DE2301501A1

DE2301501A1 - Verfahren zur gewinnung eines stabilen, von hypotensiven stoffen freien plasmaproteins

Info

Publication number: DE2301501A1
Application number: DE2301501A
Authority: DE
Inventors: Ken-Ichi Izaka; Eizo Tsutsui
Original assignee: GREEN CROSS CORP; Green Cross Corp Japan
Current assignee: GREEN CROSS CORP; Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1972-06-19
Filing date: 1973-01-12
Publication date: 1974-01-17
Also published as: DE2301501C3; CH596839A5; CA1004598A; JPS5620287B2; US3876775A; JPS4920318A; DE2301501B2; SE420049B; AT320853B

Description

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β M ti η ο h a n 12, i^/udwlllr.Ίβ 2301501

81-20.040Ρ 12. 1. 1973

THE GREEN CROSS CORPORATION, Osaka (Japan)

Verfahren zur Gewinnung eines stabilen, von hypotensiven Stoffen freien Plasmaproteins

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung eines stabilen Plasmaproteins, das frei von jeder hypo» tensiven Substanz ist, also keinerlei depressive Wirkung zeigt und für eine Schnellinfusion verwendet werden kann.

In der letzten Zeit gewinnt die Infusion von Plasmaprotein als wirksames Mittel für die medizinische Behandlung anstelle der Bluttransfusion zunehmend an Interesse. Insbesondere werden bemerkenswerte therapeutische Wirksamkeiten bei der intravenösen iOropfinfusion von stabilem Plasmaprotein beobachtet, das frei von aktiven Hepatitisviren ist und bei Schock, Hypoproteinämie und übermäßigen Blutverlusten durch Operation angewandt wird.

81-(POS 29 279) NoHe

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Eines der Ziele der Erfindung ist die Entwicklung eines Verfahrens zur Erzeugung eines stabilen Plasmaproteins, das keinerlei depressive Wirkung zeigt und für eine~ Schnellinfusion verwendet werden kann.

Grundsätzlich wird dieses Ziel gemäß der Erfindung durch Abtrennung eines als Verunreinigung in einem von menschlichem Blut oder Placenta erhaltenen stabilen Plasmaprotein enthaltenen hypotensiven Peptids durch Adsorption an einem Kationenaustauscherharz oder an einem anorganischen Adsorptionsmittel oder durch Abtrennung des hypotensiven Peptids durch Gelfiltration- oder Ultrafiltrationsverfahren erreicht.

Weitere Besonderheiten der Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung der Ausgangssituation sowie der Entwicklung und Eigenart der Erfindung hervorgehen, wobei auf die angefügten Zeichnungen bezug genommen wird; es zeigen:

Fig. 1a eine bei intravenöser Verabreichung von 188 tag/kg stabilem Plasmaprotein beobachtete Blutdruckkurvei das Plasmaprotein stammte von venösem Protein und wurde vor der lOstündigen Erwärmung auf 60 C verwendet; Drucksenkungi O ^j

Fig. 1b eine bei intravenöser Verabreichung von 188 mg/kg stabilem Plasmaprotein beobachtete Blutdruckkurve; das Plasmaprotein stammte von venösem Protein und wurde nach der lOstündigen Erwärmung auf 60⁰G verwendet; Drucksenkungi 11,5 /ό;

Pig. 1 c eine bei intravenöser Injektion von einem stabilen Plasmaprotein aus venösem Protein beobachtete ßlut-

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druckkurve; (Protein nach lOstündiger Erwärmung auf 6O⁰C; behandelt mit Silicagel); Drucksenming: O f->\

Fig. 1d eine bei Verabreichung von 188 mg/kg menschlichem Serum-Albumin gemessene Kurve; Druckaenkung: O *f»\

Fig. 1e eine Kurve zum Vergleich der bei der glatten Muskulatur mit 10ng Bradykinin (a), 5 ^igervPlasmaproteinlösung aus venösem Protein (b) und 5 ^iger Lösung, die durch Behandlung der vorstehenden Lösung mit Silicagel erhalten worden war (c), beobachteten Kontraktionen;

Fig. 2a eine Blutdruckkurve nach bzw. bei intravenöser Verabreichung von 188 mg/kg Plasmaprotein aus der Placenta unmittelbar vor einer einstündigen Erwärmung au
senkungj 0

wärmung auf 60⁰C in Gegenwart von Buttersäure; Druck-

Fig. 2b eine bei intravenöser Verabreichung von 188 mg/kg stabilem Plasmaprotein aus menschlicher Placenta beobachtete Kurve; Drucksenkungs 19» 1 i»;

Fig. 2c eine bei Verabreichung von 188 mg/kg stabilem Plasmaprotein aus menschlicher Placenta, das mit Silicagel behandelt worden war, gemessene Kurve; Drucksenkung: 0 jo;

Fig. 2d eine Vergleichskurve für die Kontraktionen am glatten Muskel, die mit 5 ^igervplasmaproteinlösung (aus menschlicher Placenta; behandelt mit Silieagel) (d), mit der gleichen aber nicht behandelten Lösung (e) mit 5 ^iger Humanserumalbumin-Lösung (f) und mit 20 ng (g), 10 ng (h) und 5 ng (i) Bredykinin beobachtet werden.

