DE2440529A1

DE2440529A1 - Hyaluronidase-proeparat aus menschlicher plazenta und verfahren zu seiner gewinnung

Info

Publication number: DE2440529A1
Application number: DE2440529A
Authority: DE
Inventors: Yasuhiro Mima; Masaaki Yamada
Original assignee: GREEN CROSS CORP; Green Cross Corp Japan
Current assignee: GREEN CROSS CORP; Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1973-08-28
Filing date: 1974-08-23
Publication date: 1975-04-03
Also published as: JPS5413510B2; US3945889A; JPS5048184A; DE2440529C3; DE2440529B2

Description

" Hyaluronidase-Präparat aus menschlicher Plazenta und Verfahren zu seiner Gewinnung "

Priorität: 28. August 1973, Japan, Nr. 97 066/73

Hyaluronidase ist eine Gruppe von Enzymen,die Hyaluronsäure spaltet. Dieses Enzym kommt in der Natur verbreitet vor, beispielsweise in Testikeln von Säugetieren, Leber und Milz, Schlangengiften und bestimmten Bakterien. Es ist bekannt, daß dieses Enzym insbesondere in Testes von Säugetieren in verhältnismäßig großen Mengen vorliegt, und gewöhnlich werden zu

seiner Gewinnung Testes verwendet; vgl. Ullmanns Enzyklopädie der technischen Chemie, 3. Auflage, Bd. 7 (1956), S. 402-403.

Hyaluronidase wirkt als Ausbreitungsfaktor ("spreading factor") in Haut und Bindegewebe. Hyaluronidase wird in der Human- und Veterinärmedizin zur Erleichterung und Beschleunigung der subkutanen Infusion auch größerer Fliissigkeitsmengen (Salz- oder Glucose Lösungen, Plasma) verwendet. Auch andere Injektionen worden erleichtert und oft in Lhror i/lrksaiakot t gesteigert, z.U. bei Aruer. Lhet i:-.n , AntibLo t Lca, Antiseren und !Umtgenkon-

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trastmitteln. Auch die Wirkung von Aerosolen zur Inhalation wird oft durch Hyaluronidasezusatz verstärkt.

Hyaluronidase-Präparate aus den vorgenannten Quellen können bei ihrer Verabfolgung durch Injektion erhebliche Nebenwirkungen infolge ihres Gehalts an heterogenen Proteinen hervorrufen.

Über die Gegenwart von Hyaluronidase in menschlichem Plazentagewebe sowie die physiologische Bedeutung und die klinische Rolle des Enzyms ist bis jetzt noch wenig veröffentlicht worden; vgl. F. Scarpa, A. Panazzolo, M. Tanfema und P.F. Pavetto, BoIl. Soc. Ital. Biol. Sper., Bd. 45 ,(1969), Seiten 217 bis 220, I.P. Homenyuk, Pediatr. Akush. Hinekol. Bd. 34 (2) (1972), Seiten 44 bis 46,und N.P. Rudyuk, Nekotorye, Vopr. Patol. Beremennosti i Rodov, Vinnitsk, Med. Inst. Vinnitsa, i960, Nr. 2, Seiten 251 bis 258. Bis jetzt sind keine Veröffentlichungen über die Isolierung oder Gewinnung von Hyaluronidase aus menschlicher Plazenta bekannt geworden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Hyaluronidase-Präparat zu schaffen, das bei parenteraler Verabfölgung an Menschen keine störenden Nebenwirkungen infolge eines Gehalbes von heterogenen Proteinen hervorruft. Eine weitere Aufgabe dor Erfindung ist es, ein Verfahren zur Gewinnung dieser Hyaluronidase aus leicht zugänglichen Quellen ?u schaffen. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem Überraschender= Beuui'i, daß menschliche Plazenta Hyaluronidase in verbal t:a L Im-VAl^

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großen Mengen enthält und leicht aus Plazentagewebe isoliert werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Hyaluronidase-Präparat aus menschlicher Plazenta mit einem Molekulargewicht von etwa 70 000, einem isoelektrischen Punkt von etwa 5,2, einem pH-Optimum von 3,6 bis 4,0 und einer Stabilität von mindestens 24 Stunden in wäßriger Lösung bei Temperaturen unterhalb 30 C und einem pH-Wert von 6 bis 7. . .

