikrozyten gekennzeichneten Entwicklungszyklus lassen sie sich eindeutig den Myxobakterien zuordnen. Entsprechend ihren natürlichen Lebensbedingungen ge-' deihen sie am besten auf nährstoffarmen Kulturmedien.

Die Spezies Sporocytophaga cauliformis umfaßt zahlreiche Stämme, die sich gemäß ihrer biochemischen Eigenschaften in zwei Typen (Typ I NCIB 9 487 und Typ II NCIB 9 488) einteilen lassen. Die Stämme des erfindungsgemäß verwendeten Typs II NCIB 9488 sind schwache Katalysebildner und besitzen geringere fermentative Eigenschaften, d. h., sie sind nicht imstande, gebräuchliche Zucker zu spalten. Die Stämme des Typs I hingegen sind starke Katalasebildner und spalten Zucker unter Säurebildung; überdies besitzen sie keine antibiotische Aktivität.

Gegenstand der Erfindung ist-ein Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums auf üblichem biologischem Wege, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Sporocytophaga cauliformis Typ II NCIB 9 488 unter aeroben Bedingungen züchtet, das Antibiotikum aus den Zellmassen isoliert und anschließend reinigt.

Die Kultivierung erfolgt unter aeroben Bedingungen auf festen Glucose-Peptön-Agar-Nährböden. Auch die Verwendung flüssiger Nährmedien ist möglich, doch gestaltet sich die Abtrennung der zu extrahierenden Bakterienmassen von., den Nährbodenbestandteilen dabei schwierig. " '" ' ■·'·.··

Zur Isolierung des Antibiotikums digeriert man die gebildeten Zeihnassen in wasserfreiem Aceton, wobei das Pigment der vegetativen Myxobakterien in Lösung geht. Nach mehrmaliger Wiederholung dieses Verfahrens sind die Zellmassen nahezu farblos. Zur Beseitigung der letzten acetonunlöslichen Spuren des Pigments kann man zum Schluß nochmals mit wasserfreiem Methanol nachwaschen.

Die nahezu farblosen Bakterienleiber werden dann mit destilliertem Wasser eluiert. Nach dem Abzentrifugieren werden aus der überstehenden hellgelben Lösung die Proteine durch Zusatz von Aceton ausgefällt und abgetrennt. Es hinterbleibt eine klare hellgelbe Flüssigkeit, aus der sich beim Einengen Kristalle von eigentümlich parkettartigem Aufbau abscheiden. Das Antibiotikum läßt sich auch durch Dialyse der mit Aceton behandelten Zellmassen, anschließende chromatographische Reinigung an saurem Aluminiumoxyd und Einengen gewinnen.

Ein reines Produkt erhält man, wenn man die kristalline Rohsubstanz in Wasser löst und die filtrierte Lösung der Papierchromatographie mit Butanol—

ίο Wasser—-Eisessig (9:1:1) unterwirft.

Das reine Antibiotikum bildete farblose hygroskopische Kristalle von charakteristisch parkettartiger Struktur, die sich oberhalb 120°C zersetzen. Es löst sich ausgezeichnet in Wasser, ist jedoch in allen organischen Lösungsmitteln unlöslich. In neutraler wäßriger Lösung ist es relativ stabil, von verdünnten Säuren und Laugen wird es abgebaut. Durch Chromatographie unter Verwendung von wassergesättigtem Butanol läßt sich der Wirkstoff in eine Ninhydrinpositive Substanz von Rf-Wert 0,028 und einem im UV-Licht blau fluoreszierenden Stoff vom Rf-Wert 0,10 auftrennen. Letzterer besitzt keine antibiotische Wirksamkeit; die Ninhydrin-positive Substanz weist eine gute Wachstumshemmung auf, die jedoch von der Wachstumshemmung des kombinierten Produktes weit übertroffen wird.

Die Ninhydrin-positive Substanz erweist sich bei der Säurehydrolyse als ein Polypeptid, bestehend aus fünf Aminosäuren. Über die Natur der im UV-Licht fluoreszierenden Verbindung wurden noch keine Aufschlüsse erhalten.

Das Antibiotikum besitzt eine sehr gute Verträglichkeit und eine gute Hemmwirkung des Wachstums gram-positiver und gram-negativer Keime im Agardiffusionstest. Das Wirkungsspektrum ist aus der nach stehenden Tabelle ersichtlich.

