DE2259404A1 - Verfahren zur gewinnung von orgotein aus tierischem gewebe - Google Patents

Description

Dr. Joachrm Rasper

Patentanwalt
62 Wiesbaden

!!«stator H6h» 22 IiJ. 5*2141

DIAGNOSTIC M, INC. .
Mountain View, CaI₀, V.S-t.A,

Verfahren zur Gewinnung von Orgotein aus tierischem Gewebe

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von weitgehend reinem Orgotein aus tierischem Gewebe.

Mit Orgotein bezeichnet man eine Familie von miteinander verwandten

Proteinverbindungen, die eine charakteristische Kombination von physi-

Og
kaiischen, chemischen und pharmakolischen Eigenschaften aufweisen.

Jede dieser miteinander verwandten Verbindungen, im folgenden als "Artgenossen" bezeichnet, läßt sich physikalisch als die isolierte, weitgehend reine Form eines globulären, in Pufferlösung und Wasser löslichen Proteins definieren, das eine sehr kompakte, natürliche Konformation aufweist, und welches zwar hitzelabil ist, jedoch gegen Erwärmung für mehrere Minuten auf 65 C in Wasser oder einer Pufferlösung, die
ein Salz eines zweiwertigen Metalls mit einem Ionenradius von 0,60 bis 1,00 A -Einheiten enthält, beständig ist, und welches bei der Gelelektrophorese bei pH 8,45 in 0,01 m Trisglycin-Puffer ein charakteristisches Vielbanden-Muster ergibt. Chemisch ist dieses Protein dadurch

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gekennzeichnet, daß es alle (oder alle bis auf eine) essentiellen Aminosäuren, eine geringe Menge Kohlehydrat, keine Lipide, 0,1 bis 1,0 Mol-% Metalle in Form von etwa 3 bis etwa 5 g-Atomen/Mol eines oder mehrerer chelatgebundener, zweiwertiger Metalle mit einem Ionenradius von 0,60 bis 1,00 Ä-Einheiten, und im wesentlichen keine chelatgebundenen einwertigen Metalle oder Zellgifte im Molekül enthält, Pharmakodynamisch kann jeder dieser Artgenossen als ein nicht-toxisches, immunologisch gut verträgliches, injezierbares Protein definiert werden, unter dessen pharmakologischen Wirksamkeiten seine entzündungshemmende Wirkung von besonderem Interesse ist, die, ebenso wie seine kompakte Konformation, mit seinem Gehalt an chelatgebundenen zweiwertigen Metallen zusammenhängt. Die immunologische Ähnlichkeit der Orgotein-Artgenossen ist so stark, daß ihre in einem Kaninchen oder einem anderen, geeigneten Tier erzeugten Antikörper von ei-· nem oder mehreren anderen Orgotein-Artgenossen als Antigen erkannt werden und/oder von einem oder mehreren Antikörpern, die anderen Orgotein-Artgenossen zugehören, als Antigen erkannt werden, wie sich bei der Geliinmunoelektrophorese und/oder der Gelimmunodiffusion gezeigt hat. Obgleich einige der physikalischen und chemischen Eigenschaften sowie die Art und Stärke der pharmakodynamischen Wirksamkeit von Artgenosse zu Artgenosse variieren, besitzen alle Orgotein-Artgenossen die oben erwähnte Kombination von Eigenschaften.

Aus der in jüngster Zeit veröffentlichten Literatur geht hervor,daß zu der Orgotein-Pamilie von Metalloproteinen auch die Proteine gehören, die schon früher in unterschiedlicher Reinheit isoliert worden sind, und denen man die Namen Hepatocuprein, Mann & Keilin, Proc. Royal. Soc. fox Biol. Sei., 126, 303 (1939)? Cerebrocuprein, Porter & Ainsworth, J. Neurochem., Y, 26O (1957)i Erythrocuprein, Markowitz et al., J. Biol. Chem., 23_i» 40 (1959); und Cytocuprein, Carrico & Deutsch, J. Biol. Chem., 244, 6O87 (1969)· Als andere Veröffentlichungen zu diesem Sachgebiet sind zu nenneni Mohamed & Greenber^, J. Gen. Physiol. j>2, 433 (1954)» Porter & Polch, Arch. Neurol. Psychiat. 21» 8 (1957); Porter & Ainsworth, J. Neurochem., 5_, 91 (1959); Krimmel et al., J. Biol. Chem., 254t 46 (1959)i Wyman, Biochem. Biophys. Acta, 4J>, 387 (i960); Shields et al., J. Clin. Inv., 40, 2007 (1961); Markowitz et al., Anal. Chem., 3_3_, 1594 (I96I)} Porter et al., Arch. Biochem. Bioph., 10^, 319 (1964) j Stansell & Deut ■.:

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J. Biol. Chem., 2^0, 4299 (1965); ibid, 240» 4306 (1965); Stansell & Deutsch, Clin. Chem. Aeta, 1_4_, 598 (I966) 5 McCord & Fridovich, J. Biol. Chem., 243, 5753 (1968); McCord & Fridovich, J. Bid. Chem., 243, 6056 (1968)| Hartz & Deutsch, J. Biol. Chem., 24J^, 4565 (1969)? Carrieo & Deutsch, ibid, 24J[, 723 (1970); Wood et al., Eui. J. Biochem. 18 (1.971) I87. Diese Untersuchungen haben gezeigt, daß die Familie der Oxgotein-Artgenossen auch diese Metalloproteine umfaßt; da Orgotein eine ausgeprägte Superoxid-Dismutase-Wirksamkeit "besitzt, gilt seine Verwandtschaft zu der ,in Säugetieren anzutreffenden Form dieses Enzyms als gesichert. Von diesen Metalloproteinen wird berichtet, daß sie eine sehr hohe Superoxid-Dismutase-Wirksämkeit aufweisen (s.a. McCord & Fridovich, J. Biol. Chem., 24Jb 6Ο49 (1969)5 Keele, McCord und "Fridovich, J. Biol. Chem., 24JL, 6176 (1970); ibid, 246, 2875 (1971).)