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Gewinnung des Hyaluronidase-Präparats, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man menschliches Plazentagewebe mit einer wäßrig-alkalischen Lösung mit einem pH-Wert von 7,5 bis 10,5 extrahiert, aus dem erhaltenen Extrakt die Globulinfraktioh isoliert, die Globulinfraktion an einem Anionenaustauscher adsorbiert, der mit einer 0,005 bis 0,01 molaren Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,0 bis 8,5 äquilibriert worden ist, die adsorbierte Hyaluronidase mit einer Pufferlösung erhöhter Molarität und/ oder erniedrigtem pH-Wert eluiert und die erhaltene Hyaluronidase-Fraktion der Gelfiltration unterwirft.

In der Praxis wird das erfindungsgemäße Verfahren folgendermaßen durchgeführt:

Frische oder gefrorene menschliche Plazenta wird gegegebenenfalls nach dem Waschen zur Entfernung von Blut im Fleischwolf zerkleinert und mit einer wäßrig-alkalischen Lösung mit einem pH-Wert von 7,5 bis 10,5 homogenisiert. Alle Arbeitsgänge werden vorzugsweise bei einer Temperatur unterhalb 5⁰C durchge-

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führt. Unlösliche Stoffe werden abfiltriert oder abgeschleudert. Man erhält einen klaren Extrakt. Durch die Extraktion mit der wäßrig-alkalischen Lösung mit einem pH-Wert von 7,5 bis 10,5 wird die Hyaluronidase in maximaler Ausbeute gewonnen und in diesem pH-Bereich ist das Enzym während der Extraktion stabiler als in saurem Medium.

Als Base für die wäßrig*-alkalische Lösung können Ammoniumhydroxid, Natriumhydroxid, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, verschiedene Salze der Borsäure und vorzugsweise alkalische Puffersubstanzen verwendet werden, die die vorgenannten basisch reagierenden Verbindungen enthalten.

Aus dem erhaltenen klaren Extrakt wird in an sich bekannter Weise durch Fraktionierung eine Globulinfraktion gewonnen. Beispielsweise kann die Fraktionierung durch fraktionierendes Aussalzen mit Ammoniumsulfat, fraktionierende Fällung mit einem wasserlöslichen Alkohol, durch Zinkacetat oder durch Elektrophorese erreicht werden. Auf diese Weise wird eine Trennung von Hemoprotein, wie Hemoglobin, und gefärbten Proteinen erreicht. Das günstigste Fraktionierungsverfahren ist die fraktionierende Fällung mit Ammoniumsulfat oder mit einem wasserlöslichen Alkohol. Besonders gute Ergebnisse werden mit der fraktionierenden Fällung mit Ammoniumsulfat erhalten. Bei der fraktionierenden Fällung mit Ammoniumsulfat wird der erhaltene Extrakt auf einen pH-Wert von 6,5 bis 7,5 eingestellt und mit kristallinem Ammoniumsulfat oder einer konzentrierten wäßrigen Ammoniumsulfatlösung unter kräftigem Rühren bis zu 40 bis 50prozentiger Sättigung versetzt. Die entstandene Fällung wird

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durch Zentrifugieren isoliert. Diese Fällung bzw. Globulinfraktion enthält nahezu die Gesamtmenge an Hyaluronidase, die in der eingesetzten Plazenta vorhanden war. Gleichzeitig sind große Mengen an Verunreinigungen, wie Heraoprotein im ursprünglichen Plazentagewebe, wirksam abgetrennt worden. Ferner gelingt es auf diese Weise, das große Volumen des ursprünglichen Extraktes auf ein kleines Volumen in Form einer Ausfällung zu reduzieren. Die fraktionierende Ausfällung mit Ammoniumsulfat kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden, da das Ammoniumsulfat auf das Enzym eine stabilisierende Wirkung und gleichzeitig eine bakteriostatische Wirkung entfaltet.