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(Bei allen diesen Kurvenbildern bezeichnen ¹¹A" und "B" ein Intervall, innerhalb dessen die Verabreichung vorgenommen wurde).

Fig. 3 eine Verteilung der Fraktionen bei der Gelfiltration von stabilem Plasmaprotein aus menschlicher Placenta

unter Verwendung von Sephadex G-5O (hydrophiles unlösliches Molekularsieb für chromatographische Zwecke aus vernetztem Dextran von Pharmacia Fine Chemicals, Upsala, Schweden).

Daten für die Gelfiltration;

Säulengröße : 5 x 50 cm ■

Packungsvolumen : 11

aufgegebene Lösung i stabile Plasmaproteinlösung

Volumen derselben : 70 ml

Volumen von 1 Prüfglas : 10 ml

Effluent : 0,5 M WaCl

Jälutionsgeschwindigkeit ; 4 ml/min

Das stabile Plasmaprotein besteht zur Hauptmenge aus Albumin und geringeren Anteilen an -Globulin und ß-Globulin. Thermisch stabiles c*-Globulin und ß-Globulin wird durch Ultrazentrifugalanalyse vom Albumin nicht unterschieden. Demgemäß wird das stabile Plasmaprotein bei ?i'tf" durch elektrophoretisch^ Verfahren nicht e als reines Albumin identifiziert; es wird jedoch durch das Vorliegen eines einzigen dem Albumin entsprechenden Peaks beim Ultrazentrifugieren gekennzeichnet.

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Verfahren zur Herstellung von Protein mit thermischer Beständigkeit aus von frischem menschlichen Blut abgetrenntem Plasma wurden bereits praktisch angewandt, jedoch oestehen erhebliche Schwierigkeiten bei der Aufsammelung großer Mengen von frischem Plasma gesunder Personen, üienschliche Placenta dagegen, die erhebliche Mengen Blut enthält, wird allgemein als Abfall betrachtet und ist daher leicht zu erhalten, jedoch haben bislang Versuche zur Erzeugung von stabilem Plasmaprotein durch Extraktion von Plasma aus der Placenta zu keiner praktischen Anwendung geführt.

Typischerweise werden für die Gewinnung von stabilem Plasmaprotein aus Plasma im wesentlichen folgende Verfahren angegeben:

(1) Eine Abwandlung des Verfahrens von Cohn zur Plasmaproteinfraktionierung (6. Verfahren, siehe Japanische Patentpublikation Nr. 5297/60). Dieses Fraktionierungsverfahren besteht in der Behandlung eines von Fibrinogen und ^"-Globulin freien Plasmas mit Äthanol von 25 bis 38 ^oiger Konzentration unter Bedingungen wie pH-Werten

von 4,3 - 4,7, Temperaturen im Bereich von -2 bis 2O⁰G und einer Ionenstärke von 1,2 oder weniger zur Ausfällung einer kischung von Albumin, cX-Globulin und ß-Globulin und Gewinnung des stabilen Plasmaproteins mit nachfolgender lOstündiger iirwärsung desselben auf 6O⁰G zur Inaktivierung von Hepatitisviren, die als Verunreinigung im Plasmaprotein vorhanden sein könnten. Das auf diese ./eise erhaltene Plasmaprotein zeigt jedoch eine depressive Wirkung (siehe l'ig. 1b). Diese depressive ./irkung zeigt sich allerdings noch nicht bei der noch nicht wärmebehandelten Lösung dieses Plasmaproteins (siehe Pig. 1a).

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Eine Gewinnung von stabilem Plasmaprotein aus Plasma- oder Gewebsextrakten mit einer großen Menge an Hämoglobin erfolgt (2) nach einem Verfahren (siehe Japanische Patentpublikation Nr. 16041/68), bei dem stabiles Plasmaprotein durch Zugabe von Buttersäure zu Plasmaprotein-oder Gewebsextrakt mit einer großen Menge an Hämoglobin und nachfolgende Erwärmung auf 57 bis 60 G bei pH-.Verten von 4,5 bis 5,5 zur .Aurscheidung und Entfernung von instabilem Globin gewonnen wird.

Dieses Verfahren besteht in der Gewinnung eines stabilen Plasmaproteins aus Albumin, o(-Globulin "und ß-Globulin aus der überstehenden Flüssigkeit bei der Abtrennung einer ^-Globulin enthaltenden Fraktion als Niederschlag vom Plastaa- oder Placentaextrakt mit einer großen Menge an Hämoglobin; zu der (abgetrennten) überstehenden Flüssigkeit wird Buttersäure in solcher Menge zugegeben, daß ihre Endkonzentration 2 bis 6 ⁰Jo ausmacht, der pH-Wert dann auf 4,5 bis 5,5 eingestellt und die Lösung zur Entfernung von wärmeinstabilem Globin als Niederschlag auf 57 bis 60⁰C erwärmt.