In der Be-PS 687,828 und der GB-PS 1,160,151 ist ein Mehrstufenverfahren zur Isolierung von Orgotein aus tierischem Gewebe, wie z.B. Rinderleber, "beschrieben. In der US-PS 3»687,927 ist ein verbessertes Verfahren "beschrieben, bei welchem einige Verfahrensschritte ausgelassen werden und die Ausbeute erheblich erhöht wird. In der US-PS 3»5799495 wird ein Mehrstufenverfahren zur Isolierung von Orgotein aus roten Blutzellen beansprucht, welches eine Lösungsmittel-Vorreinigung und eine Erwärmungsstufe umfaßt, wobei eine Gesamtausbeute_s "bezogen auf .. gepackte rote Zellen,von 0,01 ^cfo erreicht wird«

Bei einigen der in der vorstehend genannten Literatur beschriebenen Verfahren wurde eine chromatographische Reinigungsstufe an Diäthylaminoäthyl-Cellulose als Teil eines Mehrstufenverfahrens zur Isolierung von Orgotein aus roten Blutzellen angewandt. In einem dieser Verfahren (Carrico et al., J.B.C. 244» 6O87-6O93, I969) wird das Gemisch der extrahierten löslichen Proteine drei chromatographischen Reinigungsstufen unterworfen, an die sich in jedem Falle eine Dialyse und danach eine Gelfiltration an Sephadex G-75 anschließt. Dieses Verfahren ist zwar für das Laboratorium ausreichend, für die technische Gewinnung von Orgotein jedoch viel zu unwirtschaftlich. Außerdem beträgt die Gesamtausbeute nur 0,0065 ¥>·

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Ziel dieser Erfindung ist ein Verfahren, mit welchem Orgotein von pharmazeutisch akzeptabler Reinheit in einer einzigen chromatogra;hischen Reinigungsstufe gewonnen werden kanni wodurch dieses Verfahren außerordentlich wirtschaftlich würde.

Dieses Ziel wird mit einem Verfahren erreicht, bei welchem weitgehend reines Orgotein aus einem Orgotein enthaltenden, löslichen Pufferextrakt aus tierischem Gewebe in einer einzigen chromatographischen Reinigungsstufe isoliert wird, und welches dadurch gekennzeichnet ist, daß eine wässrige Lösung des Gemisches von Proteinen, die einen pH-Wert von etwa 6 und eine Ionenstärke unter etwa 0,01 aufweist, über einer DÄAÄ-Cellulose- oder einer anderen schwach basischen Ionenaustausch-Säule chromatographiert wird, ein Teil der adsorbierten Proteine mit einem wässrigen iJluierun ;smittel von einer Ionenstärke unter etwa 0,02 m eluiert wird, bis ein Abfall der 260- und 280-nm-Adsorptionen und gleichzeitiger Anstieg des Gehalts an zweiwertigen Metallen beobachtet wird, dae adsorbierte Orgotein mit einem wässrigen Eluierungamittel von höherer Ionenatärke von etwa 0,02 bis 0,OJ m eluiert wird, wobei der Gehalt des Eluats an zweiwertigen Metallen gemessen wird, und Orgotein aus dem Teil des Eluats abgetrennt wird, der den höchsten Gehalt an zweiwertigen Metallen aufweist.

Das neue Verfahren ist so einfach und wirtschaftlich, daß die gesamten Verfahrens- und Materialkoeten etwa ein Zehntel der Mindestkosten ausmachen, die bei den bisherigen technischen Verfahren aufgewendet werden müseen.

In dem erfindungegemäßen Verfahren können die verschiedensten Arten von tierischem Gewebe eingesetzt werden.

Das Ausgangematerial für daa Verfahren ist ein Gemisch aus pufferlöslichen Proteinen, das aus tierischem Gewebe extrahiert «orden ist· Der Ausdruck "tierisches Gewebe" soll alles organische, Muskel- oder ähnliches Gewebe umfassen. Ausgenommen sind Blut und Blutfraktionen, bei denen das Verhältnis anderer löslicher Proteine, wie Hämoglobin und Carbonaäureanhydrase, zu Orgotein viel höher ist, und die daher andere Methoden zu ihrer Abtrennung exforderlich machen. Unter den tierischen Geweben wird Leber, insbesondere Rinderleber, bevorzugt, weil sie einen hohen Gehalt an Orgotein aufweist. Andere Gewebe, die verwendet werden

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können, sind Niere, Herz, Hirn, Milz, Eingeweide, Muskeln, Testikel, Oervikaldrüsen, Lunge, Zunge, Thymusdrüse und Bauchspeicheldrüse. Vorzugsweise stammen diese Gewebe vom Rind, Huhn, Schwein und Pferd oder vom Schaf, der Ziege, dem Kaninchen, dem Hund, der Hatte, dem Menschen usw.. Die löslichen Proteine aus Rindergewebe werden am meisten bevorzugt.

Das Ausgangsgemisch aus Orgotein enthaltenden, pufferlöslichen Proteinen kann gewonnen werden, indem das tierische Gewebe sorgfältig mit dem ausgewählten wässrigen Extraktionsmittel vermischt wird. Um die löslichen Proteine von den unlöslichen Proteinen zu trennen, sollte das Gewebe so fein wie möglich zerkleinert werden. Das Gewebe kann z.B. in einem Fleischwolf zu einer Pulpe vorgemahlen und dann sorgfältig mit der ausgewählten Sxtraktionsflüssigkeit vermengt werden, z.B. in einer Hochleistungsmischapparatur.

Das Mengenverhältnis von Extraktionsmittel zu tierischem Gewebe ist nicht kritisch und wird in erster Linie von'der Forderung nach guter Verarbeitbarkeit des Gemisches bestimmt. Ein sehr niedriges Verhältnis verringert die Ausbeute an dem aus dem Gewebe extrahierten Orgotein geringfügig und ergibt ein schlammartiges Gemisch, welches schlecht aufzutrennen ist, und in welchem die flüssige Phase zuviel kolloidales Material zurückhält,, das die chromatographische Säule verstopfen kann. Ein zu hohes Verhältnis bringt keine Vorteile und- ergibt eine stark verdünnte Lösung von extrahierten Proteinen, die wegen ihres Volumens schwer zu handhaben ist. Im allgemeinen wird ein Volumenverhältnis von Extraktionsmittel zu tierischem Gewebe von etwa 2 t 1 bis 4:1, vorzugsweise von etwa 2>3 « 1 bis 2»8 : 1 angewendet.

Das Extraktionsmittel kann Wasser, ein Gemisch aus Wasser und einem damit mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Methanol, A'thanol, oder vorzugsweise eine Pufferlösung von relativ niedriger Ionenstärke, z.B. 0,01 - 0,05 nij vorzugsweise etwa 0,02 - 0,03 m sein. Obgleich das Extraktionsmittel praktisch jeden pH-Wert haben kann, z.B. einen solchen zwischen 4 und 9, werden schwach alkalische pH-Werte zwischen 7 ¹^d 9» insbesondere zwischen etwa 7»5 und 7,8 bevorzugt, und zwar besonders dann, wenn das tierische Gewebe Leber ist.