Zur fraktionierenden Ausfällung mit einem wasserlöslichen Alkohol wird vorzugsweise Äthanol oder Isopropanol verwendet. Bei Verwendung von Äthanol beträgt die Endkonzentration etwa 20 . bis 25 Prozent und der pH-Wert 6,5 bis 8,5. Obwohl die Fraktionierung mit Äthanol gewöhnlich ziemlich genaue Bedingungen hinsichtlich der Temperatur, des pH-Werts und der Ionenstärke erfordert, unterscheidet sich das Verfahren hinsichtlich Ausbeute und Reinheit nicht wesentlich von der Fraktionierung mit Ammoniumsulfat.

Die als Fällung erhaltene Globulinfraktion ist durch blutdrucksenkende Faktoren, blutähnliche Substanzen, Hemoproteine und andere Substanzen noch erheblich verunreinigt. Sie muß daher weiter gereinigt werden. Zur Abtrennung dieser Verunreinigungen wird die Globulinfraktion mit einem Anionenaustauscher be·=· handelt, an dem die Hyaluronidase selektiv adsorbiert wird. Zu diesem Zweck wird die erhaltene Fällung in einer geringen

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Menge Wasser gelöst und das in der Lösung vorhandene Ammoniumsulfat wird durch Dialyse gegen Wasser abgetrennt. Sodann wird das. Dialysat mit einem Anionenaustauscher zusammengebracht. Die selektive Adsorption der Hyaluronidase wird so durchgeführt, daß man das Dialysat mit dem Anionenaustauscher bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 8,5 in einer Pufferlösung verminderter Molarität von etwa 0,005 bis 0,01 molar zusammenbringt. Das Dialysat wird also mit einem etwa 0,005 bis

0,01 molarem Puffer, wie Phosphatpuffer oder Tris-(hydroxyraethyl) · aminomethan-Puffer, bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 8,5 äquilibriert und auf eine mit einem Anionenaustauscher gefüllte Säule gegeben, die vorher mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist. Die Hyaluronidase im Dialysat wird auf diese Weise selektiv am Anionenaustauscher adsorbiert.

Als Anionenaustauscher kann in dieser Stufe beispielsweise ein Polysaccharidgel mit basischen Gruppen, wie Diäthylaminoäthyldextran (DEAE-Sephadex) und Diäthylaminoäthylcellulose (DEAE-Cellulose), ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat mit basischen Gruppen, wie Dowex 1, d.h. ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat mit quartären Ammoniumgruppen, oder ein Phenol-Formaldehyd-Kondensat mit basischen Gruppen, wie Amberlite XE, verwendet werden.

Danach wird der Anionenaustauscher mit der gleichen Pufferlösung gewaschen, die zum Äquilibrieren verwendet wurde, um die nicht adsorbierten Verunreinigungen abzutrennen. Hierauf wird die Hyärulonidase mit der gleichen Pufferlösung eluiert, die jedoch, eine erhöhte Molarität besitzt, beispielsweise 0,02 bis

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0,10 molar, bei gleichem oder niedrigerem pH-Wert, oder mit einer Pufferlösung mit niedrigerem pH-Wert, beispielsweise 6,5 bis 5,0.

Die eluierte Hyaluronidase-Fraktion wird sodann der Gelfiltration durch ein stark vernetztes Polysaccharidgel-Molekularsieb, wie Sephadex G-150 oder G-2oO (ein vernetztes Dextran), oder Sepharose 6-B (Agarosegel) oder einem Polyacrylamidgel-Molekularsieb, wie Biogel P-100 oder P-150, einem Acrylamid-Methylenbisacrylamid-Copolymerisat, unterworfen. Das Filtrat kann lyophilisiert werden. Man erhält ein Hyaluronidase-Präparat in Form eines weißen Pulvers.

Nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren wird ein Hyaluronidase-Präparat mit befriedigenden Eigenschaften erhalten. Ein : Präparat mit höherer Aktivität kann dadurch hergestellt werden,

man ' .

daß/die aus dem Extrakt isolierte Globulinfraktion zunächst entweder mit einem Kationenaustauscher, der mit einer etwa 0,01 bis 0,05 molaren Pufferlösung bei einem pH-Wert von etwa 5 bis 7 äquilibriert worden ist, oder mit einem Anionenaustauscher, der der gleiche sein kann, wie er in dem vorstehend geschilderten Verfahren verwendet wurde und der mit einer etwa 0,1 bis 0,2 molaren Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 6,0 bis etwa 7,0 äquilibriert worden ist, behandelt, um zunächst unerwünschte Verunreinigungen selektiv zu adsorbieren und dadurch abzutrennen. · .

