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Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung eines chemisch unmodifizierten, nicht enzymatisch behandelten, im wesentlichen Immunglobulin A (IgA)-freien Immunglobulin G (IgG), das frei von Nebenwirkungen ist, aus praktisch reinem IgG besteht und in Form einer stabilen klaren wässrigen Lösung oder als lyophilisiertes Präparat für die intravenöse Verabreichung zur Verfügung steht.
In der EP-A 85 747 wird ein Immunglobulin zur intravenösen Verabreichung beschrieben, das aus einer nach bekannten Methoden gewonnenen Immunglobulinlösung erhalten wird, indem man sie säulenchromatographisch an einen Anionenaustauscher bindet, das monomere Immunglobulin selektiv eluiert, dieses durch Behandlung mit einer sehr schwachen Säure und/oder durch Zusatz eines Polyglykols und Zuckers und/oder Polyols stabilisiert und anschliessend die letzten Reste von antikomplementärer Aktivität durch Adsorption an Aluminiumhydroxid entfernt. Dieses Produkt ist jedoch nur im lyophilisierten Zustand lagerfähig.
Aus der AT-PS 381 026 ist ein vielstufiges Verfahren zur Herstellung einer intravenös verabreichbaren und in flüssiger Form lagerstabilen IgG-Lösung bekannt, das jedoch in bezug auf Ausbeute, Einfachheit des Verfahrens und auf Reinheit des Produktes nicht voll befriedigt, wobei auch die Entsorgung des Fällungsmittels in umweltfreundlicher Weise problematisch ist. Das Verfahren beruht darauf, dass aus einer Rohglobulinlösung die Euglobuline bei einem pH-Wert zwischen 5, 3 und 5, 5 gefällt und die verschiedenen Verunreinigungen durch zugesetztes Bariumsulfat und Immunglobulin A durch zugesetzten DEAE-Ionenaustauscher gebunden werden. Die Immunglobulinlösung wird dann durch eine Säure- und Hitzebehandlung stabilisiert und durch mehrmalige Fällung mit Ammonsulfat gereinigt.
Letzte Verunreinigungen werden durch Adsorption an Aktivkohle und Aluminiumhydroxid gebunden.
In der WO-A 84/00891 wird ein Verfahren zur Herstellung von intravenös verträglichem Gammaglobulin beschrieben, wobei das Gammaglobulin durch eine Behandlung mit einem Ionenaustauscher und durch Ultrafiltration gereinigt wird. Diese Reinigungsschritte müssen in Anwesenheit von Stabilisatoren erfolgen. Das so erhaltene Produkt ist jedoch nicht in flüssiger Form lagerstabil.
In der DE-OS 2606118 wird ein mehrstufiges Verfahren zur Herstellung eines intravenös verträglichen Gammaglobulin-Präparates beschrieben. Hierbei wird in einer Stufe a) eine Euglobulinfällung bei pH 4, 8 bis 6, 5 durchgeführt, in einer Stufe b) werden Verunreinigungen mit Polyethylenglykol (PEG) mit einem Molekulargewicht von 4 000 bei einer Konzentration von 4 und 5 % ausgefällt und in Stufe c) wird das IgG mit PEG 4 000 bei einer Konzentration von 12 % gefällt. In dieser Offenlegungsschrift werden jedoch keine Angaben über die Reinheit des Produktes, insbesondere über den Gehalt an Monomeren gemacht. Die nach diesem Verfahren erhaltenen Produkte haben ausserdem den Nachteil, dass das als Fällungsmittel verwendete PEG im Präparat verbleibt. Ferner müssen zur Stabilisierung Albumin und ein oberflächenaktives Mittel zugesetzt werden.
Letzteres ist jedoch vom medizinischen Standpunkt unerwünscht.