Testkeim	Minimale Hemm konzentration mg/ml
Salmonella typhi murium Aerobacter nov. spec Shigella flexneri E. coli	2,00 2,00 0,50 0,25 0,03 0,035 0,0017
B. cereus Staph. aureus Sarc. tetragena

-₀ Beispiel

Feste Agarplatten, bestehend aus 10 g Pepton,

20 g Agar, 5 g Glukose und destilliertem Wasser ad 1000 ml vom pH-Wert 7,2 werden mit einer wäß-

. rigen Keimsuspension von Sporocytophaga cauliformis Typ II NCIB 9 488 geimpft und 2 bis 3 Tage lang bei 22° C bebrütet. Danach wird der gebildete Bakterienralsen abgehoben, in wasserfreies Aceton eingebracht und mit dem Magnetrührer 5 Minuten in Bewegung gehalten. Nach dreimaliger Wiederholung dieses Prozesses sind die Zellmassen nahezu farblos. Letzte acetonunlösliche Spuren des Pigments werden durch einmalige Behandlung mit wasserfreiem Methanol beseitigt.

1. Reinigung durch Acetonfällung

Die abzentrifugierte Lösung des Antibiotikums wird zur Weiterverarbeitung mit der doppelten Menge Aceton versetzt und über Nacht stehengelassen. Dabei

fallen große Mengen von Proteinen aus, die abzentrifugiert werden.

Aus dem klaren Überstand wird das Aceton bei 40° C im Vakuum ausgetrieben. Die verbleibende wäßrige Lösung wird durch Säulenchromatographie an saurem Aluminiumoxyd von letzten noch vorhandenen Pigmentspuren befreit und anschließend bei 4O⁰C zur Trockne eingeengt. Die dabei gebildeten schwach gelblichen Kristalle zeigten im mikroskopischen Bild einen charakteristischen parkettartigen Aufbau.

Zur Reinigung wird das Kristallisat in destilliertem Wasser gelöst, die Lösung von ungelösten Begleitstoffen abfiltriert und abermals eingeengt.

2. Reinigung der Dialyse

Die mit Aceton gewaschenen nahezu farblosen Bakterienleiber werden in wenig destilliertem Wasser aufgeschwemmt und in einem Cellophan-Dialysator gegen steriles destilliertes Wasser 18 Stunden lang dialysiert, wobei das Wasser jeweils nach 1, 12 und 16 Stunden erneuert wurde. Die vereinigten Dialysate wurden durch Säulenchromatographie an saurem Aluminmmoxyd von gelösten Proteinen befreit und wie vorher im Trockenschrank eingeengt.

Eine endgültige Reinigung erfolgte durch aufsteigende Papierchromatographie (Chromatographierpapier von Schleicher & Schüll 2043 bM) in einem System von Butanol—Wasser—Eisessig (9:1:1). Die Chromatographierdauer beträgt zweckmäßig 24 Stunden. Bei der Entwicklung des Chromatogramms mit Ninhydrin-Reagens erhält man sechs Zonen. Außerdem erkennt man im UV-Licht zwei stark blau fluoreszierende Ninhydrin-negative Zonen. Die zweitunterste

ίο Ninhydrin-positive Zone und die in engster Nachbarschaft zu dieser befindliche blau fluoreszierende Ninhydrin-negative Zone enthalten den antibiotisch wirksamen Bestandteil. Durch Elution dieser Zonen und nachfolgende Einengung des wäßrigen Eluats erhält man wieder die schon beschriebenen parkettförmigen Kristalle, jetzt in gereinigter Form.

3. Trennung in zwei Komponenten

Durch nochmalige Chromatographie unter Verwendung von wassergesättigtem Butanol als Fließmittel kann man die Substanz in zwei Komponenten auftrennen, von denen die eine im UV-Licht fluoresziert, mit Ninhydrin keine Reaktion gibt und nach dem Einengen der wäßrigen Lösung kristallin hinterbleibt, während die andere eine positive Ninhydrinreaktion gibt und keine Kristalle bildet.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums auf üblichem biologischem Wege, dadurch gekennzeichnet, daß man Sporocytophaga cauliformis Typ II NCIB 9 488 unter aeroben Bedingungen züchtet, das Antibiotikum aus den Zellmassen isoliert und anschließend reinigt.