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Wenn eine Pufferlösung ala Extraktionsmittel verwendet wird, kann os ein beliebiger Puffer sein, der den gewünschten pH-Wert ergibt. Beispiele hierfür sind Salze der Phosphorsäure» Borsäure, CadodyIsäure, Citronensäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Collidin-HCl, Tris-glycin-HCl, usw. (s.a. J. Gomori, "Methods in Enzymology", Bd. I, S. 136-146 (1955), insbesondere die Puffer Nr. 5-8 und 10 - 18). Ein bevorzugter Puffer, insbesondere für die Extraktion von Leber, ist Tris-glycin-Puffer, pH 7,5.

Der Puffer kann auch andere Salze und andere Materialien enthalten, die sein Extraktionsverhalten verändern. NaCl, KCl, MnSO. oder andere, nichtpuffernde Salze können dazu dienen, die Ionenstärke des Sxtraktionsmittels zu erhöhen. Ein löslicher Zucker, wie Glucose, Saccharose usw. kann ebenfalls zugesetzt werden, um den Puffer selektiver zu machen und damit die Extraktion zu erleichtern.

Das Gemisch aus suspendierten Gewebepartikeln und wässrigem Extrakt kann auf jede beliebige Vi/eise aufgetrennt werden, z.B. durch Druck- oder Vakuumfiltration oder Zentrifugieren, wobei das letztere bevorzugt wird. Der Extrakt kann gewünschtenfalls mittels Filtrieren durch ein Filtrierhilianittel oder nach irgend einer anderen Methode geklärt werden.

Wenn der abgetrennte Extrakt eine Ionenstärke von mehr als etwa 0,01 m hat, ist es erforderlich, seine Ionenstärke zu reduzieren, um eine bevorzugte Adsorption des Orgoteins an dem Ionenaustauschharz sicherzustellen. Dies kann bequem durch Verdünnen oder durch Dialyse, z.B. gegen Wasser oder vorzugsweise gegen einen Puffer von geringer Ionenstärke erreicht werden, und zwar am besten mit dem Puffer, der bei der chromatographischen Trennung verwendet wird, wie z.B. Phosphatpuffer.

Weil gelöste Salze die Adsorbierbarkeit des Orgoteins an dem chromatographischen Adsorbens merklich beeinflussen, sollte die Lösung der extrahierten löslichen Proteine eine geringe Ionenstärke, d.h., von weniger als etwa 0,01 m, wie z.B. 0,001 - 0,005 m haben. Hat die Lösung eine höhere Ionenstärke, kann diese leicht durch Verdünnen oder durch einfache Membrandialyse gegen Wasser oder gegen eine Pufferlösung von etwa 1 χ 10*^ m Ionenstärke verringert werden, wobei vorzugsweise der gleiche Puffer wie bei der chromatographischen Trennung verwendet wird, z.B. also Phoaphatpuffer.

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Die Natur des Salzes, das für die Ionenstärke der Ausgangslösung verantwortlich ist, ist nicht entscheidend. Phosphatsalze werden "bevorzugt, weil mit diesem Puffer der gewünschte pH-Wert von etwa 6 hei der gewünschten niedrigen Ionenstärke besonders leicht eingestellt werden kann. Andere geeignete Salze sind solche von Borsäure, Cacodylsäure, Citronensäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Collidin-HCl, Trisglycin-HCl usw. (s.a. J. Gomori, "Methods in Enzymology", Vol. I, S. 156-146 (1955)5 insbesondere die Puffer 3Jo. 5-8 und 10 - 18).

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise insgesamt bei einem pH-Wert von etwa 6, d.h., 5>7 - 6>3 durchgeführt, einschließlich der Stufe, bei der das Orgotein an dem chromatographischen Adsorbens adsorbiert wird, Jedoch hängt der Erfolg der selektiven Eluierungsstufe mehr als der der Adsorptionsstufe von dem pH-Vert ab. Deshalb kann, auch wenn dies nicht vorgezogen wird, die' Ausgangslösung aus löslichen Proteinen einen geringfügig höheren oder niedrigeren pH-Wert, z.B. 4-8 haben. In einem solchen Falle sollte das chromatographische Adsorbens vor dem Beladen mit der Probe ins Gleichgewicht gebracht und danach auf den Eluierungs-pH-Wert von etwa 6 eingestellt werden, bevor daran gegangen wird, das Orgotein daraus zu eluiexen.

Das in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete, chromatographische Adsorbens ist ein Ionenaustausch-Harz, das schwach basische Gruppen aufweist, die auf saure Ionen anziehend wirken. Beispiele hierfür sind die bekannten Cellulose- und Polysacoharid-Ionenaustauschharze, einschließlich der niederen Alky.laminoalkyl-Cellulosen, z.B. Diäthylaminoäthyl-Cellulose (DÄAÄ), Triäthylaaiinoäthyl-Cellttloee (TÄAÄ), Diäthylasainoäthyl-Sephadex und QAÄ-Sephadex (quaternäres aminoäthyliertes, vernetztes Dextran-Harz). Die verwendeten Harze sollten eine vergleichsweise geringe Adsorptionskapazität, z.B. von etwa 1,0 bis 5 Milliäquivalenten pro Gramm haben. DÄAl-Cellulose z.B. kann z.B. eine Kapazität von 1,0 Milliäquivalenten/g (Trockengewicht), DÄAA'-Sephadex von 3»5 + 0,5 Millival/g und TÄAÄ-Sephadex von 0,55 bis 0,75 Millival/g haben. DÄAÄ-Cellulose, TÄAÄ-Cellulose und vernetzte Dextran-Harze, die Diäthylaminogruppen, und zwar insbesondere die oben erwähnten, aufweisen, werden bevorzugt. Pasrige DÄAÄ-Cellulose wird bevorzugt, weil ihre Fließgeschwindigkeit höher als die der feinkörnigen Formen ist. Dafür haben die letzteren ein etwas höheres Auflösungsvermögen·

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Das Orgotein wird durch selektive Eluierung von dem Ionenaustausch-Harz isoliert, Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Orgotein zusammen mit anderen Proteinen an dem Ionenaustauschharz adsorbiert, dann werden alles Hämoglobin und andere, nichtadsorbierte Proteine von dem Harz abgetrennt, und schließlich wird das Orgotein selektiv von dem Harz eluiert und aus der Fraktion des üluats gewonnen, die im

wesentlichen reines Orgotein enthält. In allen diesen Stufen bildet das Harz normalerweise die Schicht einer Chromatographiersäule. Jedoch kann das Verfahren beliebig variiert werden, indem z.B. das Harz mit der Ausgangslösung aus löslichen Proteinen aufgeschlämmt wird.

Die angewandte Menge an Ionenaustauschharz ist nicht kritisch, beeinflußt jedoch die Ausbeute und Reinheit des gewonnenen Orgoteins. Vorzugsweise werden etwa 0,25 bis 0,5 ml Harz pro 100 mg extrahierte Proteine verwendet, wenn man davon ausgeht, daß das verwendete Gewebe etwa 15 5^ lösliche Proteine enthält. Ein größeres Verhältnis (Vol/Gew) von Harz zu Proteinen bringt keine besonderen Vorteile gegenüber einem Verhältnis von etwa 0,5 ml/100 mg.