Als Kationenaustauscher kann beispielsweise ein Polysaccharidgel, wie Carboxymethylcellulose (CM-Cellulose), Carboxymethyl-

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dextran (CM-Sephadex), oder ein Methacrylsäure-Divinylbenzol-Copolymerisat, wie Amberlite IRC-5O, verwendet werden. Die selektive Adsorption wird in an sich bekannter Weise durchgeführt.

In beiden Fällen wird die Pufferlösung, die durch den jeweiligen Ionenaustauscher geleitet wird, und die weiter gereinigte Hyaluronidase enthält, mit dem Anionenaustauscher unter den vorgenannten Bedingungen zusammengebracht. Es wird eine besser gereinigte Hyaluronidase-Fraktion erhalten, die anschließend der Gelfiltration unterworfen wird.

Die in der Globulinfraktion enthaltenen Verunreinigungen können auch mittels weniger vernetzter Molekularsiebe und unspezifischer Adsorptionsmittel abgetrennt werden, um die wesentlichen Stufen zu erleichtern, d.h. das Zusammenbringen mit dem Anionenaustauscher und die Gelfiltration. Zu .diesem Zweck wird die Globulinfraktion durch ein Molekularsieb, wie Sephadex G-1OO oder G-150, geleitet, und in drei Fraktionen fraktioniert, d.h. eine Fraktion, die Substanzen mit höherem Molekulargewicht enthält, die Produktfraktion, die Substanzen mit einem Molekulargewicht von 50 000 bis 100 000 enthält, sowie eine Substanzen mit niedrigerem Molekulargewicht enthaltende Fraktion. Die Produktfraktion kann mit einem unspezifischen Adsorptionsmittel, wie Aktivkohle, Kaolin oder Hydroxylapatit, zusammengebracht' werden. Die auf diese Weise erhaltene partiell gereinigte Fraktion kann sodann mit dem Kationenaustauscher oder Anionenaustauscher nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren und anschließend nach dem eingangs beschriebenen Ver-

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fahren mit dem Anionenaustauscher behandelt und der Gelfiltration unterworfen werden.

Überraschenderweise zeigt das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Hyaluronidase-Präparat keine Nebenwirkungen, wenn es dem Menschen injiziert wird.

Die Eigenschaften des Hyaluronidase-Präparats der Erfindung sind folgende:

Das Molekulargewicht beträgt etwa 70 000, der isoelektrische Punkt liegt bei 5,2 und das pH-Optimum bei 3,6 bis 4,0, bestimmt mit Hyaluronsäure aus menschlicher Nabelschnur als Substrat. Das Enzym ist sehr stabil, wenn es unterhalb 30⁰C in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 6 bis 7 aufbewahrt wird.

Hyaluronidase aus Stiertestikel hat ein Molekulargewicht von 110 000, einen isoelektrischen Punkt von 5,7 und ein pH-Optimum von 4,0 bis 5,5. . .

Aus den vorstehend angegebenen Werten ist ersichtlich, daß sich das Hyaluronidase-Präparat der Erfindung aus menschlicher Plazenta von Hyaluronidase aus Stiertestikel unterscheidet.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Die Bestimmung der Hyaluronidase-Aktivität wird nach einer modifizierten Methode von N.N. Aronson", Jr. und E. A. Padidson, J. Bial. Chem. Bd. 242 (3) (1967), Seiten 437 bis 440, und V. Patel, A.L. Tappel und J₀S. O'Brien, Biochem. Med., Bd. 3 (1972),. Seiten 447 bis 457_} durchgeführt. In einem Reagenzglas werden

