DE4115910C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von nativem, intravenös verabreichbarem, stabilisiertem Immun­ globulin (IgG). Nativ bezeichnet in diesem Zusammenhang ein chemisch nicht verändertes und enzymatisch nicht abgebau­ tes Immunglobulin, das eine unveränderte Antikörperaktivi­ tät aufweist. Ein derartiges, intravenös verabreichbares Immunglobulin bildet ein wertvolles Mittel zur Prophylaxe und zur Behandlung von infektiösen Krankheiten und Anti­ körpermangelzuständen bei Mensch und Tier. Zur gefahrlosen intravenösen Applikation ist wichtig, daß derartige Immun­ globuline keine nachweisbare antikomplementäre Aktivität aufweisen, die auf polymere Immunglobulinaggregate zurück­ führbar ist. Durch Zusatz von Stabilisierungsmitteln wie beispielsweise Albumin, Zucker, Glukose und/oder anderen Polyglykolen, sowie Polyolen wie etwa Mannit wird verhin­ dert, daß das polymerfreie, applizierbare IgG-Präparat bei längerer Lagerung erneut polymere IgG-Aggregate bildet.

Mehr im einzelnen betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von nativem, intravenös verabreichbarem, sta­ bilisiertem Immunglobulin (IgG), wobei bei einer Tempera­ tur unterhalb 8°C

• a) unter Maßnahmen zur schonenden Gesamtglobu­ linfällung aus Serum, Plasma oder Plazenten ein IgG enthaltender Gesamtglobulinniederschlag ausgefällt und abgetrennt wird, der weniger als 1 Gew.-% Polymere enthält,
• b) dieser Gesamtglobulinniederschlag bei schwach saurem pH mit einer schwach ionischen, wäßrige, alkoholischen Lösung behandelt wird, und
• c)- die danach erhaltene IgG-Lösung vom alkoholischen Lösungsmittel befreit, auf eine gewünschte Proteinkonzentration sowie eine isotonische Salz­ konzentration und eines physiologisch verträglichen pH-Wert eingestellt und durch Zugabe von Stabilisierungsmittel(n), Sterilisation und gegebenenfalls Virusinaktivierung/Elimination, zu einem applizierbaren Präparat wei­ terverarbeitet wird.

Verfahren dieser Art sind bekannt. So offenbart das Dokument EP 00 85 747 B2 ein Verfahren zur Herstellung von intravenös verabreichbarem Immunglobulin zur Verstärkung der Immunab­ wehr des menschlichen Organismus, bei welchem die wesent- liche Reinigungsstufe, d. h. die Erzeugung eines geklärten Extraktes, mittels Chromatographie an einem Ionenaustauscher durchgeführt wird. Das als Ausgangsmaterial eingesetzte na­ tive Immunglobulin wird in einer Proteinkonzentration von 20 bis 40 mg/ml und einem pH von 4,0 bis 5,5 verwendet. Bei­ spielsweise wird eine Cohn-Fraktion II+III, eine Endfällung venöser oder plazentarer Immunglobuline oder ein Lyophilisat durch Auflösung oder eine eventuell sogar Ethanol enthalten­ de Immunglobulin-Lösung durch entsprechende Verdünnung und durch Säurezusatz auf pH 4,0 bis 5,0 eingestellt. Diese Lösung aus IgG-Monomeren IgG-Dimeren, IgG-Trimeren und IgG-Polymeren wird mittels eines Ionenaustauschers aufge­ trennt (chromatographiert). Die IgG-Monomere werden mit einem 0,02 bis 0,2 molaren Puffer von pH 4,0 bis 5,5, der zusätzlich 0,05 bis 0,15 mol Kochsalz enthält, eluiert. Dieses Eluat (= geklärter Extrakt) weist lediglich eine schwache antikomplementäre Aktivität auf und wird der Feinreinigung zugeführt. Die IgG-Aggregate und zwar sowohl die Polymere als auch die Trimere und Dimere bleiben am Ionenaustauscher gebunden und können später mit hochmolarem Puffer abgelöst werden.

Das Dokument DE 27 51 717 C2 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines praktisch von antikomplementärer Aktivität freien und für die intravenöse Verabreichung geeigneten Gamma-Globulins, dessen Antikörperspektrum und Unterklassen- Verteilung gegenüber dem als Ausgangsmaterial verwendeten Plasma praktisch unverändert ist. Hier wird eine Paste von Cohn-Fraktionen II oder II+III oder von diese enthaltendem Plazenta-Extrakt mit pyrogenfreiem Wasser bei einem pH-Wert von 4,9 bis 6 extrahiert. Aus diesem filtrierten Extrakt werden durch stufenweise Fällung mit Polyethylenglykol bis zu einer Konzentration von 4% und anschließend mit Ethanol bis zu einer Konzentration von 4 bis 12%, wobei jedesmal die ausgefallenen Verunreinigungen abgetrennt werden, und nach anschließender Steigerung des pH-Wertes auf 7 bis 8,2 durch Erhöhung der Polyethylenglykolkonzentration auf bis zu 12% oder durch Erhöhung der Ethanolkonzentration auf bis zu 25% das gewünschte Gamma-Globulin ausgefällt und isoliert. Der Niederschlag wird in einer Lösung aufgenommen, die Human-Albumin, Natriumazetat, Glycin und Mannit enthält und einen pH von 5,1 aufweist. Das applizierbare Präparat kann in Lösung oder als Lyophilisat aufbewahrt werden.