Bas nach diesem Verfahren erhaltene stabile Plasmaprotein zeigt ebenfalls depressive Y/irkung (eiehe iig. 2b), Die nach dem gleichen Verfahren erhaltene Proteinlösung zeigt allerdings vor der Erwärmung auf 57 bis 60⁰C keinerlei depressive Wirkung (siehe Fig. 2a).

Bland u.a. beobachteten eine drucksenkende Wirkung bei Injektion von zumindest 100 ml 5 zeiger lösung des nach obigem Verfahren (1) erhaltenen stabilen Plasmaproteins bei der Chirurgie am offenen Herzen innerhalb von 4 Minuten Jj. K.L. Bland, N.B. Laver und E. Lowenstein, "Hypotension

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infolge 5 ^iger Plasmaproteinfraktionen", Iiew England J. 1/Ied. 286, 109 (1972)].

Harrison u.a. berichteten ebenfalls, daß eine Schnellinfusion von stabil :m Plasmaprotein, das nach oben erwähntem Verfahren (1) erhalten worden war, beim Patienten eine DrucK-senkung auslöste. [ (i.A. Harrison, II. iiobinson, R.V. Stacey, CH. licCulloch, T.A. Torda und J.S. Wright, "Hypotensive Effects of Stable Plasma Protein Solution, - a preliminary Communication" Medical J. Australia 1U40 Vol. 2 (1971); G.A. Harrison, T.A. Torda und P. Schiff, "Hypotensive Effects of Stable Plasma Protein Solution, a Preliminary Communication" Medical J. Australia 1508 Vol. 2 (1971)].

Zur Zeit ist die klinische Anwendung des nach oben erwähntem Verfahren (1) erhaltenen stabilen Plasraaproteins allein auf die intravenöse Tropfinfusion beschränkt, da bei eier Schnellinfusion beim Patienten die Gefahr einer Hypotension besteht. Der rasche Fortschritt in der operativen Praxis macht jedoch eine Schnellinfusion von stabilem ilasmaprotein in zunehmendem UaQe notwendig.

Die Erfinder haben daher die Möglichkeiten zur Ausschaltung der hypotensiven Wirkung bei den nach den oben erwähnten Verfahren (1) und (2) erhaltenen stabilen Plasmaproteinlösungen untersucht und dabei festgestellt, daß als hypotensive Substanz ein Peptid mit eineiu lioleKulargewicht von 1000 bis 10000 in Frage kommt, das als Nebenprodukt bei der Erwärmung auf 56 bis 60⁰C im Hahmen der bekannten Verfahren gebildet wird. Dieses hypotensiv wirksame Peptid besitzt auch eine Kontraktionswirkung gegenüber der glatten Luskulatur; es wird jedoch durch die Wirkung von üarboxypeptidase B inaktiviert.

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Es wurde nun gefunden, daß dieses hypotensive Peptid vom stabilen Plasmaprotein durch GeIfiltrations- oder Ultrafiltrationsverfahren abgetrennt werden kann, wobei die Tatsache ausgenutzt wird, daß das Molekulargewicht des Peptids geringer ist als dasjenige des stabilen I-lasmaproteins. Darüber hinaus wurde als Ergebnis einer Untersuchung der Adsorptionseigenschaften des besagten hypotensiven Peptids an allen Arten von Adsorptionsmitteln gefunden, das dieses Peptid von Kationenaustauschern/anorganischen Adso.rbentien adsorbiert wird, während das stabile Plasmaprotein, ohne an diesen Adsorptionsmitteln absorbiert zu werden, gewonnen wird.

V/enn dieses als Hebenprodukt nach lOstündiger Erwärmung von stabilem Plasmaprotein gemäß Verfahren (1) auf 60 C gebildete hypotensive Peptid nach dem erfindungsgemäßen Verfahren entfernt worden ist, wird es nicht mehr gebildet, selbst wenn die Wärmebehandlung bei 6O⁰G nachfolgend fortgesetzt wird.

Darüber hinaus wird das hypotensive Peptid ebenfalls nicht mehr gebildet, selbst wenn das stabile Plasmaprotein einer lOstündigen Erwärmung auf 6O⁰G zur Inaktivierung von Hepatitisviren unterworfen wird, nachdem das hypotensive Peptid durch das erfindungsgemäße Verfahren von dem nach Verfahren (2) erzeugten stabilen Plasmaprotein entfernt worden ist (siehe Fig. 2c).

Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der Feststellung, daß stabiles Plasmaprotein, das keinerlei depressive 'Virkung zeigt und für die Schnellinfusion verwendet werden kann, aus menschlichem Blut und Placentaextrakt herstellbar ist. l/.h., nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein stabiles Plasmaprotein ohne depressive Wirkung durch

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Abtrennung von hypotensiver peptidischer Substanz mit einem Lolekulargewicht von 1OÜÜ bis 1OOOÜ von dem protein erhalten, das durch Fraktionierung von menschlichem jJlut oder Gewebe und «irv/ärmung auf 57 bis 60 0 während oder nach der Fraktionierung erhalten wurde und laut elektrophoretiachem Befund im wesentlichen au3 Albumin besteht.

Da das stabile Piasiaaprotein, das gemäß der Erfindung erzeugt wird, keinerlei hypotensives Peptid enthält, beateht keine Gefahr einer Jlutdrucksenkung beim Patienten, selbst wenn nicht nur eine intravenöse iropfinfusion sondern eine öchnellinfusion vorgenommen wird. Damit wird der klinische Anwendungsbereich bedeutend erweitert. Ferner kommen als katerialien für die Gewinnung des stabilen Plasmaproteins gemäß der Erfindung nicht nur reines plasma sondern auch Plasma- oder Placentaextrakte in Betracht, die eine große Menge Hämoglobin enthalten, was einen erheblichen wirtschaftlichen Gewinn bedeutet.

Das Verfahren zur Abtrennung des gemäß der Erfindung zu verwendenden Plasmaproteins vom Blut erfolgt nach dem oben erwähnten abgewandelten Verfahren der rlasmaproteinfraktionierung nach Gohn (6. Verfahren} ein Verfahren, bei dem Zinkionen bei einem Tieftemperaturäthanolfraktionierungsverfahren eingeführt werden (siehe Daglas I... Sargener u.a.: Vox.Sungini3, Bd. 5, (1960) ά. 272) oder nach einem Verfahren,

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bei dem die Ionenstärke des Plasmas durch ein Ionenaustauscherharz erniedrigt wird zur Entfernung von instabilem Globulin als Niederschlag (siehe Hans liichman u.a. Vox.ounginis>, j^d. 2 (1956) o. 184).

Zur Erzielung von Plasmaprotein aus Plasma- oder Placentaextrakten mit einem hohen Hämoglobingehalt kann das oben beschriebene Verfahren (Japanische Patentpublikation Nr. 16 041/68) angewandt werden.

Bei einem konkreten Beispiel für das Verfahren zur erzielung von Plasmaprotein aus Placenta wird wie folgt vorgegangen:

Eine auf niedrige Temperatur eingefrorene Placenta wird mit einer Eisquetsche grob zerquescht und weiter mit einem Fleischschneider geschnitzelt. Zu 100 Gewichtsteilen dieser zerschnitzelten Placenta v/erden 200 ml 1 '/aigejt balzii'sonj e hinzugefügt, die Blutanteile durch 30 LIinuten lange Extraktion extrahiert und die überstehende Flüssigkeit (Placentaextrakt) durch Zentrifugieren abgesondert, Zu dem erhaltenen Placentaextrakt wird Ammohiumsulfat in einer Menge hinzugegeben, die innerhalb eines Bereichs frei wählbar ist, der zu einer Konzentration von 35 bis 40 % (nach der Zugabe) führt und der erzeugte Niederschlag abgetrennt.

Venn irgendeine Vorrichtung zur Verfügung steht, mit welcher der Placentaextrakt bei einer ausreichend niedrigen Temperatur gehalten werden kann, ist e3 alternativ möglich, den Placentaextrakt mit ethanol in solchen LIengen zu versetzen, daß 25 Gewichtsteile pro 100 Gewichtsteile Placentaextrakt enthalten sind und den erzeugten liiederschlag abzutrennen.

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Der Hauptteil des Hämoglobins bleibt in der so erhaltenen überstehenden Flüssigkeit. Diese kann der nachfolgenden behandlung, d.h. einer .Behandlung mit organischer Säure unterworfen werden, vorzuziehen für die nachfolgende Behandlung ist jedoch eine Zugabe von Ammoniurasulfat zu dieser Lösung und Aufsamnelung einer rohen Albuminfraktion als liiederschlag, da die Proteinkonzentration der überstehenden Flüssigkeit gering ist.

Der durch Filtrieren erhaltene Niederschlag wird durch Zugabe von wasser (5 bis 4 1 zu 1 kg niederschlag) gelöst. Existenz und Menge des in der rohen Albuminfraktion enthaltenen Ammoniumsulfats hat keinerlei iSinfluß auf das Ergebnis der danach auszuführenden Behandlung mit organischer Üäure. Eine das brauchbare Protein enthaltende Lösung wird durch Zugabe einer organischen Säure zu der oben erwähnten Albuminlösung zur Ausfällung und Abtrennung des Hämoglobins durch Filtrieren erhalten. Je mehr organische Säure zugegeben wird, umso mehr Hämoglobin fällt aus und die Absonderung des brauchbaren Proteins wird besser, jedoch führt jede übermäßige Zugabe zu einer Abnahme der ausbeute an stabilen Plasmaprotein durch Litfällung von Albumin bei der nachfolgenden ./armebehandlung, und daher ist es günstig, die organische säure in einer solchen iienge zuzugeben, daß ihre ündkonzentration in besagter Lösung 2 bis 6 ;-i ausmacht.