In der AT-PS 359 641 wird ein Verfahren zur Herstellung eines intravenös verträglichen Gammaglobulins beschrieben, wobei die immunglobulinhältige Fraktion in einer ersten Reinigungsstufe einer Fällung mit Ammonsulfat unterzogen und anschliessend durch eine ein- oder mehrmalige Fällung mit Polyethylenglykol gereinigt wird, wobei die Fällung mit Polyethylenglykol in Gegenwart von Stabilisatoren erfolgt. Es findet sich in dieser Schrift jedoch kein Hinweis, dass auch niedermolekulares Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht zwischen 200 und 1000 als Fällungsmittel verwendet werden kann.
Es stellte sich daher die Aufgabe, ein einfacheres und gute Ausbeuten lieferndes Verfahren zur Herstellung eines in flüssiger Form lagerstabilen, oder lyophilisierten, praktisch reinen Immunglobulins zur intravenösen Verabreichung zu entwickeln.
Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, dass man eine vorgereinigte IgG-Lösung einer Kombination von mehreren aufeinander folgenden und aufeinander abgestimmten Behandlungsschritten unterwirft. In einer ersten Stufe werden unerwünschte Begleitproteine durch eine Euglobulinfällung beseitigt, anschliessend folgt eine Säurestabilisierung und eine Behandlung mit einem Anionenaustauscher, durch den Immunglobuline, die nicht der IgG-Klasse angehören, z. B. IgA, wie auch andere Verunreinigungen und ein Teil der unphysiologischen IgG-Aggregate entfernt werden.
In einem weiteren Schritt werden IgG-Aggregate und andere höhermolekulare Begleitproteine durch eine Fällung mit erfindungsgemäss erstmals eingesetztem niedermolekularen Polyethylenglykol (PEG) gefällt und die überstehende reine IgG-Lösung wird durch Ultra- und Diafiltration in eine lagerstabile und injektionsfähige Form gebracht. Der Vorteil des niedermolekularen PEG gegenüber dem nach dem Stand der Technik verwendeten höhermolekularen PEG mit Molekulargewichten zwischen 4 000 und 6 000 besteht darin, dass sich niedermolekulares PEG durch Dialyse vollständig entfernen lässt, wobei es sich als besonders vorteilhaft erwiesen hat, wenn man die Entfernung des PEG mit der nach jeder Fraktionierung erforderlichen Konzentrierung der Proteinlösung kombiniert in einer Ultrafiltrationsanlage durchführt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein verbessertes Verfahren zur Herstellung eines chemisch unmodifizierten, nicht enzymatisch behandelten, funktionell und strukturell intakten, nebenwirkungsfreien, alle IgG Subklassen enthaltenden, im wesentlichen IgA freien, in flüssiger Form lagerstabilen Immunglobulins zur intravenösen Verabreichung mit einem Monomergehalt von über 97 % und einem Gehalt an Tri- und höheren Polymeren von unter 1 % durch Reinigung und Anreicherung einer nach bekannten Verfahren hergestellten Ausgangsfraktion aus Humanplasma mit einem IgG-Gehalt von 30 - 100 % des Gesamtproteins in mehreren Schritten wie Dialysieren, Adsorbieren und Fällen, wobei man a) eine wässrige Lösung der Ausgangsfraktion zur Entfernung niedermolekularer Bestandteile dialysiert,
zur
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Entfernung der Euglobuline die Ionenstärke bei einem pH-Wert von 6, 0-9, 0 auf unter 500 S erniedrigt, gegebenenfalls aus dem Überstand der Euglobulinfällung Verunreinigungen durch ein- oder zweimalige Adsorption an einen Anionenaustauscher in einer Menge von 5 - 50 mg/g Protein bei einem pH-Wert von 6, 0 bis 9, 0 entfernt,
EMI2.1
Anteile abzentrifugiert, c) noch vorhandenes IgA und andere Verunreinigungen durch ein- oder zweimaliges Behandeln mit einem Anionenaustauscher in einer Menge von 5 - 50 mg/g Protein bei pH 6, 0-9, 0 entfernt, d) die Lösung gegebenenfalls mit den im Endpuffer vorhandenen Substanzen versetzt, labile und aggregierte IgG-Moleküle durch Zugabe von Polyethylenglykol ausfällt und abzentrifugiert,
zu einer noch nicht mit den im Endpuffer vorhandenen Substanzen versetzten Lösung diese Substanzen zugibt, das Fällungsmittel entfernt, die Lösung auf die gewünschte Proteinkonzentration einstellt und sterilfiltriert und im Falle des Entfallen der Stufe b) lyophilisiert, dadurch gekennzeichnet, dass man in Stufe d) Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 200 - 1 000 bis zu einer Endkonzentration von 10 - 25 % (w/w) als Fällungsmittel einsetzt.
Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemässe Verfahren kommen alle Fraktionen eines normalen oder hyperimmunen Plasmas und alle intramuskulär anwendbaren Präparate in Frage, die einen IgG-Gehalt zwischen 30 und 100 % des Gesamtproteins aufweisen. Solche Fraktionen können beispielsweise durch Ethanolfraktionierung nach Cohn als Fraktion II + III oder Fraktion II erhalten werden. Ähnliche Fraktionen können auch beispielsweise durch Ammoniumsulfatfällung, Fraktionierung mit höhermolekularem Polyethylenglykol oder durch Rivanol-Fraktionierung hergestellt werden. Es können aber auch bereits fertige, für die intramuskuläre Anwendung bestimmte oder nicht in flüssiger Form lagerstabile, für die intravenöse Anwendung hergestellte Präparate dem erfindungsgemässen Verfahren unterzogen werden.
Nach der AT-PS 381 026 werden als erste Reinigungsstufe zur Ausfällung der Euglobuline die Einstellung einer Leitfähigkeit von weniger als 300 J. S bei einem pH Wert von 5, 3 bis 5, 5 mit anschliessender Zugabe von BASEZ zur Adsorption von proteolytischen Enzymen vorgeschlagen.
Überraschenderweise wurde nun festgestellt, dass die Adsorption an ein mineralisches Adsorbens wegfallen kann, wenn man die EuglobulinfÅa1lung in Stufe a) nach Entfernung niedermolekularer Bestandteile und eventuell
EMI2.2
Hiefür eignen sich alle zur Behandlung biologischer Substanzen hergestellten schwachen Anionenaustauscher wie z. B. DEAE Sephadex (Fa. Pharmacia), DEAE Sepharose (Fa. Pharmacia), DEA Cellulofine (Fa. Whatman) u. ä. Besonders bewährt hat sich hierbei die Verwendung von DEAE-SephadexR A 50 (Fa. Pharmacia) in einer Menge von etwa 5, 0 bis 50 mg, bevorzugt 10 - 30 mg Ionenaustauscher (Trockenmasse) pro Gramm Protein bei einem pH-Wert von 6, 0 bis 9, 0, bevorzugt pH 6, 5 bis 7, 5.
Die nach Stufe a) erhaltene Lösung wird zur Erhöhung der Stabilität und zur Verringerung der antikomplementären Aktivität in Stufe b) einer Säurebehandlung unterzogen. Diese kann in Abhängigkeit von der Dauer der Einwirkung bei einem pH-Wert von 2, 5 bis 4, 2, bevorzugt von 2, 9 bis 3, 9, erfolgen, wobei die Einstellung eines pH-Wertes von 3, 3 bis 3, 5 wiederum besonders bevorzugt ist. In einer günstigen Ausführungsform kann diese Behandlung in zwei Stufen durchgeführt werden, indem die Lösung zunächst mit IN HCI bei 0-10 C, bevorzugt bei 4 C, auf einen pH-Wert von 2, 9 bis 3, 1 gebracht und für 5 bis 10 Minuten bei diesem pH-Wert belassen wird.
Anschliessend wird durch Zugabe einer Base, bevorzugt von Ammoniak, ein pH-Wert von 3, 3 bis 3, 5 eingestellt und die klare Lösung für 12 - 72 Stunden, bevorzugt 12 bis 24 Stunden bei 0 -10 C gehalten.