Das Dokument AT 2 70 068 B1 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Anti-Rh-γ-Globulin. Als Ausgangsmaterial dient menschliches Blut­ plasma, und die Aufarbeitung erfolgt entsprechend nachstehendem Schema:

• - in einer 1. Stufe wird das menschliche Blutplasma auf etwa 1°C ge­ kühlt, und der dabei gebildete Niederschlag wird aus der flüssigen Phase abgetrennt;
• - in einer 2. Stufe wird die erhaltene flüssige Phase mit 10,5 bis 10,9% Methanol versetzt, auf etwa -2°C abgekühlt und auf einen pH-Wert von 7 bis 7,4 und eine Ionenkonzentration von 0,136 gI/l eingestellt, und der dabei gebildete Niederschlag wird aus der flüssigen Phase abgetrennt;
• - in einer 3. Stufe wird der in der zweiten Stufe erhaltenen flüssigen Phase 33,25 bis 33,35% Methanol zugesetzt, die Temperatur wird auf etwa -5°C eingestellt und ferner ein pH-Wert von 6,7 bis 7,1 und eine Ionenkonzentration von 0,081 bis 0,091 gI/l aufrechterhalten, und der dabei gebildete Niederschlag wird aus der flüssigen Phase abgetrennt;
• - in einer 4. Stufe wird dem in der dritten Stufe erhaltenen Nieder­ schlag 26,5 bis 26,9% Methanol zugesetzt, und bei einer Temperatur von etwa -5°C wird ein pH-Wert von 7,0 bis 7,4 und eine Ionenkon­ zentration von 0,0047 bis 0,0057 gI/l eingestellt, und der dabei ge­ bildete Niederschlag wird aus der flüssigen Phase abgetrennt;
• - in einer 5. Stufe wird dem in der vierten Stufe erhaltenen Nieder­ schlag 22,5 bis 22,9% Methanol zugesetzt, und bei einer Tempertur von etwa -6°C wird ein pH-Wert von 5,0 bis 5,4 und eine Ionenkon­ zentration von 0,008 bis 0,018 gI/l eingestellt, und der dabei ge­ bildete Niederschlag wird aus der flüssigen Phase abgetrennt; und
• - in einer 6. Stufe der in der fünften Stufe enthaltenen flüssigen Phase 33,0 bis 33,4% Methanol zugesetzt, ferner wird eine Temperatur von etwa -6,5°C, ein pH-Wert von 7,0 bis 7,4 und eine Ionen­ konzentratin von 0,055 bis 0,065 gI/l eingestellt, und der dabei ge­ bildete Niederschlag wird isoliert und gegebenenfalls gefriergetrocknet.

Ersichtlich ist ein vielstufiges Verfahren vorgesehen, das in der 3. Stufe die Bildung eines Niederschlages vorsieht, der in der 4. Stufe durch eine weitere Fällung fraktioniert wird. Insoweit handelt es sich beim bekannten Verfahren um ein mehrstufiges Fällungsverfahren, wobei im Fällungsgemisch u. a. eine bestimmte Methanolkonzentration eingestellt wird. Die höchste Methanolkonzentration beträgt 33,0 bis 33,4%.

Die US-Patentschrift 40 21 540 offenbart ein Verfahren zur Gewinnung eines Immunglobulin, das gegen Hepatitis-B-Viren wirksam ist. Das Ver­ fahren entspricht weitestgehend dem vorstehend beschriebenen, aus AT 2 70 068 B1 bekannten Verfahren.

Die bekannten Verfahen sehen mit der chromatographischen Auftrennung oder mit der stufenweisen Polyethylenglykol/Ethanol-Fällung oder mit der mehrstufigen Fällung bei unterschiedlichen Methanolkonzentrationen mehrstufige Reinigungsschritte vor. Würde andererseits die Extraktion des Gesamtglobulinniederschlages mit einem schwach sauren Ethanol/Wasser- Extraktionsmittel unter Cohn-Bedingungen durchgeführt werden, so würden im Extrakt erneut polymere IgG-Aggregate auftreten, und das Produkt könnte nicht oder nur nach weiteren aufwendigen Reinigungsmaßnahmen für eine intravenöse Applikation vorgesehen werden.

Demgegenüber besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, bei einem Verfahren der eingangs genannten Art aus dem Gesamtglobulin- Niederschlag mit einem preiswerten Lösungsmittel unter definierten, leicht einstellbaren Extraktionsbedingungen in einem einzigen Extraktions­ schritt einen geklärten Extrakt zu erzeugen, der direkt oder nach einer wahlweisen zusätzlichen Feinreinigungsstufe zum applizierbarem Präparat weiter verarbeitet wird.

Ausgehend von einem Verfahren mit den oben angegebenen Maßnahmen ist die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe dadurch gekennzeichnet, daß

• - der in Stufe (a) enthaltene Gesamtglobulinniederschlag - soweit erforderlich - auf ein Rest­ lösungsmittel eingestellt wird, das neben Wasser 35 bis 40 Vol.-% Methanol enthält und das einen pH von 6,5 bis 7,0 aufweist;
• - dieser eingestellte Gesamtglobulinniederschlag in Stufe (b) bei einer Temperatur von 2 bis 8°C mit einem Lösungsmittel extrahiert wird, das neben Wasser 38 bis 42 Vol.-% Methanol enthält; wobei
• - das Extraktionsgemisch bei einem pH von 4,7 bis 5,3 und bei einer Methanolkonzentration von 38 bis 42 Vol.-% Methanol im Methanol/Wasser- Gemisch gehalten wird; und
• - der dabei erhaltene Extrakt geklärt - wahlweise einer Feinreinigung unterworfen - und nach Stufe (c) weiter verarbeitet wird.

Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Mit der erfindungsgemäßen Methanol-Extraktion werden eine Reihe von Vorteilen erzielt. So wird die Nativität des Ausgangs-Gamma-Globulins im Vergleich zu anderen Verfahren nicht nennenswert denaturiert. Die Methanolextraktion als solche führt nicht zu einer nennenswerten Bildung von IgG-Dimeren unter den angegebenen Bedingungen. In dem nach der Methanolextraktion erhaltenen Extrakt treten keine IgG-Trimere und höhere IgG-Polymere auf.

Methanol ist ein preiswertes Lösungs- bzw. Extraktionsmittel. Die Methanolentfernung aus der IgG-Lösung ist unproblematisch, weil zur Einstellung einer isotonischen Salzkonzentration und eines physiologisch verträglichen pH-Wertes typischerweise Dialyseschritte vorgesehen werden, welche auch Methanolspuren aus dem Präparat entfernen.

Die erfindungsgemäß vorgesehenen Extraktionsbedingungen erfordern geringere Energiekosten, weil im Vergleich zu bekannten Verfahren bei höheren Temperaturen gearbeitet werden kann.

Schließlich erfordert die erfindungsgemäße Methanolextraktion eine geringere Anzahl an Verfahrensschritten und liefert eine höhere Ausbeute an applizierbarem IgG-Präparat als vergleichbare bekannte Verfahren.

Als Ausgangsmaterial für die erfindungsgemäße Methanolextraktion dient ein Gesamtglobulinniederschlag, der weniger als 1 Gew.-% IgG-Polymere enthält und der als Restlösungsmittel bereits ein Methanol/Wasser-Gemisch enthält. Dieses Restlösungsmittel soll neben Wasser 35 bis 40 Vol.-% Methanol enthalten und einen pH von 6,5 bis 7,0 aufweisen. Ein, ein anderes Restlösungsmittel enthaltender Gesamtglobulinniederschlag, beispielsweise die Cohn-Fraktionen II und II+III, wird mit einem Methanol/Wasser-Gemisch umgewaschen, das neben Wasser 35 bis 40 Vol.-% Methanol enthält und das einen pH von 6,5 bis 7,0 aufweist. Ein dieses bestimmte Restlösungsmittel enthaltender Gesamtglobulinniederschlag wird nachstehend als eingestellter Gesamtglobulinniederschlag bezeichnet.

Als Ausgangsmaterial zur Bereitstellung eines eingestellten Gesamtglobulinniederschlags dienen bekannte, Gamma-Globulin enthaltende Materialien, wie etwa Überstände der Kryopräzipitatzentrifugation, out-dated-Plasma, die Fraktionen II oder II+III der Cohn'schen Ethanol-Plasma-Fraktionierung, Plazenta-Extrakt, der entsprechende Fraktionen enthält, im Einzelfall gezielt mit Immunkörpern angereichertes Plasma und andere in der Plasmaaufbereitung anfallende Gamma-Globulin enthaltende Fraktionen. Die Fällungsbehandlung(en) dieser Ausgangslösungen soll(en) unter schonenden Bedingungen durchgeführt werden, so daß der gebildete Gesamtglobu­ linniederschlag weniger als 1 Gew.-% IgG-Dimere und IgG-Polymere enthält. Soweit erforderlich, wird der aus diesen Materialien erhaltene Gesamtglobulinniederschlag mit einem Methanol/Wasser-Gemisch umgewaschen, das neben Wasser 35 bis 40 Vol.-% Methanol enthält und das einen pH von 6,5 bis 7,0 aufweist, um einen eingestellten Gesamtglobulinniederschlag zu erhalten.

Vorzugsweise werden bereits die vorstehend genannten IgG-haltigen Ausgangslösungen mit einem Methanol/Wasser-Fäl­ lungsmittel behandelt, um einen Gesamtglobulinniederschlag zu erhalten, der weitgehend frei von IgG-Dimeren und IgG-Polymeren ist. Zur Durchführung dieser Gesamtglobulinfällung wird die Ausgangslösung (Serum, Plasma, Plazenten) mit Puf­ ferlösung auf eine Proteinkonzentration von etwa 4,0 bis 4,5% und einen pH von etwa 6,4 bis 6,8 eingestellt, und diese eingestellte Ausgangslösung wird mit reinem Methanol oder mit einer Methanol/Wasser-Lösung versetzt, die neben Wasser etwa 60 bis 99 Vol.-% Methanol enthält, wobei das Methanol oder die Methanol/Wasser-Lösung eine Temperatur von -8°C bis -25°C aufweist. Die ein­ gestellte Ausgangslösung wird mit einer solchen Menge Methanol oder Methanol/Wasser-Lösung versetzt, die zu einem Metha­ nolgehalt von etwa 40 Vol.-% im Restlösungsmittel der Ge­ samtglobulinfällung führt. Der Niederschlag wird abgetrennt und enthält bereits das für die Weiterverarbeitung vorge­ sehene, bestimmte Restlösungsmittel.

