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Verfahren zur Gewinnung hochpolymerer Desoxyribonucleinsäure Desoxyribonucleoproteide
sind bekanntlich die Grundbestandteile der Fischmilche, aus denen durch enzymatische
Abspaltung des Proteins die Desoxyribonucleinsäure gewonnen werden kann.
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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung hochpolymerer
Desoxyribonucleinsäure (DNS) aus Desoxyribonucleoproteide enthaltenen Ausgangsstoffen,
insbesondere aus Fischmilchen, die in einer citrathaltigen Natriumchloridlösung
von etwa molarer Konzentration suspendiert sind. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß die suspendierten Ausgangsstoffe in Gegenwart von Cholsäure der enzymatischen
Spaltung durch Papain bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 unterworfen werden und die
DNS in üblicher Weise ausgefällt wird.
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Die bei dieser enzymatischen Spaltung zunächst anfallende Lösung wird
über Kieselgur des Typs, wie sie unter der Bezeichnung »Celite« im Handel bekannt
ist, filtriert und mit Äthanol versetzt, um die DNS-Fasern auszufällen. Letztere
werden durch Behandlung mit Alkohol und destilliertem Wasser schrittweise partiell
dehydratisiert und anschließend zerkleinert und getrocknet.
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Es ist bereits bekannt, hochpolymere Desoxyribonucleinsäure durch
Auflösen von zerkleinerter Fischmilch in organischen Lösungsmitteln, Filtrieren,
mehrmaliger Behandlung mit wäßriger Natriumchloridlösung unter mehrmaligem Dekantieren
oder Zentrifugieren herzustellen. Bei diesem bekannten Verfahren muß in den verschiedenen
Lösungen jeweils ein anderer pH-Wert eingestellt werden. Ferner ist dieses Verfahren
mit einem großen Zeitaufwand verbunden, da vor den jeweiligen Hydrationsvorgängen
eine Wartezeit von vielen Stunden bis mehreren Tagen eingeschaltet werden muß.
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Ferner ist es bekannt, Natriumdesoxyribonucleat aus Kälberthymus durch
mehrmaliges Behandeln mit Natriumcitrat und Natriumchloridlösungen herzustellen.
Auch bei diesem Verfahren ist ein mehrmaliges Filtrieren und Wiederauflösen des
behandelten Produktes erforderlich. Dieses Verfahren, bei dem Hydrierhilfsmittel,
wie z. B. »Celite«, zur Anwendung kommen können und bei dem das Natriumdeoxyribonucleat
durch Behandlung mit Alkohol ausgefällt wird, ist ebenfalls mit einem erheblichen
Zeitaufwand verbunden.
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Es ist ferner bekannt, zur Gewinnung von Desoxypentosenucleinsäure
Spermien in einer Natriumchlorid-und Natriumcitratlösung zu behandeln und dann eine
Enzymbehandlung mit Trypsin vorzunehmen, wobei anschließend eine Ausfällung mit
Äthanol sowie eine nachfolgende Zentrifugierung stattfindet. Auch dieses Verfahren
erfordert eine aufwendige Reinigungsarbeitsweise und bringt wegen der viskosen Natur
der betreffenden Nucleinsäure Schwierigkeiten bei der Zentrifugierung mit sich.
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Weiterhin ist es bekannt, aus Ribonucleoproteinen, die aus Rattenmikrosomen
mit Natriumdesoxycholat gewonnen worden sind, mittels proteolytischen Enzymen Ribonucleinsäure
zu gewinnen.
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Schließlich ist es bekannt, daß Papain Fischeiweiß spaltet, daß jedoch
die Papainproteolyse durch DNS gehemmt wird.
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Gegenüber den bekannten Verfahren zeichnet sich die erfindungsgemäße
Arbeitsweise dadurch aus, daß überraschenderweise gerade durch eine Behandlung mit
dem proteolytischen Enzym Papain Desoxyribonucleinsäure dann in technisch einfacher
und wirtschaftlicher vorteilhafter Weise mit geringem Zeitaufwand hergestellt werden
kann, wenn man die besonderen Bedingungen gemäß der Erfindung einhält.
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Das Verfahren soll an Hand der bevorzugten Aufarbeitung von Fischmilchen
näher erläutert werden, obgleich es auch mit anderen Ausgangsstoffen, wie Kälberthymus,
ausgeführt werden kann.
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Beispiel Zur Bereitung der Ausgangssuspension werden Fischmilche grob
zerkleinert und in der geeigneten Menge einer etwa 1/lomolaren Natriumchloridlösung,
der Natriumcitrat in etwa dreimal schwächerer Konzentration
zugegeben
wurde, fein suspendiert. Da der Gehalt an DNS in den Fischmilchen je nach Fischart
und bei der gleichen Fischart je nach Jahreszeit variiert, werden die wie vorstehend
beschrieben erhaltenen Suspensionen vorzugsweise auf ein geeignetes Volumen eingestellt,
und zwar so, daß der DNS-Gehalt der Lösung etwa zwischen 0,2 und 3 mg/ml beträgt.
Darauf wird zur Erzielung einer molaren Konzentration festes Natriumchlorid in genügenden
Mengen zugegeben und die Suspension mit geeigneten Mitteln in Bewegung versetzt,
um das Natriumchlorid in Lösung zu bringen und zu verteilen.
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Die so erhaltenen hochviskosen Lösungen lassen sich im Kühlraum bei
Temperaturen zwischen 0 und 3'C bis zu 1 Jahr aufbewahren.