Da Hämoglobin und Myoglobin in der Ausgangslösung der Proteine unterhalb ihres isoelektrischen Punktes nicht an dem Ionenaustauschharz adsorbiert werden, können sie neben anderen nichtadsorbierten Proteinen bequem entfernt werden, indem die Säule mit einem wässrigen Eluierungsmittel, vorzugsweise einem solchen mit einem pH-Wert von etwa 6, gewaschen wird. Um ein Auswaschen des Orgoteins zu verhindern, sollte die Ionenstärke des wässrigen Mediums kleiner als etwa 0,01 m sein. Wasser oder vorzugsweise ein Puffer der oben definierten Art, insbesondere Phosphatpuffer, können in dieser Verfahrenastufe verwendet werden. Häufig ist nur ein Mehrfaches des Hohlraumvolumens der Säule erforderlich, um die Säule von Hämoglobin und anderen nichtadsorbierten Proteinen zu klären. An der Farbe des Ausflusses kann die Hämoglobinentfernung leicht verfolgt werden.

Die nächste Stufe nach der Entfernung des Hämoglobins und anderer nichtadsorbierter Proteine aus der Säule ist die Trennung des Orgoteins von den anderen adsorbierten Proteinen, und zwar in einer Weise, daß ein Eluat erhalten wird, welches weitgehend reines Orgotein enthält. Dies kann dadurch erreicht werden, daß das Orgotein selektiv von der Säule

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eluiert wird, indem ein. wässriges Eluierungsmittel mit einem pH—Wert von etwa 6, d.h., 5*7 ^bis 6j3» und wechselnder Ionenstärke verwendet wird, so daß die adsorbierten Proteine nacheinander eluiert werden,. Ein wichtiges Alerkmal dieser Erfindung, bei der in einer einzigen ehromatographisehen Stufe weitgehend reines Orgotein isoliert wird, ist die Eluierung der Proteine in einer Aufeinanderfolge, bei der eine Eluatfraktion erhalten wird, die weitgehend reines Orgotein enthält. Um dies zu erreichen, werden die adsorbierten Proteine nach und nach von der Säule eluiert, und der Gehalt des Eluats an zweiwertigen Metallen sowie vorzugsweise auch seine ■&„£(-"" und A₂₈₀-Absorptionen werden verfolgt.

Wie bereits oben gesagt wurde, ist es wichtig, daß der pH-viert des EIuierungsmittels etwa 6 bei der verwendeten Ionenstärke ist. Bei anderen pH-Werten werden andere Proteine zugleich mit den Orgotein in solchen Mengen eluiert, daß anstelle von weitgehend reinem Orgotein stark verunreinigtes Orgotein gewonnen wird.

Eine bequeme Methode für die aufeinander folgende Eluierung der adsor« bierten Proteine von dem Harz besteht darin, einen Puffer mit allmählich zunehmender Ionenstärke von etwa Q,01 m bis etwa 0,03 m zu verwenden. Im Falle der Verwendung von DAAA-Cellulose wird ein großer Teil der unerwünschten Proteine bei einer Ionenstärke von weniger als 0,02 m eluiert. Das Orgotein wird mit einem Puffer von ungefähr 0,02 - 0,03 m eluiert, und die restlichen unerwünschten Proteine werden bei höheren Ionenstärken eluiert. Im allgemeinen wird als höchste End-Ionenstärke etwa 0,1 m bis zu etwa 2 m angewendet, um sicherzustellen, daß die Säule vollständig leergewaschen ist und zur Wiederverwendung regeneriert werden kann.

Anstelle einer graduell zunehmenden Ionenstärke kann eine stufenweise zunehmende lonenfftärke verwendet werden, z.B. etwa 0,001 - 0,005 ffl. zur Eluierung der leicht auswaschbaren Proteinverunreinigungen, etwa 0,02 0,03 πι zur Eluierung des Orgoteins, und etwa 0,1 - 2,0 m zur Klärung der Säule von restlichen Proteinverunreinigungen.

Unabhängig davon, ob das Harz mit einem Puffer von kontinuierlich zunehmender Ionenstärke oder einem von stufenweise zunehmender Ionenstärke

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eluiert wird, ist es, um Orgotein von hoher Reinheit zu erhalten» wichtig, daß ein möglichst scharfer Fraktionsschnitt genommen wird. Zu einem gewissen Maße muß also die erzielbare Gesamtausbeute gegen die erzielbare Reinheit abgewogen werden· Wenn der Schnitt jedoch genau bei dem optimalen Punkt genommen wird, wird eine hohe Ausbeute an weitgehend reinem Orgotein erzielt. Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist daher die genaue Bestimmung des Punktes, an dem der Orgotein-Schnitt genommen werden muß.

Dieser Funkt, d.h., die Lage derjenigen Fraktion des fluate, die im wesentlichen reines Orgotein enthält, wird bestimmt, indem der Gehalt des Eluats an zweiwertigen Metallen und vorzugsweise auch mindestens eine der 280- und 265 nm-Absorptionen des Eluats gemessen werden, und zwar kontinuierlich oder in häufigen, regelmäßigen Abständen» Da das Eluierungsmittel normalerweise keine nennenswerten Mengen an zweiwertigen Ivletallionen enthält, kann die Eluierung des Orgoteins an einem deutlichen Anstieg des Gehalts des Eluats an zweiwertigen Metallen er-» kannt werden. Orgotein liegt in seinem natürlichen Zustand als ein gemischtes Cu-Zn-Chelat vor, so daß die Messung des Kupfer- und vorzugsweise auch des Zinkgehalts die Möglichkeit der genauen Bestimmung des Orgoteins im Sluat bietet.

Um einen Orgotein von höchster Heinheit enthaltenden Fraktionsschnitt zu erhalten, werden auch die A₂₈₀- und A-g,--Absorptionen des Eluats gemessen. Innerhalb der Eluatfraktion, die erhebliche Cu- und Zn-Gehalte aufweist, wird dieser Orgoteinschnitt an der Stelle begonnen, an der ein Anstieg im Cu- und Zn-Gehalt und ein gleichzeitiger Abfall in den 265- und 2Θ0 nm-Absorptionen beobachtet werden. Das Ende des Schnittes wird angezeigt durch einen steilen Abfall in den Cu- und Zn-Gehalten und einen steilen Anstieg der 265- und 280 nm-Absorptionen. Zur Bestimmung dieser Punkte bracht nur eine der Cu- oder Zn-Gehalt© und der 265- oder 280 nm-Absorptionen gemessen zu werden. Vorzugsweise werden jedoch alle vier Vierte bestimmt. Wenn sowohl die 265- als auch die nm-Absorption gemessen werden, kann der Beginn des Orgoteinschnitts auch am Ap-'c/Aporj-Verhältnis erkannt werden; der Orgoteinschnitt wird dann an der Stelle genommen, an der dieses Verhältnis einen Höchstwert erreicht, d.h., nahe oder größer als 1 ist. Das Ende des Orgoteinschnitts

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liegt an der Stelle, an der das A„/-^/A -Verhältnis wieder abfällt und eine Zunahme an Itficht-Ürgotein-Proteinen anzeigt.