Der eingestellte Gesamtglobulinniederschlag wird der er­ findungsgemäßen Methanolextraktion zugeführt. Hierbei wird der eingestellte Gesamtglobulinniederschlag bei einer Tempe­ ratur von 2 bis 8°C mit einem Lösungsmittel extrahiert, das neben Wasser 38 bis 42 Vol.-% Methanol enthält. Vorzugs­ weise enthält das Lösungsmittel neben Wasser etwa 40 Vol.-% Methanol. Das Extraktionsgemisch wird bei einem pH von 4,7 bis 5,3 und bei einer Methanolkonzentration von 38 bis 42 Vol.-% Methanol im Methanol/Wasser-Gemisch gehalten.

Beträgt die Methanolkonzentration des Methanol/Wasser-Ge­ misches im Extraktionsgemisch weniger als 38 Vol.-% Metha­ nol, so gehen bereits Spuren von Begleitproteinen in Lösung und das Produkt wird unreiner. Beträgt andererseits die Methanolkonzentration im Methanol/Wasser-Gemisch des Extrak­ tionsgemisches mehr als 42 Vol.-% Methanol, so geht das Gamma-Globulin nicht ausreichend in Lösung und die Ausbeuten sinken schlagartig. Vorzugsweise wird bei einer Methanolkon­ zentration von etwa 40 Vol.-% im Methanol/Wasser-Gemisch des Extraktionsgemisches gearbeitet. Hier wird ein besonders reines Produkt erhalten und das im Gesamtglobulinnieder­ schlag enthaltene Gamma-Globulin löst sich vollständig.

Die erfindungsgemäße Methanolextraktion wird bei einer Temperatur zwischen +2 bis +8°C durchgeführt. Es wäre mög­ lich, auch bei tieferen Temperaturen zu arbeiten, wobei je­ doch die Methanolkonzentration an die dann gegebene Löslich­ keit von Gamma-Globulin angepaßt werden müßte. Abgesehen von Sonderfällen bringt ein Arbeiten bei tieferen Temperaturen keine Vorteile, erfordert jedoch einen höheren Energiebe­ darf. Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße Methanolextrak­ tion bei einer Temperatur von etwa +4°C durchgeführt.

Weiterhin wird im Extraktionsgemisch ein pH zwischen 4,7 und 5,3 aufrecht erhalten. Bei einem pH unterhalb 4,7 tritt unter diesen Extraktionsbedingungen eine Denaturierung des Gamma-Globulins auf. Bei einem pH oberhalb 5,3 wird eine schleichende Ausbeuteabnahme beobachtet. Vorzugsweise wird bei einem pH zwischen 5,1 und 5,2 im Extraktionsgemisch ge­ arbeitet. Hier wird eine optimale Ausbeute und Reinheit des Gamma-Globulins erhalten.

Die laufende Überwachung des pH-Wertes des Extraktionsge­ misches kann mit Hilfe von Wasserstoffelektroden erfolgen. Zur pH-Einstellung wird der Gesamtglobulinniederschlag direkt mit 0,01 m Na-Azetat-Puffer 4,7 in Lösung gebracht. Jegliche Eintropfdenaturierung und/oder Polymerbildung wird vermieden.

Vorzugsweise wird 1 Gewichtsteil Gesamtglobulinniederschlag mit etwa 2 bis 6 Gewichtsteilen Methanol/Wasser-Gemisch extrahiert. Besonders bevorzugt wird 1 Gewichtsteil Gesamt­ globulinniederschlag mit etwa 4 Gewichtsteilen Lösungs­ mittel extrahiert. Es wird eine optimale Gamma-Globulinaus­ beute erhalten.

Je nach Art und Zusammensetzung des Gesamtglobulinnieder­ schlags gehen unter diesen Extraktionsbedingungen etwa 1/3 der Eiweißmenge in Lösung. Der restliche Anteil wird ver­ worfen oder kann zu anderen Produkten aufgearbeitet werden. Der gebildete Extrakt wird durch Filtration und/oder Zentri­ fugation von dem verbleibenden Rest abgetrennt. Es wird ein geklärter Extrakt erhalten, der abhängig von der Restfeuchte des Gesamtglobulinniederschlags zwischen etwa 1,0 bis 3,0 Gew.-% hochreines Gamma-Globulin (Reinheit über 95%) ent­ hält. Dieser geklärte Extrakt kann bei Bedarf wahlweise einer zusätzlichen Feinreinigung unterworfen werden, oder dieser geklärte Extrakt wird direkt der Weiterverarbeitung zum applizierbaren Präparat zugeführt.

Die für Fachleute überraschende Reinheit der erfindungsge­ mäß erhältlichen IgG-Lösung wird auch durch die Figuren be­ stätigt; es zeigen:

Fig. 1a ein HPLC-Chromatogramm eines handelsüblich zugänglichen, applizierbaren IgG-Präparates, das nach Cohn-Fraktionierung und mehreren Reinigungsschritten erhalten wurde; neben dem Hauptpeak des IgG-Monomeren sind deut­ lich die Peaks für IgG-Dimere und für Albu­ min zu erkennen, das dem Präparat als Stabi­ lisator zugesetzt ist; und

Fig. 1b das unter analogen Bedingungen erhaltene HPLC-Chromatogramm eines geklärten IgG-Extraktes, der nach einmaliger, erfindungsgemäßer Metha­ nolextraktion aus einem, weniger als 1 Gew.-% IgG-Polymere enthaltenden Gesamtglobulinnie­ derschlag erhalten wurde. Es ist deutlich zu erkennen, daß die für die IgG-Dimeren charak­ teristische Absorption lediglich als schwache Schulter ausgeprägt ist, was bestätigt, daß dieser erfindungsgemäß erzeugte IgG-Extrakt im wesentlichen vollständig aus IgG-Monomeren be­ steht und IgG-Dimere lediglich in Spuren vor­ handen sind.