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Nach Einstellung der oben erhaltenen Lösung auf einen pH-Wert zwischen
6,5 und 7,5 wird erfindungsgemäß Cholsäure in geeigneter Menge und Papain in einer
Menge zwischen 0,4 und 0,8 °/o, bezogen auf die Menge der behandelten Fischmilch,
zugegeben. Der Zusatz -des Papains erfolgt in zwei im Abstand von etwa 6 Stunden
aufeinanderfolgenden Dosen.
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Die Mischung wird während annähernd 24 Stunden mit Hilfe eines mechanischen
Rührwerks in Bewegung gehalten. Die erforderliche Einwirkungszeit des Papains kann
jedoch verschieden sein; sie hängt von der Natur des Eiweißkörpers, der an die DNS
gebunden ist und mit ihr zusammen das Desoxyribonucleoproteid bildet, ab.
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Die enzymatische Wirkung des Papains wird abgebrochen, wenn das Protein
völlig-abgespalten ist; was sich leicht durch Beobachtung feststellen läßt. Dabei
wird man erkennen, 'daß die Wirkung des Papains beschleunigt wird, wenn die Lösung
während der Dauer der anzymatischen Einwirkung gegen Natriumchlorid dialysiert wird.
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Nach Beendigung dieser Einwirkung wird die Lösung langsam im Kühlraum
durch einen Kieselgurkuchen vom »Celite<c-Typ filtriert; Kieselgur adsorbiert
bekanntlich Proteine von genügend hohem Molekulargewicht. Das so gewonnene viskose
Filtrat, das erheblich klarer geworden ist und nur noch eine geringe Opaleszenz
aufweist, stellt eine noch verunreinigte DNS-Lösung dar. Wenn das Filtrat noch sehr
trüb ist, kann eine zweite Filtration unter den gleichen Bedingungen über neuem
»Celite« vorgenommen werden. Die Filter werden mit einer molaren Natriumchloridlösung
gewaschen und die Waschflüssigkeiten mit dem Filtrat vereinigt.
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Aus diesem Filtrat werden die DNS-Fasern mit Äthanol gefällt. Diese
Fällung, die im Kühlraum bei einer Temperatur von etwa 2°C vorgenommen wird, wird
auf folgende Weise durchgeführt: Dem zu behandelnden Filtrat wird ein gleiches Volumen
Äthanol zugegeben. An den Grenzflächen bilden sich langsam DNS-Fasern aus. Die Lösung
wird langsam durch gleichmäßige, umfassende Bewegungen in Bewegung versetzt, bis
sich beide Phasen miteinander gemischt haben und die DNS-Fasern die ganze Fällungsschale
überwuchern. Die Mischung wird mehrfach von einem Gefäß in ein anderes gebracht.
Dabei sammeln sich die Fasern an der Oberfläche.
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Diese Fasern werden mit einem Glasstab herausgenommen und in eine
Schale gebracht, die eine Mischung aus 2 Volumteilen absolutem Alkohol und 1 Volumteil
destilliertem Wasser enthält; das Ganze wird etwa 15 Minuten lang durch gleichmäßige
umfassende Bewegungen in bewegten Zustand versetzt. Die Fasern werden noch einmal
herausgenommen und in eine Schale, die eine Mischung aus 3 Volumteilen Alkohol und
1 Volumteil destilliertem Wasser enthält, eingebracht und wiederum etwa 15 Minuten
lang in Bewegung versetzt. Die gleiche Behandlung wird noch einmal unter Verwendung
einer Lösung aus 4 Volumteilen Alkohol und 1 Volumteil Wasser durchgeführt und schließlich
mit einer zweimaligen Aufnahme in reinem Alkohol wiederholt.
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Die so partiell dehydratisierten Fasern werden zweckmäßig auf einem
Glasstab an der Luft getrocknet. Das Knäuel aus DNS-Fasern wird zerteilt, in feine
Fasern zerlegt und mehrere Stunden bei Zimmertemperatur an einem trockenen Ort stehengelassen.
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Die in Form der Fasern vorliegende DNS wird in einer 1/loomolaren
NaCl-Lösung durch langsame Zugabe dieser Lösung zu den Fasern wieder in Lösung gebracht.
Nach langsamem Umrühren soll die Konzentration der so erhaltenen Lösung etwa 1 mg/ml
betragen.
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Mit dieser Lösung wird eine Bestimmung des Proteingehaltes durchgeführt:
Wenn der Proteingehalt zu hoch ist (2 °/o), wird die Lösung noch einmal 12Stünden
lang bei einer Temperatur von 37°C mit Papain behandelt (die Konzentration an Papain
variiert dabei mit dem Proteingehalt der DNS). Die Lösung wird im Kühlraum filtriert,
und die Fasern werden nach der vorstehend beschriebenen Methode ausgefällt.
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Mit der so gewonnenen DNS werden folgende Bestimmungen durchgeführt:
Wassergehalt, UV-Spek= trum und Hyperchromizität, Phosphor, Stickstoff (nach einer
Methode, die einen 0,2°/oigen Proteingehalt erkennen läßt), Proteine, Desoxyribose,
Ribose.
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Bei Verwendung von Kälberthymus als Ausgangsprodukt verlängern sich
wegen der stärker komplexen Natur der an die DNS gebundenen Proteine die enzymatischen
Einwirkungszeiten.
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Die hierbei erhaltene Lösung enthält außer DNS auch noch Ribonucleinsäure
(RNS), die in den Milchen männlicher Fische nur in geringer Konzentration vorliegt.
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Daher muß nach Filtration über »Celiteu die RNS durch Überleiten über
eine Aktivkohlesäule, die nur die RNS, nicht aber die DNS adsorbiert, entfernt werden.
Die RNS kann nach Belieben aus der Aktivkohlesäule mit einer ammoniakalischen Alkohollösung
eluiert werden.