Durch weitere Zugabe einer Base wird der pH-Wert auf 7, 0 bis 9, 0, bevorzugt pH 8, 0 bis 8, 5 eingestellt und 0, 5 bis 5 Stunden, bevorzugt 1 - 3 Stunden, zur Ausflockung von Aggregaten und denaturierten Proteinen stehen gelassen. Gegebenenfalls kann man die Lösung auch, vor der Einstellung auf pH 7, 0 bis 9, 0 für 15 Minuten bis 2 Stunden bei pH 3, 0 bis 8, 0 auf 40-60 C, bevorzugt eine halbe bis eine Stunde auf 45-55 C erwärmen.
Hiebei erhält man bei einer Hitzebehandlung im sauren Bereich ein besonders stabiles Produkt, während eine Hitzebehandlung im neutralen bis leicht alkalischen Bereich zu höheren Ausbeuten führt. Die Entfernung des Niederschlages kann dann auf übliche Art durch Filtrieren, Zentrifugieren oder Dekantieren erfolgen.
Wird ein Immunglobulin-Präparat hergestellt, das nicht in flüssiger Form vorliegt, so ist die Säure- und Temperaturbehandlung nicht unbedingt notwendig.
In der Stufe c) wird der Überstand aus Stufe b) ein- bis zweimal mit einem schwachen Anionenaustauscher
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Menge von etwa 5 - 50 mg (Trockenmasse) pro Gramm Protein bei einem pH-Wert von 6, 0 bis 9, 0, bevorzugt in einer Menge von 10 - 30 mg Anionenaustauscher pro Gramm Protein, bei pH 7, 0 bis 7, 5. Die Einstellung eines neutralen bis leicht alkalischen pH-Wertes führt zu einem besonders IgA-armen IgG-Präparat.
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Die Abtrennung von Dimeren und Aggregaten des IgG sowie von höhermolekularen Verunreinigungen und labilen Proteinen erfolgt im Schritt d), gegebenenfalls nach Versetzen mit den im Endpuffer vorhandenen Substanzen, erfindungsgemäss durch Zugabe von niedermolekularem Polyethylenglykol (PEG) mit einem mittleren Molekulargewicht von 200 - 1 000, wobei Molekulargewichte von 600 bis 1 000 bevorzugt sind. Die Endkonzentration an PEG zur Ausfällung der oben beschriebenen Bestandteile der IgG-Lösung hängt hierbei weitgehend vom Molekulargewicht des PEG ab und reicht von 10 Gewichtsprozent bei PEG 1 000 bis 25 Gewichtsprozent bei PEG 200. Der pH-Wert der Lösung soll während der PEG-Fällung zwischen 6, 0 und 8, 0
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der Niederschlag abzentrifugiert wird.
Falls nicht bereits vor der PEG-Fällung, wird die IgG-Lösung nun mit den im Endpuffer verwendeten Substanzen versetzt. Es können dazu alle physiologisch und mit IgG verträglichen Puffer verwendet werden, wie z. B. Phosphatpuffer, Glycin/Natriumchlorid, u. ä. Die Entfernung des PEG kann nach mit in der Biochemie üblichen Methoden wie Umfällen, Dialysieren, Ultra- und Diafiltration erfolgen. Besonders bevorzugt ist hiebei jedoch, die klare Lösung in eine Ultrafiltrationsanlage zu überführen und dort durch Ultra-und Diafiltration gegen einen 5-fachen Überschuss des Endpuffers gleichzeitig die gewünschte Proteinkonzentration und den gewünschten Puffer einzustellen sowie das PEG aus der IgG-Lösung zu entfernen.
Anschliessend wird die IgG-Lösung, die mindestens 97 % Monomere, meistens jedoch über 99 % Monomere enthält, sterilfiltriert und abgefüllt.
Bevorzugterweise wird das fertige Gammaglobulinpräparat in flüssiger und anwendungsfertiger Form gelagert, wobei es auch bei längerer Lagerung stabil bleibt Es kann jedoch, falls erwünscht, auch lyophilisiert werden. Im Falle des Weglassens der Stufe b) ist die Lyophilisierung obligat.