Für Fachleute ist überraschend, daß eine Methanolextraktion unter den erfindungsgemäß vorgesehenen Bedingungen keinerlei Denaturierung der Immunglobuline hervorruft und daß bereits eine einstufige Methanolextraktion ein derart hochreines Präparat liefert.

Die Bedingungen der erfindungsgemäßen Methanolextraktion unterscheiden sich eindeutig von den typischen Bedingungen der Cohn′schen Ethanol-Franktionierung. Typischerweise wird nach Cohn die Gamma-Globulin enthaltende Ausgangslösung bei 0°C und pH 5,8 durch Ethanolzugabe auf einen Ethanolgehalt von 9 Vol.-% Ethanol gebracht. Nach Einstellung stabiler Be­ dingungen wird auf -5°C abgekühlt und es erfolgt eine Zu­ gabe von tiefgekühltem (-8°C) Ethanol bis zu einer Ethanol­ konzentration von 19 Vol.-% Ethanol im Fällungsgemisch. Es wird weiter bis auf -8°C abgekühlt. Der gebildete Nieder­ schlag wird abgetrennt und durch Zentrifugation oder Filtra­ tion von überschüssigem Lösungsmittel befreit. Zur Weiter­ verarbeitung und Lösung des Gamma-Globulins kann dieser Niederschlag mit einem wäßrigen Extraktionsmittel behandelt werden, das durch Zugabe von Na-Azetat und Essigssäure auf einen pH von etwa 4,6 eingestellt ist. Unter diesen Cohn′­ schen Bedingungen kann ein intravenös applizierbares Präpa­ rat nicht erhalten werden; vielmehr sind weitere Reinigungs­ schritte erforderlich, beispielsweise mit Hilfe einer stu­ fenweisen PEG-Zugabe und Abtrennung der jeweils gebildeten Niederschläge.

Würde unter den oben dargelegten Cohn′schen Fällungsbedin­ gungen anstelle von Ethanol mit Methanol als organischem Fällungsmittel gearbeitet werden, so könnte eine nennens­ werte Ausbeute an Gamma-Globulin nicht erhalten werden. Würde andererseits unter den Bedingungen der erfindungsge­ mäßen Methanolextraktion anstelle von Methanol mit Ethanol gearbeitet werden, so würde das zur Denaturierung führen, und eine verwertbare Ausbeute an Gamma-Globulin könnte ebenfalls nicht erzielt werden. Unter Beibehaltung der restlichen Bedingungen kann Methanol nicht durch Ethanol ersetzt werden und umgekehrt.

Der nach der erfindungsgemäßen Methanolextraktion erhaltene, klar filtrierte Extrakt wirdbei Bedarf wahlweise einer Feinreinigung unterworfen. Die Feinreinigung kann mit Hilfe bekannter Maßnahmen durch­ geführt werden, beispielsweise durch Adsorption der uner­ wünschten Begleitkomponenten an Kieselsäure oder an andere Mineralien vom Typ der Alumosilikate. Gute Ergebnisse wurden beispielsweise durch Adsorption an den Anionenaustauscher "SEPHADEX DEAE-A 50" erzielt. Die Feinreinigung kann einstu­ fig durchgeführt werden, oder mehrstufig durch Wiederholung des gleichen Reinigungsschrittes oder durch aufeinander­ folgende Anwendung verschiedener Reinigungsschritte. Vor­ zugsweise ist eine Feinreinigung vorgesehen, die als einen ersten Reinigungsschritt eine Wiederholung der oben be­ schriebenen Methanolextraktion vorsieht.

Bei diesem vorzugsweise vorgesehenen Feinreinigungsschritt erfolgt eine IgG-Ausfällung durch pH-Anhebung in methanoli­ scher Lösung und daraufhin erneut eine Methanolextraktion des Niederschlags. Von der vorausgegangenen Methanolextrak­ tion her weist der klar filtrierte Extrakt einen pH von 5,1 auf. Unter Konstanthaltung des Methanolgehaltes bei etwa 40 Vol.-% Methanol wird der pH des Extraktes auf 6,5 bis 7,3 angehoben. Besonders bevorzugt wird der pH auf 6,9 bis 7,0 angehoben. Diese pH-Anhebung kann mit bekannten Pufferlö­ sungen erfolgen; vorzugsweise wird 0,5 m NaHCO₃-Lösung zu­ gesetzt. Unter den gewählten Bedingungen für Temperatur und Methanolgehalt wird lediglich das monomere Immunglobulin ausgefällt, ohne daß die in Spuren vorhandenen Begleit­ proteine mitgerissen werden. Der gebildete Niederschlag wird abgetrennt, beispielsweise durch Zentrifugieren oder Fil­ trieren. Der erhaltene Niederschlag wird mit dem Fällungs­ mittel (40 Vol.-% Methanol, pH 6,9 bis 7,0) gewaschen. Das gewaschene Präzipitat wird erneut der erfindungsgemäßen Methanolextraktion zugeführt. Die Methanolextraktion er­ folgt unter den oben angegebenen Bedingungen, d. h., bei einer Temperatur von etwa 4°C mit einem 40 Vol.-% Methanol enthaltenden Lösungsmittel, das einen pH von etwa 4,7 aufweist. Abweichend kann eine geringere Menge Lösungs­ mittel eingesetzt werden, um die IgG-Verluste in dem im Niederschlag verbleibenden Restlösungsmittel möglichst ge­ ring zu halten. Vorzugsweise wird bei dieser erneuten Methanolextraktion im Verlauf der Reinreinigung 1 Gewichts­ teil Niederschlag mit etwa 3 Gewichtsteilen Lösungs­ mittel behandelt. Der danach erhaltene Extrakt wird klar filtriert. Die klar filtrierte IgG-Lösung ist praktisch frei von unerwünschten Begleitproteinen und wird der Dialyse oder den Dialysen zur Methanolentfernung, Einstellung eines physiologisch verträglichen pH-Wertes und einer isotoni­ schen Salzkonzentration zugeführt. Diese Dialyseschritte werden in bekannter Weise durchgeführt. Lediglich im Ein­ zelfall und bei Bedarf kann im Anschluß an die zweite Methanolextraktion im Verlauf der Feinreinigung noch eine weitere Feinreinigungsstufe, beispielsweise mit einem Anionenaustauscher vorgesehen werden. Dies kann beispiels­ weise dann angezeigt sein, wenn der Ausgangs-Gesamtglobu­ linniederschlag einen unüblich hohen Anteil an dimeren und polymeren IgG-Aggregaten enthalten hat.