Die Einstellung des pH-Wertes ist ein wirksames Mittel zur vollständigen Abtrennung von Hämoglobin. Die Hämoglabinmenge in der überstehenden Flüssigkeit nirir.:t merklich ab, wenn der pH-Vert von neutral auf 5,5 gesenkt \;±νά und das Hämoglobin fällt oei einem pH-Wert von 4,3 vollständig aus. Im allgemeinen ist es jedoch günstig, den pH-Wert innerhalb

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eines Bereichs von 4,5 bis 5,5 einzustellen, da bei weiterer Absenkung des pH-Wertes die Albuminausbeute abnimut. Die Flüssigkeit wird allmählich erwärmt. Globulin, das wärmeinstabil ist, beginnt bei 5O⁰G oder darüber auszufallen. Me Temperatur der Lösung wird für eine gewisse Zeitdauer bei 57 bis 6O⁰G gehalten. Eine 1 bis 2 LIinuten lange Erwärmung auf 60⁰G ist für die Ausfällung von instabilem Globulin ausreichend, jedoch ist eine 15 bis 30 ilinuten lange Wärmeeinwirkung zur Erlangung der Verläßlichkeit der Verfahrensweise günstiger, da das stabile Plasmaprotein wie Albumin stabil ist.

Besagte Flüssigkeit wird nach der Wärmebehandlung auf Zimmertemperatur abgekühlt. Die durch Abtrennung des nach dem Abkühlen erhaltenen Niederschlags durch Filtrieren erhaltene Flüssigkeit enthält kein Hämoglobin mehr und es werden 520 g Ammoniumsulfat pro 1 1 Flüssigkeit zur vollständigen Ausfällung von Protein hinzugegeben. Der Niederschlag wird durch Filtrieren abgetrennt und durch Dialyse in kaltem Wasser in einem Cellophanrohr von Ammoniumsulfat und organischer üäure befreit.

Auf diese »"/eise wird die stabile Plasmaproteinlösung erhalten. Die Proteinkonzentration dieser Lösung liegt bei 5,0 bis 6,5 G-ew.^. Die Lösung wird dann durch eine mit einem Ionenaustauscher oder anorganischen Adsorptionsmittel gepackte Säule geschickt zur Adsorption der hypotensiven Substanz, die alternativ durch Gelfiltration- oder Ultrafiltrationsverfahren abgetrennt werden kann_;und das stabile Plasmaprotein wird frei von der hypotensiven Substanz erhalten.

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Ala gemäß der Erfindung zu verwendende Ionenaustauscher werden "kationische Ionenaustauscherharze" (cationic ion exchange resins) verwendet, die allgemein in Gebrauch sind, wie beispielsweise Carboxymethylcellulose, Garboxymethyl-Sephadex ^ (Warenzeichen für einen hydrophilen unlöslichen Kationenaustauscher aus vernetzten: Dextran der -Blrma Pharmacia Pine Chemicals) und Amberlite GG-50 ® (Warenzeichen für einen schwach-sauren Kationenaustauscher). Als anorganische Adsorptionsmittel sind z.B. Silicagel oder Aluminiumoxidgel günstig.

Was die Bedingungen für die Adsorption der innerhalb des stabilen Plasniaproteins enthaltenen hypotensiven Substanz durch die oben erwähnten Ionenaustauscherharze oder anorganischen .adsorptionsmittel betrifft, so ist es günstig, einen Ionenaustauscher oder ein anorganisches Adsorptionsmittel in eine Säule zu füllen, die zunächst mit 0,25 ^iger Natriumchloridlösung equilibriert und nachfolgend mit besagter Plasmaproteinlösung mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 50 bis 150 ml/Std/cm beschickt wird. Als temperatur sind 4 bis 6⁰C günstig.-

Die Gelfiltration erfolgt beim erfindungsgemäßen Verfahren nach der allgemein angewandten Verfahrensweise. Beispiele für konkrete Verfahren werden in den nachfolgenden Literaturstellen angegeben.

1) J.H. Whitaker "Bestimmung der kolekulargewichte von Proteinen durch Gelfiltration an Sephadex", Anal.Ohem. 35 (1963) 1950 - 1953;

2) P. Andrews "Ermittlung der Llolekulargewichte von Proteinen durch Sephadex-tielfiltration" Biochem. J. 91 (1964) 222 - 233;

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3) T.G. Laurent, J. Killander "Eine Theorie der Gelfiltration und ihre experimentelle Nachprüfung" J.Ghromatog. H (1964) 317 - 330;

4) P.R. Carnegie "Abschätzung der L-iolekülgröße von Peptid durch Gelfiltration", Biochem. J. 95 (1965) 9 P.