Beispiel l :
25 g Cohn Niederschlag il-1,2 mit einem Proteingehalt von 25, 6 % wurden mit 25 ml demineralisiertem Wasser versetzt und bis zum Vorliegen einer homogenen Suspension bei +4 C gerührt. Anschliessend erfolgte eine Dialyse bei +4 C gegen fliessendes, demineralisiertes Wasser. Nach 48 Stunden wurde mit der 4-fachen Menge demineralisiertem Wasser verdünnt und eine Natriumchloridkonzentration von 1 mmol/1 eingestellt. Die Lösung wurde zentrifugiert und der Niederschlag, der einen hohen Anteil an höhermolekularen Proteinen enthielt, wurde verworfen.
Der Überstand wurde mit 20 mg DEAE-Sephadex A 50 (Trockenmasse) pro Gramm Protein versetzt und 2 Stunden bei +4 C gerührt. Der Ionenaustauscher wurde über eine Nutsche abgesaugt, der pH auf 7, 0 nachgestellt und die Behandlung mit DEAE-Sephadex A 50 wiederholt.
Durch Zugabe von IN HCI wurde der pH der Proteinlösung auf 2, 9 eingestellt, nach 10 Minuten Rühren wurde durch Zugabe von Ammoniaklösung ein pH von 3, 3 eingestellt und die Lösung über Nacht bei +4 C gelagert. Durch weitere Zugabe von Ammoniaklösung wurde der pH auf 8, 25 erhöht, die Lösung 2 Stunden zur Ausflockung von Aggregaten bei +4 C gelagert und der entstandene Niederschlag abzentrifugiert und verworfen.
Zur Entfernung geringer Reste von labilen IgG-Molekülen und proteolytischen Enzymen wurde nochmals mit Anionenaustauscher (20 mg/g Protein) 2 Stunden bei +4 C gerührt und anschliessend abgesaugt
Um einen Reinheitsgehalt der Endlösung an monomerem Immunglobulin G zu sichern, der grösser als 97 %, in der Regel jedoch grösser als 99 % ist, erfolgte eine Fällung durch Zugabe von PEG 1 000 (als 50 %-ige wässrige Lösung) auf einen Gehalt von 10 % (w/w). Die Fällung wurde über Nacht bei +4 0 C gelagert, bevor der Niederschlag abzentrifugiert wurde.
Die reine IgG-Lösung wurde anschliessend durch Zugabe von Glycin (15 g/l) und NaCl (7 g/l) stabilisiert und durch Ultra- bzw. Diafiltration durch eine Millipore Cassette PTGC 00005 (Fa. Millipore) mit einer Molekulargewichtsausschlussgrenze von 10 000 gegen eine fünffache Menge an Glycin-NaCl-Puffer vom PEG 1000 befreit, wobei gleichzeitig die Proteinkonzentration auf 49, 89 mg/ml erhöht wurde. Anschliessend wurde die Lösung sterilfiltriert und abgefüllt.
Ausbeute : 98 ml
Antikomplementäre Aktivität : 16, 9 (Die antikomplementäre Aktivität wurde nach KABAT, E. A. und MAYER, M. M. : Experimental Immunochemistry, 2nd Ed., Charles C. Thomas, p. 135 - 153, 1961 bestimmt.)