Die Weiterverarbeitung des nach Stufe (b) erhaltenen geklärten Extraktes oder der nach der Feinreinigung erhalte­ nen IgG-Lösung zum applizierbaren Präparat einschließlich Einstellung eines physiologisch verträglichen pH-Wertes, Zu­ gabe von Stabilisierungsmittel(n), Einstellung der gewünsch­ ten Proteinkonzentration, Sterilisation und ggf. Virusin­ aktivierung/-Elimination - gemäß Stufe (c) - erfolgt mit Hilfe üblicher, in der Fachwelt bekannter Maßnahmen. Beispielsweise kann zur Ein­ stellung eines physiologisch verträglichen pH-Wertes eine Dialyse mit 0,05 m Na-Citrat-Puffer pH 7,0 vorgesehen werden. Als Stabilisierungsmittel haben sich beispielsweise Glycin, Glykose und/oder Mannit bewährt. Beispielsweise kann zur Stabilisierung und zur Einstellung einer isotonischen Salzkonzentration eine Enddialyse mit einer Lösung von 3% Glukose und 0,6% NaCl vorgesehen werden. Zur Sterilisation kann eine Sterilfiltration vorgesehen werden. Auch eine Virusinaktivierung oder Viruselimination kann in bekannter Weise erfolgen. Zweckmäßigerweise wird das applizierbare Präparat auf einen IgG-Gehalt von 5 Gew.-% eingestellt.

Die nachstehenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung ohne diese einzuschränken.

Beispiel 1

Als Ausgangsmaterial für die erfindungsgemäße Herstellung von nativem, intravenös verabreichbarem, stabilisiertem Immunglobulin (IgG) werden Überstände der Kryopräzipi­ tatzentrifugation, out-dated-Plasma oder andere in der Plasmaaufarbeitung anfallende, Gamma-Globulin enthaltende Fraktionen eingesetzt. In jedem Falle wird von einer Lösung ausgegangen, der 0,05 m Na-Acetat-Puffer pH 4,7 zugesetzt wird, um die Proteinkonzentration auf 4,3 Gew.-% einzu­ stellen. Nach Zusatz des Puffers weist die Mischung einen pH von 6,4 bis 6,8 auf. Das Plasma-Puffer-Gemisch wird auf eine Temperatur von etwa 4°C gebracht.

Zur Erzeugung eines Gesamtglobulinniederschlags wird dieses, bei 4°C gehaltene Plasma-Puffer-Gemisch mit einer tiefge­ kühlten, wäßrigen Methanol-Lösung versetzt, die neben Was­ ser etwa 65 Vol.-% Methanol enthält und eine Temperatur von -8°C bis -25°C aufweist. Unter diesen Bedingungen wird jegliche Eintropfdenaturierung vermieden. Die tiefgekühlte wässrige Methanol-Lösung wird so lange zugesetzt, bis im Fällungsgemisch eine Methanolkonzentration in der Wasser/- Methanol-Lösung von 40 Vol.-% Methanol erreicht ist. Das ge­ bildete Präzipitat wird durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt und dient als Gesamtglobulinniederschlag zur er­ findungsgemäßen Herstellung eines intravenös applizierbaren IgG-Präparates. Aufgrund der vorausgegangenen Methanolfäl­ lung enthält dieser Gesamtglobulinniederschlag ein Restlö­ sungsmittel, das neben Wasser 35 bis 40 Vol.-% Methanol ent­ hält und das einen pH von 6,5 bis 7,0 aufweist.

Dieser, das bestimmte Restlösungsmittel enthaltende Gesamt­ globulinniederschlag wird der erfindungsgemäßen Methanol­ extraktion zugeführt. Die Extraktion des Niederschlages er­ folgt mit einem Lösungsmittel, das aus 40 Vol.-% Metha­ nol und wässrigem 0,01 m Na-Acetat-Puffer mit einem pH von 4,7 besteht. 1 Gewichtsteil Gesamtglobulinniederschlag wird mit 4 Gewichtsteilen Lösungsmittel extrahiert. Das Extraktionsgemisch wird bei einem pH von 5,1 und bei einer Methanolkonzentration von etwa 40 Vol.-% Methanol im Methanol/Wasser-Gemisch gehalten. Die im Lösungsmittel unlöslichen Anteile werden abgetrennt und der gebildete Extrakt wird klar filtriert. Eine Probe dieses geklärten Extraktes liefert das HPLC-Chromatogramm gemäß Fig. 1b.