Die Ultrafiltration erfolgt im Rahmen der Erfindung
unter den in den nachfolgenden Literaturstellen angegebenen Verfahrensbedingungen:

1) H.J. Bixler, R.w. Hausslein, L.Li. Welsen "Trennung und Reinigung von biologischen katerialien durch Ultrafiltration" May, 1969» liat. Meeting. Am. Inst, of Chenw
Eng. Cleveland}

2) CJ. Van Oss.,P.£I. Bronson "Entfernung von IgH von Serum durch Ultrafiltration", Anal. Biochem., 36 (1970) 464;

3) D. Boutin, J. Brodeur "Ultrafiltration von Humanserum; Beweis für niedermolekulare Cholinesterase-Aktivität", Rev. Can. Mol. 29 (2), 187 (Jun. 1970).

Zu dem so erhaltenen von hypotensiver Substanz freien stabilen Plasmaprotein werden Stabilisatoren wie ϊϊ-Acetyltryptophan und liatriumcaprylat hinzugegeben, so daß die
Konzentration besagter Lösung bei 0,0032 bis 0,0046 M liegt und es wird 10,5 bis 14,5 Stunden lang auf 59 bis 61⁰C
erwärmt.

Die Messung der depressiven Virkung erfolgte im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen an einem Hund. D.h., ein männlicher ausgewachsener Hund einer Mischrasse von etwa 8 kg

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Körpergewicht wurde nach Anästhesierung mit Urethan am Rücken festgebunden und eine Kanüle in die linke Carotidarterie eingeführt und der Garotidarteriendruck mit einem Schreibgerät (polygraph transducer) aufgezeichnet. Die zu prüfende Substanz wurde über ein an der rechten Oberschenkelvene befestigtes Katheter verabreicht. Die Drucksenkung wurde nach folgender Gleichung aus dem mittleren Blutdruck bei dem Minimalpunkt, der bei Absenkung durch Verabreichung der zu untersuchenden Substanz beobachtet wurde sowie aus dem Mittleren Blutdruck vor der Verabreichung (der als Standard betrachtet wurde) erhalten.

mittlerer Blutdruck mittlerer Blutdruck vor Verabreichung nach Verabreichung .Druck- der Probe — der Probe

Senkung = χ

i)o) ' mittlerer Blutdruck

vor Verabreichung der Probe

Die Messung der Kontraktionswirkung an der glatten Muskulatur am Uterus der Hatte erfolgte nach der Llagnus-Technik unter Verwendung des Uterus von virgiualen Hatten der wistar-Hasse. Hatten von 150 g Körpergewicht wurden intraperitoneal 5 mg Diöstradiol 1ö Stunden vor Entfernung des Uterus injiziert und nach 18 stunden wurden die Hatten durch Decapitation getötet und ausbluten gelassen zur Entfernung des Uterus.

Als Nährlösung diente mit Luft gesättigte de Jalon-Lösung mit 0,1 mg > Atropinsulfat. Das Volumen der Nährlösung im Organbad lag "oei 8,6 ml, das Volumen der trobelösung bei 0,4 ml und die Heaktionsdauer betrug 90 Sekunden.

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Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Eine stabile Plasmaproteinfraktion wurde aus 100 1 menschlichem Plasma nach dem modifizierten Verfahren von Cohn zur Plasmaproteinfraktionierung (6. Verfahren; siehe Japanische Patentpublikation ITr. 5297/60) gewonnen: Das Plasma wurde auf pH 7,2 eingestellt und mit 53,3 i<> kaltem Äthanol versetzt, so daß die Endkonzentration bei 8 °/ό lag und dann zur Entfernung von Fibrinogen bei -2⁰G zentrifugiert. Zu der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde so viel kalter Äthanol hinzugegeben, daß die Endkonzentration bei 21 ^c/> lag, der pH-Wert wurde auf 6,8 eingestellt und die Temperatur der Lösung allmählich auf -6⁰C gesenkt; dann wurde zur Entfernung von ^-Globulin zentrifugiert.

Die überstehende Flüssigkeit wurde einer kalten Äthanolbehandlung unter Bedingungen wie 25 "ρ Äthanolkonzentration, pH 4,7, Ionenstärke 0,1 und -6⁰G Temperatur unterworfen, " wobei eine aus Albumin, o(-Globulin und ß-G-lobulin bestehende Liischung ausfiel und gewonnen wurde. Diese stabile Plasraaproteinfraktion wurde anschließend lyophilisiert bzw. gefriergetrocknet, wobei 3,2 kg trockenes Porteinpulver erhalten wurden. Dieses trockene pulver wurde in destilliertem Wasser gelöst unter Bildung einer 5 >oigen Proteinlösung, zu der N-Acetyltryptophan und Hatriumcaprylat als Stabilisatoren in kengen zugegeben wurden, daß die Sndkonzentration bei 0,04 M lag; dann wurde die lösung 10 Stunden lang bei 60 G wärmebehandelt.