Eine "bequeme Methode zur sofortigen Bestimmung des Gehalts an zweiwertigen Metallen ist die atomare AlDSorptiohsspektrophotometrie. Ein brauchbares Gerät für die gleichzeitige Messung von Kupfer und Zink ist das Kodell 353 der Instrument Laboratories Inc., Lexington, Mass., V.St.A.

Die A₂₈₀- und A ,-,.-Absorptionen können kontinuierlich oder intermittie- ±end bestimmt werden, oder ihr Verhältnis zueinander kann direkt mittels eines Differentialspektrophotometers aufgezeichnet werden.

In der Zeichnung sind die Kurven des Cu- und Zn-Gehalts und der A./.- und A₀₀„-Absorption des Hluats der in Beispiel 2 beschriebenen Ionenaustausch-Chromatographie wiedergegeben. Die Messungen wurden an jedem aliquoten Teil des Bluats vorgenommen. Wie die Kurven zeigen, steigen die Kupfer- und Zinkgehalte steil an, wenn die. Kolarität des Sluats etwa 0,018 m erreicht. Hachdem ein Maximum bei etwa 0,022 - 0,025 ^m erreicht ist, fallen diese Gehalte wieder steil ab. Die Apg^- Α_?ο₀~ Absorptionen lassen bei 0,022 m eine starke Zunahme an Nicht-Orgotein-Proteinen in einem Abfall des A-v^/Ap^-Verhältnisses erkennen. Daran schließt sich ein allmählicher Anstieg in den Absorptionen bis zu einem Maximum bei. etwa 0,04 m an.

Nach einer anderen Ausführungsform können das Orgotein und andere restliche, adsorbierte Proteine gleichzeitig von der Ionenaustauschsäule eluiert -werden, z.B. mit einem 0,005 m-Phosphatpuffer, der mit ITaCl auf eine Ionenstärke von etwa 0,02 - 0,04 gebracht wurde, und Orgotein kann aus dem Gemisch von eluierten Proteinen durch eine Wärmebehandlung, eine zweite chromatographische Trennung an einem basischen Ionenaustauschharz oder durch irgend eine Kombination dieser Maßnahmen abgetrennt werden.

Reines Orgotein kaun durch eine Wärmebehandlung des mittels DÄAÄ-Cellulose vorgereinigten ürgoteins gewonnen werden, wie es in der US-PS 3»579*494 beschrieben ist. Eine zweite chromatographische Reinigung durch Ionenaustausch kann nach dem oben beschriebenen Verfahren oder nach dem in der US-Patentanmeldung S.IT. 3>538 vom 16.1.70 beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.

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Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die Säule, die von allen daraus entfernbaren Proteinen mit einem Eluiarungsmittel mit einer Ionenstärke unter etwa 0,01 m befreit worden ist, von allen oder fast allen restlichen daran adsorbierten Nicht-Orgotein-Proteinen geklärt,

indem die Säule für etwa 5-20 Minuten auf 65 - 70°C erwärmt wird, zu welchem Zwecke z.B. eine erwärmte 0,005 m-Phosphatpufferlösung hindurchgeleitet wird.

Orgotein kann aus dem Eluat in herkömmlicher Weise isoliert werden, z.B. durch Lyophilisierung, vorzugsweise im Anschluß an eine Dialyse gegen entsalztes Wasser zum Zwecke der Entfernung von Pufferionen.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierte Orgotein ist von hoher Qualität und kann injeziert werden, ohne daß immunologische Nebenreaktionen eintreten. Wie in der US-PS 3,579,494, der Be-PS 687,828 und der GB-PS 1,160,151 beschrieben ist, kann Orgotein u.a. als entzündungshemmendes Mittel angewendet werden. Das derart isolierte Orgotein kann jedoch Spuren an Premdproteinen enthalten, die, auch wenn sie keine sofortige immunologische Nebenreaktion hervorrufen, dies möglicherweise bei langzeitiger, parenteraler Verabreichung tun. Diese Spurenproteine können nach mehreren Methoden entfernt werden. Eine Möglichkeit ist die Gelfiltration unter Verwendung eines mikroporösen Harzes, z.B. Sephadex G-75 (mit Epichlorhydrin vernetztes Dextran-Harz). Das Sephadex muß nach Vorschrift gequollen, raffiniert und gewaschen werden. Die gepackte Säule wird mit (0,05 m Tris-HCl, pH 7,5,. 0,005 m Glycin, 0,15 m KCl, ΙΟ*⁴ Cu⁺⁺, 10"⁵ Zn⁺⁺)-Puffer ins Gleichgewicht gebracht und auf eine Pließgeschwindigkeit von etwa 2,0 ml/ml/h eingestellt. Die Zugabe von 5 - 10 % Dextrose oder Saccharose zu der Lösung ermöglicht eine gleichmäßigere Aufnahme und verbessert damit die anschließende Auflösung.

Nach dem Aufgeben auf die Säule wird diese mit zusätzlicher Pufferlösung entwickelt. Individuelle Fraktionen werden aufgefangen. Das Auftreten von Spitzen wird überwacht, indem die Absorption überall zwischen 200 und 280 nm gemessen wird.

Ultrareines Orgotein kann auch aus dem von DÄAÄ-Cellulose desorbierten Orgotein durch eine nachträgliche Wärmebehandlung des Teils des Eluats gewonnen werden, der das Orgotein und C und Zn enthält, z.B. bei

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65 - 75 C für 15 min» bei pH 5>8 mit anschließender Zentrifugierung und Dialyse, oder durch eine zweite ehromatographische Reinigung an ■DA'AÄ-Cellulose-Austauschharz, oder durch Behandeln mit einem proteolytischen Enzym, wie oben erwähnt.

Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele näher erläutert, in denen bevorzugte Ausführungsformen beschrieben sind.