Zur wahlweisen Feinreinigung wird dieser geklärte Extrakt erneut umge­ fällt. Hierzu wird 0,5 m NaHCO₃-Lösung zugesetzt, um den pH auf 6,9 bis 7,0 anzuheben; hierbei wird der Methanolgehalt des Gemisches konstant gehalten. Der gebildete IgG-Nieder­ schlag wird mittels Zentrifugation oder Filtration abge­ trennt. Der erhaltene Niederschlag wird unter Fällungsbedin­ gungen gewaschen. Das gewaschene Präzipitat wird erneut mit dem Methanol/Wasser-Lösungsmittel unter den vorstehend angegebenen Bedingungen extrahiert, wobei 1 Gewichtsteil IgG-Präzipitat mit 3 Gewichtsteilen Lösungsmittel be­ handelt werden. Der danach erhaltene Extrakt wird klar filtriert.

Die nach Klarfiltration und wahlweiser Feinreinigung anfallende IgG-Lösung wird zum applizierbaren Präparat weiterverarbeitet.

Die Dialyse der so erhaltenen IgG-Lösung erfolgt zunächst mit 0,05 m Na-Citrat-Puffer pH 7,0. Die Enddialyse erfolgt mit einer Lösung von 3% Glukose und 0,6% NaCl. Die resul­ tierende IgG-Lösung wird abschließend isoosmotisch und auf einen Proteingehalt von 5% eingestellt. Sämtliche Fällungs- und Separationsschritte werden bei einer Temperatur von 4°C ausgeführt. Das HPLC-Chromatogramm des so erhaltenen, appli­ zierbaren IgG-Präparates zeigt einen Gehalt an 99% IgG-Monomeren und lediglich Spuren von IgG-Dimeren.

Beispiel 2

Als Ausgangsmaterial zur erfindungsgemäßen Herstellung von nativem, intravenös verabreichbarem Immunglobulin dient das Präzipitat der Fraktion II+III der Cohn′schen Ethanol-Plas­ ma-Fraktionierung, sofern dieses weitgehend frei von IgG- Polymeren (weniger als 1 Gew.-% ) ist. Aufgrund der Cohn′­ schen Fraktionierungsbedingungen enthält dieser Gesamtglobu­ linniederschlag als Restlösungsmittel ein Ethanol/Wasser-Gemisch. Dieser ethanolhaltige Gesamtglobulinniederschlag wird bei einer Temperatur von 4°C mit einem Methanol/Was­ ser-Gemisch umgewaschen, das neben Wasser 40 Vol.-% Methanol enthält und einen pH von 6,7 bis 7,0 aufweist; zur pH-Ein­ stellung dient 0,01 m Na-Acetat-Puffer. 1 kg ethanolhaltiger Gesamtglobulinniederschlag wird in 4 l Methanol/Wasser-Ge­ misch aufgeschlämmt. Daraufhin wird der Niederschlag erneut durch Filtration oder Zentrifugation abgetrennt, wobei ein eingestellter Gesamtglobulinniederschlag erhalten wird, dessen Restlösungsmittel neben Wasser 35 bis 40 Vol.-% Methanol enthält und einen pH von 6,5 bis 7,0 aufweist.

Dieser eingestellte Gesamtglobulinniederschlag wird darauf­ hin der erfindungsgemäßen Methanolextraktion zugeführt, wie das in Beispiel 1 beschrieben ist. Das Extraktionsmittel besteht aus 0,01 m Na-Acetat-Puffer und 40 Vol.-% Methanol und weist einen pH von 4,7 auf. 1 kg eingestellter Gesamt­ globulinniederschlag wird mit 4 l Lösungs- bzw. Extraktionsmittel behan­ delt. Der pH-Wert des Extraktionsgemisches wird bei 5,1 ge­ halten. Der erhaltene Extrakt wird klar filtriert. Die weitere Verarbeitung zum applizierbaren Präparat erfolgt in gleicher Weise wie oben in Beispiel 1 angegeben. Das HPLC-Chromatogramm des applizierbaren Präparates zeigt 99% IgG-Monomere und lediglich Spuren von Dimeren.

Beispiel 3

Die erfindungsgemäße Methanolextraktion des Gesamtglobulin­ niederschlags erfolgt in gleicher Weise wie in Beispiel 1 angegeben. Der nach der Klarfiltration erhaltene saure Extrakt wird der Feinreinigung zugeführt. In diesem Falle wird dieser saure Extrakt zunächst zur Entfernung von Me­ thanol gegen 0,05 m Citrat-Phosphat-Puffer, pH 7,0 dialy­ siert und danach gegen eine 0,1 m NaCl-Lösung, pH 7,0 dialysiert, und das erhaltene Material auf eine Konzentra­ tion von 6 bis 8% Eiweiß eingestellt. Dieses Material wird mit dem Anionenaustauscher SEPHADEX DEAE-A 50 behandelt, der vorher auf oben genannte Milieubedingungen äquilibriert und autoklaviert worden ist. Etwa 1 l konzentrierter Extrakt wird mit 2 g SEPHDEX DEAE-A 50 behandelt. Hierdurch werden Spurenbegleitkomponenten des IgG an das Austauscherharz adsorbiert und auf diesem Wege entfernt. Das beladene Aus­ tauscherharz wird abgetrennt. Daraufhin erfolgt die Stabi­ lisierung und Einstellung der IgG-Lösung zum applizierbaren Präparat.