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Die wärmebehandelte Plasraaproteinlösung wurde durch eine Silicagel-Säule geschickt unter Gewinnung einer nichtadsorbierten fraktion (Plasiaaproteinfralction). Die hypotensive Dub ;tana wurde an der Silicagel-Säule adsorbiert und dadurch entfernt. In der nicht-adsorbierten fraktion wurden etwa 95 ;-> des stabilen Plasnaproteins gesammelt. Die experimentellen Daten sind in Sabelle 1 und in den i'ig. 1a bis 1e wiedergegeben.

Tabelle 1:

Ausbeute an stabilem Plasmaprotein vor und nach der üilicagel-Behandlungj Prüfung der drucksenkenden Wirkung beim Kund und der Kontraktionswirkung bei der glatten Luskulatur am Rattenunterus

	Sruppe lir.	Od₂₈₀	Protein ausbeute	Druck senkung beim Kund	Kontrak tionswir kung b-eim Katten- uterus
stabile Plasmapro teinlösung vor Be handlung mit der oilicagel-Säule stabile Plasmapro teinlösung nach Be handlung mit der Silicagel-Säule	1 2 1 2	30,5 31,2 30,0 30,5	(100 -.0) (100 >) 95,0 Ji 93,5 '/»	# -ff	-ttr -ftf-

Die elektrophoretische Analyse der Proteinzusammensetzung des stabilen Plasmaproteins ergab 88,5 ^ Albumin, 7,5 °ß> o(-Globulin und 4,0 ji ß-aiobulin.

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Me erzeugte 5 ,'i£e Lösung von stabiler:! Plasniaprotein kann als stabiles riasmaprotein-xrodukt verwendet werden, das keinerlei depressive Virkun^ besitzt und für die ^cLnellinl'uaion brauchbar tat.

Beispiel 2

Das nach dem modifizierten Verfahren von Cohn zur Plasmaproteinfraktionierung (6,Verfahren) aus menschlichem Plasma wie in Beispiel 1 beschrieben,erzeugte stabile Plasmaproteinpulver wurde in destilliertem ,Vasser gelöst zur Erzeugung einer 5 ,^iifen Proteinlösung, zu der Il-Acetyltryptophan und L'atriumcaprylat in solchen Mengen hinzugegeben wurden, daß die ISndkonzentration bei 0,04 Ii lag. Die Lösung wurde dann 10 otunden lang bei 60⁰G wärmebehandelt.■ Die erwärmte Plasmaproteinlösung wurde durch Ultrafiltrations methoden unter Verwendung einer ULI 10 © -Ultrafiltrationsmembran der Fa. Amicon Co., U.S.A. filtriert» Das hypotensive Peptid wurde dabei abfiltriert und vom Plasmaprotein getrennt.

Experimentelle Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.

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.'ab el le 2: Depressive ϊ/irksainkeit und Kontraktionswirkung auf die glatte Lluskulatur von stabiler Plasmaproteinlösung vor und nach der Ultrafiltration

	JrupT;e Hr.	irotein aus beute	Druck senkung beim Hund	Kontraktions wirkung bei der glatten LiUskulatur der Ratte
stabile Plasma- P ro te inlö s ung vor der Ultra filtration	3 4	100 ,Ό 100 .',	-H- -W	-m- -M-
stabile Plasma proteinlösung nach der Ultra filtration	3 4	99,4 jo 98,9 io	-	-

Die durch Ultrafiltration von hypotensivem Peptid befreite Plasmaproteinlösung wurde auf eine Proteinkonzentration von 5 ^ eingestellt und mit H-Acetyltryptophan und
Katriumcaprylat derart versetzt, daß die Endkonzentration bei 0,04 K lag und es wurde so ein stabiles Plasmaproteinprodukt erhalten, das frei von jeglicher hypotensiven bubstanz und für Schnellinfusionen verwendbar war.

Beispiel 3

Unmittelbar nach Erhalt eingefrorene und frischhaltend gelagerte Placenta wurde fein zerquetscht und zu 20 kg Placenta wurden 40 1 1 ^ige Uatriumchloridlösung hinzugegeben zur Extraktion der Blutkomponenten; eine ^-Globulin ent-

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haltende Fraktion wurde ausgefällt und vom Extrakt abgetrennt. Zur überstehenden Flüssigkeit wurde so viel Buttersäure hinzugegeben, daß die lind konzentrat ion bei 2 bis 6 $ la/- und der pH-Wert der behandelten Lösung wurde auf 4,5 bis 5,5 eingestellt, die Mischung 1 bis 2 Stunden lang auf 57 bis 6O⁰O erwärmt und der gebildete Niederschlag abgetrennt.

Zu der nach Zentrifugieren erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde zur Ausfällung des gesamten Proteins so viel Ammoniumsulfat hinzugegeben, daß die Konzentration 75 >° ausmachte. Die erhaltene Plasmaproteinpaste oder -masse wurde in ein Dialyserohr überführt und bei 4°C 24 Stunden lang gegen fließendes Wasser dialysiert (bis zu diesem Schritt ist die Behandlung die gleiche wie bei dem Verfahren nach der Japanischen Patentpublikation Nr. 16041/68).