Beispiel 11 Orgotein aus Rinderleber

212 g Rinderleber werden in Streifen von 2 cm Breite-geschnitten, das Zwischengewebe und die Blutgefäße werden entfernt, Blut wird ausgewaschen, und dann wird in einem Schnellmixer (Osterizer) mit Höchstgeschwindigkeit mit 5,8 ml eines Puffers (0,025 m Tris-HCl, pH 7,5; 0,3 m Saccharose; 0,05 m KGl) pro g Leber homogenisiert. Nun wird mit 20 000 G bei O⁰C 60 min. zentrifugiert, das Zentrifugat abgetrennt, die. überstehende Lösung in 0,005 m Phosphatlösung (pH 6,0) dialysiert, erneut zentrifugiert und durch ein mikroporöses Filter (Versapore) filtriert, wobei eine klare Lösung erhalten v/ird.

Das Filtrat wird direkt auf eine Ionenaustausch-Säule aus Diäthylaminoäthyl-Cellulose (etwa 40 Si 2,5 cm χ 40 cm, DA-23 fasrig) gegeben. Die Säule wird bei einer Fließgeschwindigkeit von 200 ml/h mit 1 Liter Phosphatpuffer (0,005 m; pH 6,0) und danach mit 4 Liter des gleichen Puffers, der ITaCl in einer solchen kontinuierlich zunehmenden Menge ent-

-2 hält, daß ein flacher Gradient von 0 bis 7,5 x 10 m erhalten wird, bei einex Fließgeschwindigkeit von 200 ml/h gewaschen· Die Ap,-,.- und A_90n-Absorptionen des Eluats werden gemessen und seine Cu- und Zn-Gehalte kontinuierlich durch Atomabsorptionsspektrophotometrie verfolgt. Nachdem 1 Liter Eluat aufgefangen worden ist, der kein NaCl enthält, und 750 ml Eluat, die allmählich zunehmende Mengen an NaCl oder KGl enthalten (an dieser Stelle hat die Molarität allmählich einen Viert von etwa 0,018 m erreicht), sinken die A₂^t-- ^und A_2ßQ-Absorptionen auf niedrige Werte ab, und die Cu- und Zn-Gehalte steigen steil an. Das Eluat, das danach bis zu dem Punkt aufgefangen wird, an dem der Gu-Gehalt wieder

-2 auf einen Tiefstwert abfällt und die Molarität etwa 2,8 χ 10 erreicht (550 ml Eluat), enthält 240 mg Orgotein von guter Reinheit. Je enger der von diesem Teil des Eluats genommene Schnitt ist, desto reiner ist das

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hieraus isolierte Orgotein und desto geringer dessen Ausbeute.

Orgotein von höchster Reinheit befindet sich in dem Eluat, das eine Ionenstärke von 0,022 m hat (bei 990 ml Gesamteluat). An dieser Stelle zeigen die Cu- und Zn-Absorptionen Spitzenwerte. Dialyse der 750 1.300 ml-Praktion des Eluats gegen Wasser bis zu einer Leitfähigkeit von 0,04 &mho, Filtration durch ein Mikroporenfilter (Millipore 0,224} und sterile Lyophiliaierung, vorzugsweise nach Mischen mit etwa dem doppelten Gewicht an Saccharose, bezogen auf Orgotein, liefert isoliertes, 100$ig aktives, nichtantigenes, injezierbares Orgotein von einer Qualität, die mit der des Orgoteins vergleichbar ist, das zur Zeit für die Veterinärmedizin im Handel ist.

Gewünschtenfalls kann auch das Waschen der Säule zur Entfernung nichtadsorbierter oder schwach adsorbierter Proteine vor der Sluierung des Orgoteina bei konstanter Ionenstärke oder stufenweise oder kontinuierlich zunehmender Ionenstärke vorgenommen werden, indem z.B. die Säule mit der oben beschriebenen Pufferlösung mit der Ionenstärke von etwa 0,012 m bis etwa 0,015 m eluiert wird, bis die A-g,-- und A_28Q-Absorp-

tionen auf Tiefstwerte fallen, worauf das Orgotein bei konstanter (z.B. 0,02 m) oder stufenweise oder kontinuierlich innerhalb des Bereichs von etwa 0,018 bis etwa 0,028 ansteigender Ionenstärke eluiert wird. Die Säule kann dann von restlichen adsorbierten Froteinen geklärt werden, indem die Ionenstärke des Eluierungsmittels auf etwa 0,1 m oder höher eingestellt wird.

Nach dem Verfahren des Beispiels 1 werden vergleichbare Ergebnisse auch bei Verwendung von TÄAÄ-Cellulose und einem Diäthylaminoäthylgruppen enthaltenden, vernetzten Dextran-Harz (DÄAÄ-Sephadex) erzielt.

Desgleichen werden nach dem Verfahren des Beispiels 1 vergleichbare Ergebnisse dann erhalten, wenn von löslichen Proteinen ausgegangen wird, die aus Hinderhirn, -nieren, -milzen, -lungen, -testikeln, -bauchspeicheldrüse, -thymusdrüsen, -eingeweiden - und -muskeln, oder aus den gleichen Geweben vom Schaf, Pferd, Huhn oder Schwein extrahiert wurden.

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Beispiel 2: Orgotein aus Rinderleber

Es wird nach dem Verfahren des Beispiels 1 vorgegangen, wobei als Ionenaustauseh-Harz DE-52, mikrokörnige DlAÄ-Cellulose verwendet wird. Dieses Harz hat den Vorteil einer schärferen Trennung des Orgoteins von den anderen Proteinen, jedoch den Nachteil geringerer Fließgeschwindigkeit.

Der Eluierungsgradient für den Orgoteinschnitt liegt zwischen 0,020 und 0,025 m (Röhrchen 85 bis 110 von je 10 ml), wobei 165 mg Orgotein von guter Reinheit erhalten werden. Vorzugsweise wird der Schnitt bei 0,020 bis 0,025 m (Röhrchen 85 bis 100) genommen, weil der engere Schnitt Orgotein von größerer Reinheit ohne nennenswerten Verlust* an Orgotein liefert. Noch enerere Schnitte, z.B. die Röhrchen 88 bis 92, ergeben geringere Ausbeuten an Orgotein von noch größerer Reinheit.