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<tb>
<tb> % <SEP> Protein <SEP> % <SEP> Monomere <SEP> % <SEP> Dimere <SEP> Polymere <SEP> IgA-Titer
<tb> aufgelöster
<tb> NS-TI-l, <SEP> 2 <SEP> 100 <SEP> 88, <SEP> 5 <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 8 <SEP>
<tb> Überstand <SEP> nach
<tb> Dialyse <SEP> 91, <SEP> 1 <SEP> 92, <SEP> 7 <SEP> 5, <SEP> 8 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 1 <SEP> :
<SEP> 8 <SEP>
<tb> Überstand <SEP> nach
<tb> 1. <SEP> DEAE-Beh. <SEP> 85, <SEP> 2 <SEP> 97, <SEP> 4 <SEP> 1, <SEP> 9 <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP> 0
<tb> Überstand <SEP> nach
<tb> 2. <SEP> DEAE-Beh. <SEP> 83, <SEP> 3 <SEP> 97, <SEP> 9 <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 0
<tb> nach <SEP> Säurestabilis. <SEP> 82, <SEP> 8 <SEP> 97, <SEP> 8 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 0
<tb> Überstand <SEP> nach
<tb> 3. <SEP> DEAE-Beh. <SEP> 79, <SEP> 7 <SEP> 98, <SEP> 6 <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 0
<tb> Überstand <SEP> nach
<tb> PEG1000 <SEP> 77, <SEP> 2 <SEP> 99, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> nach <SEP> Dialyse <SEP> 76, <SEP> 4 <SEP> 99, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
Tabelle 1 :
Der Proteingehalt der Lösung, die nach Auflösen des Niederschlages 11-1, 2 erhalten wurde, wurde gleich 100 % gesetzt.
Der Gehalt an IgA wurde mittels Ouchterlonytechnik (Serumproteine, A. Engelhardt u. H. Lommel, Verlag Chemie, 1974, Seiten 81-90) bestimmt.
Die Verteilung der Mono-, Di- und Polymeren wurde mittels HPLC (LKB, Säule TSK G 3000 SW 7, 5 x 600 mm) bestimmt.
Beispiel 2 : 49, 65 g Cohn Niederschlag II-l, 2 mit einem Proteingehalt von 26, 2 % wurden in 50 ml demineralisiertem Wasser gelöst und 2 Tage gegen fliessendes demineralisiertes Wasser dialysiert. Nach Zugabe von 400 ml demineralisiertem Wasser wurde die Lösung zentrifugiert
Der Überstand wurde durch Zugabe von 1 N HCI auf einen pH von 2, 92 eingestellt, nach 10 Minuten Rühren wurde auf einen pH von 3, 28 durch Zugabe der nötigen Menge 1 N NaOH zurückgestellt. Die Proteinlösung wurde über Nacht bei +4 C gelagert und danach auf einen pH von 8, 3 durch weitere Zugabe von 1 N NaOH eingestellt, um eine optimale Ausfällung von labilen Proteinen zu erreichen. Der Niederschlag wurde abzentrifugiert und verworfen.
Nach Zugabe des gleichen Volumens demineralisierten Wassers wurden 20 mg DEAE-Sephadex A50 pro Gramm Protein zugegeben. Es wurde eine Stunde bei +40 C gerührt. Der Ionenaustauscher wurde durch Filtration entfernt, und der pH der Proteinlösung auf 7, 0 eingestellt Die Rührung mit 20 mg DEAE-Sephadex A50 pro Gramm Protein über 1 Stunde bei +40 C wurde wiederholt, anschliessend wurde der Ionenaustauscher durch Filtration entfernt. Die Stabilisierung der Immunglobulinlösung erfolgte durch Zugabe von Glycin (15 g/l) und Natriumchlorid (7 g/l), der pH-Wert wurde auf 7, 0 eingestellt
Anschliessend erfolgte eine Fällung durch Zugabe von PEG 600 bis zu einer Konzentration von 15 % (w/w).
Nach Lagerung dieser Fällung über Nacht bei +4 C wurde der Niederschlag abzentrifugiert.
Die Abtrennung von PEG 600 und die Konzentrierung auf einen Proteingehalt von 50, 27 mg/ml erfolgte entsprechend Beispiel 1.