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0,04 molare Acetatpuffer (pH 3,6), 0,15 molare Kochsalzlösung, 15Oy Natriumhyaluronat als Substrat und die Enzymlösung miteinander vermischt. Das Gesamtvolumen beträgt 0,40 ml. Das Reaktionsgemisch wird 60 Minuten bei 37⁰C inkubiert. Nach der Inkubation wird das Reaktionsgemisch zum Abstoppen der enzymatischen Reaktion mit 50 ül 50prozentiger Trichloressigsäurelösung versetzt. Ein anderes Reagenzglas wird zur Kontrolle ohne Zusatz von Enzym inkubiert und nach der Inkubierung unter den gleichen Bedingungen mit Trichloressigsäure und dem Enzymextrakt versetzt. In Abwesenheit des Enzyms wird kein Abbau der Hyaluronsäure beobachtet. Das mit Trichloressigsäure angesäuerte Reaktionsgemisch wird mit 50 ul einer Alkalilösung entsprechender Konzentration neutralisiert. Gewöhnlich wird 3,4 η Natronlauge verwendet. Die Menge von N-Acetylhexosamin-Endgruppen, die aus dem Substrat durch die enzymatische Reaktion abgespalten wurde, wird nach der Methode von Reissig, Strominger und Leloir, J. Biol. Chem., Bd. 217 (1955), Seiten 959 bis 966, unter Verwendung von N-Acetylglucosamin als Standard bestimmt. Eine Aktivitätseinheit von Hyaluronidase ist diejenige^Enzymmenge, die 1 uMol N-Acetylglucosamin aus Hyaluronsäure bei 37°C/min freisetzt.

Beispiel 1

Gefrorene menschliche Plazenta, die in feuchtem Zustand 2676 g wiegt, wird in einem Fleischwolf zerkleinert und dreimal in jeweils 10 Liter kalter physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und filtriert, um anhaftendes'Blut sorgfältig abzutrennen. Es werden 2071 g gewaschenes Plazentagewebe erhalten, das mit einem"Virtis 45 Homogenisator mit dem 2,5-fachen VoIu-.·■'■· 5098U/1124

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men gekühlten 0,02 molaren Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) bei der Höchstgeschwindigkeit des Schneidmessers 30 Sekunden homogenisiert wird. Es werden 5450 ml Homogenat erhalten. Das Homogenat wird 2 Stunden stehengelassen und sodann 15 Minuten bei 9600 g zentrifugiert. Es werden 3950 ml eines klaren Uberstands erhalten. Der Überstand wird mit 5 η Salzsäure unter kräftigem Rühren auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Sodann werden 1290 g kristallines Natriumsulfat bei einer Temperatur von 0 bis 5⁰C eingetragen. Man erhält eine etwa 50prozentige gesättigte Lösung. Der pH-Wert der Lösung wird erneut überprüft und mit 1 η Natronlauge auf 7,0 eingestellt. Hierauf wird die Lösung 15 bis 18 .Stunden bei 0 bis 5⁰C stehengelassen. Die entstandene Fällung wird 15 Minuten bei 9600 g zentrifugiert und in 200 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird gegen.Wasser in einem Hollow Fiber Dialyzer Concentrator Modell DC-2 dialysiert, bis die Lösung frei von Sulfationen ist. Das Dialysat wird mit einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung (pH 8,2) äquilibriert und auf eine mit DEAE-Cellulose gefüllte Säule mit den Abmessungen 4,5 χ 50 cm gegeben. Die DEAE-Cellulose wurde vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert. Sodann wird die Säule mit dem gleichen Puffer gewaschen, um nicht absorbierbare Verunreinigungen abzutrennen. Hierauf wird das Enzym mit 0,05 molarer Phosphatpufferlösung (pH 7,5) eluiert. Es werden 725 ml Eluat erhalten, das durch Dialyse gegen Wasser entsalzt wird. Die spezifische Aktivität des Enzyms beträgt 4,5 Millieinheiten pro mg Proteine Der Reinigungsgrad auf der Stufe der Ammoniumsulfat-Fraktionierung beträgt 1,8 und nach der Chromatographie an DEAE-Cellulose 10.