Die erfindungsgemäß erhältlichen, nativen, intravenös appli­ zierbaren IgG-Präparate sind insbesondere zum Einsatz im Humanbereich bestimmt. Wegen der geringen Verluste und des­ halb hohen Ausbeute ist das Verfahren auch zur Aufarbeitung von hyperimmunusiertem Plasma gut geeignet. Darüber hinaus können erfindungsgemäß erhältliche IgG-Präparate auch im veterinärmedizinischen Bereich eingesetzt werden, beispiels­ weise zur Behandlung von Pferd, Rind, Schwein oder Hund, so­ fern von homologen Ausgangsmaterialien ausgegangen wird.

Claims (12)

1. Verfahren zur Herstellung von nativem, intravenös verabreichbarem, stabilisiertem Immunglobulin (IgG), wobei bei einer Temperatur unterhalb 8°C

• a) unter Maßnahmen zur schonenden Gesamtglobulinfällung aus Serum, Plasma oder Plazenten ein IgG enthaltender Gesamtglobulinniederschlag ausgefällt und abgetrennt wird, der weniger als 1 Gew.-% Polymere enthält,
• b) dieser Gesamtglobulinniederschlag bei schwach saurem pH mit einer schwach ionischen, wäßrigen, alkoholischen Lösung behandelt wird, und
• c) die danach erhaltene IgG-Lösung vom alkoholischen Lösungsmittel befreit, auf eine gewünschte Proteinkonzentration sowie isotonische Salzkonzentration und einen physiologisch verträglichen pH-Wert eingestellt wird und durch Zugabe von Stabilisierungsmittel(n), Sterilisation und gegebenenfalls Virusinaktivierung/-elimination, zu einem applizierbarem Präparat weiterverarbeitet wird,

dadurch gekennzeichnet, daß
der in Stufe (a) erhaltene Gesamtglobulinniederschlag - soweit erforderlich - auf den Restlösungsmittel eingestellt wird, das neben Wasser 35 bis 40 Vol.-% Methanol enthält und das einen pH von 6,5 bis 7,0 aufweist;
dieser eingestellte Gesamtglobulinniederschlag in Stufe (b) bei einer Temperatur von 2 bis 8°C mit einem Lösungsmittel extrahiert wird, das neben Wasser 38 bis 42 Vol.-% Methanol enthält; wobei
das Extraktionsgemisch bei einem pH von 4,7 bis 5,3 und bei einer Methanolkonzentration von 38 bis 42 Vol.-% Methanol im Methanol/Wasser-Gemisch gehalten wird; und
der dabei erhaltene Extrakt geklärt, - wahlweise einer Feinreinigung unterworfen - und nach Stufe (c) weiterverarbeitet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
zur Feinreinigung der pH des geklärten Extraktes auf 6,5 bis 7,0 angehoben wird;
der dabei gebildete Niederschlag separiert wird; und
dieser separierte Niederschlag erneut bei einer Temperatur von 2 bis 8°C mit einem Lösungsmittel extrahiert wird, das neben Wasser 38 bis 42 Vol.-% Methanol enthält; wobei
das Extraktionsgemisch bei einem pH von 4,7 bis 5,3 und bei einer Methanolkonzentration von 38 bis 42 Vol.-% Methanol im Methanol/Wasser-Gemisch gehalten wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der im Verlauf der Feinreinigung separierte Niederschlag mit einer solchen Menge Lösungsmittel extrahiert wird, um eine IgG-Lösung zu erhalten, die eine IgG-Konzentration größer 5%, vorzugsweise eine IgG-Konzentration von 6 bis 9% aufweist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gewichtsanteil eingestellter Gesamtglobulinniederschlag mit etwa 2 bis 6 Gewichtsteilen Lösungsmittel extrahiert wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel neben Wasser etwa 40 Vol.-% Methanol enthält.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel einen pH von 4,7 bis 5,3 aufweist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die pH-Einstellung des Lösungsmittels mit Na-Azetat-Pufferlösung erfolgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel eine 0,0005 bis 0,02 molare Ionenkonzentration aufweist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Extraktionsgemisch bei einem pH von 5,1 bis 5,2 gehalten wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß
zur Durchführung der Gesamtglobulinfällung nach Stufe (a) die Ausgangslösung (Serum, Plasma, Plazenten) mit Pufferlösung auf eine Proteinkonzentration von etwa 4,0 bis 4,5% und auf einen pH von etwa 6,4 bis 6,8 eingestellt wird;
diese eingestellte Ausgangslösung mit reinem Methanol oder mit einer Methanol/Wasser-Lösung versetzt wird, die neben Wasser etwa 60 bis 99 Vol.-% Methanol enthält, wobei das Methanol oder die Methanol/Wasser-Lösung eine Temperatur von -8°C bis -25°C aufweist; und
die eingestellte Ausgangslösung mit einer solchen Menge Methanol oder Methanol/Wasser-Lösung versetzt wird, die zu einem Methanolgehalt von etwa 40 Vol.-% im Restlösungsmittel der Gesamtglobulinfällung führt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (c) das alkoholische Lösungsmittel durch Dialyse oder durch Anionenaustauscher-Behandlung entfernt wird.