Die auf pH 7,0 eingestellte Plasmaproteinlösung wurde in eine mit Carboxymethyl-Sephadex ^=* gepackte Säule gegeben, .die mit einer Natriumchlorid in einer Konzentration von 0,1 L; enthaltenden 0,05 M Phosphat pufferlösung von pH 6,8 bis 7,0 in¹ s Gleichgewicht gesetzt worden war; die Säule wurde mil: obigem Puffer gewaschen und der eluierte Proteinanteil gesammelt. Etwa 90 $ des in die Säule gegebenen Plasmaproteins wurden wiedergewonnen und das hypotensive Peptid an der Säule adsorbiert und entfernt.

Die experimentellen Ergebnisse sind in Tabelle 5 und den Fig. 2a bis 2d wiedergegeben.

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Tabelle 3: Ausbeute an stabilem jrlasmaprotein; beim Hund

beobachtete Depressionswirkung und Kontraktionswirkung auf die glatte ...uakulatur beim Eattenuterus vor und nach Behandlung mit der Garboxymethyl-Sephadex-Säule

	Grupüe Nr/	OD₂₈₀	Protein aus beute	Druck- senkung beim Hund	Kontraktions- wirkung beim liattenuterus	I ( t 1
stabiles Plasmapro tein vor Behandlung mit Garboxymethyl- Sephadex	5 6	32,8 36,7	(100 >;) (loo ·,:)	-t⁴- -H-	*-te-*
stabiles liasmapro- tein nach Behandlung mit Garboxymethyl- Sephadex	5 6	32,0 35,2	91,0 y, 89,5 t

Das mit Garboxymethyl-bephadex behandelte stabile Plasmaprotein wurde auf 5 ipige Proteinkonzentration in einer Lösung eingestellt, zu der K-Acetyltryptophan und Hatriumcaprylat in solchen Mengen zugegeben wurden, daß die Endkonzentration
bei 0,04 Ii lag. Diese iiischung wurde 10 Stunden lang auf
60⁰G erwärmt und ein vom jeglichen hypotensiven Peptid freies stabiles Plasmaprotein erhalten, da3 für die Schnellinfusion brauchbar war. Bas so gewonnene stabile Plasmaprotein bestand zu 95 v° aus Albumin, c{-Globulin und ß-Cilobulin bei 5 ?oiger
Proteinkonzentration.

Die Ausbeute pro 1 Placenta betrug 2,2 g.

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Beispiel 4

Unmittelbar nach Erhalt eingefrorene und frischgehaltene Placenta wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 3 fraktioniert, d.h. durch Zugabe von Buttersäure und Erwärmung auf 57 bis 6O⁰C und die durch Dialyse der zentrifugierten überstehenden llüssigkeit erhaltene Plasmaproteinlösung wurde der G-el filtration unter Verwendung einer Sephadex G-5O ® unterworfen. Das Plasmaprotein wurde in eine hochmolekulare Fraktion und eine hypotensive Substanz in einer !fraktion mit geringerem L'olekulargewicht fraktioniert (siehe Fig. 3).

Das erhaltene stabile I'laauaprotein v/urde auf eine 5 >ige Proteinkonzentration in der Lösung eingestellt, zu der N-Acetyltryptophan und Natriumcaprylat in LIengen zugegeben wurden, daß die jSndkonz ent ration bei 0,04 Vi lag. Die Liiscluing wurde 10 stunden lang auf 6O⁰C erwärmt und ein von jeglichem hypotensiven Peptid freies stabiles Plasmaprotein erhalten, das für die Schnellinfusion brauchbar war.

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Claims

Patentansprüche

"1* Verfahren zur Gewinnung, eines von jeglicher hypotensiven bubstanz freien stabilen Plasmaproteins, dadurch gekennzeichnet , daß man peptidische Substanzen mit einen. Molekulargewicht von 1OJO bis 10000 von einem stabilen Plasmaprotein ii.it depressiver V/irkung abtrennt, das elektrophoretisch im wesentlichen aus einer Albuminfraktion besteht und aus menschlichem Blut oder Gewebe gewonnen und während der Gewinnung einer Wärmebehandlung bei 57 Dis ö0°0 unterworfen worden ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die peptidischen bubstanzen mit einem Ilolekulargewicht von 1000 bis 10000 durch Ultrafiltration oder Gelfiltration entfernt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die peptidischen Substanzen mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 10000 durch Adsorptionsmethoden (einschließlich Ionenaustauschyerfahren) abgetrennt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als menschliches Gewebe Placenta verwendet wird.

5ο Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,daß für das Adsorptionsverfahren Kationenaustauscherharze, SiIicagel oder Aluminiumoxidgel verwendet werden.

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