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Die vom Puffersalz befreite Hyaluronidase-Fraktion wird gefriergetrocknet und in 0,01 molarem Tris-Puffer (pH 7,0) gelöst. Diese Lösung wird der aufsteigenden Gelfiltration mit Sephadex G-200 unterworfen. Das Eluat wird in 2 ml Fraktionen aufgefangen, die Hyaluronidase-Fraktionen werden vereinigt und durch Dialyse gegen Wasser entsalzt. Danach wird das Dialysat gefriergetrocknet. Es werden 20,8 mg stark gereinigte Hyaluronidase mit einer spezifischen Aktivität von 17,2 Millieinheiten pro mg Protein erhalten. Der Reinigungsgrad bei Verwendung von Sephadex G-200 beträgt 3,8.

Das erhaltene Hyaluronidase-Präparat hat ein Molekulargewicht von etwa 69 000, bestimmt durch Gelfiltration, und einen isoelektrischen Punkt von 5,19. Das Präparat ist bei 30⁰C in

für mindestens 24 Stunden wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 6,5/stabil. Bei 30 minütiger Inkubation bei 60⁰C und beim gleichen pH-Wert gehen 90 Prozent der ursprünglichen Aktivität verloren. Andererseits zeigt das Präparat keinen Aktivitätsverlust bei mindestens 5-maligem wiederholtem Gefrieren und Auftauen. Ferner ist das Präparat stabil bei 0⁰C in wäßriger Lösung vom pH-Wert 4 bis 7,6.

Beispiel 2

1,5 kg gemäß Beispiel 1 hergestelltes gewaschenes Plazentagewebe wird zusammen mit dem 2,5-fachen Volumen Wasser in einem hochtourigen Schneidmischer homogenisiert. Das erhaltene Homogenisat wird mit 2 η Natronlauge unter kräftigem Rühren auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt und 1 Stunde stehengelassen.

Sodann wird das Gemisch unter vermindertem Druck durch ein

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Filtertuch filtriert und der pH-Wert des Filtrats mit 2 η Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Die Lösung wird mit kristallinem Ammoniumsulfat bis zur 45prozentigen Sättigung versetzt und die entstandene Fällung nach mehrstündigem Stehen 20 Minuten bei 6800 g abzentrifugiert. Die Fällung wird in wenig Wasser gelöst und die Lösung zur Abtrennung von Ammoniumsulfat gegen V/asser dialysiert. Das Dialysat wird mit 0,01 molarer Phosphatpufferlösung (pH 6,0) äquilibriert und anschließend auf eine mit CM-Sephadex (C-5Q) gefüllte Säule mit den Abmessungen 3 χ 80 cm gegeben, der vorher mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert wurde. Sodann wird mit dieser Pufferlösung eluiert. Das Eluat wird aufgefangen. Ein großer Teil der nicht-aktiven Globulinähnlichen Proteine bleibt an der CM-Sephadex-Kolonne adsorbiert. Im Eluat liegt partiell gereinigte Hyaluronidase vor. Die nicht-adsorbierte. Fraktion wird mit 0,01 molarem Tris-Puffer (pH 8,0) äquilibriert und auf einem mit DEAE-Sephadex (A-50) gefüllte Säule mit den Abmessungen 2 χ 15 cm gegeben, die vorher mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist. Es wird mit 0,05 molarer Tris-Pufferlösung (pH 7,0)eluiert und das Eluat gefriergetrocknet. Es werden 30 mg partiell gereinigte Hyaluronidase mit einer spezifischen Aktivität von 11,2 Millieinheiten pro mg Protein erhalten. Der Reinigungsgrad bei Verwendung von CM-Sephadex beträgt 3,5 und von DEAE-Sephadex 8,5.

30 mg des Enzympräparats werden in 2 ml einer O;15 molaren Phosphatpufferlösung (pH 6,5) gelöst und der ansteigenden Gelfiltration an Sephadex G-200 unterworfen. Die abfließende Lösung wird in 2 ml Portionen aufgefangen. Die -Hyaluronidase-

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Fraktionen (enzymatisch festgestellt) werden vereinigt und durch Dialyse gegen Wasser entsalzt. Danach wird das Dialysat gefriergetrocknet. Es werden 15,7 g hochgereinigte Hyaluronidase mit.einer spezifischen Aktivität von 19,8 Millieinheiten pro mg Protein erhalten. Die Hyaluronidase hat ein Molekulargewicht von 72 000 und einen isoelektrischen Punkt von 5,21.Das Präparat hat die gleiche Stabilität wie das gemäß Beispiel 1 hergestellte Präparat.