Beispiel 3^S Vorgereinigtes Orgotein

Gewünschtenfalls kann ein Teil ,der aus Leber -gemäß Beispiel 1 extrahierten, löslichen Proteine einer Vorreinigungs-Fraktionierung mittels Ammoniumsulfat unterworfen werden. Dazu wird die überstehende Lösung (etwa1.600 ml, pH 6,5 - 6,8) des zentrifugierten Extrakts mit 3 η NH, OH auf pH 7,5 eingestellt. 25 g festes Ammoniumsulfat pro 100 ml werden bei Raumtemperatur unter Rühren zugesetzt, um die Lösting su 40 fo zu sättigen. Der pH-Wert von 7,5 wird ständig beibehalten. Das Rühren wird für weitere 30 min. bei Raumtemperatur fortgesetzt, dann wird der reichliche Niederschlag mit 20.000 G bei 0°C etwa zwei Stunden zentrifugiert. Das überstehende wird abdekantiert und mit 10 </olgex H₃SO. bei 4°C bis pH 5,0 titriert; danach werden 22 g oder 35 g/100 ml festes (NH.)₂S0. nach und nach zugesetzt, um die Lösung zu 70 oder 80 fo zu sättigen. Der reichliche niederschlag wird mit 20.000 G bei O⁰C etwa eine Stunde zentrifugiert. Das Überstehende wird verworfen, der Niederschlag wird in dem kleinstmöglichen Volumen (100 ml) entsalztem Wasser aufgelöst. Dann wird in 0,005 m Phosphatpuffer (pH 6,0) dialysiert, bis kein SO. mehr nachzuweisen ist (etwa 6 Wechsel von je 4 Liter). Nun wird durch Zentrifugieren mit 20.000 G bei 0°C geklärt. Das Überstehende wird auf 6,0 eingestellt. Diese Lösung kann' auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise auf eine BÄAÄ-Cellulose-Säule gegeben werden.

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Nachgereinigtes Orgotein

Um ultrareines Orgotein zu gewinnen, wobei ein als Molekularsieb wirkendes mikroporöses Gel verwendet wird, wird das gemäß Beispiel 1 erhaltene Orgotein-Lyophilisat in 0,05 m Tris-HCl-Puffer (pH 7,5; 0,15 m KCl; 0,005 m Glycin; 0,02 </o Natriumazid; 10~⁴ Cu⁺⁺; 10"^ Zn⁺⁺; 4°C) in einer Konzentration von etwa 70 mg/ml gelöst. Nötigenfalls wird durch Zentrifugieren geklärt, Die Lösung wird auf eine G-75-Sephadex-Säule (5,2 χ $6 cm, Schichtvolumen etwa 775 ^1) gegeben, die mit dem gleichen, 10 m Cu⁺⁺ und 10"^m Zn⁺⁺ enthaltenden Puffer kalibriert wurde. Das Eluat wird in 5»4 ml-Praktionen aufgefangen, und deren A«/-^- und A₀₀„-Absorptionen werden gemessen. Beginnend etwa bei Fraktion 50 steigen diese Absorptionen steil an und erreichen eine Spitze etwa bei Fraktion 68. Die Fraktionen 66 - 73 enthalten die Hauptmenge des gesamten Orgoteins in ultrareinem Zustand. Mit Fraktion 98 fallen die Absorptionen bis etwa Fraktion 116 auf Null. Die einzige Verunreinigung von Bedeutung erscheint in den Röhrchen 118 - 150.

Das in den vorstehenden Beispielen erhaltene Orgotein kann auch durch erneute Chromatographie an einem Anionaustausch-Harz weiter gereinigt werden. Zur Vorbereitung der Säule werden 30 g Whatman DÄAÄ-Cellulose-52 (mikrokörnig) in 300 ml 0,1 m Phosphatpuffer, pH 6,0 gerührt. Die Aufschlämmung wird absitzen gelassen und das Überstehende abdekantiert. Dann wird 0,01 m Phosphatpuffer, pH 6,2 zugesetzt und das Gemisch sorgfältig gerührt. Die Aufschlämmung wird 10 min. absitzen gelassen und das Überstehende abdekantiert. Die Cellulose wird mit der Ausgangspufferlösung gewaschen, bis der pH-Wert und die Leitfähigkeit konstant blei* bende Werte angenommen haben. Um eingeschlossene Luft und Kohlendioxid zu entfernen, wird die Aufschlämmung unter schwaches Vakuum gesetzt. Diese Aufschlämmung wird sofort zum Packen der Säule verwendet. Wird die Aufschlämmung langer als eine Woche mit Puffern oder Polyelektrolyten in Berührung gelassen, sollte ein Schutzmittel, wie z.B. Toluol, zugesetzt werden.

Eine Glaskolonne von 1,5 cm Durchmesser wird mit einem Nylon-Netz ausgerüstet, und ein Millipore-Filter wird als Stützkörper am Boden vertikal eingebaut. Die Kolonne wird mit 0,01 m Natriumphosphatpuffer, pH 6,2 ge-

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füllt und die ins Gleichgewicht gebrachte und relativ dicke DÄAÄ-Cellulose-Aufschlämmung (etwa 120 - I50 °/° des ursprünglichen Volumens) ■ durch einen auf die Kolonne aufgesetzten Trichter in die Kolonne eingefüllt» Der Bodenauslaß der Kolonne bleibt geschlossen, bis 1 cm der Cellulose sich am Boden abgesetzt hat, dann wird der Auslaß geöffnet. Es wird eine Säule von 20 cm gepackt, wobei Absetzzeiten von 20 - 30 min. angewandt werden. Die langsam absitzenden Feinteilchen werden am Kopf der Kolonne abgesaugt. Die Säule wird ins Gleichgewicht gebracht, indem mehrere Stunden lang oder über Nacht Ausgangs-Pufferlösung hindurchlaufen gelassen wird. Der pH-Wert und die leitfähigkeit des Eluats werden überprüft, um Gleichgewichtseinstellung zwischen Puffer und Austauscher zu gewährleisten. Die Fließgeschwindigkeit wird hydrostatisch eingestellt, indem der Puffer-Vorrat etwa 40 cm über dem Kopf der Kolonne angeordnet wird,, was zu einer Fließgeschwindigkeit von etwa 30 ml/h in einer Säule von 1,5 cn* Durchmesser und 20 cm Höhe bei einem Schichtvolumen von 30 ml führt.

100 - 200 mg des Ausgangs-Orgoteins werden in 2 - 4 ml Ausgangs-Pufferlösung gelöst, und die entstandene, grünlich gefärbte Lösung wird vorsichtig auf die Oberfläche der Schicht gegeben. Fach erfolgter Absorption erscheint die Orgotein-LÖsung als breites, grünlich gefärbtes Band in der Nähe des Kopfes der Säule. Die Kolonne wird an ein Pufferreservoir angeschlossen, und dann wird mit der Eluierung mit 0,01 m Phosphatpuffer, pH 6,2 begonnen.. 5 ml-Fraktionen werden aufgefangen, wobei ein Simplex-Fraktionensammler verwendet wird. Die Kolonne wird bei Raumtemperatur betrieben und das Eluat mit Eiswasser gekühlt. Nach dem Aufgeben der Eluierungs-Pufferlösung, die schnell nach unten abfließt, setzt sich ein bräunlich/rosafarbenes Band und tritt unmittelbar nach der Flüssigkeit aus, die das Hohlraumvolumen eingenommen hatte, wozu ein Puffervolumen von 40 - 50 ml erforderlich ist. Nachdem die Fraktionen gesammelt worden sind, die die leicht eluierbaren Verunreinigungen, enthalten, wird die Eluierung mit 0,01 m Phosphatpuffer, pH 6,2 bis zu einem Gesamtvolumen von etwa 300 ml fortgesetzt. Nachdem etwa 120 ml Eluat aufgefangen worden sind, wird zusätzliches Material schwächerer Absorption eluiert. Weiteres Material kann mit 0,01 m Phosphatpuffer, pH 6,2 nicht eluiert werden.