Ausbeute : 199 ml
Antikomplementäre Aktivität : 18, 2
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<tb>
<tb> % <SEP> Protein <SEP> % <SEP> Monomere <SEP> % <SEP> Dimere <SEP> % <SEP> Polymere <SEP> IgA-Titer
<tb> aufgelöster
<tb> Cohn <SEP> NS
<tb> n-1, <SEP> 2 <SEP> IM <SEP> 88, <SEP> 5 <SEP> 8, <SEP> 1 <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 8 <SEP>
<tb> Überstand
<tb> nach <SEP> Dialyse <SEP> 89, <SEP> 9 <SEP> 93, <SEP> 4 <SEP> 5, <SEP> 2 <SEP> 1, <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 8 <SEP>
<tb> nach <SEP> Säurestabilisierung <SEP> 89, <SEP> 1 <SEP> 93, <SEP> 0 <SEP> 5, <SEP> 3 <SEP> 1, <SEP> 7 <SEP> 1 <SEP> :
<SEP> 8 <SEP>
<tb> ÜbersL <SEP> nach
<tb> 1. <SEP> DEAE-Beh. <SEP> 82, <SEP> 9 <SEP> 97, <SEP> 0 <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 0
<tb> Überst. <SEP> nach
<tb> 2. <SEP> DEAE-Beh. <SEP> 80, <SEP> 2 <SEP> 98, <SEP> 3 <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0
<tb> Überst. <SEP> nach
<tb> PEG <SEP> 600 <SEP> 78, <SEP> 0 <SEP> 99, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> nach <SEP> Dialyse <SEP> 76, <SEP> 9 <SEP> 99, <SEP> 4 <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
Tabelle 2 :
Der Proteingehalt der Lösung, die nach Auflösen des Niederschlages 11-1, 2 erhalten wurde, wurde gleich 100 % gesetzt.
Der Gehalt an IgA wurde mittels Ouchterlonytechnik bestimmt.
Die Verteilung der Mono-, Di- und Polymeren wurde mittels HPLC (LKB, Säule TSK G 3 000 SW 7, 5 x 600 mm) bestimmt.
Beispiel 3 :
30 g Cohn Niederschlag II-l, 2 mit einem Proteingehalt von 28 % wurden mit 30 ml demineralisiertem Wasser bei 4 C angerührt. Die anschliessende Euglobulinfällung wurde analog Beispiel 1 durchgeführt. Der Überstand wurde mit 25 mg DEAE-Sephadex A50/g Protein versetzt, der pH auf 7, 0 korrigiert, die Suspension 2 Stunden bei 4 C gerührt und der Ionenaustauscher durch Filtration über einen Buchnertrichter entfernt
Das Filtrat wurde durch Zugabe von 1 n HCI auf einen pH von 2, 9 eingestellt Nach 10 minütigem Rühren wurde durch Zugabe von Ammoniaklösung ein pH von 3, 3 eingestellt und die Lösung über Nacht bei +4 C gelagert.
Durch Zugabe von Ammoniaklösung wurde der pH auf 7, 5 erhöht, die Lösung auf 45 C erwärmt und 30 Minuten bei dieser Temperatur gehalten. Nach dem Abkühlen wurden die denaturierten Proteine abzentrifugiert.
Der Überstand wurde nochmals mit 25 mg DEAE-Sephadex A50/g Protein versetzt, der pH-Wert auf 7, 0 nachgestellt, die Lösung 2 Stunden bei 4 C gerührt und der Ionenaustauscher abfiltriert.
Durch Zugabe von PEG 1000 als 50 %-ige wässrige Lösung bis auf eine Konzentration von 10 % (w/w) und Lagerung über Nacht bei +4 C erfolgte eine weitere Ausfällung von höhermolekularen Verunreinigungen bzw. oligomeren Formen von IgG.
Nach der Zentrifugation wurde die reine IgG-Lösung durch Zugabe von Glycin (15 g/l) und NaCI (7 g/l) stabilisiert. Durch Ultra-und Diafiltration entsprechend Beispiel 1 wurde das PEG 1 000 entfernt und die IgGLösung auf 50, 26 mg Protein pro ml konzentriert.