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Claims

Patentansprüche

1. Hyaluronidase-Präparat aus menschlicher Plazenta mit einem Molekulargewicht von etwa 70 000, einem isoelektrischen Punkt von etwa 5,2, einem pH-Optimum von 3,6 Ms 4,0 und einer Stabilität von mindestens 24 Stunden in wäßriger Lösung bei Temperaturen unterhalb 30⁰C und einem pH-Wert von 6 bis 7.

2. Hyaluronidase-Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form eines lyophilisierten Pulvers vorliegt.

3. Verfahren zur Gewinnung des Hyaluronidase-Präparats nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man menschliches Plazentagewebe mit einer wäßrig-alkalischen Lösung mit einem pH-Wert von 7,5 bis 10,5 extrahiert, aus dem erhaltenen Extrakt die Globulinfraktion isoliert, die Glo-bulinfraktion an einem Anionenaustauscher adsorbiert, der mit 0,005 bis 0,01 molarer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,0 bis 8,5 äquilibriert worden ist, die adsorbierte Hyaluronidase mit einer Pufferlösung erhöhter Molarität und/oder erniedrigtem pH-Wert eluiert und die erhaltene Hyaluronidase-Fraktion der Gelfiltration unterwirft und gegebenenfalls die erhaltene Hyaluronidase-Lö- * sung gefriertrocknet.

4„ Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die aus dem Extrakt isolierte Globulinfraktion zunächst mit einem Kationenaustauscher behandelt, der mit einer 0,01 bis 0,05 molaren Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5 bis 7

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äquilibriert worden ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die aus dem Extrakt isolierte Globulinfraktion zunächst mit einem Anionenaustauscher behandelt, der mit einer 0,1 bis Ο;2 molaren Pufferlösung mit einem pH-Wert von 6,0 bis 7,0 äquilibriert worden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Globulinfraktion aus dem Extrakt mit Ammoniumsulfat bis zu 40 bis 45 Prozent Sättigung bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 fraktioniert aussalzt und die entstandene Fällung isoliert.

7. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man die Globulinfraktion aus dem Extrakt mit einem wasserlöslichen Alkohol bis zu 20 bis 25prozentiger Sättigung bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 ausfällt und die entstandene Fällung isoliert.

8. Verfahren nach Anspruch 3_t dadurch gekennzeichnet, daß man sämtliche Verfahrensschritte in feuchtem Zustand bei Temperaturen unterhalb 5°C durchführt.

9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Anionenaustauscher ein Polysaccharidgel mit basischen Gruppen, ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisatgel mit basischen Gruppen oder ein Phenol-Formaldehyd-Kondensat mit basischen Gruppen verwendet.

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10. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Anionenaustauscher ein Piathylaminoathyldextrangel (DEAE-Sephadex), eine Diäthylaminoäthylcellulose (DEAE-Cellulose), ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat mit quartären Ammoniumgruppen (Dowex 1) oder ein Phenol-Formaldehyd-Polyamin-Kondensat (Amberlite XE) verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Gelfiltration ein stark vernetztes Polysaccharidgel-Molekularsieb, wie Sephadex G-150 oder Sephadex G-200, ein Polyacrylamidgel-Molekularsieb, wie Biogel P-30, oder ein Agarosegel-Molekularsieb, wie Sepharose 6-B, verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kationenaustauscher Carboxymethylcellulose
(CM-Cellulose), Carboxymethyldextran (CM-Sephadex) oder
ein Methacrylsäure-Divinylbenzol-Copolymerisat (Amberlite
IRC-50) verwendet.

13. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die aus dem Extrakt isolierte Globulinfraktion zunächst mit einem Anionenaustauscher der gleichen Art behandelt, wie .· er anschließend bei der Adsorption der Globulinfraktion verwendet wird.

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