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Die EluierunfT des Orgoteins wird mittels einer stufenweisen oder kontinuierlichen Erhöhung der Pufferionenstärke bewerkstelligt. Solange die Ionenstärke nicht auf über etwa 0,015 m angestiegen ist, wird keine nennenswerte Eluierung beobachtet. Ab diesem Zeitpunkt wandert die Zone am Kopf der Säule als hellgrünes Band nach unten. Vollständige Eluierung wird mit 0,028 m-Puffer erreicht.

Die Eluat-Fraktionen, die das Orgotein enthalten, werden gesammelt, gründlich dialysiert und dann lyophilisiert.

Gemäß einer anderen Methode zur Nachreinigung von Orgotein werden zu den 550 ml undialysiertes Eluat aus Beispiel 1,die das Orgotein enthalten (Ionenstärke 0,018 - 0,028 m) 5 ml 10~²n Kupfer (i)-Acetat und 5 ml 10 η Zink gegeben, um deren Konzentration in dem Eluat auf etwa-10~ , bzw. 10 zu bringen. Das Eluat wird schnell auf 75 C erwärmt und bei dieser Temperatur 15 min., vorzugsweise unter Stickstoff, gehalten. Dann wird in einem Eisbad auf unter 10 C abgekühlt und der reichliche Niederschlag entfernt, worauf gegen entsalztes Wasser dialysiert wird. Die Lösung wird stabilisiert, indem 180 mg Saccharose darin aufgelöst werden. Sterilisation erfolgt mittels Filtration durch ein mikroporöses Filter in eine sterile Ampulle} die sterile Lösung kann lyophilisiert werden, wobei reines Orgotein gewonnen wird.

Gemäß Beispiel 1 erhaltenes Orgotein kann auch mit einer Carbomethoxymethylcellulose-Säule nachträglich gereinigt werden. Eine CMC-Säule von 11 ml wurde vorbereitet und mit 0,01 m Natriumacetat, pH 5t3i ins Gleichgewicht gebracht. 40 mg des über DÄAl-Cellulose gereinigten Orgoteins wurden in 0,01 φ Acetatpuffer, pH 5 »3» gelöst und gegen mehrere Wechselmengen des gleichen Puffers dialysiert. Unlösliches, soweit vorhanden, wurde abzentrifugiert, und die klare, überstehende Lösung wurde auf den Kopf der CMC-Säule gegeben. Die Fließgeschwindigkeit betrug etwa 12 ml/h. Die Säule wurde mit 30 ml einer 0,01 m Acetatlösung gewaschen, um die nichtadsorbierten Proteine zu eluieren. Dann wurde die Eluierung mit Natriumacetat, pH 5»3» Gesamtvolumen 200 ml, mit einem linearen Gradienten von 0,01 m bis 0,1 m fortgesetzt. Ultrareines Orgotein wurde bei 0,018 0,028 m eluiert und aus dem Eluat in der oben beschriebenen Weise eluiert Die vorstehenden Beispiele können mit ähnlichem Erfolg wiederholt werdt

wenn die anderen, in der Beschreibung und den Beispielen genannten Materialien und/oder Verfahrensbedingungen angewendet werden.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   1.. Verfahren zur Isolierung von Orgotein aus tierischem Gewebe, bei Vv dem ein Gemisch aus Orgotein und anderen pufferlöslichen Proteinen einer chromatographischen Trennung unterworfen wird, wobei

   a) das Gemisch aus pufferlöslichen Proteinen als wässrige Lösung mit einer Ionenstärke von weniger als etwa 0,01 m auf eine Säule aus einem schwach basische Gruppen aufweisenden Ionenaustausch-Harz gegeben wird, damit das Orgotein und ein Teil der anderen Proteine daran adsorbiert werden,

   b) die adsorbierten Proteine mit einem wässrigen Eluierungsmittel mit höherer Ionenstärke selektiv eluiert werden, und

   c) Orgotein aus dem Eluat isoliert wird,

   dadurch gekennzeichnet, daß

   1) das Gemisch der. pufferlöslichen Proteine als wässrige Lösung mit einem pH-Wert von etwa 6 und einer Ionenstärke von bis zu etwa 0,01 m auf die Säule gegeben wird,

   2) ein Teil der adsorbierten Proteine mit einem wässrigen Eluierungsmittel mit einem pH-Wert von etwa 6 und einer Ionenstärke unter etwa 0,02 m von der Säule eluiert wird,

   3) ein weiterer Teil der adsorbierten Proteine mit einem wässrigen Eluierungsmittel mit einem pH-Wert von etwa 6 und einer höheren lonenstärke von etwa 0,02 m bis etwa 0,03 m von der Säule eluiert wird, wobei mindestens eine der k-ntc- und A₂₈₀-Absorptionen verfolgt und mindestens einer der Cu- und Zn-Gehalte des Eluats gemessen v/erden, und

   4) aus dem Teil des Eluats mit der lonenstärke von etwa 0,02 - 0,03 m die Fraktion abtrennt, die den höchsten Gehalt an zweiwertigen Metallen und Tiefstwerte der A«/--- und A_?„„-Absorptionen aufweist.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein aus Leber, vorzugsweise Rinderleber extrahiertes Gemisch von löslichen Proteinen verwendet wird.

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   3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gemisch von löslichen Proteinen verwendet wird, dessen darin enthaltenes Orgotein ehe!atgebundenes Kupfer und/oder Zink enthält.

   4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3» dadurch gekennzeichnet, daß das Orgotein mit einem wässrigen ^luieruiv.'smittel eluiert wird, dessen loncnci i'lrke in einem flachen Gradienten kontinuierlich anstei "'t,

   ^lj. Verfaliren nncli einem der Ansprüche 1 bis 4> dadurch gekennzeichnet, daß als Ionenaustauschharz ein tertiäres Arninocellulose- oder -dextran-Harz verwendet wird.

   6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Auogangs^emiscli von löslichen Proteinen verwendet wird, die mit einem Puffer mit einem pH-Wert zwischen 7 ^u"d etwa 9» vorzugsweise zwischen etwa 7>5 ^u^d etwa 7>6 extrahiert worden sind.

   7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die löslichen Proteine mit einem Puffer in einem VoI./Gew.-Verhältnis zu dem tierischen Gewebe von mindestens etwa 3 * 1 extrahiert worden sind.

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