Ausbeute : 124 ml
Antikomplementäre Aktivität : 19, 8
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<tb>
<tb> % <SEP> Protein <SEP> % <SEP> Monomere <SEP> % <SEP> Dimere <SEP> % <SEP> Polymere <SEP> IgA-Titer
<tb> aufgelöster
<tb> NS <SEP> 11-1, <SEP> 2 <SEP> 100 <SEP> 88, <SEP> 3 <SEP> 8, <SEP> 3 <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 8 <SEP>
<tb> Überst <SEP> nach
<tb> PEG <SEP> 1000 <SEP> 75, <SEP> 4 <SEP> 99, <SEP> 6 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> nach <SEP> Dialyse <SEP> 74, <SEP> 2 <SEP> 99, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
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Tabelle 3 :
Der Proteingehalt der Lösung, die nach Auflösen des Niederschlages 11-1, 2 erhalten wurde, wurde gleich 100 % gesetzt.
Der Gehalt an IgA wurde mittels Ouchterlonytechnik bestimmt. Die Verteilung der Mono-, Di- und Polymeren wurde mittels HPLC (LKB, Säule TSK G 3 000 SW 7, 5 x 600 mm) bestimmt.
Beispiel 4 : Herstellung einer gefriergetrockneten Präparation.
50, 1 g Cohn Niederschlag il-1,2 mit einem Proteingehalt von 29, 6 % wurde in 50 ml demineralisiertem Wasser gelöst und 2 Tage gegen fliessendes Leitungswasser und einen Tag gegen demineralisiertes Wasser dialysiert. Nach Zugabe von 400 ml demineralisiertem Wasser wurde die stark trübe Lösung mit NaCI auf eine Konzentration von 1 MmoVl eingestellt, der pH auf 7, 0 korrigiert und abzentrifugiert.
Der Überstand wurde mit 50 mg DEAE-Sephadex A50 pro Gramm Protein versetzt und bei +4 C 2 Stunden gerührt. Der Ionenaustauscher wurde durch Filtration über einen Buchnertrichter abgetrennt.
Die Immunglobulinlösung wurde auf einen Gehalt von 15 g/l Glycin und 7 g/l NaCI eingestellt. Durch Zugabe von PEG 1000 (als 50 %-ige wässrige Lösung) auf eine Konzentration von 10 % (w/w) wurden labile und leicht aggregierbare Proteine ausgefällt, wobei die Fällung über Nacht bei +4 C gelagert wurde. Danach wurde der Niederschlag durch Zentrifugation entfernt.
Durch Ultra- bzw. Diafiltration wurde die Proteinkonzentration auf 50, 03 g/l erhöht und das PEG 1000 entfernt. Nach einer Klaar- un Sterilfiltration wurde die Immunglobulin G-Lösung abgefüllt und gefriergetrocknet
Ausbeute : 222 ml
Antikomplementäre Aktivität : 20, 9
EMI6.1
<tb>
<tb> % <SEP> Protein <SEP> % <SEP> Monomere <SEP> % <SEP> Dimere <SEP> % <SEP> Polymere <SEP> IgA-Titer
<tb> aufgelöster
<tb> NS-1, <SEP> 2 <SEP> 100 <SEP> 87, <SEP> 4 <SEP> 8, <SEP> 5 <SEP> 4, <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 16 <SEP>
<tb> Überstand
<tb> nach <SEP> Dialyse <SEP> 90, <SEP> 2 <SEP> 92, <SEP> 7 <SEP> 5, <SEP> 7 <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP> :
<SEP> 8 <SEP>
<tb> ÜbersL <SEP> nach
<tb> DEAE-Beh. <SEP> 83, <SEP> 0 <SEP> 96, <SEP> 6 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 9 <SEP> 0
<tb> übers <SEP> nach
<tb> PEG <SEP> 1000 <SEP> 78, <SEP> 4 <SEP> 98, <SEP> 8 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> nach <SEP> Dialyse <SEP> 74, <SEP> 9 <SEP> 98, <SEP> 7 <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
Tabelle 4 :
Der Proteingehalt der Lösung, die nach Auflösen des Niederschlages 11-1, 2 erhalten wurde, wurde gleich 100 % gesetzt.
Der Gehalt an IgA wurde mittels Ouchterlonytechnik bestimmt. Die Verteilung der Mono-, Di- und Polymeren wurde mittels HPLC (LKB, Säule TSK G 3 000 SW 7, 5 x 600 mm) bestimmt.
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